CN108210916A - 一种预防和治疗骨质疏松的药物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及纤溶酶原用于预防和/或治疗骨质疏松及其相关病症的用途。本发明还涉及预防和/或治疗骨质疏松的药物及制品。

Description

一种预防和治疗骨质疏松的药物及其用途

技术领域

本发明涉及纤溶酶原用于预防或治疗骨质疏松及相关疾病的用途。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少和骨组织微结构破坏为特征,并能导致骨脆性增加和易于骨折的全身性疾病。2001年美国国立卫生研究院(NIH)提出骨质疏松症是以骨强度下降、骨折风险性增加为特征的骨骼系统疾病，骨强度反映骨骼的两个主要方面，即骨密度和骨质量。骨质疏松症导致骨量减少和骨微结构的退化，使得患者骨骼的脆性增加，严重地降低患者的运动功能和生活质量。

哺乳动物骨骼发育是一个高度有序，受多重因素共同调控的过程。哺乳动物的骨骼发育主要通过膜内成骨和软骨内成骨两种方式完成，其中四肢骨、椎骨等长骨主要通过软骨内成骨形成，颅骨、锁骨内侧部分等扁骨则是通过膜内成骨^[1]。骨组织形成后并非一成不变，而是处于骨形成与吸收的稳态动态平衡中。在此动态平衡的过程中，激素、多种信号通路、骨组织细胞的协同调控及矿物盐的稳态发挥着重要作用^[2]。

骨质疏松大致可分为原发性和继发性两大类，而绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松均属于原发性骨质疏松，且十分常见。继发性骨质疏松症是一种常见的全身性骨病，除了已知的疾病和诱发骨质疏松的药物之外，一些新兴的药物和治疗手段都已经成为继发性骨质疏松症的重要病因。

流行病学调查显示，1型糖尿病患者骨量减少和骨质疏松发病率为48％～72％^[3]，对于2型糖尿病患者，骨密度增高、降低或没有改变的结果国内外文献均可见报道^[4-6]。近年来，研究发现2型糖尿病患者代谢性骨病的发病率和骨质疏松性骨折的危险性明显高于普通人群，其骨质疏松发生率可达20％～60％^[5]。糖尿病骨质疏松易导致病理性骨折，致残致死率高，可加重糖尿病患者的治疗和康复困难。

在经过了一个多世纪的观察中，人们发现骨质疏松患者常常因合并心肌梗死、中风、猝死而使死亡率明显上升；而有动脉粥样硬化的患者也常常合并骨量的丢失，导致骨质疏松性骨折的发生^[7-9]。过去常常认为动脉粥样硬化与骨质疏松是随年龄增加而出现的退行性改变，但随着对二者长期的临床观察及分子机制的深入研究，人们发现:①二者存在共同的危险因素如衰老、糖尿血管细胞中的血管钙化细胞(calcifying vascularcells，CVC)其分子特征与骨生物学特征之间越来越一致和平行，在敲除骨代谢相关基因的动物出现了血管特征性表现，提示它们之间有共同的信号途径、转录因子和细胞外基质的相互作用；③活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及氧化型脂质对血管及骨骼共同影响；④内分泌异常如雌激素的减少、甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)和维生素D、降钙素代谢异常；⑤这两个疾病的治疗策略方面也存在密切的联系。随着人们对这两个看似矛盾、但常在同一机体发生的疾病的机制进一步了解，对As/OP综合征防治也不断地深入。

近年来的多项研究显示心血管系统疾病和骨质疏松症存在相关性，它们共同发生在老年期，经常在同一老年个体可见，且发病率都随着年龄的增长而增加。尽管老年是心血管疾病和骨质疏松共同的危险因素，但大多数研究发现，忽略年龄这一因素后，这两种疾病之间仍存在显著的联系。一方面，心血管系统疾病与骨量丢失及骨折风险增加有关，同样，有证据提示骨密度降低可导致心血管系统疾病的发病率和死亡率增加。进一步研究发现心血管疾病与骨质疏松在发病机制层面有紧密而直接的联系。动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要病理基础，而动脉钙化则是其主要表现之一。动脉钙化被认为是心血管疾病的一个重要标志物和临床监测指标。研究表明，血管钙化的本质是血管平滑肌细胞向成骨细胞表型的转化以及血管组织向骨组织的转化。而血管钙化的形成也和骨矿物质丢失具有显著的相关性。第三军医大学周锐博士^[10]对一组60岁以上老年人群进行了观察性研究，探讨了老年患者动脉钙化和骨质疏松及骨折之间相关性。他的研究包括：1.从2012年1月1日到12月31日，筛选60岁以上符合条件的来院就诊患者为研究对象。2.主动脉钙化程度的半定量测量:应用腰椎x线侧位片对第1-4腰椎对应的腹主动脉钙化沉积物进行评分。根据钙化斑块的长度和累及的节段数，每位患者的主动脉钙化评分(acs)为0-24分不等，无主动脉钙化是0分，最严重的主动脉钙化是24分。并依据acs将患者分为进行了分组。3.骨密度检测使用双能x线吸收仪测量(dxa)。骨质疏松症定义为基于dxa测定的骨密度值低于同性别、同种族正常成年人骨峰值2.5个标准差或以上。4.采用多因素回归风险模型评估主动脉钙化和骨质疏松症发生风险的关系。同时，该研究还包括：1.筛选60岁以上符合条件的绝经后妇女为研究对象。2.主动脉钙化程度的半定量测量。3.椎骨骨折的诊断:通过x线片观察椎体形态(胸4-腰5节段)确定椎骨骨折的发生(椎体高度下降20％以上)。4.采用多因素回归分析模型评估主动脉钙化和椎骨骨折之间的关系。同时，该研究还包括1.筛选60岁以上符合条件的来院就诊患者为研究对象。2.骨密度检测及骨质疏松症的诊断。3.颈动脉和冠状动脉粥样硬化钙化斑块检测:使用64排螺旋ct行颈动脉和冠状动脉cta。三维图像分析工作站评估所有cta图像。并对动脉斑块的成分和发生范围进行评价。4.采用多因素回归风险模型分析骨质疏松和骨量丢失与颈动脉和冠状动脉钙化斑块发生风险之间关系。研究结果发现，在调整年龄等其它混杂因素后，严重的骨量丢失与颈动脉斑块、冠状动脉斑块及共存的钙化斑块的发生均显著相关。结论是：在老年人群中，严重的主动脉钙化与骨质疏松症的发生相关。骨质疏松症的发生风险随着动脉粥样硬化的增加而升高。骨密度降低和血25(OH)D水平下降也与骨质疏松症发生的相关。在老年绝经后妇女中，严重的主动脉钙化与椎骨骨折的发生相关。骨密度降低和血25(OH)D水平下降与椎骨骨折的发生相关。在老年人群中,骨质疏松症、低骨量及血25(OH)D水平下降与动脉钙化斑块的发生相关；严重的骨量丢失与颈动脉斑块、冠状动脉斑块及共存的钙化斑块的发生风险均相关。该研究对一组老年人群的观察性研究揭示了老年病的一些共同危险因素及内在的相互关系，对骨质疏松症及心血管疾病的防治具有重要意义。

骨质疏松症是衰老相关病症中的代表性症状之一，在中老年人群尤其普遍。骨质疏松是生物衰老在骨骼方面的一种特殊表现，已经表明维生素D水平过低或者过高都与骨质疏松有关^[11]。随着老龄化社会的到来，骨质疏松的发病率呈逐年上升趋势，由此所带来的社会经济负担也在大大增加。

对于骨质疏松的治疗而言，关键是恢复并维持正常的骨组织含量和降低骨折的发生率。虽然治疗的方法较多，但目前仍以药物治疗为主。常用的药物有骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和骨矿化物。骨吸收抑制剂是主要针对破骨细胞的药物，通过抑制破骨细胞的活动而减少骨的重吸收；骨形成促进剂则是主要针对成骨细胞的药物，能够增强成骨细胞的活性,以促进新骨的合成；骨矿化物是治疗骨质疏松的基础用药,包括钙剂和维生素D，可以起到补充骨基质成分的作用。但当前治疗骨质疏松的药物绝大多数为骨吸收抑制剂(如雌激素、双膦酸盐、降钙素等)，而骨形成促进剂(如甲状旁腺激素等)的种类却非常少。从药物的治疗效果来看，如今只是停留于改善症状，延缓病情发展的水平，却并没有达到逆转病情甚至治愈的效果，因此需要寻找新的治疗药物和治疗方法。

发明简述

本发明涉及：

1.一种预防和治疗骨质疏松及其相关病症的方法，包括给药受试者治疗有效量的纤溶酶原。

2.项1的方法，其中所述骨质疏松包括原发性骨质疏松和继发性骨质疏松。

3.项1的方法，其中所述原发性骨质疏松包括绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松。

4.项1或2的方法，其中所述继发性骨质疏松包括继发于内分泌疾病、风湿性疾病、胃肠道疾病，以及药物治疗引起的骨质疏松。

5.项4的方法，其中所述继发性骨质疏松包括糖皮质激素、原发性甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进、原发性胆汁性肝硬化、性腺功能减低、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、慢性肾脏疾病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、骨关节炎、性腺激素治疗、抗癫痫药治疗、化疗药物治疗引起的骨质疏松。

6.一种预防和治疗疾病并发的骨质疏松的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原，其中所述疾病并发的骨质疏松包括糖皮质激素、原发性甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进、原发性胆汁性肝硬化、性腺功能减低、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、慢性肾脏疾病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、骨关节炎、性腺激素治疗、抗癫痫药治疗、化疗药物治疗并发的骨质疏松。。

7.一种预防骨质疏松骨折的方法，包括给药易患骨质疏松的受试者、处于患骨质疏松高风险的受试者或诊断患有骨质疏松的受试者有效量的纤溶酶原预防骨折的发生。

8.项7的方法，其中所述受试者包括患有糖皮质激素、原发性甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进、原发性胆汁性肝硬化、性腺功能减低、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、慢性肾脏疾病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎或骨关节炎的受试者。

9.项7的方法，其中所述受试者包括正接受性腺激素治疗、抗癫痫药治疗或化疗药物治疗的受试者。

10.一种增强成骨细胞活性的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

11.一种调控骨矿物质代谢的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

12.项11的方法，所述调控包括降低血钙水平、升高血磷水平，促进钙在骨基质中的沉积和/或降低钙在血管壁、内脏的沉积。

13.项1-12任一项的方法，其中所述纤溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性。

14.项1-12任一项的方法，所述纤溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。

15.项1-12任一项的方法，所述纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。

16.项1-12任一项的方法，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。

17.项1-12任一项的方法，所述纤溶酶原为天然或合成的人纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性的变体或片段。

18.项1-12任一项的方法，所述纤溶酶原为来自灵长类动物或啮齿类动物的人纤溶酶原直向同系物或其仍然保留纤溶酶原活性的变体或片段。

19.项13-18任一项的方法，所述纤溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。

20.项1-19任一项的方法，其中所述纤溶酶原是人天然纤溶酶原。

21.项1-20任一项的方法，其中所述受试者是人。

22.项1-21任一项的方法，其中所述受试者缺乏或缺失纤溶酶原。

23.项22的方法，其中所述缺乏或缺失是先天的、继发的和/或局部的。

24.一种用于项1-23任一项的方法的纤溶酶原。

25.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载剂和用于项1-23中任一项所述方法的纤溶酶原。

26.一种预防性或治疗性试剂盒，其包含：(i)用于项1-23中任一项所述方法的纤溶酶原和(ii)用于递送所述纤溶酶原至所述受试者的构件(means)。

27.根据项26所述的试剂盒，其中所述构件为注射器或小瓶。

28.项26或27的试剂盒，其还包含标签或使用说明书，该标签或使用说明书指示将所述纤溶酶原投予所述受试者以实施项1-23中任一项所述方法。

29.一种制品，其包含：

含有标签的容器；和

包含(i)用于项1-23中任一项所述方法的纤溶酶原或包含纤溶酶原的药物组合物，其中所述标签指示将所述纤溶酶原或组合物投予所述受试者以实施项1-23中任一项所述方法。

30.项26-28中任一项的试剂盒或项29的制品，还包含另外的一个或多个构件或容器，该构件或容器中含有其它药物。

31.项30的试剂盒或制品，其中所述其它药物包括治疗骨质疏松的其它药物或治疗与骨质疏松并发的其它疾病的药物。

32.包含纤溶酶原的用于治疗骨质疏松的药剂。

33.包含纤溶酶原的用于治疗骨质疏松的药物组合物，试剂盒、制品。

34.纤溶酶原用于治疗骨质疏松的用途。

35.本发明还涉及纤溶酶原在制备上述项1-23任一项的方法中使用的药物、药物组合物、制品、试剂盒中的用途。

在本发明的上述任一实施方案中，所述纤溶酶原可与序列2、6、8、10或12具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。

在一些实施方案中，所述纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。在一些实施方案中，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为天然或合成的人纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性的变体或片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为来自灵长类动物或啮齿类动物的人纤溶酶原直向同系物或其仍然保留纤溶酶原活性的变体或片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是人天然纤溶酶原。

在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者缺乏或缺失纤溶酶原。在一些实施方案中，所述缺乏或缺失是先天的、继发的和/或局部的。

在一些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的载剂和用于前述方法的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述试剂盒可以是预防性或治疗性试剂盒，其包含：(i)用于前述方法的纤溶酶原和(ii)用于递送所述纤溶酶原至所述受试者的构件(means)。在一些实施方案中，所述构件为注射器或小瓶。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含标签或使用说明书，该标签或使用说明书指示将所述纤溶酶原投予所述受试者以实施前述任一方法。

在一些实施方案中，所述制品包含：含有标签的容器；和包含(i)用于前述方法的纤溶酶原或包含纤溶酶原的药物组合物，其中所述标签指示将所述纤溶酶原或组合物投予所述受试者以实施前述任一方法。

在一些实施方案中，所述试剂盒或制品还包含另外的一个或多个构件或容器，该构件或容器中含有其他药物。在一些实施方案中，所述其他药物选自下组：降血脂药物、抗血小板药物、降血压药物、扩张血管药物、降血糖药物、抗凝血药物、溶血栓药物，保肝药物，抗心律失常药物，强心药物，利尿药物，抗感染药物、抗病毒药物、免疫调节药物、炎症调节类药物和抗肿瘤药物。

在前述方法的一些实施方案中，所述纤溶酶原通过全身或局部给药，优选通过以下途径施用：静脉内、肌内、皮下给予纤溶酶原来进行治疗。在前述方法的一些实施方案中，所述纤溶酶原与适当的多肽载体或稳定剂组合施用。在前述方法的一些实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方厘米体表面积计算)的剂量施用，优选至少重复一次，优选至少每天施用。

本发明明确涵盖了属于本发明实施方案之间的技术特征的所有组合，并且这些组合后的技术方案在本申请中已经明确公开，就像上述技术方案已经单独且明确公开一样。另外，本发明还明确涵盖各个实施方案及其要素的所有亚组合，并且在本文中公开，就像每一个此类亚组合单独且明确在本文中公开一样。

发明详述

定义

“骨质疏松症”是一种以骨量低下，骨微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性退化性骨病。一般分为原发性、继发性和特发性骨质疏松症3类。

“原发性骨质疏松症”又分为绝经后骨质疏松症(I型)和老年骨质疏松症(Ⅱ型)，其中绝经后骨质疏松症一般发生在妇女绝经后5～10年内；老年骨质疏松症一般指老年人60岁及以上发生的骨质疏松症。原发性骨质疏松症主要强调骨量、骨丢失与骨结构的重要作用，以骨量减少、脆性增加、结构退化、易发生骨折为其临床特征。

“继发性骨质疏松症”是指由于某些疾病、药物或其他原因造成骨量降低，骨骼的微结构发生改变，易发生脆性骨折的疾病。常见的导致骨质疏松的疾病或药物包括：

1.内分泌疾病：

库欣综合征、性腺功能减低、甲状腺功能亢进症、原发性甲状旁腺功能亢进症、糖尿病

2.风湿疾病：

类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎

3.血液系统疾病：

多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、地中海贫血、血友病

4.药物治疗：

糖皮质激素过量、甲状腺激素过量替代、抗癫痫药物、锂或铝中毒、细胞毒或免疫抑制剂(环孢A、他克莫司)、肝素、引起性腺功能低下的药物(芳香化酶抑制剂、促性腺激素释放激素类似物等)

5.胃肠道疾病：

慢性肝病(尤其是原发性胆汁性肝硬化)、炎性肠病(尤其是克罗恩病)、胃大部分切除术、腹泻病

6.肾脏疾病：

肾功能不全或衰竭

7.遗传性疾病

成骨不全、马凡综合征、血色病、高胱氨酸尿、卟啉病

8.其他原因：

任何原因维生素D不足、酗酒、神经性厌食、营养不良、长期卧床、妊娠及哺乳、慢性阻塞性肺疾病、脑血管意外、器官移植、淀粉样变、多发性硬化、获得性免疫缺陷综合征

这些继发性因素通过影响成骨细胞和破骨细胞功能，使骨吸收增加和/或骨形成减低而导致骨质疏松。

本发明所述的“继发性骨质疏松”的术语涵盖了上述各种原因导致的骨质疏松。

“特发性骨质疏松”主要发生在青少年中，一般指男性发病年龄小于50岁、女性发病年龄小于40岁的骨质疏松，无潜在疾病，其原因不明。

与某种疾病或状况“并发的骨质疏松”，指的是与所述疾病或状况相伴发生的骨质疏松。所述疾病或状况与骨质疏松之间可以有某种内在的病因或发病机制方面的联系。例如糖尿病并发的骨质疏松，动脉粥样硬化并发的骨质疏松，慢性肾病并发的骨质疏松、强直性脊柱炎并发的骨质疏松、骨关节炎并发的骨质疏松等。

纤溶酶是纤溶酶原激活系统(PA系统)的关键组分。它是一种广谱的蛋白酶，能够水解细胞外基质(ECM)的几个组分，包括纤维蛋白、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖^[12]。此外，纤溶酶能将一些金属蛋白酶前体(pro-MMPs)激活形成具有活性的金属蛋白酶(MMPs)。因此纤溶酶被认为是胞外蛋白水解作用的一个重要的上游调节物^[13-14]。纤溶酶是由纤溶酶原通过两种生理性的PAs：组织型纤溶酶原激活剂(tPA)或尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)蛋白水解形成的。由于纤溶酶原在血浆和其他体液中相对水平较高，传统上认为PA系统的调节主要通过PAs的合成和活性水平实现。PA系统组分的合成受不同因素严格调节，如激素、生长因子和细胞因子。此外，还存在纤溶酶和PAs的特定生理抑制剂。纤溶酶的主要抑制剂是α2-抗纤溶酶(α2-antiplasmin)。PAs的活性同时被uPA和tPA的纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)抑制以及主要抑制uPA的溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)调节。某些细胞表面具有直接水解活性的uPA特异性细胞表面受体(uPAR)^[15-16]。

纤溶酶原是一个单链糖蛋白，由791个氨基酸组成，分子量约为92kDa^[17-18]。纤溶酶原主要在肝脏合成，大量存在于胞外液中。血浆中纤溶酶原含量约为2μM。因此纤溶酶原是组织和体液中蛋白质水解活性的一个巨大的潜在来源^[19-20]。纤溶酶原存在两种分子形式：谷氨酸-纤溶酶原(Glu-plasminogen)和赖氨酸-纤溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纤溶酶原具有一个氨基末端(N-末端)谷氨酸，因此被称为谷氨酸-纤溶酶原。然而，在纤溶酶存在时，谷氨酸-纤溶酶原在Lys76-Lys77处水解成为赖氨酸-纤溶酶原。与谷氨酸-纤溶酶原相比，赖氨酸-纤溶酶原与纤维蛋白具有更高的亲和力，并可以更高的速率被PAs激活。这两种形式的纤溶酶原的Arg560-Val561肽键可被uPA或tPA切割，导致二硫键连接的双链蛋白酶纤溶酶的形成^[21]。纤溶酶原的氨基末端部分包含五个同源三环，即所谓的kringles，羧基末端部分包含蛋白酶结构域。一些kringles含有介导纤溶酶原与纤维蛋白及其抑制剂α2-AP特异性相互作用的赖氨酸结合位点。最新发现一个纤溶酶原为38kDa的片段，其中包括kringles1-4，是血管生成的有效抑制剂。这个片段被命名为血管抑素，可通过几个蛋白酶水解纤溶酶原产生。

纤溶酶的主要底物是纤维蛋白，纤维蛋白的溶解是预防病理性血栓形成的关键^[22]。纤溶酶还具有对ECM几个组分的底物特异性，包括层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和明胶，表明纤溶酶在ECM重建中也起着重要作用^[18,23-24]。间接地，纤溶酶还可以通过转化某些蛋白酶前体为活性蛋白酶来降解ECM的其他组分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纤溶酶可能是细胞外蛋白水解的一个重要的上游调节器^[25]。此外，纤溶酶具有激活某些潜在形式的生长因子的能力^[26-28]。在体外，纤溶酶还能水解补体系统的组分并释放趋化补体片段。

“纤溶酶”是存在于血液中的一种非常重要的酶，能将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体。

“纤溶酶原”是纤溶酶的酶原形式，根据swiss prot中的序列，按含有信号肽的天然人源纤溶酶原氨基酸序列(序列4)计算由810个氨基酸组成，分子量约为90kD，主要在肝脏中合成并能够在血液中循环的糖蛋白，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全长的纤溶酶原包含七个结构域：位于C末端的丝氨酸蛋白酶结构域、N末端的Pan Apple(PAp)结构域以及5个Kringle结构域(Kringle1-5)。参照swiss prot中的序列，其信号肽包括残基Met1-Gly19，PAp包括残基Glu20-Val98，Kringle1包括残基Cys103-Cys181，Kringle2包括残基Glu184-Cys262，Kringle3包括残基Cys275-Cys352，Kringle4包括残基Cys377-Cys454，Kringle5包括残基Cys481-Cys560。根据NCBI数据，丝氨酸蛋白酶域包括残基Val581-Arg804。

Glu-纤溶酶原是天然全长的纤溶酶原，由791个氨基酸组成(不含有19个氨基酸的信号肽)，编码该序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在体内，还存在一种是从Glu-纤溶酶原的第76-77位氨基酸处水解从而形成的Lys-纤溶酶原，如序列6所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纤溶酶原(δ-plasminogen)是全长纤溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5结构的片段，仅含有Kringle1和丝氨酸蛋白酶^域[29-30]，有文献报道了delta-纤溶酶原的氨基酸序列(序列8)^[31]，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列7。小纤溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和丝氨酸蛋白酶域组成，有文献报道其包括残基Val443-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)^[31]，其氨基酸序列如序列10所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纤溶酶原(Micro-plasminogen)仅含有丝氨酸蛋白酶结构域，有文献报道其氨基酸序列包括残基Ala543-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)^[32]，也有专利文献CN102154253A报道其序列包括残基Lys531-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)，本专利序列参考专利文献CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

本发明的“纤溶酶”与“纤维蛋白溶酶”、“纤维蛋白溶解酶”可互换使用，含义相同；“纤溶酶原”与“纤溶酶原”、“纤维蛋白溶解酶原”可互换使用，含义相同。

在本申请中，所述纤溶酶原“缺乏”的含义或活性为受试者体内纤溶酶原的含量比正常人低，低至足以影响所述受试者的正常生理功能；所述纤溶酶原“缺失”的含义或活性为受试者体内纤溶酶原的含量显著低于正常人，甚至活性或表达极微，只有通过外源提供才能维持正常生理功能。

本领域技术人员可以理解，本发明纤溶酶原的所有技术方案适用于纤溶酶，因此，本发明描述的技术方案涵盖了纤溶酶原和纤溶酶。

在循环过程中，纤溶酶原采用封闭的非活性构象，但当结合至血栓或细胞表面时，在纤溶酶原激活剂(plasminogen activator，PA)的介导下，其转变为呈开放性构象的活性纤溶酶。具有活性的纤溶酶可进一步将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体，进而溶解血栓。其中纤溶酶原的PAp结构域包含维持纤溶酶原处于非活性封闭构象的重要决定簇，而KR结构域则能够与存在于受体和底物上的赖氨酸残基结合。已知多种能够作为纤溶酶原激活剂的酶，包括：组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、激肽释放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纤溶酶原活性片段”是指在纤溶酶原蛋白中，能够与底物中的靶序列结合并发挥蛋白水解功能的活性片段。本发明涉及纤溶酶原的技术方案涵盖了用纤溶酶原活性片段代替纤溶酶原的技术方案。本发明所述的纤溶酶原活性片段为包含纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶域的蛋白质，优选，本发明所述的纤溶酶原活性片段包含序列14、与序列14具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列的蛋白质。因此，本发明所述的纤溶酶原包括含有该纤溶酶原活性片段、并且仍然保持该纤溶酶原活性的蛋白。

目前，对于血液中纤溶酶原及其活性测定方法包括：对组织纤溶酶原激活剂活性的检测(t-PAA)、血浆组织纤溶酶原激活剂抗原的检测(t-PAAg)、对血浆组织纤溶酶原活性的检测(plgA)、血浆组织纤溶酶原抗原的检测(plgAg)、血浆组织纤溶酶原激活剂抑制物活性的检测、血浆组织纤溶酶原激活剂抑制物抗原的检测、血浆纤维蛋白溶酶-抗纤维蛋白溶酶复合物检测(PAP)。其中最常用的检测方法为发色底物法：向受检血浆中加链激酶(SK)和发色底物，受检血浆中的PLG在SK的作用下，转变成PLM，后者作用于发色底物，随后用分光光度计测定，吸光度增加与纤溶酶原活性成正比。此外也可采用免疫化学法、凝胶电泳、免疫比浊法、放射免疫扩散法等对血液中的纤溶酶原活性进行测定。

“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物种之间的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也称为直向同源物、垂直同源物。其具体指不同物种中由同一祖先基因进化而来的蛋白或基因。本发明的纤溶酶原包括人的天然纤溶酶原，还包括来源于不同物种的、具有纤溶酶原活性的纤溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代变体”是指其中一个给定的氨基酸残基改变但不改变蛋白质或酶的整体构象和功能，这包括但不限于以相似特性(如酸性，碱性，疏水性，等)的氨基酸取代亲本蛋白质中氨基酸序列中的氨基酸。具有类似性质的氨基酸是众所周知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水性的碱性氨基酸并可以互换。同样，异亮氨酸是疏水氨基酸，则可被亮氨酸，蛋氨酸或缬氨酸替换。因此，相似功能的两个蛋白或氨基酸序列的相似性可能会不同。例如，基于MEGALIGN算法的70％至99％的相似度(同一性)。“保守取代变体”还包括通过BLAST或FASTA算法确定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能达75％以上更好，最好能达85％以上，甚至达90％以上为最佳，并且与天然或亲本蛋白质或酶相比具有相同或基本相似的性质或功能。

“分离的”纤溶酶原是指从其天然环境分离和/或回收的纤溶酶原蛋白。在一些实施方案中，所述纤溶酶原会纯化(1)至大于90％、大于95％、或大于98％的纯度(按重量计)，如通过Lowry法所确定的，例如超过99％(按重量计)，(2)至足以通过使用旋转杯序列分析仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至同质性，该同质性是通过使用考马斯蓝或银染在还原性或非还原性条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定的。分离的纤溶酶原也包括通过生物工程技术从重组细胞制备，并通过至少一个纯化步骤分离的纤溶酶原。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的和非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸，和具有经修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列(具有或没有N端甲硫氨酸残基)的融合物；等等。

关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，氨基酸序列同一性百分数值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

如本文中使用的，术语“治疗”和“处理”指获得期望的药理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分预防疾病或其症状，和/或部分或完全治愈疾病和/或其症状，并且包括：(a)预防疾病在受试者体内发生，所述受试者可以具有疾病的素因，但是尚未诊断为具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滞其形成；和(c)减轻疾病和/或其症状，即引起疾病和/或其症状消退。

术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠、小鼠)、非人灵长类、人、犬、猫、有蹄动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。

“治疗有效量”或“有效量”指在对哺乳动物或其它受试者施用以治疗疾病时足以实现对疾病的所述预防和/或治疗的纤溶酶原的量。“治疗有效量”会根据所使用的纤溶酶原、要治疗的受试者的疾病和/或其症状的严重程度以及年龄、体重等而变化。

本发明纤溶酶原的制备

纤溶酶原可以从自然界分离并纯化用于进一步的治疗用途，也可以通过标准的化学肽合成技术来合成。当通过化学合成多肽时，可以经液相或固相进行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中将序列的C末端氨基酸附接于不溶性支持物，接着序贯添加序列中剩余的氨基酸)是适合纤溶酶原化学合成的方法。各种形式的SPPS，诸如Fmoc和Boc可用于合成纤溶酶原。用于固相合成的技术描述于Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284页于The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in PeptideSynthesis,Part A.,Merrifield,等J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963)；Stewart等,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10和Camarero JA等2005Protein PeptLett.12:723-8中。简言之，用其上构建有肽链的功能性单元处理小的不溶性多孔珠。在偶联/去保护的重复循环后，将附接的固相游离N末端胺与单个受N保护的氨基酸单元偶联。然后，将此单元去保护，露出可以与别的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之后将其切掉。

可以使用标准重组方法来生产本发明的纤溶酶原。例如，将编码纤溶酶原的核酸插入表达载体中，使其与表达载体中的调控序列可操作连接。表达调控序列包括但不限于启动子(例如天然关联的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件、和转录终止序列。表达调控可以是载体中的真核启动子系统，所述载体能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS或CHO细胞)。一旦将载体掺入合适的宿主中，在适合于核苷酸序列的高水平表达及纤溶酶原的收集和纯化的条件下维持宿主。

合适的表达载体通常在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标志物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以有助于对外源用期望的DNA序列转化的那些细胞进行检测。

大肠杆菌(Escherichia coli)是可以用于克隆主题抗体编码多核苷酸的原核宿主细胞的例子。适合于使用的其它微生物宿主包括杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以生成表达载体，其通常会含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，会存在许多公知的启动子，诸如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，beta-内酰胺酶启动子系统，或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常会控制表达，任选在操纵基因序列的情况中，并且具有核糖体结合位点序列等，以启动并完成转录和翻译。

其他微生物，诸如酵母也可用于表达。酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的例子，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。诱导型酵母启动于特别包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

在微生物外，哺乳动物细胞(例如在体外细胞培养物中培养的哺乳动物细胞)也可以用于表达并生成本发明的抗-Tau抗体(例如编码主题抗-Tau抗体的多核苷酸)。参见Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、和经转化的B细胞或杂交瘤。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，如复制起点，启动子和增强子(Queen等,Immunol.Rev.89:49(1986))，以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷酸化位点，和转录终止子序列。合适的表达控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等衍生的启动子。参见Co等,J.Immunol.148:1149(1992)。

一旦合成(化学或重组方式)，可以依照本领域的标准规程，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，高效液相层析(HPLC)，凝胶电泳等来纯化本发明所述的纤溶酶原。该纤溶酶原是基本上纯的，例如至少约80％至85％纯的，至少约85％至90％纯的，至少约90％至95％纯的，或98％至99％纯的或更纯的，例如不含污染物，所述污染物如细胞碎片，除主题抗体以外的大分子，等等。

药物配制剂

可以通过将具有所需纯度的纤溶酶原与可选的药用载体，赋形剂，或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成冻干制剂或水溶液制备治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkoniumchloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。优选冻干的抗-VEGF抗体配制剂在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作为参考。

本发明的配制剂也可含有需治疗的具体病症所需的一种以上的活性化合物，优选活性互补并且相互之间没有副作用的那些。例如，抗高血压的药物，抗心律失常的药物，治疗糖尿病的药物等。

本发明的纤溶酶原可包裹在通过诸如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，例如，可置入在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)中或置入粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。

用于体内给药的本发明的纤溶酶原必需是无菌的。这可以通过在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。

本发明的纤溶酶原可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有糖蛋白的固体疏水聚合物半通透基质，例如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3773919,EP 58,481)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯－乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出处同上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。可以根据相关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。

给药和剂量

可以通过不同方式，例如通过静脉内，腹膜内，皮下，颅内，鞘内，动脉内(例如经由颈动脉)，肌内来实现本发明药物组合物的施用。

用于胃肠外施用的制备物包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、或固定油。静脉内媒介物包含液体和营养补充物、电解质补充物，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。

医务人员会基于各种临床因素确定剂量方案。如医学领域中公知的，任一患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用次数和路径、总体健康、和同时施用的其它药物。本发明包含纤溶酶原的药物组合物的剂量范围可以例如为每天约0.0001至2000mg/kg，或约0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受试者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或50mg/kg体重或在1-50mg/kg的范围，或至少1mg/kg。高于或低于此例示性范围的剂量也涵盖在内，特别是考虑到上述的因素。上述范围中的中间剂量也包含在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其它日程表施用此类剂量。例示性的剂量日程表包括连续几天1-10mg/kg。在本发明的药物施用过程中需要实时评估治疗效果和安全性。

制品或药盒

本发明的一个实施方案涉及一种制品或药盒，其包含可用于治疗骨质疏松及其相关病症的本发明纤溶酶原或纤溶酶。所述制品优选包括一个容器，标签或包装插页。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。所述容器含有组合物，所述组合物可有效治疗本发明的疾病或病症并具有无菌入口(例如所述容器可为静脉内溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射针穿透的塞子的)。所述组合物中至少一种活性剂为纤溶酶原/纤溶酶。所述容器上或所附的标签说明所述组合物用于治疗本发明所述骨质疏松及其相关病症。所述制品可进一步包含含有可药用缓冲液的第二容器，诸如磷酸盐缓冲的盐水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可进一步包含从商业和使用者角度来看所需的其它物质，包括其它缓冲液，稀释剂，过滤物，针和注射器。此外，所述制品包含带有使用说明的包装插页，包括例如指示所述组合物的使用者将纤溶酶原组合物以及治疗伴随的疾病的其它药物给药患者。

治疗效力和治疗安全性

本发明的一个实施方案涉及使用纤溶酶原治疗受试者后，对治疗效力和治疗安全性的判断。常用的骨质疏松症治疗效果监测与评估内容包括随访(不良反应、规范服药、基础措施以及骨折风险因子再评估等)，新发骨折评估(临床骨折、身高降低和影像学检查)、骨密度(bone mineral density，BMD)测量和骨转换生化标志物(bone turnover markers，BTM)检测，以及基于这些数据的综合再评估等。其中BMD和骨量是目前应用最广泛的疗效监测和评估方法例如，可以通过双能X线骨密度仪(dual energy X-ray absorptiometry，DXA)、定量CT(quantitative computed tomography，QCT)、单光子吸收测定法(SPA)、或超声波测定法来测量BMD。治疗开始后可每年检测1次BMD，在BMD达到稳定后可以适当延长间隔，例如2年监测1次。针对BTM，目前在血清学指标中较多使用的骨形成指标是血清1型原胶原N端前肽(procollagen type 1n-terminal propeptide，PINP)，骨吸收指标是血清1型原胶原C末端肽(serum C-terminal telopeptide，S-CTX)。可根据研究进展，适时调整更合理的检测指标。应在开始治疗前检测基线值，应用促形成药物治疗后3个月、应用抑制吸收药物治疗后3～6个月时进行检测。BTM能够提供骨骼的动态信息，在作用和功能上独立于BMD，同时也与BMD成为互为补充的监测手段，二者结合起来具有更高的临床价值。一般地，如果治疗后BMD上升或稳定，BTM有预期变化，同时治疗期间无骨折发生，可认为治疗反应良好。此外，本发明还涉及使用纤溶酶原及其变体对受试者进行治疗过程中和治疗后，所述该治疗方案安全性的判断，包括但不限于对药物在受试者体内的血清半衰期、治疗半衰期、半数中毒量(TD50)、半数致死量(LD50)进行统计，或对在治疗过程中或治疗后发生的各种不良事件如致敏反应进行观察。

附图简述

图1显示15周龄野生型和纤溶酶原缺陷型小鼠的膝关节Safranin O染色代表性图片。A为野生型小鼠，B为纤溶酶原缺陷小鼠。与野生型小鼠相比，纤溶酶原缺陷型小鼠展现了广泛的骨质减少和骨髓细胞增加。

图2显示15周龄纤溶酶原缺陷型以及野生型小鼠血钙检测结果。结果显示，纤溶酶原缺陷型(Ko)小鼠血钙水平显著高于野生型小鼠(Wt)，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原在维持正常钙代谢上发挥着重要作用。

图3显示纤溶酶原缺陷型(Plg^-/-)小鼠给予纤溶酶原30天后膝关节H&E染色观察结果。A、C为给溶媒PBS对照组，B、D为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS对照组，生长板(箭头标识)排列紊乱，部分骨髓腔内骨髓消失(三角形标识)；给纤溶酶原组，生长板(箭头标识)排列整齐。说明纤溶酶原能够促进Plg^-/-小鼠膝关节生长板的正常生长。

图4显示Plg^-/-小鼠给予纤溶酶原30天后膝关节关节软骨碱性磷酸酶染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS对照组关节软骨表面只有极少量的碱性磷酸酶着色，而给纤溶酶原组关节软骨表面却有较多的呈深红色的碱性磷酸酶着色(箭头标识)。说明给纤溶酶原组关节软骨表面的碱性磷酸酶活性明显高于PBS对照组，即纤溶酶原促使膝关节关节软骨的成骨细胞活性明显增加。

图5显示Plg^-/-小鼠给予纤溶酶原30天后膝关节生长板碱性磷酸酶染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS对照组在生长板成骨细胞活性处有碱性磷酸酶着色(箭头标识)，呈浅红色；给纤溶酶原组在生长板处有较多碱性磷酸酶着色，且呈深红色。说明给纤溶酶原之后，可以促进膝关节生长板的成骨细胞活性的增加。

图6显示0.5μg/kg维生素D衰老模型C57小鼠给予纤溶酶原28天后血清碱性磷酸酶检测结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠血清碱性磷酸酶活性明显高于给溶媒PBS对照组小鼠，且统计差异显著(*表示P<0.05)，并且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组小鼠血清碱性磷酸酶活性更加接近空白对照组小鼠。这提示，纤溶酶原组能够显著促进维生素D衰老模型小鼠成骨细胞活性的增加。

图7显示1μg/kg维生素D衰老模型C57小鼠给予纤溶酶原28天膝关节生长板碱性磷酸酶染色代表性图片。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS对照组膝关节生长板碱性磷酸酶阳性着色(箭头标识)明显少于空白对照小鼠；给纤溶酶原组膝关节生长板碱性磷酸酶阳性着色明显高于给溶媒PBS对照组小鼠。说明纤溶酶原能够改善维生素D诱导的衰老模型小鼠膝关节生长板成骨细胞的活性

图8不同周龄段Plg^-/-和Plg^+/+小鼠头盖骨Micro CT骨密度检测结果。A为皮质骨密度，B为头盖骨总骨密度。结果显示，随着周龄的增大，Plg^+/+小鼠皮质骨密度和总骨密度有逐渐增加的趋势，而Plg^-/-小鼠头盖骨皮质骨密度和总骨密度逐渐降低。而两个品系的小鼠骨密度在20-21周龄就有极其显著差异，在29-30周龄时差异更加显著。说明纤溶酶原在头盖骨骨密度调节中发挥重要作用，与骨质疏松密切相关。

图9 20-21周龄周龄段Plg^/-和Plg^+/+小鼠头盖骨Micro CT骨矿物含量检测结果。结果显示，20-21周龄Plg^+/+小鼠皮质骨和总骨骨矿物含量明显高于Plg^/-小鼠，且统计差异显著。说明纤溶酶原在头盖骨矿物含量调节上发挥重要作用，与骨质疏松密切相关。

图10不同周龄段Plg^-/-和Plg^+/+小鼠股骨Micro CT骨密度检测结果。A为皮质骨密度，B为松质骨密度，C为小梁骨密度，D为总骨密度。结果显示，在12-30周龄期间随着周龄增大Plg^+/+小鼠股骨密度逐渐增加，而Plg^-/-小鼠股骨皮质骨密度、松质骨密度、小梁骨密度以及总骨密度逐渐减小。在此期间，Plg^+/+小鼠股骨密度高于Plg^-/-小鼠，在20周龄时两个品系小鼠骨密度差异显著，并且随着周龄增大，二者差异越来越显著。说明纤溶酶原参与股骨密度调节，并在一定时期发挥重要作用。

图11不同周龄段Plg^-/-和Plg^+/+小鼠股骨Micro CT骨矿物含量检测结果。A为皮质骨矿物含量，B为松质骨矿物含量，C为小梁骨矿物含量，D为总骨矿物含量。结果显示，在12-30周龄期间随着周龄增大Plg^+/+小鼠股骨不同部分矿物含量变化不大或逐步增加，而Plg^-/-小鼠股骨松质骨和小梁骨矿物含量逐渐减小。在此期间，Plg^+/+小鼠股骨矿物含量高于Plg^-/-小鼠，在20周龄时两个品系小鼠股骨皮质骨、小梁骨和总骨骨矿物含量差异显著，并且随着周龄增大，二者骨矿物含量差异越来越显著。说明纤溶酶原参与股骨矿物质代谢调节，并在一定时期发挥重要作用。

图12不同周龄段Plg^-/-和Plg^+/+小鼠腰椎骨Micro CT骨密度检测结果。A为皮质骨密度，B为松质骨密度，C为小梁骨密度，D为总骨密度。结果显示，在12-30周龄期间随着周龄增大Plg^+/+小鼠腰椎骨骨密度逐渐增大，而Plg^-/-小鼠腰椎骨皮质骨密度、松质骨密度、小梁骨密度以及总骨密度逐渐减小。在此期间，Plg^+/+小鼠骨密度高于Plg^-/-小鼠，在12周龄时两个品系小鼠腰椎骨骨密度差异显著，并且随着周龄的增大，二者差异越来越显著。说明纤溶酶原参与腰椎骨密度调节，并在一定时期发挥重要作用。

图13不同周龄段Plg^-/-和Plg^+/+小鼠腰椎骨Micro CT骨矿物含量检测结果。A为皮质骨矿物含量，B为松质骨矿物含量，C为小梁骨矿物含量，D为总骨矿物含量。结果显示，在12-30周龄期间随着周龄增大Plg^+/+小鼠腰椎骨不同部分矿物含量变化不大，而Plg^-/-小鼠腰椎骨皮质骨、松质骨、小梁骨以及总骨矿物含量逐渐减小。在此期间，Plg^+/+小鼠腰椎骨矿物含量高于Plg^-/-小鼠，在20周龄时两个品系小鼠腰椎骨松质骨和皮质骨区域矿物含量差异显著，并且随着周龄增大，二者差异越来越显著。说明纤溶酶原参与腰椎骨矿物质代谢调节，并在一定时期发挥重要作用。

图14不同周龄段Plg^-/-和Plg^+/+小鼠血清碱性磷酸酶检测结果。结果显示，Plg^+/+小鼠血清碱性磷酸酶活性在12-30周龄时虽有波动但变化并不显著，而Plg^-/-小鼠血清碱性磷酸酶的活性随着周龄的增大逐渐的降低；Plg^+/+小鼠血清碱性磷酸酶的活性明显高于Plg^-/-小鼠，两个品系小鼠血清碱性磷酸酶活性在12周龄时就出现明显的差异，并且随着周龄的增大，差异越来越显著。该结果提示纤溶酶原可能促进成骨细胞的活性，促进骨重建。

图15显示ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后血钙检测结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠血钙浓度要明显的低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能够降低ApoE动脉粥样硬化模型小鼠血钙的含量。

图16显示ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后主动脉窦茜素红染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组小鼠主动脉窦钙沉积明显少于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能够改善动脉粥样硬化中主动脉窦钙化。

图17动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原后股骨密度检测结果。A为皮质骨密度，B为松质骨密度，C为小梁骨密度，D为总骨密度。结果显示，给药10天后给纤溶酶原组小鼠股骨密度明显高于给溶媒PBS对照组，且松质骨密度和总骨密度差异显著(*表示P<0.05)；给药30天后给纤溶酶原组小鼠松质骨密度、小梁骨密度和总骨密度相较于给溶媒PBS对照组显著升高，且统计差异显著(*表示P<0.05)。皮质骨密度两组无明显差异。说明纤溶酶原能够促进动脉粥样硬化模型小鼠骨密度升高，改善动脉粥样硬化所致的骨质疏松。

图18动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原后膝关节H&E染色代表性图片。A-C为给溶媒PBS对照组，D-F为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS对照组软骨表面轻度纤维化(细箭头标识)，小梁骨(三角标识)明显变细，粗细不均匀，软骨组织(星形标识)排列紊乱，生长板(粗箭头标识)层次紊乱，软骨细胞轻度减少，潮线基本清晰；给纤溶酶原组关节软骨表面基本正常，潮线清晰，骨小梁粗细均匀，生长板结构清晰，层次规则而可分。说明纤溶酶原能够改善ApoE动脉粥样硬化模型小鼠膝关节的状况。

图19给予纤溶酶原对C57卵巢切除及注射地塞米松诱导骨质疏松模型小鼠体重影响。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠体重明显轻于正常对照组，而给纤溶酶原组体重明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(P<0.05)。说明纤溶酶原能够显著促进卵巢切除及注射地塞米松诱导骨质疏松模型小鼠体重恢复。

图20给予纤溶酶原后C57卵巢切除及注射地塞米松诱导骨质疏松模型小鼠股骨Micro CT扫描测定结果。A为骨体积测量结果，B为骨矿物含量测量结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠股骨的松质骨、小梁骨以及总骨体积和骨矿物含量均大于给溶媒PBS对照组，且均统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能够促进骨质疏松模型小鼠股骨矿物质的沉积、骨体积增加，改善骨质疏松。

图21给予纤溶酶原C57卵巢切除及注射地塞米松诱导骨质疏松模型小鼠股骨Micro CT扫描测定结果。

图21A为股骨骨密度测量结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠股骨皮质骨、松质骨、小梁骨和总骨骨密度均小于正常对照组；而给纤溶酶原组小鼠各部分骨密度大于给溶媒PBS对照组。趋势明确，但由于小鼠数量少，造成统计差异只是接近显著。可预期增加小鼠数量会出现统计学差异。

图21B为股骨骨矿物含量测量结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠股骨各部分骨矿物含量均小于正常对照组；而给纤溶酶原组小鼠各部分骨矿物含量均大于给溶媒PBS对照组。趋势明确，但由于小鼠数量少，造成统计差异只是接近显著。可预期增加小鼠数量会出现统计学差异。

图21C为小梁骨体积测量结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠股骨的小梁骨体积小于正常对照组；而给纤溶酶原组小鼠股骨小梁骨体积大于给溶媒PBS对照组。趋势明确，但由于小鼠数量少，造成统计差异只是接近显著。可预期增加小鼠数量会出现统计学差异。

综上所述，纤溶酶原能够明显改善骨质疏松，促进股骨各部分骨密度和骨量的增加，并且对小梁骨改善作用尤为明显。

图22给予纤溶酶原C57卵巢切除及注射地塞米松诱导骨质疏松模型小鼠膝关节H&E染色和Safrain O染色代表性图片。A、C为给溶媒PBS组，B、D为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS组骨小梁(箭头标识)明显变细，断裂，出现较大面积的无骨小梁骨髓腔，髓腔增大，骨小梁的连接中断，生长板下骨细胞轻度减少(三角形标识)；给纤溶酶原组骨小梁部分变细，较之于PBS组，骨小梁连续性较好，较粗，没有较大面积的无骨小梁区域，软骨组织层次结构也较规则。说明给予纤溶酶原能明显改善骨质疏松模型小鼠膝关节的状况。

图23给予纤溶酶原C57卵巢切除及注射地塞米松诱导骨质疏松模型小鼠膝关节碱性磷酸酶染色代表性图片。A、C为给溶媒PBS对照组，B、D为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠膝关节软骨组织(细箭头标识)和生长板(粗箭头标识)碱性磷酸酶着色明显少于给纤溶酶原组。说明纤溶酶原促进骨质疏松模型小鼠膝关节成骨细胞活性增加。

图24给予纤溶酶原后Plg^+/+卵巢切除诱导的骨质疏松模型小鼠血清钙检测结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠血清钙浓度明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能够显著的降低卵巢切除骨质疏松模型小鼠血钙的浓度。

图25给予纤溶酶原后Plg^+/+卵巢切除诱导的骨质疏松模型小鼠血清磷检测结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠血清磷浓度明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能够显著的升高卵巢切除骨质疏松模型小鼠血磷的浓度。

图26给予纤溶酶原3％胆固醇高脂血症模型小鼠膝关节碱性磷酸酶染色结果。A、C为给溶媒PBS对照组，B、D为给纤溶酶原组，E为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠膝关节碱性磷酸酶着色(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原显著增加3％胆固醇高脂血症模型小鼠膝关节成骨细胞活性。

图27给予纤溶酶原C57卵巢切除及注射地塞米松诱导骨质疏松模型小鼠膝关节H&E染色和Safrain O染色代表性图片。A、C为给溶媒PBS组，B、D为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠膝关节骨小梁(箭头标识)明显变细，断裂，出现较大面积的无骨小梁骨髓腔，骨小梁的连接中断，关节表面部分纤维化，生长板下成骨区成骨组织明显减少(三角形标识)；给纤溶酶原组骨小梁部分变细，较之于PBS对照组，骨小梁连续性较好，没有较严重的断裂，没有较大面积的无骨小梁区域，软骨组织层次结构也较规则，潮线清晰。说明给予纤溶酶原能明显改善骨质疏松模型小鼠膝关节的状况。

实施例

材料与方法:

动物：C57小鼠和Plg^+/+以及Plg^-/-小鼠(Jackson Lab)用于相关实验。动物饲养于符合国标的实验动物使用环境。

试剂：维生素D(Sigma Aldrich，货号D1530)，玉米油(Sigma Aldrich，货号C8267，)，低钙特殊饲料(0.2％钙，1％磷酸盐，2000U维生素D3/kg，南通特洛菲饲料科技有限公司，15kg)，钙含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号C004-2)，人纤溶酶原(10mg/ml,纯化自健康血浆捐献者)。

Aloka Micro CT专用于小鼠、大鼠形态观察，采用最新的第三代X射线测量，短时间内即可获得高质量断层扫描图像。可用于骨测量(骨密度、骨矿物质含量、骨体积、骨微结构等)、体脂肪率测量、内脏、皮下脂肪的辨别及测量、同步摄影等。骨测量以小鼠股骨、头盖骨或腰椎骨为检测对象。小鼠处死后取材股骨、头盖骨和腰椎骨于4％多聚甲醛固定，采用Micro CT(Aloka,日本HITACHI公司生产)，对骨进行测定。

实施例1纤溶酶原缺乏与骨质疏松密切相关

15周龄野生型和纤溶酶原缺陷型(Plg^-/-)小鼠各5只。取膝关节于4％多聚甲醛固定24小时，然后10％EDTA中脱钙三周，梯度蔗糖溶液洗涤，以上操作需在4℃条件下进行。然后石蜡包埋，8μm切片行Safranin O染色。切片在200倍光学显微镜下观察。

结果显示，与野生型小鼠(图1A)相比，Plg^-/-小鼠(图1B)展现了广泛的骨质减少和骨髓细胞增加。

实施例2野生小鼠和纤溶酶原缺陷型小鼠的钙流失对比

15周龄野生型(wt)和纤溶酶原缺陷型(ko)小鼠各5只。两组小鼠摘除眼球取血，检测血钙浓度。在正常情况下，体内钙平衡受到非常精密的调节。然而，在骨质疏松的情况下，钙流失是骨质疏松的一个关键标志。我们研究在野生型和Plg^-/-小鼠中钙的水平发现，Plg^-/-(Ko)小鼠在15周龄时血钙水平显著高于野生型小鼠，且统计差异显著(*表示P<0.05)(图2)。

实施例3纤溶酶原对Plg^-/-小鼠膝组织结构的保护作用

20周龄的Plg^-/-小鼠8只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各4只。实验第1天称重分组并开始给纤溶酶原或溶媒PBS，给纤溶酶原组按1mg/0.1mL/只/天经尾静脉注射给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组尾静脉注射给予相同体积的PBS。连续给药30天，第31天处死小鼠，取膝关节于固定液中4℃固定24小时。固定液配方:2％多聚甲醛，0.075mol/L赖氨酸，0.01mol/L过碘酸钠。固定后4℃PBS洗液梯度洗涤各12小时，然后置于4℃脱钙液中脱钙2周，每5天换一次脱钙液。脱钙完成后4℃PBS洗液梯度洗涤12小时，膝关节经酒精梯度脱水、二甲苯透明浸蜡后进行石蜡包埋。切片厚度5um，切片脱蜡复水，并用苏木素和伊红染色(H&E染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，并酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

结果显示，给溶媒PBS对照组(图3A、C)，生长板(箭头标识)排列紊乱，部分骨髓腔内骨髓消失(三角形标识)；给纤溶酶原组(图3B、D)，生长板排列整齐。说明纤溶酶原能促进Plg^-/-小鼠膝关节生长板的生长。

实施例4纤溶酶原促进Plg^-/-小鼠膝关节关节软骨表面成骨细胞活性的增加

20周龄的Plg^-/-小鼠8只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各4只。实验第1天称重分组并开始给纤溶酶原或溶媒PBS，给纤溶酶原组按1mg/0.1mL/只/天经尾静脉注射给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。连续给药30天，第31处死小鼠，取股骨与固定液中4℃固定24小时。固定液配方:2％多聚甲醛，0.075mol/L赖氨酸，0.01mol/L过碘酸钠。固定后4℃PBS洗液梯度洗涤各12小时，然后置于4℃脱钙液中脱钙2周，每5天换一次脱钙液。脱钙完成后4℃PBS洗液梯度洗涤12小时，膝关节经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。切片5um，脱蜡复水，氯化镁缓冲液4℃孵育过夜。碱性磷酸酶底物溶液室温孵育1小时，苏木素复染2分钟。流水冲洗5分钟，60℃烤30分钟，中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是成骨细胞早期分化的标志^[33]。结果显示，给溶媒PBS对照组(图4A)关节软骨表面只有极少量的碱性磷酸酶着色(箭头标识)，而给纤溶酶原组(图4B)关节软骨表面却有较多的呈深红色的碱性磷酸酶着色。说明给纤溶酶原组关节软骨表面的碱性磷酸酶活性明显高于对照组，即纤溶酶原促使膝关节关节软骨的成骨细胞活性明显增加。

实施例5纤溶酶原促进Plg^-/-小鼠膝关节生长板成骨细胞活性的增加

20周龄的Plg^-/-小鼠8只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各4只。实验第1天称重分组并开始给纤溶酶原或溶媒PBS，给纤溶酶原组按1mg/0.1mL/只/天经尾静脉注射给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。连续给药30天，第31处死小鼠，取股骨与固定液中4℃固定24小时。固定液配方:2％多聚甲醛，0.075mol/L赖氨酸，0.01mol/L过碘酸钠。固定后4℃PBS洗液梯度洗涤各12小时，然后置于4℃脱钙液中脱钙2周，每5天换一次脱钙液。脱钙完成后4℃PBS洗液梯度洗涤12小时，股骨经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。切片5um，脱蜡复水，氯化镁缓冲液4℃孵育过夜。碱性磷酸酶底物溶液室温孵育1小时，苏木素复染2分钟。流水冲洗5分钟，60℃烤30分钟，中性树胶封片，在显微镜下200倍下观察拍照。

结果显示，给溶媒PBS对照组(图5A)在生长板成骨细胞活性处有碱性磷酸酶着色(箭头标识)，呈浅红色；给纤溶酶原组(图5B)在生长板处有较多碱性磷酸酶着色，呈深红色。说明给纤溶酶原之后，可以促进膝关节生长板的成骨细胞活性的增加。说明给纤溶酶原之后，可以促进膝关节生长板的成骨细胞活性的增加。

实施例6纤溶酶原改善维生素D诱导的衰老模型小鼠血清碱性磷酸酶活性

取5-6周龄的雄性C57小鼠25只，称重后随机分为3组，空白对照组5只，给纤溶酶原组10只和给溶媒PBS对照组10只。空白对照组小鼠每天腹腔注射50μl玉米油；给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组小鼠按照0.5μg/kg/天腹腔注射维生素D(Sigma Aldrich)，诱导衰老^[34,35]。与此同时小鼠开始给药，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，空白对照组小鼠不做给药处理，连续造模给药28天。给药期间空白对照组小鼠饲喂低钙饲料，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组小鼠饲喂低钙饲料。开始造模给药定为第1天，第29天摘除眼球取血，离心获得上清，用以检测血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性。

结果显示，给纤溶酶原组小鼠血清碱性磷酸酶活性明显高于给溶媒PBS对照组小鼠，且统计差异显著，并且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组小鼠血清碱性磷酸酶活性更加接近空白对照组小鼠(图6)。

血清ALP是一种同工酶糖蛋白，血清ALP主要来源于肝脏和骨骼，其中来源于骨骼的ALP占40％～75％。ALP活性测定主要用于诊断肝胆和骨骼系统疾病。临床上除肝脏疾患、妊娠等因素外，血清ALP还可反映成骨情况。骨代谢旺盛时成骨细胞活跃，ALP分泌量增加，存在于成骨细胞周围及其表面，极易释放入血中，使血清ALP活性上升，因此，血清ALP是骨重建活跃性改变的标志之一^[36]。

本研究中，给纤溶酶原组小鼠血清碱性磷酸酶活性明显高于给溶媒PBS对照组小鼠，且统计差异显著。这提示，纤溶酶原组能够显著促进维生素D衰老模型小鼠成骨细胞活性的增加。

实施例7纤溶酶原促进维生素D诱导的衰老模型小鼠膝关节生长板碱性磷酸酶活性增加

取5-6周龄的雄性C57小鼠15只，称重后随机分为3组，空白对照组、给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各5只。空白对照组小鼠每天腹腔注射50μl玉米油；给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组小鼠按照1μg/kg/天腹腔注射维生素D(Sigma Aldrich)，诱导衰老^[34,35]。与此同时小鼠开始给药，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，空白对照组小鼠不做给药处理，连续造模给药28天。给药期间所有小鼠饲喂低钙饲料(南通特诺菲)。开始造模给药定为第1天，第29天处死小鼠取材膝关节于固定液中固定24小时。固定液配方:2％多聚甲醛，0.075mol/L赖氨酸，0.01mol/L过碘酸钠。固定后4℃PBS洗液梯度洗涤各12小时，然后置于4℃脱钙液中脱钙2周，每5天换一次脱钙液。脱钙完成后4℃PBS洗液梯度洗涤12小时，膝关节经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。切片5um，脱蜡复水，氯化镁缓冲液4℃孵育过夜。碱性磷酸酶底物溶液室温孵育1小时，苏木素复染2分钟。流水冲洗5分钟，60℃烤30分钟，中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

结果显示，给溶媒PBS对照组(图7B)膝关节生长板碱性磷酸酶阳性着色(箭头标识)明显少于空白对照小鼠(图7A)；给纤溶酶原组(图7C)膝关节生长板碱性磷酸酶阳性着色明显高于给溶媒PBS对照组小鼠。说明纤溶酶原能够改善维生素D诱导的衰老模型小鼠膝关节生长板成骨细胞的活性。

实施例8纤溶酶原对头盖骨密度的影响

取12-13、20-21、29-30周龄的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5只，各组小鼠体重基本相同。小鼠在实验过程中都饲以同样的食物和水。取头盖骨于4％多聚甲醛固定24小时，进行Micro CT扫描，测定骨密度。

结果显示，随着周龄的增大，而Plg^+/+小鼠皮质骨密度(图8A)和总骨密度(图8B)有逐渐增加的趋势，而Plg^-/-小鼠头盖骨皮质骨密度和总骨密度逐渐降低。两个品系的小鼠骨密度在20-21周龄有极其显著差异，在29-30周龄时差异更加显著。说明纤溶酶原参与骨矿物质代谢调节，并在一定时期发挥重要作用。

骨质疏松是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征，致使骨脆性增加、易于骨折的一种全身性骨骼疾病。WHO建议采用骨密度(bone mineral density，BMD)测量结果诊断骨质疏松症^[37,38]。上述实验结果说明，说明纤溶酶原参与骨矿物质代谢调节，并在一定时期发挥重要作用。

实施例9纤溶酶原对头盖骨矿物含量的影响

取20-21周龄的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5只，小鼠体重基本相同。小鼠在实验过程中都饲以同样的食物和水。取头盖骨于4％多聚甲醛固定24小时，进行Micro CT扫描，测定骨矿物含量。

结果显示，结果显示，20-21周龄Plg^+/+小鼠皮质骨和总骨骨矿物含量明显高于Plg^/-小鼠，且统计差异极其显著或显著。说明纤溶酶原在头盖骨矿物含量调节上发挥重要作用，与骨质疏松密切相关。

实施例10纤溶酶原缺乏小鼠股骨密度降低

取12-13、20-21、29-30周龄的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5只，各组小鼠体重基本相同。小鼠在实验过程中都饲以同样的食物和水。取股骨于4％多聚甲醛固定24小时，进行Micro CT扫描，测定骨密度。

结果显示，在12-30周龄期间随着周龄增大Plg^+/+小鼠股骨密度逐渐增加，而Plg^-/-小鼠股骨皮质骨密度(10A)、松质骨密度(图10B)、小梁骨密度(图10C)以及总骨密度(图10D)逐渐减小。在此期间，Plg^+/+小鼠股骨密度高于Plg^-/-小鼠，在20周龄时两个品系小鼠骨密度差异显著，并且随着周龄增大，二者差异越来越显著。说明纤溶酶原参与股骨矿物质代谢调节，并在一定时期发挥重要作用。

实施例11纤溶酶原缺乏小鼠股骨矿物含量减少

取12-13、20-21、29-30周龄的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5只，各组小鼠体重基本相同。小鼠在实验过程中都饲以同样的食物和水。取股骨于4％多聚甲醛固定24小时，进行Micro CT扫描，测定骨矿物含量。

结果显示，在12-30周龄期间随着周龄增大Plg^+/+小鼠股骨不同部分矿物含量变化不大或逐步增加，而Plg^-/-小鼠股骨松质骨(11B)和小梁骨矿物含量逐渐减小。在此期间，Plg^+/+小鼠股骨矿物含量高于Plg^-/-小鼠，在20周龄时两个品系小鼠股骨皮质骨(11A)、小梁骨(11C)和总骨(11D)骨矿物含量差异显著，并且随着周龄增大，二者骨矿物含量差异越来越显著。说明纤溶酶原参与股骨矿物质代谢调节，并在一定时期发挥重要作用。

实施例12纤溶酶原缺乏小鼠腰椎骨密度降低

取12-13、20-21、29-30周龄的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5只，各组小鼠体重基本相同。小鼠在实验过程中都饲以同样的食物和水。取腰椎骨骨于4％多聚甲醛固定24小时，进行Micro CT扫描，测定骨密度。

结果显示，在12-30周龄期间随着周龄增大Plg^+/+小鼠腰椎骨骨密度逐渐增大，而Plg^-/-小鼠腰椎骨皮质骨密度(12A)、松质骨密度(图12B)、小梁骨密度(图12C)以及总骨密度(图12D)逐渐减小。在此期间，Plg^+/+小鼠骨密度高于Plg^-/-小鼠，在12周龄时两个品系小鼠腰椎骨骨密度差异显著，并且随着周龄的增大，二者差异越来越显著。说明纤溶酶原参与腰椎骨骨密度调节，并在一定时期发挥重要作用。

实施例13纤溶酶原缺乏小鼠腰椎骨矿物含量减少

取12-13、20-21、29-30周龄的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5只，各组小鼠体重基本相同。小鼠在实验过程中都饲以同样的食物和水。取腰椎骨于4％多聚甲醛固定24小时，进行Micro CT扫描，测定骨矿物含量。

结果显示，在12-30周龄期间随着周龄增大Plg^+/+小鼠腰椎骨矿物含量变化不大，而Plg^-/-小鼠腰椎骨皮质骨矿物含量(13A)、松质骨矿物含量(图13B)、小梁骨矿物含量(图13C)以及总骨矿物含量(图13D)逐渐减小。在此期间，Plg^+/+小鼠骨矿物含量高于Plg^-/-小鼠，在20周龄时两个品系小鼠腰椎骨松质骨和皮质骨区域矿物含量差异显著，并且随着周龄增大，二者差异越来越显著。说明纤溶酶原参与腰椎骨骨矿物质代谢调节，并在一定时期发挥重要作用。

实施例14纤溶酶原缺乏对小鼠血清碱性磷酸酶活性的影响

取12-13、20-21、29-30周龄的Plg^+/+小鼠和Plg^-/-小鼠各5只，各组小鼠体重基本相同。小鼠在实验过程中都饲以同样的食物和水。所有小鼠摘除眼球取血，离心取上清。用碱性磷酸酶检测试剂盒检测血清中碱性磷酸酶活性。

结果显示，Plg^+/+小鼠血清碱性磷酸酶活性在12-30周龄时虽有波动但变化并不显著，而Plg^-/-小鼠血清碱性磷酸酶的活性随着周龄的增大逐渐的降低；Plg^+/+小鼠血清碱性磷酸酶的活性明显高于Plg^-/-小鼠，两个品系小鼠血清碱性磷酸酶活性在12周龄时就出现明显的差异，并且随着周龄的增大，差异越来越显著(图14)。该结果提示纤溶酶原可能促进成骨细胞的活性，促进骨重建。

实施例15纤溶酶原降低动脉粥样硬化ApoE小鼠血钙浓度

6周龄ApoE雄性小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料16周，诱导动脉粥样硬化^[39,40]。在给药前三天每只小鼠取血50μL，检测总胆固醇浓度，并据其将小鼠随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只以及给纤溶酶原组6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，给药期间小鼠继续饲喂高脂饲料。在第30天小鼠禁食16小时，第31天摘除眼球取血，离心获得上清，用以检测血清钙的浓度。血钙检测采用钙检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号C004-2)并按照说明书方法进行检测。

结果显示，给纤溶酶原组小鼠血钙浓度要明显的低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(图15)。说明纤溶酶原能够降低ApoE动脉粥样硬化模型小鼠血钙的含量。

实施例16纤溶酶原改善动脉粥样硬化ApoE小鼠主动脉窦钙化

6周龄ApoE雄性小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲，TP2031)16周，诱导动脉粥样硬化^[39,40]。在给药前三天每只小鼠取血50μL，检测总胆固醇浓度，并据其将小鼠随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只以及给纤溶酶原组6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，给药期间小鼠继续饲喂高脂饲料。于给药的第31天处死小鼠，取材心脏于4％多聚甲醛固定24-48小时，15％、30％蔗糖脱水沉底，OCT包埋，冰冻切片厚度8μm，茜素红S染色3分钟。切片在40倍光学显微镜下观察。

茜素红染色能够显示钙化的程度。结果显示，给纤溶酶原组(图16B)小鼠主动脉窦钙沉积明显少于给溶媒PBS对照组(图16A)。说明纤溶酶原能够改善动脉粥样硬化中主动脉窦钙沉积。

实施例17纤溶酶原对AopE动脉粥样硬化模型小鼠股骨骨密度的影响

6周龄AopE雄性小鼠19只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲，TP2031)16周，诱导动脉粥样硬化^[39,40]。在给药前三天每只小鼠取血50μL，检测总胆固醇浓度，并据其将小鼠随机分为两组，给溶媒PBS对照组9只以及给纤溶酶原组10只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，给药期间小鼠继续饲喂高脂饲料。于给药的第11天每组各取5只小鼠，处死后取材股骨于4％多聚甲醛固定。给药的31天处死剩余小鼠，取材股骨于4％多聚甲醛固定。取材的股骨进行Micro CT扫描，测定骨密度。

动脉粥样硬化与骨质疏松相关性早已有报道，高血脂是动脉粥样硬化的重要致病因素。近来研究表明，载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)不仅影响脂代谢，而且与骨密度、骨丢失以及骨质疏松性骨折有关^[41,42]。

结果显示，给药10天后给纤溶酶原组小鼠股骨密度明显高于给溶媒PBS对照组，且松质骨密度(图17B)和总骨密度(图17D)差异显著(*表示P<0.05)；给药30天后给纤溶酶原组小鼠松质骨密度、小梁骨密度(图17C)和总骨密度相较于给溶媒PBS对照组显著升高，且统计差异显著(*表示P<0.05)。皮质骨密度(图17A)两组无明显差异。说明纤溶酶原能够促进动脉粥样硬化模型小鼠骨密度升高，改善动脉粥样硬化伴随的骨质疏松。

已有研究表明，血管钙化的本质是血管平滑肌细胞向成骨细胞表型的转化以及血管组织向骨组织的转化。而血管钙化的形成也和骨矿物质丢失具有显著的相关性^[10]。综合上述实施例16和17的实验结果可以看出，纤溶酶原能够在降低动脉壁钙沉积的同时增强骨密度。对骨质疏松症及心血管疾病的防治具有重要意义。

实施例18纤溶酶原对AopE动脉粥样硬化模型小鼠膝关节组织结构的保护作用

6周龄AopE雄性小鼠7只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲，TP2031)16周，诱导动脉粥样硬化^[39,40]。在给药前三天每只小鼠取血50μL，检测总胆固醇浓度，并据其将小鼠随机分为两组，给溶媒PBS对照组3只以及给纤溶酶原组4只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，给药期间小鼠继续饲喂高脂饲料。于给药的31天处死小鼠，取材股骨于4％多聚甲醛固定。然后用酸性脱钙液(用超纯水配制体积分数为8％盐酸和10％甲酸的脱钙液)脱钙3.5小时。然后石蜡包埋，8μm切片行H&E染色，切片在100倍(A、D)、200倍(B、C、E、F)光学显微镜下观察。

结果显示，给溶媒PBS对照组(图18A-C)软骨表面轻度纤维化(细箭头标识)，骨小梁(三角标识)明显变细，粗细不均匀，软骨组织(星形标识)排列紊乱，生长板(粗箭头标识)层次紊乱，软骨细胞轻度减少，潮线基本清晰；给纤溶酶原组(图18D-F)关节软骨表面基本正常，潮线清晰，骨小梁粗细均匀，生长板结构清晰，层次规则而可分。说明纤溶酶原能够改善ApoE动脉粥样硬化模型小鼠膝关节的状况。

实施例19纤溶酶原对卵巢切除-地塞米松骨质疏松模型小鼠体重的影响

8-10周龄C57雌性小鼠17只称量体重，小鼠根据体重随机分为两组，正常对照组3只和模型组14只。模型组小鼠按照50mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，小鼠脱去背部两侧毛发以70％的酒精以及碘酊消毒，切开皮肤、背部肌肉和腹膜，以小镊子轻轻将白色发亮脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到卵巢。先将卵巢下端输卵管用丝线结扎，然后摘除卵巢。切口缝合后，外部敷以消炎粉。同法摘除另一侧卵巢。正常对照小鼠仅在相同位置切开，不做卵巢切除。卵巢切除14天后，模型组小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各7只。模型组小鼠按照125μg/只腹腔注射地塞米松，5天/周注射频率，共注射12天诱导骨质疏松^[43]，正常对照组小鼠不做注射处理。注射地塞米松的同时小鼠开始给药，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药16天，正常对照组小鼠不注射纤溶酶原或PBS。开始给药定为第1天，第17天测量小鼠体重。

结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠体重明显轻于正常对照组，而给纤溶酶原组体重明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(P<0.05)(图19)。说明纤溶酶原能够显著促进卵巢切除及注射地塞米松诱导骨质疏松模型小鼠体重恢复。

实施例20纤溶酶原对卵巢切除-地塞米松骨质疏松模型小鼠股骨的影响

8-10周龄C57雌性小鼠14只称量体重。所有小鼠按照50mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，小鼠脱去背部两侧毛发以70％的酒精以及碘酊消毒，切开皮肤、背部肌肉和腹膜，以小镊子轻轻将白色发亮脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到卵巢。先将卵巢下端输卵管用丝线结扎，然后摘除卵巢。切口缝合后，外部敷以消炎粉。同法摘除另一侧卵巢。卵巢切除14天后，小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各7只。两组小鼠按照125μg/只腹腔注射地塞米松，5天/周注射频率，共注射12天诱导骨质疏松^[43]。造模同时小鼠开始给药，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药16天。开始给药定为第1天，第17天处死取材股骨于4％多聚甲醛固定液中固定。进行Micro CT扫描，测定股骨各项指标。

结果显示，给纤溶酶原组小鼠股骨的松质骨、小梁骨以及总骨体积(图20A)和骨矿物含量(图20B)均大于给溶媒PBS对照组，且均统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能够促进骨质疏松模型小鼠股骨的松质骨、小梁骨和总骨体积的增加及矿物质的沉积，改善骨质疏松。

实施例21纤溶酶原改善卵巢切除-地塞米松骨质疏松模型小鼠股骨结构

8-10周龄C57雌性小鼠17只称量体重，小鼠根据体重随机分为两组，正常对照组3只和模型组14只。模型组小鼠按照50mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，小鼠脱去背部两侧毛发以70％的酒精以及碘酊消毒，切开皮肤、背部肌肉和腹膜，以小镊子轻轻将白色发亮脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到卵巢。先将卵巢下端输卵管用丝线结扎，然后摘除卵巢。切口缝合后，外部敷以消炎粉。同法摘除另一侧卵巢。正常对照小鼠仅在相同位置切开，不做卵巢切除。卵巢切除14天后，模型组小鼠按照125μg/只腹腔注射地塞米松，5天/周注射频率，共注射12天诱导骨质疏松^[43]，正常对照组小鼠不做注射处理。地塞米松注射完成后，模型组小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各7只。模型建立后(地塞米松注射完成第二天)，小鼠开始给药。给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药16天，正常对照组小鼠不注射纤溶酶原或PBS。开始给药定为第1天，第17天处死取材股骨于4％多聚甲醛固定液中固定。取材的股骨进行Micro CT扫描，测定股骨密度。

骨密度

结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠股骨皮质骨、松质骨、小梁骨和总骨骨密度均小于正常对照组；而给纤溶酶原组小鼠各部分骨密度大于给溶媒PBS对照组。趋势明确，但由于小鼠数量少，造成统计差异只是接近显著。可预期增加小鼠数量会出现统计学差异(图21A)。

骨矿物含量

结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠股骨各部分骨矿物含量均小于正常对照组；而给纤溶酶原组小鼠各部分骨矿物含量均大于给溶媒PBS对照组。趋势明确，但由于小鼠数量少，造成统计差异只是接近显著。可预期增加小鼠数量会出现统计学差异(图21B)。

骨体积

结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠股骨的小梁骨体积小于正常对照组；而给纤溶酶原组小鼠股骨小梁骨体积大于给溶媒PBS对照组。趋势明确，但由于小鼠数量少，造成统计差异只是接近显著。可预期增加小鼠数量会出现统计学差异(图21C)。

综上所述，纤溶酶原能够明显改善骨质疏松，促进股骨各部分骨密度和骨量的增加，并且对小梁骨改善作用尤为明显。

实施例22纤溶酶原改善卵巢切除-地塞米松骨质疏松模型小鼠膝关节组织结构的状况

8-10周龄C57雌性小鼠14只称量体重。所有小鼠按照50mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，小鼠脱去背部两侧毛发以70％的酒精以及碘酊消毒，切开皮肤、背部肌肉和腹膜，以小镊子轻轻将白色发亮脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到卵巢。先将卵巢下端输卵管用丝线结扎，然后摘除卵巢。切口缝合后，外部敷以消炎粉。同法摘除另一侧卵巢。卵巢切除14天后，小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各7只。两组小鼠按照125μg/只腹腔注射地塞米松，5天/周注射频率，共注射12天诱导骨质疏松^[43]。造模同时小鼠开始给药，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药16天。开始给药定为第1天，第17天处死取材膝关节于4％多聚甲醛固定液中固定。然后用酸性脱钙液(用超纯水配制体积分数为8％盐酸和10％甲酸的脱钙液)脱钙3.5小时。然后石蜡包埋，3μm切片行H&E(A、B)和Safrain O染色(C、D)，切片在100倍光学显微镜下观察。

结果显示，给溶媒PBS组(图22A、C)小鼠膝关节骨小梁(箭头标识)明显变细，断裂，出现较大面积的无骨小梁骨髓腔，髓腔增大，骨小梁的连接中断，生长板下骨细胞轻度减少(三角形标识)；给纤溶酶原组(图22B、D)骨小梁部分变细，较之于PBS组，骨小梁连续性较好，较粗，没有较大面积的无骨小梁区域，软骨组织层次结构也较规则。说明纤溶酶原能明显改善骨质疏松模型小鼠膝关节组织结构的状况。

实施例23纤溶酶原增加卵巢切除-地塞米松骨质疏松模型小鼠膝关节成骨细胞活性

8-10周龄C57雌性小鼠14只称量体重。所有小鼠按照50mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，小鼠脱去背部两侧毛发以70％的酒精以及碘酊消毒，切开皮肤、背部肌肉和腹膜，以小镊子轻轻将白色发亮脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到卵巢。先将卵巢下端输卵管用丝线结扎，然后摘除卵巢。切口缝合后，外部敷以消炎粉。同法摘除另一侧卵巢。卵巢切除14天后，小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各7只。两组小鼠按照125μg/只腹腔注射地塞米松，5天/周注射频率，共注射12天诱导骨质疏松^[43]。造模同时小鼠开始给药，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药16天。开始给药定为第1天，第17天处死小鼠取材膝关节于固定液中固定。固定液配方:2％多聚甲醛，0.075mol/L赖氨酸，0.01mol/L过碘酸钠。固定后4℃PBS洗液梯度洗涤各12小时，然后置于4℃脱钙液中脱钙2周，每5天换一次脱钙液。脱钙完成后4℃PBS洗液梯度洗涤12小时，膝关节经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。切片3um，脱蜡复水，氯化镁缓冲液4℃孵育过夜。碱性磷酸酶底物溶液室温孵育1小时，苏木素复染2分钟。流水冲洗5分钟，60℃烤30分钟，中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠(图23A、C)膝关节软骨组织(细箭头标识)和生长板(粗箭头标识)碱性磷酸酶着色明显少于给纤溶酶原组(图23B、D)。说明纤溶酶原促进骨质疏松模型小鼠膝关节成骨细胞活性增加。

实施例24纤溶酶原降低卵巢切除骨质疏松模型小鼠血钙浓度

8-10周龄Plg^+/+雌性小鼠11只。小鼠按照50mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，小鼠脱去背部两侧毛发以70％的酒精以及碘酊消毒，切开皮肤、背部肌肉和腹膜，以小镊子轻轻将白色发亮脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到卵巢。先将卵巢下端输卵管用丝线结扎，然后摘除卵巢。切口缝合后，外部敷以消炎粉。同法摘除另一侧卵巢^[44,45]。卵巢切除65天后，小鼠称重，并根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组6只和给溶媒PBS对照组5只，并开始给药。给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药11天。开始给药定为第1天，第12天摘除眼球取血，离心取上清，检测血钙浓度。血钙检测采用钙检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号C004-2)并按照说明书方法进行检测。

结果显示，给纤溶酶原组小鼠血清钙浓度明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)(图24)。说明纤溶酶原能够明显地降低卵巢切除骨质疏松模型小鼠血钙的浓度。

实施例25纤溶酶原升高卵巢切除骨质疏松模型小鼠血磷浓度

8-10周龄Plg^+/+雌性小鼠11只。小鼠按照50mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，小鼠脱去背部两侧毛发以70％的酒精以及碘酊消毒，切开皮肤、背部肌肉和腹膜，以小镊子轻轻将白色发亮脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到卵巢。先将卵巢下端输卵管用丝线结扎，然后摘除卵巢。切口缝合后，外部敷以消炎粉。同法摘除另一侧卵巢^[44,45]。卵巢切除65天后，小鼠称重，并根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组6只和给溶媒PBS对照组5只，并开始给药。给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药11天。开始给药定为第1天，第12天摘除眼球取血，离心取上清，检测血磷浓度。血磷检测采用磷检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号C006-3)并按照说明书方法进行检测。

结果显示，给纤溶酶原组小鼠血清磷浓度明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)(图25)。说明纤溶酶原能够明显的升高卵巢切除骨质疏松模型小鼠血磷的浓度。

实施例26纤溶酶原增加3％胆固醇高脂血症模型小鼠膝关节成骨细胞活性

9周龄雄性C57小鼠16只饲喂3％胆固醇高脂饲料(南通特洛菲)4周，诱导高脂血症^[46,47]，此模型定为3％胆固醇高脂血症模型。成模后的小鼠继续饲喂3％胆固醇高脂饲料。在给药前三天每只小鼠取血50μL，检测总胆固醇，并根据总胆固醇浓度和体重随机分为两组，每组各8只。开始给药记为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，给药20天。在第20天小鼠禁食16小时，第21天处死小鼠取材膝关节于固定液中固定。固定液配方:2％多聚甲醛，0.075mol/L赖氨酸，0.01mol/L过碘酸钠。固定后4℃PBS洗液梯度洗涤各12小时，然后置于4℃脱钙液中脱钙2周，每5天换一次脱钙液。脱钙完成后4℃PBS洗液梯度洗涤12小时，膝关节经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。切片3um，脱蜡复水，氯化镁缓冲液4℃孵育过夜。碱性磷酸酶底物溶液室温孵育1小时，苏木素复染2分钟。流水冲洗5分钟，60℃烤30分钟，中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

高脂血症是一种脂代谢紊乱，并能引起一系列并发症的疾病。近年来多项研究发现高脂血脂是骨质疏松和动脉粥样硬化的共同病因^[48,49]。

结果显示，给纤溶酶原组(图26B、D)小鼠膝关节碱性磷酸酶着色(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组(图26A、C)，且统计差异显著(图26E)。说明纤溶酶原增加3％胆固醇高脂血症模型小鼠膝关节成骨细胞活性。

实施例27纤溶酶原改善卵巢切除-地塞米松骨质疏松模型小鼠膝关节组织结构状况

8-10周龄C57雌性小鼠14只称量体重。小鼠按照50mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，小鼠脱去背部两侧毛发以70％的酒精以及碘酊消毒，切开皮肤、背部肌肉和腹膜，以小镊子轻轻将白色发亮脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到卵巢。先将卵巢下端输卵管用丝线结扎，然后摘除卵巢。切口缝合后，外部敷以消炎粉。同法摘除另一侧卵巢。卵巢切除14天后，模型组小鼠按照125μg/只腹腔注射地塞米松，5天/周注射频率，共注射12天诱导骨质疏松^[43]。地塞米松注射完成后，小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各7只。模型建立后(地塞米松注射完成第二天)，小鼠开始给药。给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药16天。开始给药定为第1天，第17天处死取材膝关节于4％多聚甲醛固定液中固定。然后用酸性脱钙液(用超纯水配制体积分数为8％盐酸和10％甲酸的脱钙液)脱钙3.5小时。然后石蜡包埋，3μm切片行H&E(A、B)和Safrain O染色(C、D)，切片在100倍光学显微镜下观察。

结果显示，给溶媒PBS对照组(图27A、C)小鼠骨小梁(箭头标识)明显变细，断裂，出现较大面积的无骨小梁骨髓腔，骨小梁的连接中断，关节表面部分纤维化，生长板下成骨区成骨组织明显减少(三角形标识)；给纤溶酶原组(图27B、D)骨小梁部分变细，较之于PBS对照组，骨小梁连续性较好，没有较严重的断裂，没有较大面积的无骨小梁区域，软骨组织层次结构也较规则，潮线清晰。说明给予纤溶酶原能明显改善骨质疏松模型小鼠膝关节的组织结构状况。

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序列表

<110> 深圳瑞健生命科学研究院有限公司

<120> 一种预防和治疗骨质疏松的药物及其用途

<150> 2016111613662

<151> 2016-12-15

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原核酸序列)

<400> 1

gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60

cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120

acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180

aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240

ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300

aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360

gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420

caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480

gagtgtgaag aggaatgtat gcattgcagt ggagaaaact atgacggcaa aatttccaag 540

accatgtctg gactggaatg ccaggcctgg gactctcaga gcccacacgc tcatggatac 600

attccttcca aatttccaaa caagaacctg aagaagaatt actgtcgtaa ccccgatagg 660

gagctgcggc cttggtgttt caccaccgac cccaacaagc gctgggaact ttgtgacatc 720

ccccgctgca caacacctcc accatcttct ggtcccacct accagtgtct gaagggaaca 780

ggtgaaaact atcgcgggaa tgtggctgtt accgtgtccg ggcacacctg tcagcactgg 840

agtgcacaga cccctcacac acataacagg acaccagaaa acttcccctg caaaaatttg 900

gatgaaaact actgccgcaa tcctgacgga aaaagggccc catggtgcca tacaaccaac 960

agccaagtgc ggtgggagta ctgtaagata ccgtcctgtg actcctcccc agtatccacg 1020

gaacaattgg ctcccacagc accacctgag ctaacccctg tggtccagga ctgctaccat 1080

ggtgatggac agagctaccg aggcacatcc tccaccacca ccacaggaaa gaagtgtcag 1140

tcttggtcat ctatgacacc acaccggcac cagaagaccc cagaaaacta cccaaatgct 1200

ggcctgacaa tgaactactg caggaatcca gatgccgata aaggcccctg gtgttttacc 1260

acagacccca gcgtcaggtg ggagtactgc aacctgaaaa aatgctcagg aacagaagcg 1320

agtgttgtag cacctccgcc tgttgtcctg cttccagatg tagagactcc ttccgaagaa 1380

gactgtatgt ttgggaatgg gaaaggatac cgaggcaaga gggcgaccac tgttactggg 1440

acgccatgcc aggactgggc tgcccaggag ccccatagac acagcatttt cactccagag 1500

acaaatccac gggcgggtct ggaaaaaaat tactgccgta accctgatgg tgatgtaggt 1560

ggtccctggt gctacacgac aaatccaaga aaactttacg actactgtga tgtccctcag 1620

tgtgcggccc cttcatttga ttgtgggaag cctcaagtgg agccgaagaa atgtcctgga 1680

agggttgtag gggggtgtgt ggcccaccca cattcctggc cctggcaagt cagtcttaga 1740

acaaggtttg gaatgcactt ctgtggaggc accttgatat ccccagagtg ggtgttgact 1800

gctgcccact gcttggagaa gtccccaagg ccttcatcct acaaggtcat cctgggtgca 1860

caccaagaag tgaatctcga accgcatgtt caggaaatag aagtgtctag gctgttcttg 1920

gagcccacac gaaaagatat tgccttgcta aagctaagca gtcctgccgt catcactgac 1980

aaagtaatcc cagcttgtct gccatcccca aattatgtgg tcgctgaccg gaccgaatgt 2040

ttcatcactg gctggggaga aacccaaggt acttttggag ctggccttct caaggaagcc 2100

cagctccctg tgattgagaa taaagtgtgc aatcgctatg agtttctgaa tggaagagtc 2160

caatccaccg aactctgtgc tgggcatttg gccggaggca ctgacagttg ccagggtgac 2220

agtggaggtc ctctggtttg cttcgagaag gacaaataca ttttacaagg agtcacttct 2280

tggggtcttg gctgtgcacg ccccaataag cctggtgtct atgttcgtgt ttcaaggttt 2340

gttacttgga ttgagggagt gatgagaaat aattaa 2376

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原氨基酸序列)

<400> 2

Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala

20 25 30

Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His

35 40 45

Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met

85 90 95

Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser

100 105 110

Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu

115 120 125

Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp

130 135 140

Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu

145 150 155 160

Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly

165 170 175

Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser

180 185 190

Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys

195 200 205

Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro

210 215 220

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile

225 230 235 240

Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys

245 250 255

Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr Val

260 265 270

Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr His

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Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr

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Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn

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Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser

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Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr

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Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly

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Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val

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Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly

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Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile

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Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln

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Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu

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Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala

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<212> DNA

<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原(来源于swiss prot的核酸序列)

<400> 3

atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagg tcaaggagag 60

cctctggatg actatgtgaa tacccagggg gcttcactgt tcagtgtcac taagaagcag 120

ctgggagcag gaagtataga agaatgtgca gcaaaatgtg aggaggacga agaattcacc 180

tgcagggcat tccaatatca cagtaaagag caacaatgtg tgataatggc tgaaaacagg 240

aagtcctcca taatcattag gatgagagat gtagttttat ttgaaaagaa agtgtatctc 300

tcagagtgca agactgggaa tggaaagaac tacagaggga cgatgtccaa aacaaaaaat 360

ggcatcacct gtcaaaaatg gagttccact tctccccaca gacctagatt ctcacctgct 420

acacacccct cagagggact ggaggagaac tactgcagga atccagacaa cgatccgcag 480

gggccctggt gctatactac tgatccagaa aagagatatg actactgcga cattcttgag 540

tgtgaagagg aatgtatgca ttgcagtgga gaaaactatg acggcaaaat ttccaagacc 600

atgtctggac tggaatgcca ggcctgggac tctcagagcc cacacgctca tggatacatt 660

ccttccaaat ttccaaacaa gaacctgaag aagaattact gtcgtaaccc cgatagggag 720

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gaaaactact gccgcaatcc tgacggaaaa agggccccat ggtgccatac aaccaacagc 1020

caagtgcggt gggagtactg taagataccg tcctgtgact cctccccagt atccacggaa 1080

caattggctc ccacagcacc acctgagcta acccctgtgg tccaggactg ctaccatggt 1140

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gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 1920

caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 1980

cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 2040

gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 2100

atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 2160

ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 2220

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ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 2400

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<212> PRT

<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原(来源于swiss prot的氨基酸序列)

<400> 4

Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser

1 5 10 15

Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser

20 25 30

Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu

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Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys

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Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln

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165 170 175

Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn

180 185 190

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Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe

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Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu

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Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu

245 250 255

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Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala

275 280 285

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His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp

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Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His

325 330 335

Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys

340 345 350

Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro

355 360 365

Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser

370 375 380

Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser

385 390 395 400

Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr

405 410 415

Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp

420 425 430

Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr

435 440 445

Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro

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Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp

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Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr

485 490 495

Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg

500 505 510

His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys

515 520 525

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr

530 535 540

Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys

545 550 555 560

Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys

565 570 575

Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp

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595 600 605

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Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg

645 650 655

Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser

660 665 670

Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser

675 680 685

Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp

690 695 700

Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln

705 710 715 720

Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn

725 730 735

Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly

740 745 750

Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu

755 760 765

Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys

770 775 780

Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val

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<211> 2145

<212> DNA

<213> LYS77-PLG(Lys-纤溶酶原核酸序列)

<400> 5

aaagtgtatc tctcagagtg caagactggg aatggaaaga actacagagg gacgatgtcc 60

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aacgatccgc aggggccctg gtgctatact actgatccag aaaagagata tgactactgc 240

gacattcttg agtgtgaaga ggaatgtatg cattgcagtg gagaaaacta tgacggcaaa 300

atttccaaga ccatgtctgg actggaatgc caggcctggg actctcagag cccacacgct 360

catggataca ttccttccaa atttccaaac aagaacctga agaagaatta ctgtcgtaac 420

cccgataggg agctgcggcc ttggtgtttc accaccgacc ccaacaagcg ctgggaactt 480

tgtgacatcc cccgctgcac aacacctcca ccatcttctg gtcccaccta ccagtgtctg 540

aagggaacag gtgaaaacta tcgcgggaat gtggctgtta ccgtgtccgg gcacacctgt 600

cagcactgga gtgcacagac ccctcacaca cataacagga caccagaaaa cttcccctgc 660

aaaaatttgg atgaaaacta ctgccgcaat cctgacggaa aaagggcccc atggtgccat 720

acaaccaaca gccaagtgcg gtgggagtac tgtaagatac cgtcctgtga ctcctcccca 780

gtatccacgg aacaattggc tcccacagca ccacctgagc taacccctgt ggtccaggac 840

tgctaccatg gtgatggaca gagctaccga ggcacatcct ccaccaccac cacaggaaag 900

aagtgtcagt cttggtcatc tatgacacca caccggcacc agaagacccc agaaaactac 960

ccaaatgctg gcctgacaat gaactactgc aggaatccag atgccgataa aggcccctgg 1020

tgttttacca cagaccccag cgtcaggtgg gagtactgca acctgaaaaa atgctcagga 1080

acagaagcga gtgttgtagc acctccgcct gttgtcctgc ttccagatgt agagactcct 1140

tccgaagaag actgtatgtt tgggaatggg aaaggatacc gaggcaagag ggcgaccact 1200

gttactggga cgccatgcca ggactgggct gcccaggagc cccatagaca cagcattttc 1260

actccagaga caaatccacg ggcgggtctg gaaaaaaatt actgccgtaa ccctgatggt 1320

gatgtaggtg gtccctggtg ctacacgaca aatccaagaa aactttacga ctactgtgat 1380

gtccctcagt gtgcggcccc ttcatttgat tgtgggaagc ctcaagtgga gccgaagaaa 1440

tgtcctggaa gggttgtagg ggggtgtgtg gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc 1500

agtcttagaa caaggtttgg aatgcacttc tgtggaggca ccttgatatc cccagagtgg 1560

gtgttgactg ctgcccactg cttggagaag tccccaaggc cttcatccta caaggtcatc 1620

ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgaa ccgcatgttc aggaaataga agtgtctagg 1680

ctgttcttgg agcccacacg aaaagatatt gccttgctaa agctaagcag tcctgccgtc 1740

atcactgaca aagtaatccc agcttgtctg ccatccccaa attatgtggt cgctgaccgg 1800

accgaatgtt tcatcactgg ctggggagaa acccaaggta cttttggagc tggccttctc 1860

aaggaagccc agctccctgt gattgagaat aaagtgtgca atcgctatga gtttctgaat 1920

ggaagagtcc aatccaccga actctgtgct gggcatttgg ccggaggcac tgacagttgc 1980

cagggtgaca gtggaggtcc tctggtttgc ttcgagaagg acaaatacat tttacaagga 2040

gtcacttctt ggggtcttgg ctgtgcacgc cccaataagc ctggtgtcta tgttcgtgtt 2100

tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata attaa 2145

<210> 6

<211> 714

<212> PRT

<213> LYS77-PLG(Lys-纤溶酶原氨基酸序列)

<400> 6

Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg

1 5 10 15

Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser

20 25 30

Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser

35 40 45

Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln

50 55 60

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys

65 70 75 80

Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn

85 90 95

Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala

100 105 110

Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe

115 120 125

Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu

130 135 140

Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu

145 150 155 160

Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr

165 170 175

Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala

180 185 190

Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro

195 200 205

His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp

210 215 220

Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His

225 230 235 240

Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys

245 250 255

Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro

260 265 270

Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser

275 280 285

Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser

290 295 300

Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr

305 310 315 320

Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp

325 330 335

Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr

340 345 350

Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro

355 360 365

Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp

370 375 380

Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr

385 390 395 400

Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg

405 410 415

His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys

420 425 430

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr

435 440 445

Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys

450 455 460

Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys

465 470 475 480

Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp

485 490 495

Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly

500 505 510

Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu

515 520 525

Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His

530 535 540

Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg

545 550 555 560

Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser

565 570 575

Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser

580 585 590

Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp

595 600 605

Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln

610 615 620

Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn

625 630 635 640

Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly

645 650 655

Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu

660 665 670

Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys

675 680 685

Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val

690 695 700

Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

705 710

<210> 7

<211> 1245

<212> DNA

<213> delta-plg(delta-纤溶酶原核酸序列)

<400> 7

gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60

cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120

acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180

aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240

ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300

aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360

gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420

caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480

gagtgtgaag aggcggcccc ttcatttgat tgtgggaagc ctcaagtgga gccgaagaaa 540

tgtcctggaa gggttgtagg ggggtgtgtg gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc 600

agtcttagaa caaggtttgg aatgcacttc tgtggaggca ccttgatatc cccagagtgg 660

gtgttgactg ctgcccactg cttggagaag tccccaaggc cttcatccta caaggtcatc 720

ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgaa ccgcatgttc aggaaataga agtgtctagg 780

ctgttcttgg agcccacacg aaaagatatt gccttgctaa agctaagcag tcctgccgtc 840

atcactgaca aagtaatccc agcttgtctg ccatccccaa attatgtggt cgctgaccgg 900

accgaatgtt tcatcactgg ctggggagaa acccaaggta cttttggagc tggccttctc 960

aaggaagccc agctccctgt gattgagaat aaagtgtgca atcgctatga gtttctgaat 1020

ggaagagtcc aatccaccga actctgtgct gggcatttgg ccggaggcac tgacagttgc 1080

cagggtgaca gtggaggtcc tctggtttgc ttcgagaagg acaaatacat tttacaagga 1140

gtcacttctt ggggtcttgg ctgtgcacgc cccaataagc ctggtgtcta tgttcgtgtt 1200

tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata attaa 1245

<210> 8

<211> 414

<212> PRT

<213> delta-plg(delta-纤溶酶原氨基酸序列)

<400> 8

Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala

20 25 30

Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His

35 40 45

Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met

85 90 95

Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser

100 105 110

Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu

115 120 125

Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp

130 135 140

Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu

145 150 155 160

Glu Cys Glu Glu Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val

165 170 175

Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His

180 185 190

Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met

195 200 205

His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala

210 215 220

Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile

225 230 235 240

Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile

245 250 255

Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu

260 265 270

Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala

275 280 285

Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe

290 295 300

Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu

305 310 315 320

Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr

325 330 335

Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His

340 345 350

Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu

355 360 365

Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp

370 375 380

Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val

385 390 395 400

Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

405 410

<210> 9

<211> 1104

<212> DNA

<213> Mini-plg(小纤维蛋白溶酶原核酸序列)

<400> 9

gtcaggtggg agtactgcaa cctgaaaaaa tgctcaggaa cagaagcgag tgttgtagca 60

cctccgcctg ttgtcctgct tccagatgta gagactcctt ccgaagaaga ctgtatgttt 120

gggaatggga aaggataccg aggcaagagg gcgaccactg ttactgggac gccatgccag 180

gactgggctg cccaggagcc ccatagacac agcattttca ctccagagac aaatccacgg 240

gcgggtctgg aaaaaaatta ctgccgtaac cctgatggtg atgtaggtgg tccctggtgc 300

tacacgacaa atccaagaaa actttacgac tactgtgatg tccctcagtg tgcggcccct 360

tcatttgatt gtgggaagcc tcaagtggag ccgaagaaat gtcctggaag ggttgtaggg 420

gggtgtgtgg cccacccaca ttcctggccc tggcaagtca gtcttagaac aaggtttgga 480

atgcacttct gtggaggcac cttgatatcc ccagagtggg tgttgactgc tgcccactgc 540

ttggagaagt ccccaaggcc ttcatcctac aaggtcatcc tgggtgcaca ccaagaagtg 600

aatctcgaac cgcatgttca ggaaatagaa gtgtctaggc tgttcttgga gcccacacga 660

aaagatattg ccttgctaaa gctaagcagt cctgccgtca tcactgacaa agtaatccca 720

gcttgtctgc catccccaaa ttatgtggtc gctgaccgga ccgaatgttt catcactggc 780

tggggagaaa cccaaggtac ttttggagct ggccttctca aggaagccca gctccctgtg 840

attgagaata aagtgtgcaa tcgctatgag tttctgaatg gaagagtcca atccaccgaa 900

ctctgtgctg ggcatttggc cggaggcact gacagttgcc agggtgacag tggaggtcct 960

ctggtttgct tcgagaagga caaatacatt ttacaaggag tcacttcttg gggtcttggc 1020

tgtgcacgcc ccaataagcc tggtgtctat gttcgtgttt caaggtttgt tacttggatt 1080

gagggagtga tgagaaataa ttaa 1104

<210> 10

<211> 367

<212> PRT

<213> Mini-plg(小纤维蛋白溶酶原氨基酸序列)

<400> 10

Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala

1 5 10 15

Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr

20 25 30

Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly

35 40 45

Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala

50 55 60

Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg

65 70 75 80

Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly

85 90 95

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys

100 105 110

Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln

115 120 125

Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala

130 135 140

His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly

145 150 155 160

Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr

165 170 175

Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val

180 185 190

Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu

195 200 205

Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala

210 215 220

Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro

225 230 235 240

Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys

245 250 255

Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu

260 265 270

Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg

275 280 285

Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly

290 295 300

His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

305 310 315 320

Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser

325 330 335

Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg

340 345 350

Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

355 360 365

<210> 11

<211> 750

<212> DNA

<213> Micro-plg(微纤维蛋白溶酶原核酸序列)

<400> 11

gccccttcat ttgattgtgg gaagcctcaa gtggagccga agaaatgtcc tggaagggtt 60

gtaggggggt gtgtggccca cccacattcc tggccctggc aagtcagtct tagaacaagg 120

tttggaatgc acttctgtgg aggcaccttg atatccccag agtgggtgtt gactgctgcc 180

cactgcttgg agaagtcccc aaggccttca tcctacaagg tcatcctggg tgcacaccaa 240

gaagtgaatc tcgaaccgca tgttcaggaa atagaagtgt ctaggctgtt cttggagccc 300

acacgaaaag atattgcctt gctaaagcta agcagtcctg ccgtcatcac tgacaaagta 360

atcccagctt gtctgccatc cccaaattat gtggtcgctg accggaccga atgtttcatc 420

actggctggg gagaaaccca aggtactttt ggagctggcc ttctcaagga agcccagctc 480

cctgtgattg agaataaagt gtgcaatcgc tatgagtttc tgaatggaag agtccaatcc 540

accgaactct gtgctgggca tttggccgga ggcactgaca gttgccaggg tgacagtgga 600

ggtcctctgg tttgcttcga gaaggacaaa tacattttac aaggagtcac ttcttggggt 660

cttggctgtg cacgccccaa taagcctggt gtctatgttc gtgtttcaag gtttgttact 720

tggattgagg gagtgatgag aaataattaa 750

<210> 12

<211> 249

<212> PRT

<213> Micro-plg(微纤维蛋白溶酶原氨基酸序列)

<400> 12

Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys

1 5 10 15

Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro

20 25 30

Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly

35 40 45

Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu

50 55 60

Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln

65 70 75 80

Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu

85 90 95

Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser

100 105 110

Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro

115 120 125

Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly

130 135 140

Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu

145 150 155 160

Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly

165 170 175

Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr

180 185 190

Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys

195 200 205

Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala

210 215 220

Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr

225 230 235 240

Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

245

<210> 13

<211> 684

<212> DNA

<213> 丝氨酸蛋白酶(结构域的核酸序列)

<400> 13

gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 60

aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 120

gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 180

caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 240

cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 300

gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 360

atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 420

ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 480

tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 540

ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 600

ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 660

acttggattg agggagtgat gaga 684

<210> 14

<211> 228

<212> PRT

<213> 丝氨酸蛋白酶(结构域的氨基酸序列)

<400> 14

Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile

20 25 30

Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro

35 40 45

Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn

50 55 60

Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu

65 70 75 80

Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val

85 90 95

Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val

100 105 110

Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln

115 120 125

Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile

130 135 140

Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln

145 150 155 160

Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys

165 170 175

Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr

180 185 190

Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn

195 200 205

Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu

210 215 220

Gly Val Met Arg

225

Claims (10)

1.纤溶酶原在制备预防和治疗骨质疏松及其相关病症的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述骨质疏松包括原发性骨质疏松和继发性骨质疏松。

3.权利要求1的用途，其中所述原发性骨质疏松包括绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松。

4.权利要求1或2的用途，其中所述继发性骨质疏松包括继发于内分泌疾病、风湿性疾病、胃肠道疾病，以及药物治疗引起的骨质疏松。

5.权利要求4的用途，其中所述继发性骨质疏松包括糖皮质激素、原发性甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进、原发性胆汁性肝硬化、性腺功能减低、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、慢性肾脏疾病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、骨关节炎、性腺激素治疗、抗癫痫药治疗、化疗药物治疗引起的骨质疏松。

6.纤溶酶原在制备预防和治疗疾病并发的骨质疏松的药物中的用途，其中所述疾病并发的骨质疏松包括糖皮质激素、原发性甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进、原发性胆汁性肝硬化、性腺功能减低、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、慢性肾脏疾病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、骨关节炎、性腺激素治疗、抗癫痫药治疗、化疗药物治疗并发的骨质疏松。

7.纤溶酶原在制备预防受试者骨质疏松骨折的药物中的用途，所述受试者包括给药易患骨质疏松的受试者、处于患骨质疏松高风险的受试者或诊断患有骨质疏松的受试者有效量的纤溶酶原预防骨折的发生。

8.权利要求7的用途，其中所述受试者包括患有糖皮质激素、原发性甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进、原发性胆汁性肝硬化、性腺功能减低、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、慢性肾脏疾病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎或骨关节炎的受试者。

9.权利要求7的用途，其中所述受试者包括正接受性腺激素治疗、抗癫痫药治疗或化疗药物治疗的受试者。

10.用途预防或治疗骨质疏松的包含纤溶酶原的药剂。