CN108192890A - 一种改进的反转录microRNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子检测领域,具体地,涉及一种改进的反转录microRNA的方法。本发明采用不同于以往茎环法专门反转录miRNA所用的酶,采用普通mRNA或总RNA反转录所用的酶,改进反应步骤与方法,大大降低茎环法的高成本及反转录时间,提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本,实现快速、高效、微量反转录microRNA。
Description
技术领域
本发明属于分子检测领域,具体地说,是一种改进的反转录microRNA的方法。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类长17~22个核苷酸的小分子RNA,通过与靶基因3'非翻译区结合,在转录后水平抑制基因的表达。自1993年首次发现lin-4和let-7这2种miRNA以来,已有超过193个物种中的21264种miRNA在miRBase database内注册。研究预测,在人体内有大概超过60%的蛋白质编码基因受miRNA调控,这些蛋白参与了细胞周期、发育、分化和新陈代谢等多种生物学过程,miRNA对生理活动具有重要的调控作用。要了解miRNA在基因表达调控中所扮演的角色,就要对其表达进行快速、准确和定量的分析。传统的miRNA检测技术有northern hybridization和microarray,但是这种方法对于表达量较低的miRNA灵敏度低。基于qRT-PCR(Quantitative reverse transcription PCR)原理开发的茎环引物反转录法、poly-A加尾法,以及Tagman探针qRT-PCR检测法等。其中Tagman探针qRT-PCR检测法、茎环引物反转录法采用特异的茎环引物及反转录酶,相比于加尾法有很强的灵敏度与特异性,但是这两种方法存在的主要问题是成本高,反转录时间长。
中国专利2014100670446公开一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法,包括:(1)miRNA检测引物的设计:茎环引物包括两部分,通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列,其中与靶标miRNA互补配对的碱基数为11bp;qPCR的下游引物针对通用的茎环序列,上游引物针对靶标miRNA的5’端;在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴,以使上下游引物的退火温度相近;(2)将靶标miRNA反转录成cDNA;(3)定量PCR扩增,该方法特异性好、灵敏性高,只需合成一种下游引物,大大节约了成本。现有技术中,关于本发明反转录microRNA的方法,目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种改进的反转录microRNA的方法,通过采用普通mRNA反转录酶,改进反应步骤与方法,可大大降低茎环法的高成本及反转录时间。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
一种改进的反转录microRNA的方法,采用mRNA反转录酶,按照如下反转录体系进行反转录:
试剂 | 终浓度 |
5×PrimerScript Buffer | 1× |
PrimerScript RT Enzyme Mix I | 0.5ul |
茎环引物(10uM) | 2pmol |
Total RNA | 100~500ng |
RNase Free dH2O | 定容至10ul |
作为本发明的一个优选实施方案,所述反转录条件为:37℃15min,85℃5sec。
作为本发明的一个优选实施方案,所述反转录条件为:42℃15min,85℃5sec。
作为本发明的一个优选实施方案,所述反转录条件为:50℃15min,85℃5sec。
作为本发明的一个优选实施方案,所述反转录酶为Takara公司商品号为RR037A的mRNA反转录酶,活力值为1U。
作为本发明的一个优选实施方案,所述茎环引物包括两部分,通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列。
本发明采用不同于以往茎环法专门反转录miRNA所用的酶,采用普通mRNA或总RNA反转录所用的酶,通过步骤和方法改进,同样达到快速、高效、微量反转录microRNA(miRNA)。
本发明优点在于:
现有技术使用的茎环法专门反转录miRNA试剂盒,价格昂贵,而且反转录时间相对较长,所需的RNA量较大。本发明采用普通的mRNA反转录酶,通过调整反转录条件,同样可以高效、特异、快速反转录miRNA,并且可以大大减低成本。
附图说明
附图1为Real Time PCR扩增曲线图,图中右两条分别代表U6、miR-21-3p扩增曲线。
附图2为Real Time PCR溶解曲线图,图中左侧代表miR-21-3p溶解曲线,右侧代表U6溶解曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1反转录反应:
反应体系如下:
试剂 | 使用量 | 终浓度 |
5×PrimerScript Buffer | 2ul | 1× |
PrimerScript RT Enzyme Mix I | 0.5ul | |
茎环引物(10uM) | 0.2ul | 2pmol |
Total RNA | 100~500ng | |
RNase Free dH2O | 定容至10ul |
试剂:PrimerScript RT reagent Kit:
模板:C57小鼠肾脏组织总RNA(500ng)
反应体积:10ul
PT-Primer:miR-21-3p、U6茎环引物
RT-miR-21-3p:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGCC
RT-U6:AACGCTTCACGAATTTGCGT
反应条件:37℃15min,85℃5s,4℃保存。
2Real Time PCR反应:
试剂:SYBR Premix Ex Taq(Takara)
模板:上述反转录反应液2ul
反应体积:20ul
Target Gene:miR-21-3p、U6
反应条件:10ul 2×SYBR Green PCR Master Mix,0.4ul ROX,0.4ul miR-21-3p、U6上下游引物(10uM),6.8ul DEPC水。PCR循环条件为:95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃延伸34s,共循环40次,溶解曲线按照ABI 7500PCR仪器溶解曲线标准执行,每个样本3个重复。
所用扩增引物如下:
miR-21-3p-F:GCAACACCAGTCGATGGG;miR-21-3p-R:GTGCAGGGTCCGAGGT;
U6-F:CTCGCTTCGGCAGCACA;U6-R:AACGCTTCACGAATTTGCGT。
3Real Time PCR反应结果:
如图1和图2所示。图1为Real Time PCR扩增曲线图,图中右两条分别代表U6、miR-21-3p扩增曲线。图2为Real Time PCR溶解曲线图,图中左侧代表miR-21-3p溶解曲线,右侧代表U6溶解曲线。
4结论
使用人胰腺癌细胞、肝星状细胞细胞提取的总RNA,分别验证了miR-214-3p、miR-146a-3p、U6内参,qRT-PCR结果及溶解曲线也得到验证,同样也可以得到高效、快速、微量扩增。
反转录酶是以RNA为模板指导三磷酸脱核甘酸合成互补DNA(cDNA)的酶。反转录酶主要包含几种酶活性:DNA聚合酶活性、RNase H活性以及DNA指导的DNA聚合酶活性等,由于miRNA长度短,按照随机引物及Oligodt方法并不能反转录出miRNA的cDNA。本发明将随机引物及Oligodt换成特异性茎环引物,通过调整反应条件,成功反转录出miRNA。
下表是本发明反转录microRNA方法与传统方法单次单样本的反转录优缺点对比。本发明采用普通的mRNA反转录酶,通过调整反转录条件,同样可以高效、特异、快速反转录miRNA,并且可以大大减低成本。
时间 | RNA量 | 成本 | |
传统方法 | 1h~2h | 500ng~1000ng | 50~100元 |
新方法 | 15min | 100ng~500ng | 5~10元 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学附属中山医院
<120> 一种改进的反转录microRNA的方法
<130> /
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacagcc 50
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcaacaccag tcgatggg 18
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aacgcttcac gaatttgcgt 20
Claims (6)
1.一种改进的反转录microRNA的方法,其特征在于,采用mRNA反转录酶,按照如下反转录体系进行反转录:
2.根据权利要求1所述反转录microRNA的方法,其特征在于,反转录条件为:37℃15min,85℃5sec。
3.根据权利要求1所述反转录microRNA的方法,其特征在于,反转录条件为:42℃15min,85℃5sec。
4.根据权利要求1所述反转录microRNA的方法,其特征在于,反转录条件为:50℃15min,85℃5sec。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,反转录酶为Takara公司商品号为RR037A的mRNA反转录酶,活力值为1U。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述茎环引物包括两部分,通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列。
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CN117887847A (zh) * | 2024-01-16 | 2024-04-16 | 湖南宏雅基因技术有限公司 | 一种外周血外泌体miRNA无创早期检测卵巢癌的组合物、试剂盒及检测方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103866009A (zh) * | 2014-02-26 | 2014-06-18 | 东华大学 | 一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法 |
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