CN108409841A - 用于检测特异性过敏原IgE的单域结合蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于检测特异性过敏原IgE的单域结合蛋白，所述单域结合蛋白选自E01A1、E02A1、E02A2、E03B1、E04A1或E05A2，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1‑6所示，或SEQ ID NO:1‑6所示序列C端去掉6个His标签形成的序列。本发明针对微量免疫反应的检测，提供了一个较传统使用多抗或单抗较果更为良好的检测方式。具体利用特定结构的单域结合蛋白取代常用的单抗，应用于微量免疫反应检测，优化条件后可以大幅改善微量免疫反应检测的性能，增强反应稳定性，提高反应速率，增加免疫检测套组的热稳定性。

Description

用于检测特异性过敏原IgE的单域结合蛋白及应用

技术领域

本发明涉及免疫学、分子生物学及临床医学检测领域，具体地说，涉及用于检测特异性过敏原IgE的单域结合蛋白及应用。

背景技术

免疫检测技术(Immunoassay)，或称免疫诊断(Immuno-diagnostics)技术是利用抗原抗体的间的特异性免疫反应来测定免疫状态、检测各种疾病的诊断方法。免疫检测技术的发展经历了放射免疫分析技术(Radioimmunoassay,RIA)、免疫胶体金技术(Immunogold assay)、酶联免疫分析技术(Enzyme linked immune sorbent assay,ELISA)、荧光免疫分析技术(Fluorescence immunoassay,FIA)和化学发光免疫分析技术(Chemo-luminesce Immunoassay,CLIA)，它们的主要差别在于对抗原或抗体进行标记以放大、定量检测反应信号的方法不同。

从临床学的角度来说，免疫诊断可应用于检查传染性疾病、免疫性疾病、肿瘤和其它临床各科疾病。临床使用的免疫检测技术，应用样品多范围广，灵敏度与再现性都高，所以在疾病的检测上能较为精确的提供医疗上的判断方向。近年来于临床使用的体外诊断试剂(In-Vitro diagnostic kit)，在医疗诊断上提供超过一半的疾病相关讯息。按检验原理或检验方法的不同，主要分为：临床检验、生物化学检验、免疫学检验、微生物检验、核酸与分子检验、实时检验(POCT)。其中占比最大、市场份额最大的是免疫学检验部分，使用的就是免疫检测技术。因而，在免疫检测技术上的改良与改善，是多数体外诊断试剂厂商最为重视的研究课题。免疫检测的方式朝着简单化、小型化、自动化、缩短检测时间、减少样本取样量(样本微量化)、提高检测灵敏度、同反应能多项目检测等方向进行改善，以期在医疗诊断的使用上能有更大的突破。

目前最常使用的微量免疫检测，又能同时检测多项目的检测，包括蛋白质生物芯片以及Luminex公司开发的荧光微粒检测(Luminex xMAP)。基本上都是以免疫学方法原理，将抗体或抗原点制芯片表面的小点内，或者是包覆在荧光微粒上，可以迅速的与待测物反应，在一个反应中可以同时检测数十到数百个检测标的物。然而在这些同时多标的检测的试剂开发过程，常遇到的困扰是由于极度的微量化，使用的单株或多抗的标记物，发出来的信号极弱，必须要使用较高灵敏度的光学或磁学检测仪来检测反应的结果。另外，由于抗体本身也是一种蛋白质，各种蛋白质本身的抗热差异性非常大，在试剂制造完成后，可能因为储存或运输的条件不佳，导致抗体活性的下降造成试剂本身的稳定性不佳，甚至检测结果失准。所以如何增加稳定性以及加速反应，是重要的研究方向。

单域结合蛋白(single domain binding protein)的研究起始于1980年代，针对特定的生物分子，包含DNA的结合蛋白、酵母菌poly A结合蛋白等，其中最为突出的就是单域抗体(single domain antibody)。由于免疫学的进展，1975年首度有学者提出，以融合瘤技术制造只针对单一抗原反应的单一种抗体，称为单抗(monoclonal antibody)。在1980以后，单抗因为蛋白质新药的发展而积极发展，再加上抗原结合位点(antigen-bindingsites)概念被加入人源抗体IgG的Fc片段以后，显著的降低了单抗分子的大小，也增加了单抗药物的实用性。之后在生技界以及制药界，无不想尽办法找是否有更合适的分子，比单抗更小更稳定的分子，并且能专一性结合在标的物上。1989年，Hamers-Casterman等偶然发现骆驼(单峰驼)血液中有半数的抗体是重链抗体(heavy-chain antibodies,HCAbs)，它是一种缺失了轻链的重链二聚体抗体。1997年，Ghahroudi等利用噬菌体展示技术获得骆驼重链可变区片段(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)基因库，经多轮淘选后得到了只含有一个结构域的最小单元抗原结合蛋白片段，被称为单域抗体(single-domain antibodies,sdAbs)。这种椭球形的小分子抗体的直径仅2.5nm，长4nm，相对分子质量仅15kDa，因此发展此技术的公司Ablynx公司团队将其命名为纳米抗体(nanobodies,Nabs)。

单域抗体是抗体分子的最小抗原结合单元，仅由一个可变结构域或一个仅协助靶标结合的工程化的恒定结构域组成。此类抗体衍生物现今技术已知的，包括来源于骆驼科和鲨鱼类动物中天然产生的可变区，以及工程化的人源抗体中重链或轻链的可变区或恒定区结构域。单域抗体为约110个氨基酸的肽链，包含了一般完整抗体中的一个重链可变域(VH)。它们对抗原的特异性程度与完整的抗体相似，但热稳定性好，在清洁剂和高浓度尿素环境下稳定。从骆驼和鲨鱼的抗体中获得的单域抗体脂溶性较差，而更易溶于水。在药物学上来说，相对于完整抗体，单域抗体的分子质量更低，这使其更容易渗透到组织中。同时由于更容易通过肾脏清除，因此其药代动力学半衰期也更短。此外由于它们没有可结晶区，因此无法通过补体系统引发细胞毒性。所以在药物学的研究和应用上，近20年来他的研究非常广泛，也有数个已经初期开发完成进入临床试验的单域抗体药物。

在检测上，单域抗体的相关应用，虽然具有较佳的热稳定性以及分子量小，但是一开始所受到的瞩目就没有如此的高。一方面由于传统的免疫学检测方式，高亲和性的单抗应用，在传统平台上的表现已经非常稳定，困扰仅在于抗体本身热稳定性问题。而一般抗体其较长的重链Fc部分可以提供酵素等分子进行键结，又可用于吸附于固态载体如胶体金、乳胶粒子上，甚至于在特定平台上还可以键结一些连接分子(linker)。所以在免疫检测上的应用，虽然在某些特定的癌症筛检应用于分子传感器上，或者是细胞染色上有较佳的表现以及相关研究，然而实际上并未见有商品化产品。

微量化的免疫检测，现在发展主流以蛋白质生物芯片以及荧光微粒检测为主。因为方法学上的不同，反应速率以荧光微粒检测的反应快均质性高，检测方法以瘤式细胞仪相同概念进行同时多颗粒荧光标记的判读，占有一定的速度优势。在多标的检测上，因为蛋白质芯片是同时在一个固态表面如玻璃或者是硝化纤维膜上，可以根据检测标的项目的总数，进行较大规模的增加，只要在操作许可范围以及检测灵敏度许可范围下，蛋白质芯片在同时检测项目上，占有了绝对的优势。但是两个系统在热稳定性、反应稳定性、反应速率上的研究，一直有各自的进展。

在蛋白质芯片的产品发展过程中，热稳定性以及定量检测的变异性一向是被诟病的问题。一则是因为生物芯片的发展，一开始起始于DNA芯片，在整个制造流程一直到临床应用的操作上，DNA本身的生物分子特性，热稳定性极佳。而被检测的DNA标的，因为需要经过聚合酶连锁反应(polymerase chain reation,PCR)放大近亿倍，其放大的绝对误差很大，所以除了同步监测的实时聚合酶连锁反应(real time PCR)，定量是没有太大意义的。但是蛋白质是生理反应的直接角色，其本身在身体内的总量，常常与疾病本身发生一定的关联性，定量的检测意义较大。在生物芯片从DNA芯片，细胞芯片等等发展过程中，其定性意义大于定量意义。然则发展到蛋白质芯片时，定量就成了重要的课题，而反应稳定性是定量的基础要求。

在蛋白质芯片的反应速率上，临床样本通常是以液态形式参与免疫检测反应，这些样本包括了血清、血浆、唾液、尿液等各式体液。在液态的反应系统内，如果反应用的抗体或抗原固定于固态表面，则抗体抗原本身的碰撞机率，决定了反应完成的速度。无论多抗或者是单抗，因为抗体本身的大小，在反应速率上会有一定的限制，如果使用较小的蛋白质或多肽链来取代抗体，则有可能提高反应的速率，达成医疗检测时对于反应速度的需求。在蛋白质芯片的应用上，一次检测多标的物是最大的优势，因而在临床上如果有多种标的物必须同时进行筛选，就会是重要的应用方向，这些检测包括过敏原检测、自体免疫疾病、癌症相关多标的筛检等。

在过敏原检测上的应用，蛋白质芯片与传统常用的两步骤酵素免疫分析法，基本原理相同。两种方式都是将过敏原蛋白质固定于固态表面，之后将待测血清样本进行适当浓度稀释后，直接与固态表面的过敏原蛋白进行抗体抗原反应。反应完成后，与过敏原反应的免疫球蛋白E(IgE)会黏附于过敏原上，然后经过清洗冲掉待测物，再加入已经经过标记的单抗与IgE反应。最后再进行标记物的信号测定，在蛋白质芯片上常见的标记物为荧光分子如Cy3,Cy5,Alexa等。其中最重要的信号强弱与噪声控制，在单抗与免疫球蛋白的适当浓度、反应完成度以及反应时间。在商业上除了使用单抗来针对IgE做反应示踪之外，Heska公司曾在US00US5945294中描述了以IgE在人类细胞上的反应受器(Fc receptor)，但是其适用对象仅应用于宠物动物的IgE检测，并且只应用于传统的酵素免疫检测法，并且仅应用于该公司的收检检测上，推测应该是受限于Fc receptor的本身性质，无法提升太多的检测灵敏度。因为在宠物血清中，特异性针对过敏原有反应的IgE浓度，通常是人类的5～10倍，所需检测灵敏度不需要太高。若是采用与单抗较为类似的单域抗体，其可行性显然会大幅提升。

国际上针对抗IgE的单域抗体，已经多有研究。但针对IgE检测方面，尚未进行深入的研究和开发。

发明内容

本发明的目的是解决目前单抗或多抗在微量免疫检测上的缺点，提供用于检测特异性过敏原IgE的单域结合蛋白。

本发明的另一目的是提供所述单域结合蛋白在特异性过敏原IgE检测中的应用。特别是将单域结合蛋白的设计应用于蛋白质芯片相关微量免疫检测的模式，使蛋白质芯片检测法的反应稳定性、反应速率及热稳定性得以提升。

为了实现本发明目的，本发明提供的用于检测特异性过敏原IgE的单域结合蛋白，所述单域结合蛋白选自E01A1、E02A1、E02A2、E03B1、E04A1或E05A2，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-6所示，或SEQ ID NO:1-6所示序列的C端连6个His标签形成的序列。

本发明还提供含有所述单域结合蛋白或其组合的用于检测特异性过敏原IgE的检测试剂、试剂盒或芯片。

优选地，所述单域结合蛋白是经过酵素或荧光物质(如Cy3)标记的单域结合蛋白。

本发明所述单域结合蛋白单独或组合使用的以下任一种应用：

1)特异性过敏原IgE的蛋白质芯片检测中的应用；

2)制备特异性过敏原IgE检测试剂中的应用；

3)特异性过敏原IgE ELISA免疫分析检测中的应用；

4)制备特异性过敏原IgE的胶体金检测试纸条中的应用。

优选地，所述蛋白质芯片检测是指基于蛋白质芯片的微量免疫检测。

本发明还提供数种单域结合蛋白，此类蛋白一般统称为单域抗体。在蛋白质芯片应用于临床时，通常使用多抗或者是单抗，抗体上面标记特定荧光物质或酶，用于示踪反应结果。当其针对的标的物留存于蛋白质芯片上时，抗体会与标的物结合。当操作者以特定光学仪器读取信号时，标记于抗体上面的荧光物质会产生信号，或者酶与加入显色的反应底物(substrate)产生冷光信号，操作者读取信号强度得以了解抗体反应的强度，进而知悉检测标的物的多寡，是一种定量检测反应。其中抗体的亲和性强弱、抗体本身是否可以到达标的物的结合位置、以及反应系统的均质性，都会影响最终的信号结果。本发明中以单域抗体，取代多抗及单抗的角色，担任反应结果示踪的抗体。

在本发明中，提供了数个应用于蛋白质芯片的单域抗体氨基酸序列、其设计和生产方式以及荧光物质的标记方法。这些单域抗体与蛋白质芯片组成的试剂套组，与原始由单抗和蛋白质芯片组成的套组进行比较，可以发现在性能稳定性、热稳定性以及反应速率上，都有显著的提升。

在本发明中所述的蛋白质芯片，可应用于临床医学检测或者是动物检测，针对多样品的过敏原检测。检测的对象样本是血清、血浆或者是全血，其中的针对过敏原有特异性反应的IgE(specific IgE,sIgE)是主要的检测对象。将样本与蛋白质芯片上的过敏原反应后，sIgE会黏附于各过敏原蛋白上，再以本发明所述的其中一个或数个单域抗体与黏附在芯片过敏原上的sIgE进行反应后，即可以雷射扫描仪读取单域抗体上标记的荧光强度。荧光可以反映出受检样本内，是否有针对特定过敏原有反应的sIgE，并且荧光强度可以推测出受检人sIgE的多寡，间接了解受检者过敏的严重程度，是一种临床医学上的定量检测。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供一种单域结合蛋白及其应用，针对微量免疫反应的检测，提供了一个较传统使用多抗或单抗较果更为良好的检测方式。具体利用特定结构的单域结合蛋白取代常用的单抗，应用于微量免疫反应检测，优化条件后可以大幅改善微量免疫反应检测的性能，增强反应稳定性，提高反应速率，增加免疫检测套组的热稳定性。

附图说明

图1为本发明实施例3中单域结合蛋白E03B1性能测试，酶联反应法的结果。

图2为本发明实施例3中单域结合蛋白性能测试，生物芯片法的检测结果。

图3为本发明实施例3中单域结合蛋白E03B1性能测试，生物芯片法的检测结果。

图4为本发明实施例4中单域结合蛋白E03B1热稳定性测试结果。

图5为本发明实施例5中单域结合蛋白E03B1反应稳定性测试结果。

具体实施方式

本发明的单域抗体是一种特定序列的蛋白质，此类蛋白质可以针对特定抗原标的物进行反应，此反应可以取代现有常用的单抗或多抗，在临床或动物检验加以应用。在本发明的实施例中，此类蛋白质经过数据库搜寻、克隆方式设计、最后利用大肠杆菌大量表现出蛋白质，经过纯化后，进行荧光物质的标记，最后可应用于检测中。

实施例1抗人类IgE单域结合蛋白的设计与克隆

开始设计前，在美国国家卫生研究院的生物数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)、生物信息资源入口网(https://www.expasy.org/)以及美国专利数据库上，搜寻针对人类IgE的单抗及单域抗体，进行序列分析。这些序列基本上具有七段相连的序列，依照性质为骨架区(framework region,FR)以及互补决定区(Complementarity-determining region,CDR)，依照排列分别为蛋白质氮端(N)-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，以这些序列为模板，依照氨基酸本身特性，设计不同的氨基酸序列进行后续合成。除了要与标的物人类IgE可以有反应之外，因为后续使用的需求，还必须注意几个设计重点:(1)整段蛋白质中，为了后续荧光物质的标记，必须留下较多的赖氨酸(Lysine,K)于骨架区(framework region,FR)中，或在蛋白质链碳端(C terminal)加上少数赖氨酸(Lysine,K)，以提高后续荧光物的标记效能。(2)在整段蛋白质中，为了避免荧光标物质影响互补决定区(Complementarity-determining region,CDR)的效能，所以尽量在设计时在互补决定区不选择赖氨酸(Lysine,K)于序列中。(3)由于未来须使用于检验使用，能够进行量产应用，设计中必须加入提供纯化的特定序列如His tag,GST tag。(4)考虑多数数据库中三级结构仿真完成时，发现蛋白质氮端(N terminal)如果添加的过长的序列，会严重影响前段蛋白质的三级结构型态，所以序列在骨架序列1(FR1)的前不要设计过多氨基酸。

设计完成后，将氨基酸序列逆向翻译为DNA序列，并委托进行商业化DNA序列合成。合成完的DNA，使用pET22plasmid为载体(pET22,为Merck Millipore公司Novagen系列商标产品)，转入大肠杆菌E.coli Rosetta gami B(Merck Millipore公司Novagen系列商标产品)进行表达。利用IPTG诱导表现出来的蛋白质皆直接可溶，可利用超声波震荡法将菌体打碎，再利用His tag管柱进行纯化。经过纯化后的蛋白即目标单域结合蛋白，与数据库所可以找到的单域抗体表现出相似的特性。本发明中经过测试的单域蛋白E01A1、E02A1、E02A2、E03B1、E04A1或E05A2，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-6所示。

实施例2单域结合蛋白的标记

纯化完成的每一个单域结合蛋白，利用Vivaspin 6离心浓缩管，在4℃下以1000g离心，浓缩至大于1mg/ml的浓度。浓缩后的各单域结合蛋白，依照试验类型，可以用不同种标记物加以标记。

1、单域结合蛋白的酵素标记

使用商用的酵素标记套组，即可进行单域结合蛋白的酵素标记，本发明中单域结合蛋白的基础效能测试，以辣根过氧化酶(Horseradish peroxidase,HRP)进行酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)进行活性测试。发明中以Lighting-Link HRP套组(Innova Biosciences公司产品)，进行单域结合蛋白的酵素标记。将浓度为1mg/ml纯化的单域结合蛋白，以分子数量1:1,1:2,1:4的不同比例，加入酵素套组中。反应3小时后，加入50％甘油保存备用。

2、单域结合蛋白的荧光物标记

纯化完成的每一个单域结合蛋白，利用Vivaspin 6离心浓缩管，在4℃下以1000g离心，浓缩至大于1mg/ml的浓度。以Cy3mono-reactive Dye Pack(GE,AmershamBiosciences公司产品)或类似的荧光标记套组加以标记。依照标记套组的说明，标记阶段完成后，可利用PD-10管柱(GE,Amersham Biosciences公司产品)进行终产物的纯化分离。

实施例3单域结合蛋白性能测试

经过纯化并且标记过的单域结合蛋白，可以应用酶联免疫法或者是生物芯片法来进行实际的效能测试。测试的比对可以用既有的商业化单抗，同样经过酵素或者荧光物的标记，作为对照组。

1、酶联免疫法的进行

将人类IgE,IgA,IgM,IgG,IgD标准品以1.0ug/ml的浓度，以碳酸缓冲液(carbonate buffer,pH9.5)包被于酶联免疫法ELISA平板中，再经过含1％牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)的磷酸缓冲生理盐水(Phosphate buffer saline,PBS)封闭。

将不同浓度的标记完成的单域结合蛋白-HRP产物(以E03B1为例)，与对照用的单抗(购自Biocheck公司，Anti human IgE mAb#70188)，分别稀释1000,4000,16000,64000,256000倍，加入ELISA平板进行反应。从ELISA反应结果(图1)可以发现，设计完成的单域结合蛋白与人类IgE有较强的反应，与对照组的单抗类似。对于IgA,IgM,IgG,IgD反应极弱，表示出针对IgE设计的单域结合蛋白可以应用于专一性的IgE检测。实验结果还显示，在ELISA反应中，经过标记的单域结合蛋白与单抗相比，显然可能因为单域蛋白的分子较小(约12KD)，其可能与酵素反应标记的氨基酸位置可能会影响到免疫反应的结合位置，故整体评估其信号小于单抗。明显在ELISA反应系统，单域结合蛋白不特别占有优势。图1中，mAb*HRP：单抗-HRP产物，SBP*HRP：单域结合蛋白-HRP产物。

2、蛋白质生物芯片法的进行

将人类IgE标准品以2.5,5,10ug/ml(低[L]、中[M]、高[H])的浓度，IgA,IgM,IgG,IgD标准品以10ug/ml，以磷酸缓冲生理盐水(Phosphate buffer saline,PBS)稀释，点在 Slide Glass B(Schott公司的系列产品)的玻片上。每个标准品点制三重复，每个点的大小约为350um。点制完完成后，以1％酪蛋白磷酸缓冲液(caseinphosphate buffer,pH7.5)封闭。

将不同浓度的标记完成的单域结合蛋白-Cy3产物，与对照用的单抗，分别稀释400,1000,2000,4000倍，加入准备完成的芯片表面进行反应。蛋白质芯片的反应结果显示(图2)，设计完成的单域结合蛋白E01A1、E02A1、E02A2、E03B1、E04A1或E05A2与人类IgE有较强的反应，与对照组的单抗类似。挑选其中针对IgE反应较强的单域结合蛋白E03B1为例，与对照组单抗相比，其对于IgA,IgM,IgG,IgD反应极弱(图3)，表明在蛋白质芯片上单域结合蛋白亦可达成检测的目的。以信号定量分级结果加以判定，mAb*Cy3 2000倍稀释的IgE高、中、低三个浓度反应比例线性为最佳，但最高信号强度仅为1625。SBP*Cy3按1000倍稀释线性最佳，最高信号强度达2571。从结果可以看出，以Cy3标记的单域结合蛋白，其反应结果明显优于ELISA免疫检测反应结果。图3中，mAb*Cy3：单抗-Cy3产物，SBP*Cy3：单域结合蛋白-Cy3产物。

从原理上解释，虽然Cy3分子跟HRP酵素与单域结合蛋白的反应氨基酸相同(都是赖氨酸Lysine,K)，但由于HRP的分子量远大于单域结合蛋白，而Cy3分子却远小于单域结合蛋白，因此造成了截然不同的效果。在蛋白质生物芯片的应用上，尤其是以玻片为基底的蛋白质生物芯片，使用的标记物都是高荧光效率的小分子标记物。单域结合蛋白在这种方法学上，显然具有较大的优势。

实施例4单域结合蛋白热稳定性测试

本实施例以单域结合蛋白E03B1为例，进行热稳定性测试。

将实施例3中的单域结合蛋白-Cy3标记产物分别置于37℃(37C)、45℃(45C)的条件下，进行热稳定性测试。于7,14,28,56天进行蛋白质生物芯片再测试。对照组采用单抗-Cy3标记产物，以同为1000倍稀释浓度，同条件下进行所有相关测试。从实验结果(图4)可以看出，单域结合蛋白标记物的信号强度明显大于单抗标记物，且与实施例3差异性不大，可以证明单域结合蛋白应用于微量免疫检测套组时，热稳定性会优于传统使用的抗体。图4中，mAb*Cy3：单抗-Cy3产物，SBP*Cy3：单域结合蛋白-Cy3产物。所用单抗购自Biocheck公司，Anti human IgE mAb#70188。蛋白质生物芯片IgE点制浓度为10ug/ml，

依照学理上，单域抗体多数热稳定性优于一般的单抗或者多抗，在本发明中设计数个结构类似于单域抗体的单域结合蛋白，经过标记后，其性质还是倾向于单域抗体，可以有较佳的热稳定性。对于临床上使用的蛋白质芯片试剂套组，此试验结果可以优化现有的试剂套组性能，并且避免在运输或储存条件不佳时，所造成的性能变化，进而避免试剂套组性能偏差所造成的检测结果失准，影响后续医疗判定。

实施例5单域结合蛋白性能稳定性测试

本实施例以单域结合蛋白E03B1为例，进行性能稳定性测试。

将人类IgE,标准品以2.5,5,10ug/ml(低[L]、中[M]、高[H])的浓度，以磷酸缓冲生理盐水(Phosphate buffer saline,PBS)稀释，点在 Slide Glass B(Schott公司的系列产品)的玻片上，每个浓度点制20组，共60个点。每个标准品点制三重复，每个点的大小约为350um。每个浓度(L,M,H)重复点制20组，每个单一反应中包含60×3个点。点制完成后，以1％酪蛋白磷酸缓冲液(casein phosphate buffer,pH7.5)封闭。将实施例3中的单域结合蛋白-Cy3，以单抗-Cy3为对照组，均以1000倍稀释倍率，进行生物芯片反应。反应完成后读取信号，计算每组(L,M,H)的反应变异系数(CV％)。此试验采用两位不同实验室人员OP1、OP2进行试验操作，两位操作者的统计分析分别计算。

从试验结果得知(图5)，在单域结合蛋白-Cy3的反应结果，优于使用单抗-Cy3。由于蛋白质芯片易受操作者操作手法、反应时间长短、反应温度、反应震荡速率、背景值等外在因素干扰，所以在临床上要发展一个性能合适的试剂套组常常会遇到变异系数(CV％)过大的问题。在试剂套组的开发者，必须在试剂开发前期，就已经评估到降低使用者外在因素干扰。单域结合蛋白在这个方面显然是一个好的选择。图5中，mAb*Cy3：单抗-Cy3产物，SBP*Cy3：单域结合蛋白-Cy3产物。所使用的单抗购自Biocheck公司，Anti human IgE mAb#70188。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京康亿鸿科技发展有限公司

<120> 用于检测特异性过敏原IgE的单域结合蛋白及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Phe Val Ala Ser Ile Thr Trp Thr Gly Thr Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Ala Gly Thr Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Val Asp Arg Arg Ser Ser Thr Tyr Tyr Leu Met Arg Gly

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Arg Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Leu

115 120 125

Glu His His His His His His

130 135

<210> 2

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Arg

20 25 30

Tyr Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu

35 40 45

Leu Val Ala Thr Ile Thr Ser Thr Gly Ser Thr Asn Phe Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Tyr Arg Asp Gly Ala Lys Thr Thr Val

65 70 75 80

Asp Leu Arg Leu Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe

85 90 95

Cys Asn Ala Asp Val Arg Glu Tyr Asp Leu Gly Pro Trp Arg Gln Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Glu His His

115 120 125

His His His His

130

<210> 3

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Leu Val Ala Thr Ile Thr Trp Ser Gly Ser Thr Asn Phe Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Tyr Arg Asp Gly Ala Lys Arg Thr Val

65 70 75 80

Asp Leu Arg Leu Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Ala Asp Val Arg Glu Tyr Asp Leu Gly Pro Trp Arg Gln Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Glu His His

115 120 125

His His His His

130

<210> 4

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Gly

20 25 30

Ser Tyr Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu

35 40 45

Trp Val Ser Ser Ile Asp Thr Gly Gly Asp Ser Thr His Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Met

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Trp Cys Ala Val Asp Glu Asp Tyr Ala Leu Gly Pro Trp Glu Tyr Asp

100 105 110

Tyr Tyr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Lys Lys Leu Glu

115 120 125

His His His His His His

130

<210> 5

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Gly Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Arg Thr Ile Gly

20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Phe Val Ala Ser Ile Ser Ser Leu Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Asn Asp Lys Val Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Phe Cys Ala Ala Asp Tyr Arg Tyr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Thr Arg Ser

100 105 110

Gly Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Lys Leu Glu His His His His His His

130 135

<210> 6

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Val Thr Phe Ser

20 25 30

Arg Tyr Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu

35 40 45

Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ile Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Tyr Thr Gly Pro Asn

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Lys

115 120 125

Leu Glu His His His His His His

130 135

Claims (5)

1.用于检测特异性过敏原IgE的单域结合蛋白，其特征在于，所述单域结合蛋白选自E01A1、E02A1、E02A2、E03B1、E04A1或E05A2，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-6所示，或SEQ ID NO:1-6所示序列C端去掉6个His标签形成的序列。

2.含有权利要求1所述单域结合蛋白或其组合的用于检测特异性过敏原IgE的检测试剂、试剂盒或芯片。

3.根据权利要求2所述的检测试剂、试剂盒或芯片，其特征在于，所述单域结合蛋白是经过酵素或荧光物质标记的单域结合蛋白。

4.权利要求1所述单域结合蛋白单独或组合使用的以下任一种应用：

1)特异性过敏原IgE的蛋白质芯片检测中的应用；

2)制备特异性过敏原IgE检测试剂中的应用；

3)特异性过敏原IgE ELISA免疫分析检测中的应用；

4)制备特异性过敏原IgE的胶体金检测试纸条中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白质芯片检测是指基于蛋白质芯片的微量免疫检测。