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CN108410449A - 一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒的制备及其应用 - Google Patents

一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒的制备及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测碱性磷酸酶的硅纳米颗粒的制备及其应用，具体制备方法包括将N‑[3‑(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)在搅拌下加入水中,随后分别加入对苯二酚、间苯二酚和邻苯二酚，并在室温常压下搅拌，即可获得黄色荧光硅纳米颗粒(yellow‑Si NPs)、蓝色荧光硅纳米颗粒(blue‑Si NPs)以及橘色荧光硅纳米颗粒(orange‑Si NPs)。制备得到的水溶性橘色荧光硅纳米颗粒能够用于高选择性灵敏检测碱性磷酸酶(ALP)。

Description

一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒的制备及其 应用
技术领域
本发明属于化学化工领域，具体涉及一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒的制备及其应用。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，广泛分布于人体各器官中，其中以肝脏为最多，其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。ALP检测主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。患这些疾病时，肝细胞过度制造ALP，经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血液而引起血清ALP明显升高。因此，建立准确检测血清中ALP的方法对人类健康起着至关重要的作用。迄今为止，已发展了基于CdS/CdTe/CdSe QDs、Au/Ag NCs、C dots、聚合物探针和小分子探针检测ALP 的方法。以上检测材料存在选择性较低、制备复杂、成本较高或者毒性较高等问题，相比较而言硅纳米颗粒具有制备简单、毒性较低、稳定性强、生物相容性好、可生物降解、原料丰富便宜、无需复杂的修饰等优势。因此以硅纳米颗粒为探针建立一种高选择性、高灵敏度检测ALP的新方法尤为必要。迄今为止，硅纳米颗粒的制备通常需用到高温高压或复杂的仪器。目前所制备的硅纳米颗粒多为蓝色荧光或绿色荧光，有关制备长波长荧光发射或具有荧光可调性的硅纳米颗粒尚未见报道。因此，以简单温和的方法在室温常压下快速制备荧光可调性的硅纳米颗粒，实现从蓝色荧光到黄或者红色荧光的调控十分必要。
发明内容
针对现有技术的不足和上述问题，本发明的目的在于提供一种制备具有多色荧光可调性的水溶性硅纳米颗粒的新方法。在此基础上，以硅纳米颗粒为荧光探针建立一种简单、高选择性、高灵敏度检测碱性磷酸酶(ALP)的新方法。
本发明提供了一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒,所述的水溶性荧光硅纳米颗粒是由N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)和苯二酚合成得到。
进一步地，所述的苯二酚为对苯二酚、间苯二酚或者邻苯二酚。
进一步地，当所述的苯二酚为对苯二酚，所述的水溶性荧光硅纳米颗粒的制备方法包括：
(1)将N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)加入水中；
(2)加入对苯二酚并搅拌即可获得黄色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(yellow-SiNPs)；
(3)将制备得到的水溶性荧光硅纳米颗粒用500Da的透析袋透析，即可获得纯化后的水溶性荧光硅纳米颗粒。其中N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)和对苯二酚的摩尔比为1：10。
进一步地，当所述的苯二酚为间苯二酚，所述的水溶性荧光硅纳米颗粒的制备方法包括：
(1)将N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)加入水中；
(2)加入间苯二酚并搅拌即可获得蓝色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(blue-SiNPs)；
(3)将制备得到的水溶性荧光硅纳米颗粒用500Da的透析袋透析，即可获得纯化后的水溶性荧光硅纳米颗粒。其中N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)和间苯二酚的摩尔比为1：140。
进一步地，当所述的苯二酚为邻苯二酚，所述的水溶性荧光硅纳米颗粒的制备方法包括：
(1)将N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)加入水中；
(2)加入邻苯二酚并搅拌即可获得橘色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(orange-SiNPs)；
(3)将制备得到的水溶性荧光硅纳米颗粒用500Da的透析袋透析，即可获得纯化后的水溶性荧光硅纳米颗粒。其中N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)和邻苯二酚的摩尔比为1：6。
一种包含水溶性荧光硅纳米颗粒的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在pH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液中加入0.7mol/L的维生素C磷酸酯(ascorbicacid 2-phosphate，AAP)和不同浓度的碱性磷酸酶(ALP)，置于37℃水浴中孵化25分钟；
(2)在上述溶液中依次加入所制备的橘色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(orange-SiNPs)溶液和浓度为10mM的KMnO4溶液；
(3)设定激发波长为481nm，在发射波长为558nm处测定荧光强度，制作标准工作曲线，并根据荧光强度和标准曲线计算ALP的含量。
进一步地，上述的检测碱性磷酸酶的方法可应用于血清中碱性磷酸酶的检测。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明所发展的制备水溶性荧光硅纳米颗粒方法简单、成本低。
(2)本发明制备得到的水溶性荧光硅纳米颗粒毒性低、具有水溶性、稳定性好、具有较强的耐盐性、抗光漂白性、pH稳定性及良好的生物相容性。
(3)本发明建立了一种在血清中检测碱性磷酸酶的新方法，该方法选择性好、灵敏度高。
附图说明
图1：制备得到的纳米颗粒的TEM图和尺寸分布图：
其中A为黄色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(Y-Si NPs)、B为橘色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(O-Si NPs)、C为蓝色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(B-Si NPs)；
图2：制备得到的纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图：
其中a线表示橘色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(O-Si NPs)、b线表示黄色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(Y-Si NPs)、c线表示蓝色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(B-Si NPs)；
图3：制备得到的纳米颗粒的激发光谱、发射光谱、紫外可见吸收光谱图：
其中A为橘色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(O-Si NPs)的激发光谱(a线表示)、发射光谱(b线表示)、紫外可见吸收光谱(c线表示)；B为黄色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(Y-SiNPs)的激发光谱(a线表示)、发射光谱(b线表示)、紫外可见吸收光谱(c线表示)；C为蓝色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(B-Si NPs)的激发光谱(a线表示)、发射光谱(b线表示)；
图4：制备的水溶性荧光硅纳米颗粒检测碱性磷酸酶的荧光光谱图和标准曲线：
其中A为橘色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(orange-Si NPs)中加入不同浓度的碱性磷酸酶的荧光光谱图；B为标准工作曲线；
具体实施方式
下面将结合说明书附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分，而不是发明的全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1水溶性荧光硅纳米颗粒的制备并对其进行结构表征
(1)黄色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒的制备
将1mL N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)在搅拌下加至5mL水中。随后加入 5.0mg对苯二酚并在室温常压下搅拌25分钟，即可获得黄色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(yellow-Si NPs)1.13g。将所制备的硅纳米颗粒用500Da的透析袋透析10小时，即可获得纯化后的硅纳米颗粒。
(2)蓝色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒的制备
将1mL N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)在搅拌下加至5mL水中。随后加入 70.0mg间苯二酚并在室温常压下搅拌25分钟，即可获得蓝色荧光硅纳米颗粒(blue-SiNPs)0.97g。将所制备的硅纳米颗粒用500Da的透析袋透析10小时，即可获得纯化后的硅纳米颗粒。
(3)橘色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒的制备
将1mL N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)在搅拌下加至5mL水中。随后加入 3.0mg邻苯二酚并在室温常压下搅拌2小时后，即可获得橘色荧光硅纳米颗粒(orange-Si NPs)1.17g。将所制备的硅纳米颗粒用500Da的透析袋透析10小时，即可获得纯化后的硅纳米颗粒。
如图1所示制备得到的纳米颗粒的TEM图和尺寸分布图，其中A为黄色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(yellow-Si NPs)、B为橘色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(orange-Si NPs)、C 为蓝色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(blue-Si NPs)；
如图2所示制备得到的纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图，其中a线表示橘色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(orange-Si NPs)、b线表示黄色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒 (yellow-Si NPs)、c线表示蓝色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(blue-Si NPs)；
如图3所示制备得到的纳米颗粒的激发光谱、发射光谱、紫外可见吸收光谱图，其中A 为橘色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(orange-Si NPs)的激发光谱(a线表示)、发射光谱(b 线表示)、紫外可见吸收光谱(c线表示)；B为黄色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(yellow-Si NPs) 的激发光谱(a线表示)、发射光谱(b线表示)、紫外可见吸收光谱(c线表示)；C为蓝色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(blue-Si NPs)的激发光谱(a线表示)、发射光谱(b线表示)。
如图4所示制备得到的水溶性荧光硅纳米颗粒检测不同浓度的碱性磷酸酶的荧光光谱图 (A表示)和标准工作曲线图(B表示)。
实施例2一种包含水溶性荧光硅纳米颗粒的检测碱性磷酸酶的方法
一种包含水溶性荧光硅纳米颗粒的检测碱性磷酸酶的方法包括：
(1)在2.83mL，pH为7.4，浓度为10mM的Tris-HCl缓冲溶液中加入30μL 0.7mol/L的维生素C磷酸酯(ascorbic acid 2-phosphate，AAP)和浓度分别为0U/L、0.01U/L、0.1U/L、1U/L、5U/L、50U/L和500U/L的碱性磷酸酶(ALP)，置于37℃水浴中孵化25分钟。
(2)在上述溶液中依次加入20μL实施例1所制备的橘色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒 (orange-Si NPs)溶液和90μL浓度为10mM的KMnO4溶液。
(3)在激发波长为481nm，发射波长为558nm处测定荧光强度
(4)制作标准工作曲线和计算ALP的含量：以orange-Si NPs+KMnO4溶液的荧光强度为F1；orange-Si NPs+KMnO4+AAP+ALP溶液的荧光强度为F2；以F2-F1为纵坐标，logcALP为横坐标；激发波长和发射波长的狭缝宽度均5nm，并根据荧光强度和标准曲线 F2-F1＝116.17logcALP-100.52计算ALP的含量。
实施例3一种包含水溶性荧光硅纳米颗粒的检测碱性磷酸酶的方法对血清中碱性磷酸酶的检测
(1)将购买的人血清样品用Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4；浓度为10mM)稀释100倍，加入30μL浓度为0.7mol/L的维生素C磷酸酯(ascorbic acid 2-phosphate，AAP)和浓度分别为50U/L、100U/L、150U/L的ALP，最终总体积为2.89mL，置于37℃水浴中孵化25分钟。
(2)在上述溶液中依次加入20μL实施例1所制备的orange-Si NPs溶液，90μL浓度为 10mM的KMnO4溶液。
(3)设定激发波长为481nm，在发射波长为558nm处测定荧光强度。
(4)制作标准工作曲线和计算ALP的含量：以orange-Si NPs+KMnO4溶液的荧光强度为F1；orange-Si NPs+KMnO4+AAP+ALP溶液的荧光强度为F2；以F2-F1为纵坐标，logcALP为横坐标；激发波长和发射波长的狭缝宽度均5nm，并根据测得荧光强度F1、F2和标准曲线 F2-F1＝116.17logcALP-100.52计算ALP的含量。
(5)实验结果：如表1实施例1制备得到的水溶性荧光硅纳米颗粒用于血清中碱性磷酸酶的测定结果所示：
表1.人血清样品中ALP的测定结果
上述实验结果证明了本发明可以灵敏检测血清中碱性磷酸酶的含量，满足临床中检测血清碱性磷酸酶的要求，对临床监测分析具有一定的指导意义；且本发明检测碱性磷酸酶结果较为准确，实验获得结果与PNPP比色法检测结果一致，证明本方法是可靠可行的。

Claims (10)

1.一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒,其特征在于，所述的水溶性荧光硅纳米颗粒是由N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)和苯二酚合成得到。
2.如权利要求1所述的一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒,其特征在于，所述的苯二酚为对苯二酚、间苯二酚或者邻苯二酚。
3.如权利要求1所述的一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒,其特征在于，所述的苯二酚为对苯二酚，所述的水溶性荧光硅纳米颗粒的制备方法包括：
(1)将N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)加入水中；
(2)加入对苯二酚并搅拌即可获得黄色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(yellow-Si NPs)；
(3)将制备得到的水溶性荧光硅纳米颗粒用500Da的透析袋透析，即可获得纯化后的水溶性荧光硅纳米颗粒。
4.如权利要求3所述的一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒,其特征在于，所述的N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)和对苯二酚的摩尔比为1：10。
5.如权利要求1所述的一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒,其特征在于，所述的苯二酚为间苯二酚，所述的水溶性荧光硅纳米颗粒的制备方法包括：
(1)将N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)加入水中；
(2)加入间苯二酚并搅拌即可获得蓝色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(blue-Si NPs)；
(3)将制备得到的水溶性荧光硅纳米颗粒用500Da的透析袋透析，即可获得纯化后的水溶性荧光硅纳米颗粒。
6.如权利要求5所述的一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒,其特征在于，所述的N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)和间苯二酚的摩尔比为1：140。
7.如权利要求1所述的一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒,其特征在于，所述的苯二酚为邻苯二酚，所述的水溶性荧光硅纳米颗粒的制备方法包括：
(1)将N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)加入水中；
(2)加入邻苯二酚并搅拌即可获得橘色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(orange-Si NPs)；
(3)将制备得到的水溶性荧光硅纳米颗粒用500Da的透析袋透析，即可获得纯化后的水溶性荧光硅纳米颗粒。
8.如权利要求7所述的一种检测碱性磷酸酶的水溶性荧光硅纳米颗粒,其特征在于，所述的N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺(DAMO)和邻苯二酚的摩尔比为1：6。
9.一种包含水溶性荧光硅纳米颗粒的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在pH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液中加入0.7mol/L的维生素C磷酸酯(ascorbic acid2-phosphate，AAP)和不同浓度的碱性磷酸酶(ALP)，置于37℃水浴中孵化25分钟；
(2)在上述溶液中依次加入所制备的橘色荧光水溶性荧光硅纳米颗粒(orange-SiNPs)溶液和浓度为10mM的KMnO4溶液；
(3)设定激发波长为481nm，在发射波长为558nm处测定荧光强度，制作标准工作曲线，并根据荧光强度和标准曲线计算ALP的含量。
10.如权利要求9所述的一种包含水溶性荧光硅纳米颗粒的检测碱性磷酸酶的方法,其特征在于，所述的方法可应用于血清中碱性磷酸酶的检测。
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