[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN108192890A - 一种改进的反转录microRNA的方法 - Google Patents

一种改进的反转录microRNA的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108192890A
CN108192890A CN201810035784.XA CN201810035784A CN108192890A CN 108192890 A CN108192890 A CN 108192890A CN 201810035784 A CN201810035784 A CN 201810035784A CN 108192890 A CN108192890 A CN 108192890A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reverse transcription
microrna
mirna
stem ring
reverse
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810035784.XA
Other languages
English (en)
Inventor
孙剑勇
陈艮文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhongshan Hospital Fudan University
Original Assignee
Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhongshan Hospital Fudan University filed Critical Zhongshan Hospital Fudan University
Priority to CN201810035784.XA priority Critical patent/CN108192890A/zh
Publication of CN108192890A publication Critical patent/CN108192890A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于分子检测领域,具体地,涉及一种改进的反转录microRNA的方法。本发明采用不同于以往茎环法专门反转录miRNA所用的酶,采用普通mRNA或总RNA反转录所用的酶,改进反应步骤与方法,大大降低茎环法的高成本及反转录时间,提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本,实现快速、高效、微量反转录microRNA。

Description

一种改进的反转录microRNA的方法
技术领域
本发明属于分子检测领域,具体地说,是一种改进的反转录microRNA的方法。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类长17~22个核苷酸的小分子RNA,通过与靶基因3'非翻译区结合,在转录后水平抑制基因的表达。自1993年首次发现lin-4和let-7这2种miRNA以来,已有超过193个物种中的21264种miRNA在miRBase database内注册。研究预测,在人体内有大概超过60%的蛋白质编码基因受miRNA调控,这些蛋白参与了细胞周期、发育、分化和新陈代谢等多种生物学过程,miRNA对生理活动具有重要的调控作用。要了解miRNA在基因表达调控中所扮演的角色,就要对其表达进行快速、准确和定量的分析。传统的miRNA检测技术有northern hybridization和microarray,但是这种方法对于表达量较低的miRNA灵敏度低。基于qRT-PCR(Quantitative reverse transcription PCR)原理开发的茎环引物反转录法、poly-A加尾法,以及Tagman探针qRT-PCR检测法等。其中Tagman探针qRT-PCR检测法、茎环引物反转录法采用特异的茎环引物及反转录酶,相比于加尾法有很强的灵敏度与特异性,但是这两种方法存在的主要问题是成本高,反转录时间长。
中国专利2014100670446公开一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法,包括:(1)miRNA检测引物的设计:茎环引物包括两部分,通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列,其中与靶标miRNA互补配对的碱基数为11bp;qPCR的下游引物针对通用的茎环序列,上游引物针对靶标miRNA的5’端;在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴,以使上下游引物的退火温度相近;(2)将靶标miRNA反转录成cDNA;(3)定量PCR扩增,该方法特异性好、灵敏性高,只需合成一种下游引物,大大节约了成本。现有技术中,关于本发明反转录microRNA的方法,目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种改进的反转录microRNA的方法,通过采用普通mRNA反转录酶,改进反应步骤与方法,可大大降低茎环法的高成本及反转录时间。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
一种改进的反转录microRNA的方法,采用mRNA反转录酶,按照如下反转录体系进行反转录:
试剂 终浓度
5×PrimerScript Buffer
PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5ul
茎环引物(10uM) 2pmol
Total RNA 100~500ng
RNase Free dH2O 定容至10ul
作为本发明的一个优选实施方案,所述反转录条件为:37℃15min,85℃5sec。
作为本发明的一个优选实施方案,所述反转录条件为:42℃15min,85℃5sec。
作为本发明的一个优选实施方案,所述反转录条件为:50℃15min,85℃5sec。
作为本发明的一个优选实施方案,所述反转录酶为Takara公司商品号为RR037A的mRNA反转录酶,活力值为1U。
作为本发明的一个优选实施方案,所述茎环引物包括两部分,通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列。
本发明采用不同于以往茎环法专门反转录miRNA所用的酶,采用普通mRNA或总RNA反转录所用的酶,通过步骤和方法改进,同样达到快速、高效、微量反转录microRNA(miRNA)。
本发明优点在于:
现有技术使用的茎环法专门反转录miRNA试剂盒,价格昂贵,而且反转录时间相对较长,所需的RNA量较大。本发明采用普通的mRNA反转录酶,通过调整反转录条件,同样可以高效、特异、快速反转录miRNA,并且可以大大减低成本。
附图说明
附图1为Real Time PCR扩增曲线图,图中右两条分别代表U6、miR-21-3p扩增曲线。
附图2为Real Time PCR溶解曲线图,图中左侧代表miR-21-3p溶解曲线,右侧代表U6溶解曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1反转录反应:
反应体系如下:
试剂 使用量 终浓度
5×PrimerScript Buffer 2ul
PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5ul
茎环引物(10uM) 0.2ul 2pmol
Total RNA 100~500ng
RNase Free dH2O 定容至10ul
试剂:PrimerScript RT reagent Kit:
模板:C57小鼠肾脏组织总RNA(500ng)
反应体积:10ul
PT-Primer:miR-21-3p、U6茎环引物
RT-miR-21-3p:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGCC
RT-U6:AACGCTTCACGAATTTGCGT
反应条件:37℃15min,85℃5s,4℃保存。
2Real Time PCR反应:
试剂:SYBR Premix Ex Taq(Takara)
模板:上述反转录反应液2ul
反应体积:20ul
Target Gene:miR-21-3p、U6
反应条件:10ul 2×SYBR Green PCR Master Mix,0.4ul ROX,0.4ul miR-21-3p、U6上下游引物(10uM),6.8ul DEPC水。PCR循环条件为:95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃延伸34s,共循环40次,溶解曲线按照ABI 7500PCR仪器溶解曲线标准执行,每个样本3个重复。
所用扩增引物如下:
miR-21-3p-F:GCAACACCAGTCGATGGG;miR-21-3p-R:GTGCAGGGTCCGAGGT;
U6-F:CTCGCTTCGGCAGCACA;U6-R:AACGCTTCACGAATTTGCGT。
3Real Time PCR反应结果:
如图1和图2所示。图1为Real Time PCR扩增曲线图,图中右两条分别代表U6、miR-21-3p扩增曲线。图2为Real Time PCR溶解曲线图,图中左侧代表miR-21-3p溶解曲线,右侧代表U6溶解曲线。
4结论
使用人胰腺癌细胞、肝星状细胞细胞提取的总RNA,分别验证了miR-214-3p、miR-146a-3p、U6内参,qRT-PCR结果及溶解曲线也得到验证,同样也可以得到高效、快速、微量扩增。
反转录酶是以RNA为模板指导三磷酸脱核甘酸合成互补DNA(cDNA)的酶。反转录酶主要包含几种酶活性:DNA聚合酶活性、RNase H活性以及DNA指导的DNA聚合酶活性等,由于miRNA长度短,按照随机引物及Oligodt方法并不能反转录出miRNA的cDNA。本发明将随机引物及Oligodt换成特异性茎环引物,通过调整反应条件,成功反转录出miRNA。
下表是本发明反转录microRNA方法与传统方法单次单样本的反转录优缺点对比。本发明采用普通的mRNA反转录酶,通过调整反转录条件,同样可以高效、特异、快速反转录miRNA,并且可以大大减低成本。
时间 RNA量 成本
传统方法 1h~2h 500ng~1000ng 50~100元
新方法 15min 100ng~500ng 5~10元
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学附属中山医院
<120> 一种改进的反转录microRNA的方法
<130> /
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacagcc 50
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcaacaccag tcgatggg 18
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (6)

1.一种改进的反转录microRNA的方法,其特征在于,采用mRNA反转录酶,按照如下反转录体系进行反转录:
试剂 终浓度 5×PrimerScript Buffer PrimerScript RT Enzyme MixI 0.5ul 茎环引物(10uM) 2pmol Total RNA 100~500ng RNase Free dH2O 定容至10ul
2.根据权利要求1所述反转录microRNA的方法,其特征在于,反转录条件为:37℃15min,85℃5sec。
3.根据权利要求1所述反转录microRNA的方法,其特征在于,反转录条件为:42℃15min,85℃5sec。
4.根据权利要求1所述反转录microRNA的方法,其特征在于,反转录条件为:50℃15min,85℃5sec。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,反转录酶为Takara公司商品号为RR037A的mRNA反转录酶,活力值为1U。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述茎环引物包括两部分,通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列。
CN201810035784.XA 2018-01-15 2018-01-15 一种改进的反转录microRNA的方法 Pending CN108192890A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810035784.XA CN108192890A (zh) 2018-01-15 2018-01-15 一种改进的反转录microRNA的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810035784.XA CN108192890A (zh) 2018-01-15 2018-01-15 一种改进的反转录microRNA的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108192890A true CN108192890A (zh) 2018-06-22

Family

ID=62589451

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810035784.XA Pending CN108192890A (zh) 2018-01-15 2018-01-15 一种改进的反转录microRNA的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108192890A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117887847A (zh) * 2024-01-16 2024-04-16 湖南宏雅基因技术有限公司 一种外周血外泌体miRNA无创早期检测卵巢癌的组合物、试剂盒及检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103866009A (zh) * 2014-02-26 2014-06-18 东华大学 一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103866009A (zh) * 2014-02-26 2014-06-18 东华大学 一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAIFU CHEN等: "Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR", 《NUCLEIC ACIDS RES》 *
JUNLIFENG等: "The quantification of tomato microRNAs response to viral infection by stem-loop real-time RT-PCR", 《GENE》 *
PATRICK WINATA: "The analysis of novel microRNA mimic sequences in cancer cells reveals lack of specificity in stem-loop RT-qPCR-based microRNA detection", 《BMC RESEARCH NOTES》 *
熊黎等: "特异性逆转录microRNA-505的高效茎环引物的设计", 《现代生物医学进展》 *
赵丽等: "茎-环RT-PCR法定量miRNA-421的引物设计", 《南京师大学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117887847A (zh) * 2024-01-16 2024-04-16 湖南宏雅基因技术有限公司 一种外周血外泌体miRNA无创早期检测卵巢癌的组合物、试剂盒及检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102154505B (zh) 一种检测miRNA的方法及引物及其应用
EP2419538B1 (en) Methods and compositions to detect and differentiate small rnas in rna maturation pathway
CN107385014B (zh) 一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法
CN103509789B (zh) 一种用于扩增短链rna的引物及其相关方法
CN112048556B (zh) 原发性肝细胞肝癌分子分型及生存风险基因群及诊断产品和应用
CN101082060B (zh) 新型微核糖核酸定量pcr(聚合酶链式反应)检测方法
CN116761899A (zh) 结直肠癌分子分型及生存风险基因群及诊断产品和应用
CN102925577B (zh) 一种微小rna实时定量pcr检测方法及其应用
CN105132577B (zh) 一种对miRNA进行多重定量检测的方法
CN109251964B (zh) 循环microRNAs检测试剂盒和特异性检测循环microRNAs的方法及应用
CN108165622A (zh) 一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物及其定量方法
CN1763223B (zh) miRNA检测方法
CN108192890A (zh) 一种改进的反转录microRNA的方法
CN109371122B (zh) 一种用于熊猫乳汁miRNA检测的内参基因及其应用
CN103757122B (zh) 基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-188-5p检测试剂盒及其检测方法
NL2030973B1 (en) Primer set for detection of expression of human eosinophil cationic protein (ecp) mrna and kit
CN110295252A (zh) 提高特异性的检测犬副流感的反应液、引物对、探针及试剂盒
EP4253557A1 (en) Primer/probe design method, detection composition and kit for mirna detection
CN113481197B (zh) 一种线性探针及利用其检测miRNA的方法
CN104032031A (zh) 一种rna聚合酶和连接酶偶联反应介导的定量检测核酸的pcr分析方法
CN105506146B (zh) 一种非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法及试剂盒
CN116287146B (zh) 一种用于miRNA检测的dT引物、试剂盒及检测方法
CN114836548B (zh) tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂盒
CN103740853B (zh) 基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-134检测试剂盒及其检测方法
CN103740850B (zh) 基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒及其检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180622

RJ01 Rejection of invention patent application after publication