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CN108379562B - 一种聚合物纳米佐剂及其制备方法和用途 - Google Patents

一种聚合物纳米佐剂及其制备方法和用途 Download PDF

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CN108379562B CN201810216710.6A CN201810216710A CN108379562B CN 108379562 B CN108379562 B CN 108379562B CN 201810216710 A CN201810216710 A CN 201810216710A CN 108379562 B CN108379562 B CN 108379562B
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Abstract

本发明公开了一种聚(乳酸‑羟基乙酸)包裹免疫刺激剂和过氧化氢酶的纳米佐剂，在放疗与免疫治疗中具有明显效果。其中过氧化氢酶可以有效地改善肿瘤乏氧的微环境从而提高放疗的效果，同时免疫刺激剂可以在活体上引导免疫治疗，在免疫检查点阻断剂帮助下，调节性T细胞的活性被抑制，具有能够抑制肿瘤生长及转移的效应。本发明还公开了该纳米佐剂的制备方法及用途。

Description

一种聚合物纳米佐剂及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种聚合物纳米佐剂及其制备方法，以及其在肿瘤放疗治疗中作为佐剂与免疫检查点阻断剂联用的用途。
背景技术
癌症是威胁人类健康的重大恶性疾病之一。虽然从上世纪50年代起，数十年中大量的人力、物力、财力被投入到癌症的预防和治疗中，但在这方面人类所取得的进展十分有限。
放射治疗作为临床主流的癌症治疗策略之一，主要指的是用X射线，伽马射线等电离辐射产生活性氧自由基来诱导DNA损伤，从而杀死癌细胞。因此，放射治疗对癌细胞的破坏程度极大地依赖于氧浓度，氧自由基可以稳定DNA的损伤，防止电离辐射后DNA自身的修复，大大提高放疗的效果。然而，实体瘤内通常具有乏氧的肿瘤微环境，从而导致癌症治疗的耐药性和放射治疗的失败，是放射治疗关键的不利因素。因此，改善肿瘤乏氧的微环境是提高放疗疗效的重要因素。放射治疗除了可以有效地治疗原发性实体瘤，还可诱导机体的各种免疫反应，从而有助于消除体内残留的癌细胞。通过激活免疫系统，肿瘤细胞可以进一步被体内的相关免疫细胞杀伤。免疫治疗联合其他疗法在临床上取得了很好的结果。免疫治疗包括细胞因子治疗、免疫检查点封锁法，获得性免疫治疗和嵌合抗原受体修饰T细胞免疫治疗(CAR-T)，对癌症治疗有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚(乳酸-羟基乙酸)纳米佐剂及其制备方法，以及其在肿瘤放疗治疗中作为佐剂与免疫检查点阻断剂联用的用途。
为达到上述的目的，本发明采取的技术方案是包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、过氧化氢酶(CAT)和免疫刺激剂(IMMSTM，immunostimulants)。
进一步的，聚乳酸-羟基乙酸共聚物用来包裹过氧化氢酶(CAT)和免疫刺激剂(IMMSTM)形成纳米颗粒。
进一步的，可选的，所述免疫刺激剂(IMMSTM)为咪唑喹啉或者单磷酰脂质A(MPLA)。
进一步的，作为优选，所述咪唑喹啉为R837或R848。
进一步的，作为优选，所述聚(乳酸-羟基乙酸)与过氧化氢酶和咪唑喹啉的质量比为1∶0.1∶0.035～0.040，更佳为1∶0.1∶0.038。
进一步的，作为优选，所述过氧化氢酶的装载率为～16％。
进一步的，作为优选，所述咪唑喹啉的装载率为～25％。
进一步的，作为优选，所述聚(乳酸-羟基乙酸)(50:50)、过氧化氢酶和咪唑喹啉的分子量分别为7-17kDa、247kDa、313.40Da。
进一步的，作为优选，所述聚(乳酸-羟基乙酸)纳米佐剂的粒径为80～180nm，优选为100nm。
进一步的，作为优选，所述聚(乳酸-羟基乙酸)与过氧化氢酶和单磷酰脂质A(MPLA)的质量比为1∶0.1∶0.002。
进一步的，所述纳米佐剂中还包含免疫检查点阻断剂。
进一步的，作为优选，所述免疫检查点阻断剂为Anti-CTLA4，Anti-PD1或Anti-PDL1。
过氧化氢酶(CAT)可以有效地改善肿瘤乏氧的微环境，从而提高放疗的效果，同时咪唑喹啉或单磷酰脂质A(MPLA)作为免疫刺激剂，同时在免疫检查点阻断剂的帮助下，能够协同的抑制肿瘤的生长及转移。
本发明还公开一种聚(乳酸-羟基乙酸)纳米佐剂的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤一：配制聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)溶液，配制免疫刺激剂(IMMSTM)溶液，二者混合并在冰浴条件下在聚醋酸乙烯脂(PVA)中超声得到第一乳化溶液；
步骤二：配制聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)溶液，将过氧化氢酶(CAT)溶于聚醋酸乙烯酯(PVA)中，二者混合并在冰浴条件下超声得到第二乳化溶液；
步骤三：将第一乳化液逐滴加入到第二乳化溶液中，并进一步在超声条件下加入的聚醋酸乙烯酯(PVA)溶液中，最终得到所述聚合物纳米佐剂。
进一步的，作为优选，步骤一中所述聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)溶于二氯甲烷。
进一步的，作为优选，步骤一中所述免疫刺激剂(IMMSTM)溶于二甲亚砜(DMSO)。
进一步的，作为优选，步骤一中所述免疫刺激剂(IMMSTM)为咪唑喹啉或单磷酰脂质A(MPLA)。
进一步的，作为优选，步骤二中所述聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)溶于二氯甲烷。
进一步的，步骤二中还加入免疫检查点阻断剂。
进一步的，所述免疫检查点阻断剂为Anti-CTLA4，Anti-PD1或Anti-PDL1。
进一步的，作为优选，步骤一至步骤三中的聚醋酸乙烯酯(PVA)溶液的浓度为0.5％-5％，优选为1％。
在一个具体实施方案中，通过放射治疗触发的免疫应答，可以延缓转移性肿瘤的生长。当引入免疫刺激剂后，放射治疗引起的免疫应答可以更好地抑制原发性和转移性肿瘤生长的能力，表明聚(乳酸-羟基乙酸)纳米佐剂PLGA-IMMSTM@Cat在诱导更强的免疫应答方面的重要作用。再联合Anti-CTLA-4治疗下生长受到极大的抑制，表明在活体水平的联合治疗效果显著。
因此，本发明还提供了所述聚(乳酸-羟基乙酸)纳米佐剂，用于制备肿瘤放疗后诱导免疫药剂的用途。
本发明还提供了所述聚(乳酸-羟基乙酸)纳米佐剂，用于肿瘤放疗后诱导免疫中的用途。
本发明将过氧化氢酶(CAT)、免疫刺激剂咪唑喹啉(R837，R848)或单磷酰脂质A(MPLA)包裹到聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)上，得到的PLGA-IMMSTM@Cat纳米颗粒，过氧化氢酶(CAT)可以催化肿瘤微环境中的过氧化氢分解产生氧气，从而提高放疗的效果有效地抑制原发性肿瘤的生成，同时在Anti-CTLA-4帮助下来抑制调节性T细胞的活性。利用过氧化氢酶(CAT)改善肿瘤乏氧提高放疗的治疗效果或使用热疗进行肿瘤治疗加上anti-CTLA-4的免疫检查点抑制作用会诱导显著的协同效应能够抑制肿瘤细胞的生长和转移。因此，本发明的聚(乳酸-羟基乙酸)纳米佐剂能够有效结合放射治疗和免疫治疗并在抑制肿瘤转移方面奠定了良好的临床应用前景。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1.本发明制备的聚(乳酸-羟基乙酸)-免疫刺激剂@过氧化氢酶(PLGA-IMMSTM@Cat)纳米颗粒具有非常好的水溶性和生物相容性，在水和生理条件下都具有很好的分散性，对注射部位无明显的刺激作用。
2.本发明公开的聚(乳酸-羟基乙酸)-免疫刺激剂@过氧化氢酶(PLGA-IMMSTM@Cat)纳米颗粒，可以有效地提高放疗的效果，抑制原发性肿瘤的生长，放疗过程中产生的癌细胞相关抗原可以进一步引发抗肿瘤免疫反应，同时在Anti-CTLA-4帮助下来抑制调节性T细胞的活性。
3.本发明公开的聚(乳酸-羟基乙酸)-免疫刺激剂@过氧化氢酶(PLGA-IMMSTM@Cat)纳米颗粒还是非常好的免疫佐剂，可显著提高机体的细胞免疫和体液免疫水平，在细胞及活体水平能促进树突状细胞(DC)的成熟和抗肿瘤细胞因子的产生，基于PLGA-IMMSTM@Cat的放射治疗加上anti-CTLA-4会诱导显著的协同效应，能有效抑制二次肿瘤的生长。
附图说明
图1是实施例一中PLGA-R837@Cat的透射电镜照片；
图2是实施例一中PLGA-R837@Cat的水合直径分布；
图3是实施例三中PLGA-IMMSTM@Cat产氧能力；
图4是实施例五中不同处理组小鼠淋巴结中DC细胞的刺激；
图5是实施例四中不同处理组小鼠体内抗体滴度；
图6是实施例四中不同处理组小鼠第一个肿瘤的生长曲线；
图7是实施例四中不同处理组小鼠第二个肿瘤的生长曲线。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：制备聚(乳酸-羟基乙酸)-咪唑喹啉@过氧化氢酶(PLGA-R837@Cat)纳米佐剂：
将过氧化氢酶(CAT)和免疫刺激剂咪唑喹啉(R837)通过水/油/水(W/O/W)的方法包裹到嵌段高分子聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)中，形成纳米粒子。具体包括以下步骤：
将聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)溶于二氯甲烷等易挥发有机溶剂中，将过氧化氢酶(CAT)溶于1％的聚醋酸乙烯酯(PVA)等表面活性剂中，二者混合并在冰浴条件下超声得到第一乳化溶液；然后将溶于二甲亚砜(DMSO)的咪唑喹啉(R837)溶液逐滴加入到第一乳化溶液中；并进一步在超声条件下加入1％的聚醋酸乙烯酯(PVA)溶液中，最终得到水/油/水的聚(乳酸-羟基乙酸)纳米佐剂(PLGA-R837@Cat)。然后，对其进行表征(透射、动态光散射)。
附图1是PLGA-R837@Cat的透射电镜照片，从图上可以看到PLGA-R837@Cat的粒径大约为100nm，说明成功包裹了Cat和R837并形成稳定的纳米粒子。图2是上述PLGA-R837@Cat纳米粒子的激光动态粒径分布，如图2所示，PLGA-R837@Cat的水化粒径约为100nm左右，进一步证明了PLGA，Cat，R837成功形成了纳米粒子。
实施例二：制备聚(乳酸-羟基乙酸)-单磷酰脂质A@过氧化氢酶(PLGA-A(MPLA)@Cat)纳米佐剂：
将过氧化氢酶(CAT)和免疫刺激剂单磷酰脂质A(A(MPLA))通过W/O/W的方法包裹到嵌段高分子聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)中，形成纳米粒子。具体包括以下步骤：
将聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)溶于二氯甲烷等易挥发有机溶剂中，将过氧化氢酶(CAT)溶于1％的聚醋酸乙烯酯(PVA)等表面活性剂中，二者混合并在冰浴条件下超声得到第一乳化溶液；然后将溶于二甲亚砜(DMSO)的单磷酰脂质A(A(MPLA))溶液逐滴加入到第一乳化溶液中；并进一步在超声条件下加入5％的聚醋酸乙烯酯(PVA)溶液中，最终得到水/油/水的聚(乳酸-羟基乙酸)纳米佐剂(PLGA-R848@Cat)。然后，对其进行表征(透射、动态光散射)。
实施例三：聚(乳酸-羟基乙酸)-免疫刺激剂@过氧化氢酶产氧能力的测定
将聚(乳酸-羟基乙酸)-免疫刺激剂@过氧化氢酶(PCR)和聚(乳酸-羟基乙酸)-免疫刺激剂(PC)溶解在100微摩的过氧化氢溶液中，利用氧电极检测产生的氧气。
附图3是PCR在过氧化氢溶液中产生氧气的能力，可以看到加入PCR的过氧化氢溶液中可以产生大量的氧气。这里说明过氧化氢酶仍具有活性。相比之下，无过氧化氢酶的PC并不能催化过氧化氢分解，过氧化氢溶液本身相对比较稳定，不易分解。
实施例四：Cat与R837装载率的确定
为了研究Cat的装载，我们采用双蛋白酸(BCA)蛋白测定试剂盒测量Cat的装载效率～16％(Cat是一种蛋白质，所以测量蛋白质含量推测Cat的装载率)。为了研究R837的装载，我们采用高效液相色谱(HPLC)测量了装载在PLGA-R837@Cat上的R837的量。将合成的PLGA-R837@Cat分别溶在色谱纯的乙腈中，在室温下静置培养12h，14800rpm离心10分钟除去沉淀，经过滤针头后待测。R837的量由装载着紫外检测器的高效液相色谱检测(325nm)为～25％，乙腈和水的混合物以体积比1:1作为流动相。
实施例五：基于聚(乳酸-羟基乙酸)-咪唑喹啉@过氧化氢酶(PLGA-R837@Cat)纳米佐剂的放疗对小鼠机体免疫反应的影响(效果验证)
将24只带有肿瘤的雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)随机分为8组，每组3只，分为A：空白对照组、B:PLGA@Cat对照组、C：PLGA-R837对照组、D:PLGA-R837@Cat对照组、E：X射线对照组、F：PLGA-R837@Cat+X射线对照组、G:PLGA-R837+X射线对照组、H:PLGA-R837@Cat+X射线试验组。
每只小鼠瘤内注射不同的纳米粒子4小时后辐照X射线(8Gy)；72小时后同样每组处死3只小鼠并取其淋巴结，检测淋巴结处的DC的成熟，确定材料对小鼠机体细胞免疫水平的影响；每组另外3只小鼠，不同时间点通过眼球取血并分离小鼠血清，利用ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)方法检测材料对抗体滴度的影响；
(1)小鼠淋巴结细胞的制备(验证实验的制备方法可以不公开出来，对发明本身的创造性没有影响)
图4和图5分别为细胞免疫和体液免疫的检测结果。由图4可见，PLGA@Cat本身不能刺激小鼠巴结处DC(树突状细胞)成熟；PLGA-R837@Cat处理的小鼠，淋巴结处DC有一定的成熟，PLGA-R837@Cat+X射线处理的小鼠淋巴结处DC成熟更明显，说明放射治疗的过程中会进一步引发抗肿瘤免疫反应。由图5(a)-图5(c)可见，PLGA-R837@Cat+X射线处理的小鼠的免疫相关细胞因子如TNF-α，IFN-γ，IL-12P40明显上调，说明对原位肿瘤进行放射治疗，促进机体的细胞免疫和体液免疫水平。
实施例六：基于PLGA-R837@Cat放疗诱导抗肿瘤免疫在抑制肿瘤转移中的应用
首先，每个BALB/c小鼠左边通过皮下注射接种第一个结肠癌肿瘤，作为原发性肿瘤。一个星期后,将第二个肿瘤接种在小鼠右侧来模拟转移性肿瘤。4天后，当第一个肿瘤达到～250mm3,将不同的纳米粒子进行瘤内注射并照射X射线，为了进一步提高治疗效果，我们选取临床批准的抗体Anti-CTLA-4，能够抑制调节性T细胞和增强效应T细胞活性。在消除原发肿瘤后1天、4天、7天后，通过尾静脉向小鼠体内注射anti-CTLA4抗体。
图6和图7分别为第一个肿瘤和第二个肿瘤的生长曲线。可以看到，对于原发性肿瘤，单独照射X射线对这种大肿瘤(约250mm3)的生长没有显著的抑制作用，而基于PLGA@Cat(图中简写为PC)的放射治疗可以更有效地抑制原发性肿瘤。因此，利用过氧化氢酶改善肿瘤乏氧可以有效地提高放疗的效果。基于放射治疗触发的免疫应答，可以延缓转移性肿瘤的生长。当引入免疫刺激剂R837后，放射治疗引起的免疫应答可以更好地抑制原发性和转移性肿瘤生长的能力，表明免疫佐剂R837在诱导更强的免疫应答方面的重要作用。当与CTLA-4封锁剂相结合时，PLGA-R837@Cat(图中简写为PCR)放射治疗显示进一步改善原发性肿瘤的治疗效果。最明显的是，组合治疗后右侧的肿瘤(转移瘤)完全消失。这些结果一起表明，基于PLGA-R837@Cat的放射治疗与CTLA-4阻断联合将诱导强大的抗肿瘤免疫应答来抑制肿瘤的生长和转移。
实施例七：制备聚(乳酸-羟基乙酸)-咪唑喹啉-免疫检查点阻断剂@过氧化氢酶(PLGA-R837-Anti-CTLA-4@Cat)纳米佐剂
具体包括以下步骤：
将聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)溶于二氯甲烷等易挥发有机溶剂中；将过氧化氢酶(CAT)和Anti-CTLA-4溶于1％的聚醋酸乙烯酯(PVA)等表面活性剂中，二者混合并在冰浴条件下超声得到第一乳化溶液；然后将溶于二甲亚砜(DMSO)的咪唑喹啉(R848)溶液逐滴加入到第一乳化溶液中；并进一步在超声条件下加入1％的聚醋酸乙烯酯(PVA)溶液中，最终得到水/油/水的聚(乳酸-羟基乙酸)纳米佐剂(PLGA-R837-Anti-CTLA-4@Cat)。
本发明公开了聚(乳酸-羟基乙酸)-免疫刺激剂@过氧化氢酶复合佐剂的制备及其在放疗中与免疫检查点封锁的联合治疗中的应用，本发明的总体思路为首先是利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物用来包裹过氧化氢酶(Cat)和免疫刺激剂咪唑喹啉(R837，R848)或单磷酰脂质A(MPLA)合成了稳定的、生物相容性好的纳米粒子，是非常好的免疫佐剂，可提高机体的细胞免疫和体液免疫水平。可以有效地提高放疗的效果，抑制原发性肿瘤的生长，触发抗肿瘤免疫反应，同时在Anti-CTLA-4，Anti-PD1或Anti-PDL1帮助下来抑制调节性T细胞的活性。因此，PLGA-IMMSTM@Cat的作为纳米佐剂用于肿瘤放疗，加上anti-CTLA-4后诱导免疫，产生显著的协同效应，能有效抑制肿瘤细胞的生长和转移。

Claims (7)

1.一种聚合物纳米佐剂，其特征在于：包括聚合物纳米载体、过氧化氢酶和R837，其中聚合物纳米载体为聚(乳酸/羟基乙酸)，聚合物纳米载体包裹过氧化氢酶和R837，形成水/油/水结构的聚(乳酸-羟基乙酸)纳米佐剂，所述纳米佐剂用于肿瘤的放疗诱导免疫。
2.根据权利要求1所述的聚合物纳米佐剂，其特征在于所述聚(乳酸-羟基乙酸)：过氧化氢酶：R837的质量比为1∶0.1∶（0.035~0.040）。
3.根据权利要求1所述的聚合物纳米佐剂，其特征在于所述聚(乳酸-羟基乙酸)：过氧化氢酶：R837的质量比为1∶0.1∶0.038。
4.根据权利要求1-3任一项所述的聚合物纳米佐剂，其特征在于所述纳米佐剂的粒径为80～180纳米。
5.根据权利要求1所述的聚合物纳米佐剂，其特征在于所述纳米佐剂中还包含anti-CTLA4。
6.一种权利要求1所述聚合物纳米佐剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：配制聚(乳酸-羟基乙酸)溶液，将过氧化氢酶溶于1%的聚醋酸乙烯酯得到过氧化氢酶溶液，二者混合并在冰浴条件下超声得到第一乳化溶液；
步骤二：将R837溶于二甲基亚砜中；
步骤三：将步骤二中得到的溶液逐滴加入到第一乳化溶液中，并进一步在超声条件下加入1%的聚醋酸乙烯酯溶液，最终得到水/油/水结构的聚(乳酸-羟基乙酸)纳米佐剂，所述纳米佐剂用于肿瘤的放疗诱导免疫。
7.权利要求1至5任一项所述的聚合物纳米佐剂, 用于制备肿瘤放疗诱导免疫制剂的用途。
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