CN108398406B

CN108398406B - 一种检测尿嘧啶糖基化酶（udg）的生物传感器及其应用

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Publication number: CN108398406B
Application number: CN201810029772.6A
Authority: CN
Inventors: 王玉; 张雪; 刘素; 黄加栋
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2038-01-12
Also published as: CN108398406A

Abstract

本发明提供了一种检测尿嘧啶糖基化酶的生物传感器，包括UDG模板、S‑HAP1杂交链，HAP2‑AgNCs和ExoIII酶，可采用荧光检测测定尿嘧啶糖基化酶的活性，荧光检测的激发波长为560nm，发射波长为625nm，检测波段为575‑750nm。本发明的生物传感器特异性好、灵敏度高，反应条件温和、反应速度快；采用银簇荧光检测，操作简便、检测周期短、易携带；工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求；制备方法简单，性能稳定，重复性好，适用于医疗卫生领域对UDG的检测。

Description

一种检测尿嘧啶糖基化酶（UDG）的生物传感器及其应用

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种基于ExoIII辅助的循环放大及银簇荧光强度变化检测尿嘧啶糖基化酶的生物传感器。

背景技术

UDG（尿嘧啶糖基化酶）是各种哺乳动物发生碱基错配时首要的DNA切除修复酶，负责尿嘧啶的移除。它主要是通过切断DNA中错误插入的尿嘧啶(U)与糖基之间的N糖苷键，移去U，产生无碱基位点(AP site)，然后由AP内切核酸酶(AP endonucleases1, APE1)切断DNA单链，最后再由DNA聚合酶和DNA连接酶识别并修复该断裂位点，从而完成对错配DNA的修复。

目前报道的UDG的检测方法包括放射免疫分析法、化学免疫发光分析、化学发光酶免疫分析技术、电化学发光免疫分析技术等，这些方法往往存在仪器昂贵、操作复杂、价格昂贵、灵敏度低、对人体有放射性等问题。因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测尿嘧啶糖基化酶。

发明内容

为了解决以上现有技术中检测尿嘧啶糖基化酶的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高、操作复杂的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于Exo III辅助的循环放大及银簇荧光强度变化检测尿嘧啶糖基化酶的生物传感器。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测尿嘧啶糖基化酶（UDG）的生物传感器，包括UDG模板、S-HAP1杂交双链，HAP2-AgNCs（含发卡探针2的银簇）和ExoIII酶（核酸外切酶III）；

所述UDG模板的序列如SEQ No. 1所示；

所述S链的序列如SEQ No. 4所示；

所述HAP1的序列如SEQ No. 2所示；

所述HAP2的序列如SEQ No. 3所示。

所述S-HAP杂交双链采用以下制备方法获得：将缓冲液、S链溶液、HAP1溶液混合均匀，37℃恒温反应2h。

所述HAP2-AgNCs采用以下制备方法获得：将缓冲液、HAP2的溶液、AgNO₃混合后置于4℃下15-30min；然后加入冷NaHBO₄溶液，4℃静置4h以上，即得。

所述HAP2、AgNO₃与NaHBO₄的摩尔比为1:6:6。

一种利用上述生物传感器检测UDG的方法，包括以下步骤：

（1）将S链和HAP1杂交成S-HAP1杂交双链；

（2）将UDG模板、ExoIII、S-HAP1杂交双链、HAP2-AgNCs在缓冲液中混匀，测定荧光强度，然后加入系列浓度UDG标准溶液或待测液，在37℃下反应2h，检测荧光强度；

（3）根据系列浓度UDG标准溶液的荧光强度做标准曲线，计算回归方程，根据待测物的荧光强度，计算得所含UDG的含量。

所述ExoIII浓度为1-20U/μL，优选为1-10 U/μL；

所述S-HAP1杂交链浓度为0.01-5 μM；

所述UDG模板浓度为50-100 nM。

所述荧光检测条件为：激发波长为560nm，发射波长为625nm，检测波段为575-750nm。

本生物传感器的工作原理如下：

S链与HAP1部分碱基互补配对的，可杂交成双链S-HAP1，UDG模板在目标物UDG和ExoIII存在的条件下在“U”碱基处被切割成2段，产生Trigger序列（5’-GCAAGAGTGACATCATAGAC AAAAA-3’）。此时Trigger的5’端会与事先杂交好的S-HAP1中HAP1的3’端杂交使得HAP1的3’端为平末端，在ExoIII存在的情况下，ExoIII会从3’端切割HAP1链，最终使得S链和Trigger链均从双链体系中释放出来，另外会留下HAP1的5’端部分碱基，该部分中有9个碱基和Trigger链中5’端的9个碱基是相同的，因此该部分相当于是一个次级Trigger，从而实现了Trigger链的循环放大。HAP2的5’端12个碱基为合银簇的序列，3’端包括富含G的序列。当HAP2为发夹结构时，事先将HAP2合成好银簇，由于HAP2的5’端为银簇，5'端银簇和3’端富含G的序列靠近，从而产生强烈的荧光，由于该体系中产生的S链的5’端会与HAP2的3’端结合从而将HAP2打开，S链把HAP2打开后，就会使其荧光强度骤降，同时由于S链和HAP2的互补配对使得HAP2的3’端为平末端，在ExoIII存在的情况下，ExoIII会从发夹2的3’末端富含G的序列开始切割，使得S链重新游离出来，释放到体系中，进行新的和HAP2杂交的反应，实现了信号的放大。通过测定检测加入待测物前后的荧光强度变化，测定所含UDG的含量。

本发明具有以下优点：

本发明的生物传感器特异性好、灵敏度高，反应条件温和、反应速度快；采用银簇荧光检测，操作简便、检测周期短、易携带；工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求；制备方法简单，性能稳定，重复性好，适用于医疗卫生领域对UDG的检测。

附图说明

图1为本生物传感器的工作原理图；

图2为荧光强度比随ExoIII浓度的变化图；

图3为荧光强度随S-HAP1杂交双链浓度的变化；

图4为荧光强度随UDG模板浓度的变化；

图5为荧光强度随UDG浓度的变化；

图6为检测UDG的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 HAP2-AgNCs的制备。

配置PB缓冲溶液（浓度为20mM），PB缓冲溶液是由磷酸氢二钠与磷酸二氢钠组成，分别称取0.7163g的磷酸氢二钠与0.3120g的磷酸二氢钠，各配成100ml溶液，然后取一部分磷酸氢二钠与一部分磷酸二氢钠混合，将其混合溶液的pH值调至6.5然后备用。

配制AgNO₃浓度为2mM，体积为1mL，AgNO₃现用现配，避光存放。

配制NaHBO₄浓度为2mM，体积为1mL，NaHBO₄现用现配，用0℃冰水配制。

取1mL的离心管，加入76μL的PB（20mM），加入15μL HAP2（100μM），加入4.5μL的AgNO₃（2mM），震荡1min，放于4℃冰箱30min；再加入4.5μL NaHBO₄（2mM）于反应体系中，震荡1min，放在4℃冰箱4h以上，获得HAP2-AgNCs溶液。

取30μL制备好的HAP2-AgNCs于离心管中，加入120μL超纯水混匀，用移液枪取150μL溶液于微量比色皿中，使用荧光分析仪对其进行扫描，激发光560nm，测得其发射峰在625nm，说明有溶液中存在HAP2-AgNCs。

实施例2 荧光强度随ExoIII浓度的变化。

将2μL的S链（100μM）和2μL的HAP1（100μM）、2μL的NEBuffer2.1混合均匀，使其在37℃下反应2h，得到S-HAP1杂交双链备用；

将2μL的UDG模板（1μM）、3μL的ExoIII（1U/μL、5U/μL、10U/μL、15U/μL、20U/μL）、4μL的NEBuffer 2.1、2μL的S-HAP1杂交双链（5μM）、8μL HAP2-AgNCs（15μM）以及超纯水（21μL）混匀，测定荧光强度，然后加入1μL的UDG（50U/mL），在37℃下反应2h，检测荧光强度。

结果如图2所示，其中，“-S”代表的是体系中没有游离的S链时的荧光强度，即未加入UDG时的荧光强度；“+S”代表体系中存在游离的S链时的荧光强度，即加入UDG后的荧光强度，柱形图中数字为加入后荧光值/加入前荧光值。由图可知，检测到的荧光信号强度随着ExoIII的浓度在1-20U/μL区间内逐渐降低，当反应体系中时ExoIII的浓度在10U/μL，荧光强度比最小。

实施例3 荧光强度随S-HAP1杂交双链浓度的变化。

将2μL的UDG模板（1μM）、3μL的ExoIII（10U/μL）、4μL的NEBuffer 2.1、2μL的S-HAP1杂交双链（0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM）、8μL HAP2-AgNCs（15μM）以及超纯水（21μL）混匀，测定荧光强度，然后加入1μL的UDG（50U/mL），在37℃下反应2h，检测荧光强度。

结果如图3，检测到的荧光信号强度随着S-HAP1杂交双链的浓度在0.01-5μM 区间内逐渐下降，当反应体系中S-HAP1杂交双链的浓度为5μM时，荧光强度值大。

实施例4 荧光强度随UDG模板浓度的变化。

将2μL的UDG模板（50nM、100nM、500nM、1μM）、3μL的ExoIII（10U/μL）、4μL的NEBuffer 2.1、2μL的S-HAP1杂交双链（5μM）、8μL HAP2-AgNCs（15μM）以及超纯水（21μL）混匀，测定荧光强度，然后加入1μL的UDG（50U/mL），在37℃下反应2h，检测荧光强度。

结果如图4所示，检测到的荧光信号强度随着UDG模板的浓度在50nM-1μM区间内逐渐下降，当反应体系中UDG模板的浓度为1μM，荧光强度值最大。

实施例5 UDG的检测。

将2μL的UDG模板（1μM）、3μL的ExoIII（10U/μL）、4μL的NEBuffer 2.1、2μL的S-HAP1杂交双链（5μM）、8μL HAP2-AgNCs（15μM）以及超纯水（21μL）混匀，测定荧光强度，然后加入1μL的UDG（0.0005U/mL、0.005U/mL、0.05U/mL、0.5U/mL、5U/mL、50U/mL）或待测液，在37℃下反应2h，检测荧光强度。

检测结果如图5所示，荧光信号强度随着UDG浓度在0.0005U/ml- 50U/ml区间内逐渐下降；根据系列浓度UDG标准溶液的荧光强度做标准曲线，如图6所示；计算得回归方程为Y= -161.4logC+436.92，相关系数为0.998。

<110> 济南大学

<120> 一种检测尿嘧啶糖基化酶（UDG）的生物传感器及其应用

<130> 20180112

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UDG T

<400> 1

gtctaugcaa gagtgacatc atagacaaaa a 31

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HAP1

<400> 2

gcaagagtga tataagtctg aatgagcggg tggggtgggg tggggcactc ttgc 54

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HAP2

<400> 3

cccttaatcc ccgctcatat gcgtactgaa tgagcgggtg gggtggggtg ggg 53

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S

<400> 4

ccccacccca ccccacccgc tcattcagac taaaaaa 37

Claims

1.一种检测尿嘧啶糖基化酶的生物传感器，其特征在于，包括UDG模板、S-HAP1杂交双链，HAP2-AgNCs和ExoIII酶；

所述UDG模板的序列如SEQ No. 1所示；

所述S链的序列如SEQ No. 4所示；

所述HAP1的序列如SEQ No. 2所示；

所述HAP2的序列如SEQ No. 3所示。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，S-HAP1杂交双链采用以下制备方法获得：将缓冲液、S链溶液、HAP1溶液混合均匀，37℃恒温反应2h。

3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，HAP2-AgNCs采用以下制备方法获得：将缓冲液、HAP2的溶液、AgNO₃混合后置于4℃下15-30min；然后加入冷NaHBO₄溶液，4℃静置4h以上，即得。

4.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，所述HAP2、AgNO₃与NaHBO₄的摩尔比为1:6:6。

5.一种利用如权利要求1所述的生物传感器检测尿嘧啶糖基化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）合成HAP2-AgNCs；

（2）将S链和HAP1杂交成S-HAP1杂交双链；

（3）将UDG模板、ExoIII、S-HAP1杂交双链、HAP2-AgNCs在缓冲液中混匀，测定荧光强度，然后加入系列浓度尿嘧啶糖基化酶标准溶液或待测液，在37℃下反应2h，检测荧光强度；

（4）根据系列浓度尿嘧啶糖基化酶标准溶液的荧光强度做标准曲线，计算回归方程，根据待测物的荧光强度，计算得所含尿嘧啶糖基化酶的含量。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述ExoIII浓度为1-20U/μL；所述S-HAP1杂交双链浓度为0.01-5 μM；所述UDG模板浓度为50-100 nM。