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CN108251377B - 利用携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF制备饲养层细胞的方法 - Google Patents

利用携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF制备饲养层细胞的方法 Download PDF

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CN108251377B CN201810041514.XA CN201810041514A CN108251377B CN 108251377 B CN108251377 B CN 108251377B CN 201810041514 A CN201810041514 A CN 201810041514A CN 108251377 B CN108251377 B CN 108251377B
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Abstract

本发明公开了一种利用转染了R6的MEF制备新型饲养层细胞的方法，首先利用结合于Xist第一内含子区的基于类转录激活效应物样Tale的抑制性转录因子R6转染MEF获得永生型MEF细胞系R6‑MEF，经过对多种R6‑MEF细胞系筛选后，选择多能性基因表达较高的R6‑MEF细胞系，经丝裂霉素处理后获得新型饲养层细胞R6‑feeder，获得的饲养层细胞能够很好的维持胚胎干细胞ESC和诱导性多能干细胞的多能性iPSC。该方法不仅为干细胞的培养和研究提供了新的选择，而且为研究如何获得并提高人、猪和牛等其它哺乳动物iPSCs提供了新的技术和理论基础。

Description

利用携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF制备饲养层 细胞的方法
技术领域
本发明属于适用于多能干细胞培养的新型饲养层细胞的制备方法，特别涉及一种利用携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF制备饲养层细胞的方法。
背景技术
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)是指从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞中，经体外分化抑制培养筛选出的一种多潜能细胞。它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，无论在体内或者体外环境，均能被诱导分化为机体所有类型成体细胞。诱导多能干细胞(induced pluripotent stemcell,iPSC)是通过导入特定的转录因子使成体细胞直接重编程为胚胎干细胞(ESC)样的多能性干细胞。iPSC同样具有自我更新和分化的全能性，其功能与胚胎干细胞类似，无需制造胚胎，从任何组织的细胞都可以制造出具有干细胞功能的细胞,避免了转基因面临的伦理问题，更重要的是简化了制备转基因动物的过程。源自患者的诱导多能干细胞，进一步用于自体移植可避免免疫排斥问题。iPSC产生机理与相关技术的深入研究，将会给治疗人类疑难疾病、组织修复与再生以及生物制药等诸多生物医学领域带来新的发展机遇。而胚胎干细胞和诱导性多能干细胞在体外培养时容易出现分化，所以胚胎干细胞培养的关键是找到适合的培养条件，保持其未分化状态，而饲养层是维持胚胎干细胞未分化状态的一个关键因素，因此寻找一种新的适合干细胞生长的饲养层具有重要意义。
在目前的多能细胞培养体系中，无论是胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)，还是原始生殖细胞(PGC)，均须与饲养层细胞共培养。这是因为饲养层细胞能够合成分泌多种因子，如成纤维细胞因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)及白血病抑制因子(LIF)等，在多能干细胞分离、培养过程中起促进增殖、抑制分化及维持多能性等重要作用。因此，探讨及优化饲养层细胞对完善多能性干细胞的培养体系具有重要意义。
饲养层是经有丝分裂阻断剂处理后的细胞单层，处理后的细胞失去增殖能力，但仍然具有产生多种生物活性物质能力，从而影响其它细胞的增殖和分化。饲养层细胞通常由小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryo Fibroblast,MEF)构成，多用于ESC和iPSC的体外培养和建系。据报道从MEF的条件培养液中可以分离到的蛋白多达136种因子，其中的白血病抑制因子(LIF)可使ESCC在未分化状态下长期培养，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和干细胞生长因子(SCF)对ESCC的生长起促进作用。目前，饲养层细胞通过γ照射或MMC有丝分裂灭活。γ射线可以同时处理比MMC更多的细胞，但钴-60的γ射线辐射源是稀有而昂贵的。MMC的可购性、灵活性和便利性使其成为制备饲养层细胞的良好常规方案。
较为常用的饲养层细胞有两类：有限系的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和无限系的STO细胞(SIM mouse embryoderived thioguanine and ouabain rESCistant，STO)。STO细胞系由加拿大多伦多安大略癌症研究所的A.Bernstein从SIM(Sandos Inbred Mice)小鼠胚胎成纤维细胞的连续谱获得。选择6-硫鸟嘌呤和乌本苷抗性的群体，对HAT培养液敏感并且是HPRT阴性的。STO细胞能在体外长期培养，使用方便，应用较广泛，但STO细胞在体外若经长期连续传代，常会产生胞质空泡、致密体生成等异常现象，导致细胞功能发生改变，影响饲养层质量。SNL即稳定转染了neo和LIF的STO细胞系，建系后稳定表达LIF，可以当作饲养层细胞培养ESC。
目前，本实验室利用结合于Xist第一内含子的Tale抑制性转录因子建立了无限增殖的MEF细胞系(以下称为R6-MEF)(见CN106754729A)，而且该细胞系的多能性基因有不同程度的上调。因此，从这些R6-MEF中筛选干性基因高表达的细胞系，并制备成新型饲养层细胞，不仅为培养ESC和iPSCs提供了更广的选择，而且为研究如何获得并提高人、猪和牛等其它哺乳动物的多能干细胞提供了新的技术和理论基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF细胞系制备饲养层细胞R6-feeder的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用转染XistTale抑制性转录因子R6的MEF制备饲养层细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)细胞制备
获取胎鼠的成纤维细胞Oct4-GFP MEFs；获取R6-MEF细胞系；
2)获得新型饲养层细胞R6-feeder
从获得的R6-MEF细胞系中挑选多能性基因表达较高的细胞系并增至150mm培养皿，待细胞汇合度达到80％时添加丝裂霉素C，最后收集细胞计数并冻存。
所述丝裂霉素C的最佳处理浓度为5μg/mL，丝裂霉素C处理时间为2.5h。
所述获取胎鼠的成纤维细胞Oct4-GFP MEFs，包括以下步骤：将孕鼠体外获得的胎鼠洗净后除去头部、四肢和尾部，洗净剪碎后用0.25％的Trypsin-EDTA消化液37℃水浴中消化20min，吹打混匀后加入M10培养液终止消化，1000rpm离心10min，弃掉上清，M10培养液重悬后转移至T25培养瓶中于37℃、5％CO2培养箱中培养，达到80％汇合度后，进行1：3-1：5传代或原代冻存备用。
所述获取R6-MEF细胞系，包括以下步骤：
A、Oct4-GFP MEFs的脂质体转染：将Oct4-GFP MEFs使用M10培养液培养于6孔板中，待其达到40％汇合度时进行转染，转染12-18h；
B、脂质体转染后R6-MEFs的诱导及建系：脂质体转染后第二天将M15培养液更换为M15+Dox培养液培养继续培养；脂质体转染后第三天更换新的M15+Dox+puro培养液，筛选具有转基因的细胞；脂质体转染后第六天更换为M15+Dox培养液培养，直至汇合度达到80％时进行传代培养，观察并及时更换M15+Dox培养液；当有生长速度较快并且形成明显克隆的细胞时，将其单克隆传入6孔板进行建系，建系成功后按比例1：40传代和冻存。
所述获得新型饲养层细胞R6-feeder，包括以下步骤：
A、解冻R6-MEF：将冻存在液氮罐中的R6-MEF取出快速解冻接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
B、R6-MEF的扩增：待细胞的汇合度达到80-90％后，按1:50的比例扩至150mm培养皿；
C、丝裂霉素C处理并收集冻存：待细胞汇合度达到80％时，添加丝裂霉素C,丝裂霉素C浓度为5μg/mL，处理时间为2.5h；丝裂霉素C处理完成后收集细胞计数并将细胞冻存。
所述的利用转染Xist Tale抑制性转录因子R6的MEF制备饲养层细胞的方法，还包括对R6-feeder和STO-feeder培养的iPSCs进行多能性鉴定，包括以下步骤：
A、iPSCs总RNA提取：收集传代5次后的iPSCs进行总RNA提取，利用RNA提取试剂盒完成iPSCs的总RNA提取；
B、iPSCs cDNA的制备：使用反转录试剂盒制备iPSCs的cDNA；
C、进行qPCR：使用qPCR试剂盒进行qPCR，反应完成后保存数据并进行分析。
所述R6-MEF细胞系制备中，R6具体的结合位点如下：
TTAAGTGTTATGGACAAGGA SEQ ID NO.1，GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7。
本发明的有益效果是：该方法制备的新型R6-feeder与传统的STO-feeder相比更有利于小鼠ESC和iPSCs的贴壁生长，R6-feeder上小鼠ESC和iPSCs的克隆形态较好，生长速率较快，多能性基因表达水平更高。
新型R6-feeder的制备不仅为小鼠干细胞的培养和研究提供了新的思路，也为研究如何获得并优化人、猪和牛等其它哺乳动物多能性干细胞的建系和培养提供了新的技术和理论基础。
附图说明
图1是本发明具体技术流程图；
图2是本发明中所使用的R6-MEF，A、B比例尺均为500μm；
图3是对不同R6-MEF细胞系进行多能性基因表达检测结果图；
图4是本发明中制备R6-feeder时不同浓度，的丝裂霉素处理结果对比图，A：0μg/mL、B：5μg/mL、C：10μg/mL和D：15μg/mL，比例尺为500μm；
图5是利用本发明中制备的R6-feeder培养小鼠ESC和iPSCs效果图，比例尺为200μm；
图6是对R6-feeder和STO-feeder上培养的iPSCs进行多能性基因检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明是一种利用携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF细胞系制备饲养层细胞R6-feeder的方法，包括以下步骤：
1.细胞制备：
(1)胎鼠的成纤维细胞Oct4-GFP MEFs的制备：
取性成熟的C57BL/6J母鼠与携带Oct4-GFP的MF1，129/sv公鼠按1(♂):2(♀)比例合笼，将见栓13.5d的孕鼠剖腹获取胎鼠，即将上述孕鼠体外获得的胎鼠洗净后除去头部、四肢和尾部，洗净剪碎后用0.25％的Trypsin-EDTA消化液(25200056，Gibco)于37℃水浴中消化20min，期间混匀几次；继续加入0.25％的Trypsin-EDTA消化液(25200056，Gibco)，于37℃水浴中消化20min；吹打混匀后加入M10培养液终止消化，1000rpm离心10min，弃掉上清，加适量M10培养液，反复吹打约10次，置于T25培养瓶中于37℃、5％CO2培养箱中培养，达到80％汇合度后，进行1：3-1：5传代和培养，其它细胞进行原代冻存备用；
(2)R6-MEF细胞系的制备：
A、Oct4-GFP MEFs的脂质体转染：
将携带Oct4-GFP MEFs使用M10培养液培养于6孔板中，待Oct4-GFP MEFs达到40％-60％汇合度时进行转染，转染前30min更换为新鲜的M15培养液2mL，放入培养箱中平衡30min，将提前配制好并混匀的500μL转染液加入M15培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，进行脂质体转染12-18h；
B、脂质体转染后R6-MEFs的诱导及建系：
脂质体转染后第二天将M15培养液更换为M15+Dox培养液培养，放入37℃，5％CO2培养箱中培养；脂质体转染后第三天荧光显微镜检测转染效率：转染成功的细胞表达红色荧光蛋白，更换新的M15+Dox+puro培养液，筛选具有转基因的细胞，培养细胞三天后绝大多数非转基因细胞凋亡；第六天更换为M15+Dox培养液培养，直至汇合度达到80％时，按照1：40进行传代培养；观察并及时更换M15+Dox培养液；细胞生长速度较快并且形成明显克隆的细胞，将其单克隆传入6孔板进行建系，建系成功后按比例1：40传代和冻存；
2.R6-MEF细胞系的筛选：
R6-MEF细胞生长形态与MEF相似(见图2)，生长速度明显高于野生型MEF,对R6-MEF细胞系进行1:50传代，3-5天传代一次，可传代至50代以上，所以R6-MEF细胞系是一种无限MEF细胞系；
(1)选择生长状态良好的R6-MEF细胞系，编号分别为9-1#、9-2#、10-1#和10-2#，利用RNA提取试剂盒(Cat.No.74104，QIAGEN)完成R6-MEF的总RNA提取；
(2)将收集到的RNA混匀后进行浓度与纯度的测定；
(3)利用提取的R6-MEF RNA制备cDNA：
提前制冰，将反转录试剂盒(A5001，promega)中的试剂在冰上融化；反转录反应体系为20μL，分为5μL和15μL两部分，5μL体系包括5μg的RNA，1μL的引物，然后用无核酸的水配制成5μL体系；70℃加热5min，然后迅速冰浴至少5min，微型离心机中离心10s，冰上放置直至15μL体系加入；15μL体系包括GoScriptTM5×缓冲液4.0μL，MgCl2最终浓度1.5-5.0mM2.5μL，dNTP1.0μL，核糖核苷酸酶抑制剂0.5μL，GoScriptTM反转录酶1.0μL，无核酸水6μL；将5μL体系与15μL体系混匀，于25℃孵育5min后，42℃孵育1h；
(4)制备的cDNA用于qPCR：将qPCR(Real-time Quantitative Polymerase ChainReaction，q-PCR)试剂盒(KK4601，KAPA)中的试剂于冰上融化，样品使用前混匀后离心富集；将样品加入到96孔板中并记录加样信息，封好透明膜后离心，离心完成后将电脑连接qPCR仪(Thermo，TCR0096)，更改电脑IP地址，打开软件PikoReal software，选择程序设定参数，qPCR反应完成后保存数据并进行分析；q-PCR结果显示，相对于野生型的MEF，R6-MEF的多能性基因Oct4、Nanog和Stella表达上调，而10-1#和10-2#细胞系的多能性基因表达相对更高；根据多能性基因的表达情况，最终选择10-1#和10-2#R6-MEF细胞系制备R6-feeder；
3.利用R6-MEF制备新型饲养层细胞R6-feeder：
解冻10-1#和10-2#R6-MEF：提前调节水温至38℃，将冻存在液氮罐中的10-1#和10-2#R6-MEF取出并移至温水中，迅速晃动冻存管使其快速解冻；解冻后，将细胞移至15mL离心管中，并加入3倍体积的M10细胞培养液混匀，1300rpm/min离心3min，弃上清，加入M15+Dox重悬细胞并接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
待细胞的汇合度达到80-90％后，弃培养液，DPBS(14190-144，Gibco)洗一遍，0.25％Trypsin 37℃消化5min后吹悬，加入等体积M10培养液终止消化，1300rpm/min离心3min，弃上清，加M10培养液重悬，按1:50的比例扩至150mm培养皿；待细胞汇合度达到80％时，添加丝裂霉素C(MMC),MMC处理浓度梯度为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和15μg/mL，最终选择较优的MMC浓度为5μg/mL(见图4)，处理时间为2.5h；MMC处理完成后收集细胞计数并将细胞冻存，按4.2×106/每管的细胞数量冻存；解冻R6-feeder并接种于培养平板测试细胞增殖是否被成功阻断；
4.利用R6-feeder培养小鼠ESC和iPSC
解冻R6-feeder和STO-feeder，实验组为R6-feeder，对照组为STO-feeder；将解冻的R6-feeder和STO-feeder接入12孔板，培养液为M15+Dox，次日解冻小鼠ESC和iPSC，接入铺有R6-feeder和STO-feeder的12孔板，培养液更换为M15，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；3-4天后按照1:10传代；传代5次后收集iPSC细胞并进行q-PCR以检测其多能性基因表达水平；实验结果显示：利用R6-feeder培养的小鼠ESC和iPSC的生长状态、生长速率和多能性基因表达水平均优于对照组STO-feeder(见图5和图6)；
5、对R6-feeder和STO-feeder培养的iPSCs进行多能性鉴定
利用qPCR对iPSCs进行多能性基因表达的检测：
(1)iPSCs总RNA提取：收集传代5次后的iPSCs进行总RNA提取，利用RNA提取试剂盒(Cat.No.74104，QIAGEN)完成iPSCs的总RNA提取，将收集到的RNA进行浓度与纯度的测定；
(2)iPSCs cDNA的制备：提前制冰，将反转录试剂盒(A5001，promega)中的试剂在冰上融化，反转录反应体系为20μL，分为5μL和15μL两部分，5μL体系包括5μg的RNA，1μL的引物，然后用无核酸的水配制成5μL体系，70℃加热5min，然后迅速冰浴，至少5min，微型离心机中离心10s，冰上放置直至15μL体系加入；15μL体系包括GoScriptTM5×缓冲液4.0μL，最终浓度1.5-5.0mM的MgCl22.5μL，dNTP 1.0μL，核糖核苷酸酶抑制剂0.5μL，GoScriptTM反转录酶1.0μL，无核酸水6μL，将5μL体系与15μL体系混匀，于25℃孵育5min后，42℃孵育1h；
(3)进行qPCR：将qPCR试剂盒(KK4601，KAPA)中的试剂于冰上融化，样品使用前混匀后离心富集，qPCR的反应体系为20μL(15μL Mix I+5μL MixII)，设置反应条件，将样品加入到96孔板中并记录加样信息，封好透明膜后离心，离心完成后将电脑连接qPCR仪(Thermo，TCR0096)，更改电脑IP地址，打开软件PikoReal software，选择程序设定参数，qPCR反应完成后保存数据并进行分析。
所述步骤1中携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF细胞系制备中，R6具体的结合位点如下：TTAAGTGTTATGGACAAGGA SEQ ID NO.1，GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7。
本发明中使用了2种培养液，具体配制方法如下：
1、小鼠胎儿成纤维细胞用液体培养液(M10)的配制：
含有10％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素的KnockoutDMEM。
2、ESC和iPSCs培养用液体培养液(M15)的配制：
含有15％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素、0.1mMβ-巯基乙醇和106U/mL LIF的Knockout DMEM。
所述M15+Dox培养液为添加2μg/mL Doxcycline的M15培养液；
所述M15+Dox+puro培养液为添加2μg/mL Doxcycline和2μg/mLpuromycin的M15培养液
实施例1：Oct4-GFP MEFs的制备
取性成熟的C57BL/6J母鼠与携带Oct4-GFP的MF1，129/sv公鼠按1(♂):2(♀)比例合笼，将见栓13.5d的孕鼠剖腹获取胎鼠，洗净后除去头部、四肢和尾部，洗净剪碎后用0.25％的Trypsin-EDTA消化液(25200056，Gibco)于37℃水浴中消化20min，期间混匀几次；继续加入0.25％的Trypsin-EDT A消化液(25200056，Gibco)，于37℃水浴中消化20min；吹打混匀后加入M10培养液终止消化，1000rpm离心10min，弃掉上清，加适量M10培养液，反复吹打约10次，置于T25培养瓶中于37℃、5％CO2培养箱中培养，达到80％汇合度后，进行1：3-1：5传代和培养，其它细胞进行原代冻存备用。
实施例2：R6-MEF细胞系的制备
A、Oct4-GFP MEFs的脂质体转染：
将携带Oct4-GFP MEFs使用M10培养液培养于6孔板中，待Oct4-GFP MEFs达到40％-60％汇合度时进行转染，转染前30min更换为新鲜的M15培养液2mL，放入培养箱中平衡30min，将提前配制好并混匀的500μL转染液加入M15培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，进行脂质体转染12-18h；
B、脂质体转染后R6-MEFs的诱导及建系：
脂质体转染后第二天将M15培养液更换为M15+Dox培养液培养，放入37℃，5％ CO2培养箱中培养；脂质体转染后第三天荧光显微镜检测转染效率：转染成功的细胞表达红色荧光蛋白，更换新的M15+Dox+puro培养液，筛选具有转基因的细胞，培养细胞三天后，绝大多数非转基因细胞凋亡；第六天更换为M15+Dox培养液培养，直至汇合度达到80％时，按照1：40进行传代培养；隔天进行细胞生长情况的观察，并在液体发黄时更换M15+Dox培养液；细胞生长速度较快并且形成明显克隆的细胞，将其单克隆传入6孔板进行建系，建系成功后按比例1：40传代和冻存；
实施例3：R6-MEF细胞的筛选：
利用qPCR对R6-MEF进行多能性基因表达的检测
①R6-MEF总RNA提取：利用RNA提取试剂盒(Cat.No.74104，QIAGEN)完成9-1#、9-2#、10-1#和10-2#的R6-MEF细胞系总RNA提取。将收集到的RNA进行浓度与纯度的测定。
②R6-MEF cDNA的制备：提前制冰，将反转录试剂盒(A5001，promega)中的试剂在冰上融化。反转录反应体系为20μL，分为5μL和15μL两部分，5μL体系包括5μg的RNA，1μL的引物，然后用无核酸的水配制成5μL体系。70℃加热5min，然后迅速冰浴，至少5min，微型离心机中离心10s，冰上放置直至15μL体系加入。15μL体系包括GoScriptTM5×缓冲液4.0μL，MgCl2(最终浓度1.5-5.0mM)2.5μL，dNTP 1.0μL，核糖核苷酸酶抑制剂0.5μL，GoScriptTM反转录酶1.0μL，无核酸水6μL。将5μL体系与15μL体系混匀，于25℃孵育5min后，42℃孵育1h。
③qPCR：将qPCR试剂盒(KK4601，KAPA)中的试剂于冰上融化，样品使用前混匀后离心富集。qPCR所用到的引物见表1.1；qPCR的反应体系为20μL(15μL Mix I+5μL Mix II，见表1.2)，反应条件见表1.3。将样品加入到96孔板中并记录加样信息，封好透明膜后离心，离心完成后将电脑连接qPCR仪(Thermo，TCR0096)，更改电脑IP地址，打开软件PikoRealsoftware，选择程序设定参数(参数设置见表1.3)，qPCR反应完成后保存数据并进行分析(见图4)。
表1.1qPCR所需引物信息(SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.19)
Figure BDA0001549635940000101
Figure BDA0001549635940000111
表1.2qPCR反应体系
Mix I：
Component 1× 20×
SYBR(2×) 10μL 200μL
cDNA 1μL 20μL
Nuclear-Free water 4μL 80μL
15μL
Mix II：
Component 1× 9×
Primer F+R(10μM) 0.8μL 7.2μL
Nuclear-Free water 4.2μL 37.8μL
5μL
表1.3qPCR反应条件
Figure BDA0001549635940000112
实施例4：新型饲养层细胞的制备：
解冻10-1#和10-2#R6-MEF：提前调节水温至38℃，将冻存在液氮罐中的10-1#和10-2#R6-MEF取出并移至温水中，迅速晃动冻存管使其快速解冻，解冻后将细胞移至15mL离心管中并加入3倍体积的细胞培养液混匀1300rpm/min离心3min，弃上清，加入M15+Dox重悬细胞并接入6孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
待细胞的汇合度达到80-90％时(见图2)，弃培养液，DPBS洗一遍，0.25％Trypsin于37℃消化5min后吹悬，然后加入等体积培养液终止消化，1300rpm/min离心3min，弃上清，加培养液重悬，按1:50的比例扩至150mm培养皿。待细胞汇合度达到80％时添加丝裂霉素C(MMC),MMC浓度梯度依次为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和15μg/mL，最终选择较优的5μg/mL(见图4)，处理时间为2.5h。弃去培养液，加5mL的DPBS洗涤细胞，重复3次，以完全去除丝裂霉素C。加入3mL 0.25％Trypsin于37℃消化3min，倒置相差显微镜下观察细胞收缩变圆后，手动轻拍培养皿侧壁，细胞层随之从皿底脱下，此时加入等量的M10培养液终止消化；用电动移液器对皿壁和细胞悬液进行吹打混匀，收集细胞悬液至15mL离心管进行细胞计数。1300rpm/min离心3min后弃掉上清，用冻存液(10％FBS+10％DMSO+80％M10培养液)以8.4×106每管的浓度将其冻存，待使用时对其进行解冻，接种密度为7.0×104/cm2。该新型饲养层细胞命名为R6-feeder。解冻R6-feeder接入培养平板测试细胞增殖被阻断情况。
实施例5：利用R6-feeder培养小鼠ESC和iPSCs
1、利用R6-feeder培养小鼠ESC
解冻R6-feeder和STO-feeder(实验组为R6-feeder，对照组为STO-feeder)。将解冻的R6-feeder和STO-feeder接入12孔板，培养液为M15+Dox，次日解冻小鼠ESC，接入铺有R6-feeder和STO-feeder的12孔板中，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养。3-4天后按照1:10传代。实验结果显示利用R6-feeder培养的小鼠ESC的生长状态、生长速率均优于对照组STO-feeder。
2、利用R6-feeder培养小鼠iPSCs
解冻R6-feeder和STO-feeder(实验组为R6-feeder，对照组为STO-feeder)。将解冻的R6-feeder和STO-feeder接入12孔板，培养液为M15+Dox，次日解冻小鼠iPSC，接入铺有R6-feeder和STO-feeder的12孔板中，并置于37℃、5％CO2培养箱中培养。3-4天后按照1:10传代，传代5次后收集iPSC细胞并进行q-PCR以检测其多能性基因表达水平。实验结果显示利用R6-feeder培养的小鼠iPSC的生长状态、生长速率和多能性基因表达水平均优于对照组STO-feeder(见图5)。
实施例6：对R6-feeder和STO-feeder培养的iPSCs进行多能性鉴定
利用qPCR对iPSCs进行多能性基因表达的检测
①iPSCs总RNA提取：利用RNA提取试剂盒(Cat.No.74104，QIAGEN)完成iPSCs的总RNA提取。将收集到的RNA进行浓度与纯度的测定。
②iPSCs cDNA的制备：提前制冰，将反转录试剂盒(A5001，promega)中的试剂在冰上融化。反转录反应体系为20μL，分为5μL和15μL两部分，5μL体系包括5μg的RNA，1μL的引物，然后用无核酸的水配制成5μL体系。70℃加热5min，然后迅速冰浴，至少5min，微型离心机中离心10s，冰上放置直至15μL体系加入。15μL体系包括GoScriptTM5×缓冲液4.0μL，MgCl2(最终浓度1.5-5.0mM)2.5μL，dNTP 1.0μL，核糖核苷酸酶抑制剂0.5μL，GoScriptTM反转录酶1.0μL，无核酸水6μL。将5μL体系与15μL体系混匀，于25℃孵育5min后，42℃孵育1h。
③qPCR：将qPCR试剂盒(KK4601，KAPA)中的试剂于冰上融化，样品使用前混匀后离心富集。qPCR所用到的引物见表1.4；qPCR的反应体系为20μL(15μL Mix I+5μL Mix II，见表1.5)，反应条件见表1.6。将样品加入到96孔板中并记录加样信息，封好透明膜后离心，离心完成后将电脑连接qPCR仪(Thermo，TCR0096)，更改电脑IP地址，打开软件PikoRealsoftware，选择程序设定参数(参数设置见表1.3)，qPCR反应完成后保存数据并进行分析(见图6)。
实验结果显示：利用R6-feeder培养的小鼠ESC和iPSC的生长状态、生长速率和多能性基因表达水平均优于对照组STO-feeder。
表1.4qPCR所需引物信息(SEQ ID NO.2-13，18-19)
Figure BDA0001549635940000131
Figure BDA0001549635940000141
表1.5qPCR反应体系Mix I：
Component 1× 16×
SYBR(2×) 10μL 16μL
cDNA 1μL 16μL
Nuclear-Free water 4μL 64μL
15μL
Mix II：
Component 1× 5×
Primer F+R(10μM) 0.8μL 4μL
Nuclear-Free water 4.2μL 21μL
5μL
表1.6qPCR反应条件
Figure BDA0001549635940000142
Figure BDA0001549635940000151
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
Figure BDA0001549635940000161
Figure BDA0001549635940000171
Figure BDA0001549635940000181
Figure BDA0001549635940000191
Figure BDA0001549635940000201
Figure BDA0001549635940000211
Figure BDA0001549635940000221
序列表
<110> 内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司
<120> 利用携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF制备饲养层细胞的方法
<130> Demo Reference Number
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
ttaagtgtta tggacaagga 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 2
ctgagggcca ggcaggagca cgag 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 3
ctgtagggag ggcttcgggc actt 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 4
ggcagctaca gcatgatgca ggagc 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 5
ctggtcaggg agttgtactg cagg 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 6
caggagtttg agggtagctc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 7
cggttcatca tggtacagtc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 8
ctggtggcaa gtatgtggtg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 9
caggagtgta tggctcagca 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 10
aaactccatg caagtgccaa at 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 11
tctcggcctg tcttttcagt tc 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 12
agcgcctttc ccaagagaag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 13
agggtctttc agcaccgaca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 14
gcacacctgc gaactcacac 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 15
gtttgcggta gtgcctggtc 20
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 16
ttctcagccg ctgccaagct ggtc 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 17
ggtttgctgt ggcctcggga tgga 24
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 18
accacagtcc atgccatcac 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 19
tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims (3)

1.一种利用转染Xist Tale抑制性转录因子R6的MEF制备饲养层细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)细胞制备
获取胎鼠的成纤维细胞Oct4-GFP MEFs；获取R6-MEF细胞系；
所述获取胎鼠的成纤维细胞Oct4-GFP MEFs，包括以下步骤：将孕鼠体外获得的胎鼠洗净后除去头部、四肢和尾部，洗净剪碎后用0.25％的Trypsin-EDTA消化液37℃水浴中消化20min，吹打混匀后加入M10培养液终止消化，1000rpm离心10min，弃掉上清，M10培养液重悬后转移至T25培养瓶中于37℃、5％CO2培养箱中培养，达到80％汇合度后，进行1：3-1：5传代或原代冻存备用；
所述获取R6-MEF细胞系，包括以下步骤：
A、Oct4-GFP MEFs的脂质体转染：将Oct4-GFP MEFs使用M10培养液培养于6孔板中，待其达到40％汇合度时进行转染，转染12-18h；
B、脂质体转染后R6-MEFs的诱导及建系：脂质体转染后第二天将M15培养液更换为M15+Dox培养液培养继续培养；脂质体转染后第三天更换新的M15+Dox+puro培养液，筛选具有转基因的细胞；脂质体转染后第六天更换为M15+Dox培养液培养，直至汇合度达到80％时进行传代培养，观察并及时更换M15+Dox培养液；当有生长速度较快并且形成明显克隆的细胞时，将其单克隆传入6孔板进行建系，建系成功后按比例1：40传代和冻存；
所述R6-MEF细胞系制备中，R6具体的结合位点如下：TTAAGTGTTATGGACAAGGA，GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7；
2)获得新型饲养层细胞R6-feeder
从获得的R6-MEF细胞系中挑选多能性基因表达较高的细胞系并增至150mm培养皿，待细胞汇合度达到80％时添加丝裂霉素C，最后收集细胞计数并冻存；所述丝裂霉素C的最佳处理浓度为5μg/mL，丝裂霉素C处理时间为2.5h。
2.根据权利要求1所述的利用转染Xist Tale抑制性转录因子R6的MEF制备饲养层细胞的方法，其特征在于：所述获得新型饲养层细胞R6-feeder，包括以下步骤：
A、解冻R6-MEF：将冻存在液氮罐中的R6-MEF取出快速解冻接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
B、R6-MEF的扩增：待细胞的汇合度达到80-90％后，按1:50的比例扩至150mm培养皿；
C、丝裂霉素C处理并收集冻存：待细胞汇合度达到80％时，添加丝裂霉素C，丝裂霉素C浓度为5μg/mL，处理时间为2.5h；丝裂霉素C处理完成后收集细胞计数并将细胞冻存。
3.根据权利要求1所述的利用转染Xist Tale抑制性转录因子R6的MEF制备饲养层细胞的方法，其特征在于：还包括对R6-feeder和STO-feeder培养的iPSCs进行多能性鉴定，包括以下步骤：
A、iPSCs总RNA提取：收集传代5次后的iPSCs进行总RNA提取，利用RNA提取试剂盒完成iPSCs的总RNA提取；
B、iPSCs cDNA的制备：使用反转录试剂盒制备iPSCs的cDNA；
C、进行qPCR：使用qPCR试剂盒进行qPCR，反应完成后保存数据并进行分析。
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Address after: 011517 Jinle Economic Zone, Helingeer City, Hohhot, the Inner Mongolia Autonomous Region. The intersection of Jinsheng road and East Valley Road of Sheng Le modern service area

Applicant after: INNER MONGOLIA SAIKEXING LIVESTOCK BREEDING AND SEED INDUSTRY BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE Co.,Ltd.

Applicant after: INNER MONGOLIA SK-XING BREEDING BIOTECHNOLOGY (Group) Co.,Ltd.

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Inventor after: Li Xihe

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