CN108135812A

CN108135812A - 色谱分离的方法

Info

Publication number: CN108135812A
Application number: CN201680059602.1A
Authority: CN
Inventors: S·H·霍克; Q·雷; S·莫特拉夫; J·C·霍特; M·雷利; K·T·斯里科里斯纳; Y·林
Original assignee: Procter and Gamble Ltd
Current assignee: Procter and Gamble Ltd; Procter and Gamble Co
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2018-06-08
Also published as: AU2016340901A1; EP3364940B1; BR112018006735A2; CA3000021C; US20170036994A1; JP2018533567A; WO2017070414A1; US10035759B2; MX2018004813A; CA3000021A1; AU2016340901B2; EP3364940A1

Abstract

本发明涉及一种从含有32种不同立体构型可能性的复杂混合物中分离特定立体异构体和对映异构体的装置，从而将立体异构体或对映异构体浓缩至高纯度。

Description

色谱分离的方法

技术领域

本发明涉及由合成包含立体异构体的化合物进行色谱分离的方法。

背景技术

口腔护理产品诸如牙粉和漱口水被消费者日常用作它们口腔护理卫生方案的一部分。熟知，口腔护理产品可向消费者提供治疗和美容卫生有益效果。治疗有益效果包括龋齿预防，其通常通过使用各种氟化物盐来递送；齿龈炎预防，其通过使用抗微生物剂诸如氟化亚锡、三氯生、精油来实现；或者过敏的控治，其通过使用诸如氯化锶或硝酸钾等成分而进行。由口腔护理制品提供的美容有益效果包括控制牙斑和牙结石的形成、牙齿色斑的去除和预防、牙齿美白、清新口气、以及口感印象的总体改善，所述口感印象可被广义地表征为口感美观性。牙结石和牙斑以及行为和环境因素导致牙齿色斑的形成，严重影响了牙齿的美观。趋于促生牙齿变色特性的行为和环境因素包括定期饮用咖啡、茶、可乐或吸食烟草产品，并且还包括使用某些口腔产品，所述口腔产品包含促进牙齿变色的成分如阳离子抗微生物剂和金属盐。

因此，家庭日常口腔护理需要含有多种成分的产品，所述成分通过不同的机制起作用来提供完整的治疗和美观有益效果范围，包括防龋、抗微生物、抗齿龈炎、抗牙斑、抗牙结石和抗腐蚀、以及抗异味、口腔清新、色斑去除、色斑控制和牙齿美白。为了使日常使用的口腔护理产品如牙粉和漱口液提供完整的口腔护理功效，通常需要将活性物质和添加剂组合在一起，其中许多具有在使用期间会造成负面美观性的缺点，具体地是令人不悦的味道和感觉以及促生色斑。令人不悦的味道和口感已被描述为具有以下中的一个或多个：苦味、金属腥味、涩味、咸味、麻味、针刺感、灼热感或刺痛感、甚至是刺激感。与这些美学负面影响相关的用于口腔护理用途的典型成分包括抗微生物剂如西吡氯铵、氯己定、亚锡盐和锌盐；牙齿漂白剂如过氧化物；抗牙垢剂如焦磷酸盐、三聚磷酸盐和六偏磷酸盐；以及赋形剂如小苏打和表面活性剂。为了减轻这些成分的美学负面影响，通常将口腔护理产品与风味剂、甜味剂和凉爽剂配制，以尝起来味道尽可能好并且提供令人愉快的体验。具体地，希望口腔护理产品在使用期间和之后提供清新凉爽的感觉。除了缓解负面感觉以外，还将感觉剂分子配制到口腔护理组合物中以传达功效信号。此类功效信号包括凉爽感、麻刺感、麻木感、温热感、甘甜感、和流变感如相变和发泡或起泡。

已描述了大量天然或合成源的凉爽剂化合物。最熟知的化合物为薄荷醇，尤其是l-薄荷醇，其天然存在于薄荷油，特别是野薄荷(Mentha arvensis L)和绿薄荷(Menthaviridis L)中。在薄荷醇异构体中，l-异构体最广泛存在于自然界中，并且是通常被命名为薄荷醇的物质，具有凉爽剂性质。L-薄荷醇具有特征性的胡椒薄荷气味，具有爽口清新的味道，并且当施用到皮肤和粘膜表面上时，产生清凉的感觉。其它薄荷醇异构体(新薄荷醇、异薄荷醇和新异薄荷醇)略有相似，但是气味和味道不同，即某些具有令人不悦的味道，描述为泥土味、樟脑味、霉味。异构体之间的主要差异在于它们的凉爽效力。L-薄荷醇提供最具效力的凉爽感，即具有约800ppb的凉爽度下限，即可清晰辨识凉爽效果时的浓度。在此含量下，其它异构体无凉爽效果。例如，据报道，d-新薄荷醇具有约25,000ppb的清凉阈值，并且l-新薄荷醇具有约3,000ppb的清凉阈值。(R.Emberger和R.Hopp，“Synthesis and SensoryCharacterization of Menthol Enantiomers and Their Derivatives for the Use inNature Identical Peppermint Oils”，Specialty Chemicals(1987),7(3),193-201)。该研究展示了l-薄荷醇在凉爽和清新方面的优异感官性质以及立体化学对这些分子活性的影响。

在合成的凉爽剂中，许多是薄荷醇的衍生物或者是与薄荷醇结构上相关的，即包含环己烷部分，以及是官能团衍生的，所述官能团包括羧酰胺、缩酮、酯、醚和醇。示例包括对薄荷烷甲酰胺化合物如商业上被称为“WS-3”的N-乙基对薄荷烷-3-甲酰胺，以及此系列的其它化合物如WS-5(N-乙氧基羰基甲基对薄荷烷-3-甲酰胺)、WS-12[N-(4-甲氧基苯基)-对薄荷烷-3-甲酰胺]和WS-14(N-叔丁基对薄荷烷-3-甲酰胺)。薄荷烷羧基酯的示例包括WS-4和WS-30。结构上与薄荷醇不相关的合成甲酰胺清凉剂的示例是被称为“WS-23”的N,2,3-三甲基-2-异丙基丁酰胺。合成凉爽剂的附加示例包括醇衍生物如被称为TK-10的3-(1-薄荷氧基)-丙烷-1,2-二醇、异蒲勒醇(商品名为Coolact P)和对薄荷烷-3,8-二醇(商品名为Coolact 38D)；被称为MGA的薄荷酮甘油缩醛；薄荷酯如乙酸薄荷酯、乙酰乙酸薄荷酯、被称为Frescolat由Haarmann和Reimer提供的乳酸薄荷酯、以及以商品名Physcool得自V.Mane的琥珀酸单薄荷酯。TK-10描述于美国专利4,459,425中。薄荷醇的其它醇和醚衍生物描述于例如GB 1,315,626和美国专利4,029,759、5,608,119、和6,956,139中。WS-3和其它甲酰胺凉爽剂描述于例如美国专利4,136,163、4,150,052、4,153,679、4,157,384、4,178,459和4,230,688中。附加N-取代的对薄荷烷甲酰胺描述于WO 2005/049553A1中，包括N-(4-氰甲基苯基)对薄荷烷甲酰胺、N-(4-氨磺酰苯基)对薄荷烷甲酰胺、N-(4-氰基苯基)对薄荷烷甲酰胺、N-(4-乙酰基苯基)对薄荷烷甲酰胺、N-(4-羟甲基苯基)对薄荷烷甲酰胺和N-(3-羟基-4-甲氧苯基)对薄荷烷甲酰胺。其它N-取代的对薄荷烷甲酰胺包括氨基酸衍生物，如公开于WO 2006/103401以及美国专利4,136,163、4,178,459和7,189,760中的那些，如N-((5-甲基-2-(1-甲基乙基)环己基)羰基)甘氨酸乙酯和N-((5-甲基-2-(1-甲基乙基)环己基)羰基)丙氨酸乙酯。包括氨基酸如甘氨酸和丙氨酸的那些的薄荷基酯公开于例如EP 310 299和美国专利3,111,127、3,917,613、3,991,178、5,703,123、5,725,865、5,843,466、6,365,215、6,451,844、和6,884,903中。缩酮衍生物描述于例如美国专利5,266,592、5,977,166和5,451,404中。结构上与薄荷醇无关但是已报道具有类似的生理清凉效果的附加试剂包括描述于美国专利6,592,884中的α酮基酰胺衍生物，其包括3-甲基-2-(1-吡咯烷基)-2-环戊烯-1-酮(3-MPC)、5-甲基-2-(1-吡咯烷基)-2-环戊烯-1-酮(5-MPC)、以及2,5-二甲基-4-(1-吡咯烷基)-3(2H)-呋喃酮(DMPF)；描述于Wei等人的J.Pharm.Pharmacol.(1983),35:110-112中的激动剂依色林(icilin)(也被称为AG-3-5，化学名1-[2-羟基苯基]-4-[2-硝基苯基]-1,2,3,6-四氢嘧啶-2-酮)。对薄荷醇和合成凉爽剂的凉爽剂活性的综述包括H.R.Watson等人的J.Soc.Cosmet.Chem.(1978),29,185-200和R.Eccles的J.Pharm.Pharmacol.,(1994),46,618-630。

如WO 2009/067410中所公开的，由环丙烷甲酰胺主链构建出的结构已被用作抗癌剂。如美国专利4,150,052中所示，仅一些所选环丙烷甲酰胺衍生物具有显著的凉爽感。对WO 2009/067410中所公开的分子进行它们在破坏前列腺癌细胞方面的TRPM8活性的评定；然而激活TRPM8不一定表示将察觉到凉爽感。因此，凉爽将为不期望的效应，并且有时它们将被避免。

本发明提供了用于分离具有凉爽剂性质的一种或多种组合物的方法，其中由一种或多种凉爽剂提供的凉爽感和清新感在发生、强度或持续时间方面经最优化。

发明内容

本发明提供了一种由合成化合物进行色谱分离的方法，该化合物包含以下结构的立体异构体：

R₁选自H、烷基、氨基烷基、烷氧基；

Q＝H₂、O、-OR₁、-N(R₁)₂、-OPO(OR₁)_x、-PO(OR₁)_x、-P(OR₁)_x，其中x＝1-2；

V＝NR₁、O、-OPO(OR₁)_x、-PO(OR₁)_x、-P(OR₁)_x，其中x＝1-2；

W＝H₂、O；

对于n＝0，X、Y＝独立地选自H、芳基、萘基；

对于n≥1，X、Y＝脂族CH₂或芳族CH并且Z选自脂族CH₂、芳族CH或杂原子；

A＝低级烷氧基、低级烷硫基、芳基、被取代的芳基或稠合芳基；以及

立体化学在标记*的位置是可变的，并且甚至可以在标记(S)和(R)的位置变化。

以下示出可以使用本发明的方法分离的化合物的代表：

其中当R1是烷基基团时，位置#1处的可变立体化学是L或D；位置#2处的立体化学位置处于S-位或R-位；并且来自位置#3的薄荷基部分的立体化学处于L或新构型。位置4和5通常分别处于S和R构型，尽管它们也可以变化。

包括称为化合物28(其中R1＝CH₃)的立体异构体的这种结构表示出人意料地发现可用作TRPM8活化调节剂的类。设想具有这些结构的许多立体异构体，包括化合物28，其中每个立体中心的相对构型将决定对受体的活性。在一些情况下，相同分子的异构体可具有能与之相比的活性。在其它情况下，相同分子的立体异构体可具有增强或减弱的对受体的活性。在一些情况下，单独的立体异构体可不具有活性。

对于本领域的技术人员来说，通过下面的详细描述，本发明的这些和其它的特征、方面和优点将变得显而易见。

附图说明

图1为化合物28级分1三次平行注射的UV色谱图叠加。相对峰面积百分比示于该混合物中观察到的每种同分异构化合物上方。所有峰出现在QDa质谱的标称m/z 374处，表明这些是同分异构物质。

图2为化合物28级分2三次平行注射的UV色谱图叠加。相对峰面积百分比示于该混合物中观察到的每种同分异构化合物上方。所有峰出现在QDa质谱的标称m/z 374处，表明这些是同分异构物质。

图3为化合物28级分1(虚线)和级分2(实线)分离分析期间产生的UV色谱图迹线叠加。所有峰出现在QDa质谱的标称m/z 374处，表明这些是同分异构物质。

图4为化合物28级分1三次平行注射的UV色谱图叠加。所有峰出现在QDa质谱的标称m/z 374处，表明这些是同分异构物质。使用这些条件从该混合物中分离出的异构体的数量在每个峰的上方用顺序编号表示。

图5为在通过非立体定向合成产生的级分1中发现的化合物28异构体的手性SFC分离。相同的手性SFC色谱分离条件也用于分析来自立体选择性合成化合物28DSL、DRL和LSL异构体的反应产物。如表5所示，来自立体选择性反应产物分析的SFC结果显示对比度非常高的异构体纯度(99+％)。

具体实施方式

本发明提供了从含有32种不同立体构型的可能性的复杂混合物中分离特定立体异构体的装置，从而将立体异构体浓缩到高度纯度。使用Chiralpak AS-H和AD-H柱的组合实现分离。

在某些实施方案中，本发明提供由二氧化碳、乙醇和/或乙酸铵组成的移动相。

在某些实施方案中，本发明包括在加压CO₂的超临界、亚临界或增强流动性束流中施加梯度分离。

在其它实施方案中，本发明包括施加顺序分离以将单独异构体的纯度增加至大于约70％，大于约85％，大于约90％，大于约95％，大于约97％或大于约99％异构纯。

除非另外指明，否则下文中所用的所有百分比和比率均按总组合物的重量计。除非另外指明，否则本文提及的所有成分的百分比、比率和含量均基于该成分的实际含量，并且不包括在市售产品中可与这些成分一起使用的溶剂、填料或其它物质。

除非另外指明，否则本文所涉及的所有测量均在25℃下进行。

如本文所用，词语“或”当用作两个或更多个元素的连词时，是指包括单独的所述元素或所述元素的组合；例如X或Y，是指X或Y或两者。

“个人护理组合物”是指在常规使用过程中被施用至身体表面或与身体表面接触以提供有益效果的产品。身体表面包括皮肤，例如表皮或粘膜的；身体表面还包括与身体表面相关联的结构，例如毛发、牙齿、或指/趾甲。个人护理组合物的示例包括被施用于人体以改善外观、清洁、和气味控制或整体美观的产品。个人护理组合物的非限制性示例包括口腔护理组合物，诸如牙粉、漱口水、摩丝、泡沫、口喷剂、锭剂、咀嚼片、口香糖、牙贴白、牙线及牙线涂层、口气清新可溶解条带、或义齿护理产品、义齿粘合剂产品；剃须后凝胶和霜膏、剃须前制剂、剃须凝胶、霜膏或泡沫、保湿剂和乳液；咳嗽和感冒组合物、凝胶、凝胶帽和喉咙喷雾剂；免洗护肤乳液和霜膏、洗发剂、沐浴剂、身体磨擦剂，如Vicks Vaporub；头发调理剂、染发和漂白组合物、摩丝、沐浴凝胶、条皂、止汗剂、除臭剂、脱毛剂、唇膏、粉底、睫毛膏、免晒美黑剂和防晒乳液；女性护理组合物，如针对吸收制品的乳液和乳液组合物；针对吸收制品或一次性制品的婴儿护理组合物；以及用于动物诸如狗和猫的口腔清洁组合物。

本发明还涉及“口腔健康组合物”，如本文所用，“口腔健康组合物”是指在需要时可通过口腔、嘴巴、喉咙、鼻通道或它们的组合递送至哺乳动物的形式的组合物。非限制性示例包括液体组合物、咳嗽糖浆、呼吸系统用制剂、饮料、补给水、药丸、软凝胶、片剂、胶囊、凝胶组合物、泡沫组合物、盐水洗液、以及它们的组合。液体组合物、凝胶组合物可以是可直接递送至口腔和咽喉的形式。这些组合物和/或制剂可通过递送装置递送，所述递送装置选自点滴器、泵、喷涂器、液体点滴器、经由鼻通道递送的含盐洗液、杯子、瓶子、液体填充的凝胶、液体填充的树胶、中心填充的胶、咀嚼物、薄膜、中心填充的锭剂、胶填充的锭剂、加压喷涂器、喷雾器、吸气装置、液体填充的压片、液体填充的胶质胶囊、液体填充的胶囊、可压挤的小药囊、强力注射器、以及其它包装和设备、以及它们的组合。喷涂器、雾化器和吸气装置可与电池或电功率源相联。

除非另外指明，否则如本文所用，术语“牙粉”包括牙齿或龈下糊剂、凝胶、或液体制剂。牙粉组合物可以是单相组合物，或可以是两种或更多种单独牙粉组合物的组合。牙粉组合物可呈任何期望的形式，如深条纹的、浅条纹的、多层的、糊剂周围有凝胶的、或它们的任意组合。在包括两种或更多种单独牙粉组合物的牙粉中，每种牙粉组合物均可被包含于物理上独立的分配器隔室中，并且并排分配。

如本文所用，术语“分配器”是指适于分配组合物(如牙粉)的任何泵、管或容器。

如本文所用，术语“牙齿”是指自然牙齿以及人造牙齿或假牙。

术语“口部可接受的载体或赋形剂”包括安全有效的用于口腔护理组合物中的材料和常规添加剂，包括但不限于氟化物离子源、抗牙结石剂或抗牙垢剂、缓冲剂、研磨剂例如二氧化硅、碱金属碳酸氢盐、增稠材料、湿润剂、水、表面活性剂、二氧化钛、风味剂、甜味剂、木糖醇、着色剂、以及它们的混合物。

本文中，术语“牙垢”和“牙结石”互换使用，并且是指矿物化的牙斑生物膜。

SEQ ID NO	序列
		1	人TRPM8DNA序列

阐述本文SEQ ID NO：1的核苷酸序列的序列表正在作为名为“14075M_Nucleotide_Sequence_Listing_ST25”的ASCII文本文件与本申请同时提交。ASCII文本文件于2016年10月21日创建，大小为5KB。根据MPEP§605.08和37CFR§1.52(e)，ASCII文本文件中的主题内容以引用方式并入本文。

如本文所用，术语“TRPM8”或"TRPM8受体"是指对冷-和薄荷醇-敏感的受体(CMR1)或TRPM8。用于所述受体的TRPM8命名来自于其作为瞬时受体电位(TRP)家族的非选择性阳离子通道的特性，其通过刺激包括低温、薄荷醇和其它化学凉爽剂而被活化。TRPM8受体以SEQ ID NO:1提供。

通常称为TRPM8或薄荷醇受体的凉爽受体已被示为区分引发和传播非热性凉爽感觉的有机分子强度和持续时间的途径(D.D.Mckemy，The Open Drug Discovery Journal2:81-88 2010)。McKemy报导了许多TRPM8激动剂的EC50值，所述值在100nM至19mM范围区间内，从而示出，信道可在不同浓度的宽泛结构范围内被活化。该信道还具有CRM1和TRPP8命名。后者如此命名归因于其对前列腺细胞的辨识，其中它被用作识别以前列腺癌为靶标的分子的途径。

如本文所用，术语“TRPM8激动剂”是指根据本文所述的FLIPR方法，加入到TRPM8受体时，产生相对于背景的任何荧光增加的任何化合物。

如本文所用，术语“TRPV1”或“TRPV1受体”是指瞬时受体电位香草酸受体亚型1，其是优先表达在小直径的感觉神经元上的配体门控型、非选择性阳离子通道并且检测到有毒物以及其它物质。TRPV1受体以SEQ ID NO:1提供。TRPV1受体响应于，例如，伤害和疼痛刺激。有毒刺激将包括提供灼热(即热)感觉的那些。

如本文所用，术语“TRPV1激动剂”是指根据本文所述的FLIPR方法，在1mM的浓度下提供比细胞中存在的基值钙含量高至少1000计数或20％的钙通量计数的任何化合物。术语“计数”定义为细胞系由于钙离子跨细胞膜流入时导致的荧光变化，所述钙离子与细胞内存在的钙离子敏感染料反应。

如本文所用，术语“TRPA1”或“TRPA1受体”是指瞬时受体电位阳离子通道亚家族A成员1，具有包含18个预测的锚蛋白重复的大的富含半胱氨酸的N末端。TRPA1受体以SEQ IDNO:2提供。TRPA1是配体门控型的、非选择性阳离子通道，优先在小直径感觉神经元上表达。

如本文所用，术语“TRPA1激动剂”是指根据本文所述的FLIPR方法，在1mM的浓度下提供比细胞中存在的基值钙含量高至少1000计数或20％的钙通量计数的任何化合物。术语“计数”定义为细胞系由于钙离子跨细胞膜流入时导致的荧光变化，所述钙离子与细胞内存在的钙离子敏感染料反应。

如Merck Manual定义的术语效能是指，如分级剂量响应曲线如所描绘的，产生50％化学最大效应所需的化合物浓度(EC50)或剂量(ED50)。当占用和响应之间存在线性关系时，EC50等于Kd(解离常数，其为50％的与所述受体结合的所考虑物质的量度)。通常，在受体占用和响应之间存在信号放大，这致使响应的EC50大幅小于(即被定位于对数剂量响应曲线横坐标的左边)受体占用的KD。效能取决于化合物对其受体的亲和力，以及化合物-受体交互作用与响应相关联的效率。产生效应所需的化合物的剂量与效能负相关。一般来讲，仅在造成施用不可行的大剂量化合物的需要时，低效能才是重要的。量子剂量响应曲线提供化合物效能信息，所述信息不同于由分级剂量响应曲线导出的信息。在量子剂量响应关系中，ED50为50％个体表现出指定量子效应的剂量。

对口腔和其它粘膜表面以及皮肤尤其具有生理凉爽效果的凉爽剂或化合物是多种产品中的常见成分，所述产品包括可食用组合物、个人护理组合物、以及风味剂或香料组合物。可食用组合物的示例包括糖果、蜜饯、巧克力、口香糖、饮料和口服药物。先前已描述了个人护理组合物，包括口腔护理组合物。由凉爽剂提供的舒适凉爽感觉有助于产品的吸引力和可接受性。具体地，口腔护理产品如牙粉和漱口水配有凉爽剂，因为它们在口腔中提供口气清新效果以及清洁、凉爽、清新的感觉。

现在得到确认的是诸如凉爽或寒冷等感觉可归因于在末梢神经纤维处的受体通过刺激如低温或化学凉爽剂的活化，其产生电化学信号，该信号传送至大脑，然后其将进来的信号翻译、组织并且整合成知觉或感觉。在哺乳动物的感觉神经纤维处，不同种类的受体已被涉及到感觉寒冷的温度或化学凉爽剂刺激中。在这些受体中，涉及感觉寒冷的主要候选者已被鉴别并且指定为寒冷和薄荷醇敏感受体(CMR1)或TRPM8。用于所述受体的TRPM8命名来自于其作为瞬时受体电位(TRP)家族的非选择性阳离子通道的特性，其通过刺激包括低温、薄荷醇和其它化学凉爽剂而被活化。然而，目前还未清楚地理解感知皮肤或口腔表面上令人愉快的凉爽感觉下的精确机理。虽然已证明TRPM8受体被薄荷醇和其它凉爽剂活化，但是未完全理解的是其它哪些受体可能被涉及，并且这些受体需要被刺激或者也许被压制到什么样的程度，以使得总体感觉是愉快、清凉和清新的。例如，薄荷醇广泛用作凉爽剂，但是薄荷醇还能够产生其它感觉，包括发麻、灼热、刺痛和灼痛以及薄荷气味和苦味。因此，能够推断出的是薄荷醇作用在多种不同的受体上，包括寒冷、温暖、疼痛和味觉受体。

可用于增溶如下所论述的本发明化合物(如化合物28)的溶剂的示例是基于溶解度参数和内聚力性能的，所述溶解度参数和内聚力性能由Charles Hansen在“HansenSolubility Parameters:A User’s Handbook”(Charles M.Hansen所著，CRC出版社(2007))以及由Allan F.M.Barton编辑的“The CRC Handbook and SolubilityParameters and Cohesion Parameters”(1999)中有所解释。每种材料由三维空间中的三个点界定，并且这三个点被称为Hansen溶解度参数(HSP)，其可如下定义。

溶解度参数是理论计算出的数值常数，它是预测溶剂材料对特定溶质溶解能力的可用工具。当溶剂的溶解度参数在溶质即待溶解材料的溶解度参数范围内时，可能发生所述溶质的溶解。存在三个Hansen经验和理论导出的溶解度参数：分散力组分(δ_D)、极性或偶极交互作用组分(δ_P)和氢键组分(δ_H)。三个参数(即分散力、极性和氢键)中的每一个表示溶解力或溶剂能力的不同特征。将三个参数组合在一起为溶剂总体强度和选择性的量度。总Hansen溶解度参数为前述三个参数平方之和的平方根，其提供了更加综合的溶剂溶解力描述。单独溶解度参数和总溶解度参数单位以MPa^0.5示出。然后，可将材料的溶解度参数绘制于正规三维图中。由所述位置(δ_D、δ_P、δ_H)，投射半径以形成包围溶解度区域的球体，因此其参数位于此空间内的任何溶剂应能够溶解所关注的溶质。材料(即溶质)的HSP坐标与材料(溶剂)的HSP坐标间的距离在本文中被指定为Ra。3D距离Ra由以下等式定义：Ra²＝4(δ_D1-δ_D2)²+(δ_P1-δ_P2)²+(δ_H1-δ_H2)²。以所选目标分子为中心计算Hansen球体公式，在此情况下，所选目标分子为化合物28和各自的各种异构体(L、D和新)和对映体。目标极性、分散力和氢键HSP是由5.1.9版“Molecular Modeling Pro”软件(ChemSW，Fairfield Calif.，www.chemsw.com)计算出的目标分子Hansen溶解度参数或是得自Dynacomp软件的Hansen溶解度。在此分析中，同样经由此软件计算出每种溶剂的溶解度参数。半径R_a＝14的球体内的是化合物28和异构体物质将溶解于其中的溶剂。为使在所选溶剂中的溶解度>5％，δ_分散的优选范围为±3个单位，约15.2至21.2(MPa)^0.5。δ_极性的优选范围为±6个单位，约0至10.8(MPa)^0.5。δ_氢键的优选范围为±13个单位，约0至25(MPa)^0.5。化合物28的HSP计算为分散＝17.8，极性＝5.6，并且氢键＝9.0。用于增溶酰胺衍生物(化合物28)的具有适宜Hansen溶解度参数的风味剂和芳香剂原材料的非限制性示例包括薄荷酮、香芹酮、松油、肉桂醛、乙醇、苄醇、桉叶脑、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、己烷、乙醇胺、环糊精和三醋精。

理想的是，凉爽剂可产生与薄荷醇所产生的类似的凉爽或清新感觉，但是没有与薄荷醇相关的某些缺点，如风味改变、苦的余味、异味、强的气味和灼热或刺激的感觉，尤其是在高浓度下。希望所述凉爽剂化合物仅仅拥有区别性的气味或风味，同时提供持久的令人愉快的清新清凉的感觉，使得在使用后所述效应仍能够在相当长的时间内被察觉到，例如长于15分钟。薄荷醇一般提供起始高强度的凉爽冲击，但是由于凉爽感觉在使用后几分钟内急剧下降，因此其效果是相当短暂的。相反，许多较长持续时间的凉爽剂化合物可能无法提供立即的凉爽感觉，即在施用的几秒钟之内，尤其是当以低含量使用时。因此，有持续的对在以下方面加强凉爽剂化学品的活性的方法的需要：加快凉爽感觉的发生、加强凉爽感觉(尤其是在较低浓度时)并且产生比薄荷醇所提供的更加持久的凉爽和清新的感觉。

如前所述，本发明涉及一种或多种如下所示的从5-甲基-2-(1-甲基乙基)-N-(2-苯乙基)-,(1R,2S,5R)-环己烷甲酰胺结构分离特定立体异构体的方法，特定立体异构体可在低浓度下促使凉爽响应。

包括化合物28的结构I代表出人意料地发现可用作TRPM8活化调节剂的类。结构I代表具有下文所示结构的甲醇的杂烷基取代的芳基或杂烷基-芳基取代的烷基酰胺，并且包括其任何可接受的盐或溶剂化物；其中：

结构I

R₁选自H、烷基、氨基烷基、烷氧基；

V＝NR₁、O、-OPO(OR₁)_x、-PO(OR₁)_x、-P(OR₁)_x，其中x＝1-2；

W＝H₂、O；

对于n＝0，X、Y＝独立地选自H、芳基、萘基；

A＝低级烷氧基、低级烷硫基、芳基、被取代的芳基或稠合芳基；以及立体化学在标记*的位置是可变的，并且甚至可以在标记(S)和(R)的位置变化。

上文结构I中设想了多种立体异构体并且可以根据本发明的目标进行分离，其中允许取代，并且每个立体中心的相对构型将决定对受体的活性。侧链基团的立体化学可对分子活性具重要性，然而这些化合物的体内活性是高度不可预测的。在一些情况下，相同分子的异构体可具有能与之相比的活性。在其它情况下，相同分子的立体异构体可具有增强或减弱的对受体的活性。在一些情况下，单独的立体异构体可不具有活性。

受关注的特定化合物可衍生自存在于天然(-)-薄荷醇中的1R,2S,5R构型(下文中以结构IA示出)。在这些情况下，1R,2S,5R-薄荷基酰胺的立体异构衍生物将存在于所述分子的取代烷基侧链片段中。虽然1R,2S,5R构型对活性而言是重要的，但是N-取代的薄荷基酰胺衍生物的1S,2S,5R新-异构体(下文中以结构IB示出)也已示出前景。

新-异构体：

R₁选自H、烷基、氨基烷基、烷氧基；

V＝NR₁、O、-OPO(OR₁)_x、-PO(OR₁)_x、-P(OR₁)_x，其中x＝1-2；

W＝H₂、O；

对于n＝0，X、Y＝独立地选自H、芳基、萘基；

下文列出一些可使用根据本发明的方法进行分离的一些立体异构体的示例。

(1R，2S，5R)-N-(2-((R)-2-氨基丙酰胺基)-2-苯基乙基)-2-异丙基-5-甲基环己烷-1-甲酰胺

DRL立体异构体

(1R，2S，5R)-N-((R)-2-((R)-2-氨基丙酰胺基)-2-苯基乙基)-2-异丙基-5-甲基环己烷-1-甲酰胺

DSL立体异构体

(1R，2S，5R)-N-((S)-2-((R)-2-氨基丙酰胺基)-2-苯基乙基)-2-异丙基-5-甲基环己烷-1-甲酰胺

LSL立体异构体

(1R，2S，5R)-N-((S)-2-((S)-2-氨基丙酰胺基)-2-苯基乙基)-2-异丙基-5-甲基环己烷-1-甲酰胺

已发现，具有2-氨基-丙酰胺(CAS#4726-84-5)的(1R，2S，5R)-5-甲基-2-(1-甲基乙基)-N-(2-苯乙基)-环丙烷甲酰胺(CAS#824947-52-6)和(1R，2S，5R)-5-甲基-2-(1-甲基乙基)-N-(2-苯乙基)-环丙烷甲酰胺(CAS#847564-71-0)结构(上文示出)具有增强的持久凉爽特性，并且具有氨基乙烷(CAS#75-04-7)部分的(1R，2S，5R)-5-甲基-2-(1-甲基乙基)-N-苯基-环丙烷甲酰胺和(1R，2S，5R)-5-甲基-2-(1-甲基乙基)-N-1-萘基--环丙烷甲酰胺(CAS#863091-95-6)结构递送温热感。两种类型的环己烷甲酰胺(凉爽和温热)在低使用含量(1-10ppm)下是有效的。使用如此低含量的这些材料的优点使得它们能够被配制成含水更高的组合物如漱口水，而无需另外的加工助剂如辅助表面活性剂、油或其它悬浮剂。这些材料也可提供味感减轻，如来自金属盐、过氧化物和CPC的味感。

以化合物28举例说明的长效TRPM8活性的其它合适用途将用于食品应用；皮肤状况，诸如非角化分层上皮的治疗；止痛剂应用，作为疼痛缓解剂；减少炎症；香烟添加剂；用于肌肉疼痛的局部用药，用于骨关节炎的慢性疼痛以及用于化疗诱导的神经病变；皮肤屏障恢复促进剂；和止痒或防腐药物；和用于舒张血管中的血管收缩。

所述化合物如化合物28的使用含量取决于身体的靶向TRPM8区域。例如，在本发明化合物如牙粉、牙线、口香糖或美白贴条的口腔施用中，使用含量可以为按所述组合物的重量计约0.00001％至约0.1％；约0.00005％至约0.1％；约0.0001％至约0.05％；或约0.001％至约0.01％。当本发明化合物用于漱口水中时，使用含量可为按所述组合物的重量计约0.000001％至约0.01％，或约0.0001％至约0.001％。当以例如洗发剂和洗剂形式局部递送本发明化合物如化合物28时，所述含量可为按所述组合物的重量计约0.001％至约0.5％，或按所述组合物的重量计约0.01％至约0.4％。

在由例如牙粉、锭剂、牙线、口香糖或美白贴条口腔施用化合物例如本发明化合物28时，当化合物28分离成异构体或混合的异构体时，使用含量可为约10％至约70％的级分1和约10％至约70％的级分2，或约30％至约60％的级分1和约30％至约60％的级分2。当为异构体或混合的异构体的化合物28与TRPA1激动剂、TRPV1激动剂或二者混合时，TRPA1或TRPV1激动剂的用量将在按所述组合物的重量计约0.001％至约0.5％，或约0.01％至约0.2％的TRPA1或TRPV1激动剂范围内，其中TRPA1激动剂和/或TRPV1激动剂可分别或同时加入到包含化合物28的组合物中。当除了化合物28以外，还使用另一种TRPM8激动剂时，附加TRPM8激动剂的使用含量可为按所述组合物的重量计约0.001％至约0.5％，或约0.005％至约0.3％。如果除了化合物28以外，还使用TRPM8增强剂，则它可以按所述组合物的重量计约0.001％至约0.2％，或约0.005％至约0.1％的范围加入。本发明的组合物可包含上文所公开范围内的多种TRPA1和TRPV1激动剂，以由化合物28递送增强的感觉信号。

在以例如洗发剂和洗剂形式局部施用化合物如化合物28时，当化合物28分离成异构体或混合的异构体时，使用含量可为约10％至约70％的级分1和约10％至约70％的级分2，或约30％至约60％的级分1和约30％至约60％的级分2。当为异构体或组合的异构体的化合物28与TRPA1和/或TRPV1激动剂组合时，TRPA1或TRPV1激动剂的使用含量按所述组合物的重量计可在约0.001％至约0.5％，或约0.01％至约0.2％的TRPA1或TRPV1激动剂范围内，其中TRPA1激动剂和TRPV1激动剂可分别或同时加入到包含化合物28的组合物中。当除了化合物28以外，还使用另一种TRPM8激动剂时，附加TRPM8激动剂的使用含量可为按所述组合物的重量计约0.001％至约0.5％，或约0.005％至约0.3％。如果除了化合物28以外，还使用TRPM8增强剂，则它可以按所述组合物的重量计约0.001％至约0.2％，或约0.005％至约0.1％的含量使用。所述组合物可包含所述范围内的多种TRPA1和TRPV1激动剂，以由化合物28递送增强的感觉信号。

实施例

除非另有说明，否则实施例中所述的所有步骤均在室温下进行。

实施例1化合物#28异构体的非手性分离和表征

由非立体特异性合成产生的化合物28进行色谱分离以产生两个称为级分1和级分2的多克级分。从化合物#28的结构看，有n＝5个手性中心，并且理论上可以是2⁵或32个总异构体，包括16对对映体。最初，开发非手性色谱条件以分离化合物28的异构体并且通过LC-UV-MS使用配备有样品管理器、四元溶剂管理器、可调紫外(TUV)检测器和QDa质量选择性单四极杆质量分析器的Waters Acuity H Class超高效液相色谱仪(UPLC)(WatersCorporation，Milford，MA)来表征级分1和级分2。为准备进行分析和表征，将化合物28的固体样品称重并且以约100μg/mL溶解于由50％去离子水/50％甲醇(MeOH，HPLC等级，得自EMDMillipore Corporation，Billerica，MA)组成并且还包含0.1％三氟乙酸(TFA，SigmaAldrich Corporation，St.Louis，MO)的溶液中。

使用具有1.7μm颗粒的2.1×100mm Acuity UPLC BEH Shield RP18柱(WatersCorporation，Milford，MA)，实现包含于化合物28的样品中的异构体的非手性分离。使用移动相梯度，其中移动相(A)包含水和0.1％的得自Sigma Aldrich的TFA，并且移动相(B)包含得自EMD Millipore,Co.,Billerica,MA的MeOH。注入前使移动相组成平衡至75％(A)/25％(B)，然后进行5μl样品注入，在10分钟时使移动相组成线性阶升至100％(B)。使100％移动相(B)保持3分钟，然后在2分钟内斜线降回至初始条件。在整个LC分析方法中保持0.4毫升/分钟的移动相流速。通过监测215nm处的检测器吸光度，获得UV迹线。

化合物28级分1和级分2的UV分析分别示于图1和图2中，表明优异的滞留时间重复性和非常好的存在于这些混合物中的异构体的分离。图3提供级分1和级分2的代表性分析的UV叠加，凸显化合物28的这两种级分的异构组成的差异。

图3示出化合物28异构体的HPLC(高效液相色谱法)分离。在7.4至7.5分钟收集的标记为级分1的级分对应于递送强烈凉爽感和由TRPM8活性测得的低EC50的主要异构体和次要异构体，如下表2、3和4中所示。在7.20至7.38分钟收集的标记为级分2的级分对应于具有低得多的TRPM8值的化合物28的异构体，其在所测试剂量下不提供人类感知到的凉爽响应，如表2、3和4中所示。

来自分析化合物28的级分1的UV迹线示于图4中，这显示出在此混合物中由此处所用的非手性色谱条件分离的8种不同的异构体。给定化合物28的结构，示于图4中的QDa正离子质谱峰按预期在m/z 374处显示强的质子化分子离子，并且表明图4中凸显的组分是化合物28的异构体物质。

实施例2使用反相条件对化合物28异构体进行手性分离和表征

为了进一步改善化合物28异构体的分离，使用上述TUV和QDa检测器，使用反相UPLC条件(Waters Acquity H ClasS，超高效液相色谱仪，Waters Corporation，Milford，MA)评估手性固定相。Waters Acquity UPC²Trefoil柱与UPLC一起使用，或者在Waters2695分离模块和Waters 2998光电二极管阵列检测器(均来自Waters Corporation，Milford，MA)上使用HPLC。评估CEL1(纤维素三-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))和AMY1(直链淀粉三-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))(150mm×2.1mm，2.5μm粒子，WatersCorporation，Milford，MA)Trefoil柱的它们分离化合物28的异构体的能力。另外，评估Chiralcel OJ-R(150mm×4.6mm，5μm粒子，Daicel Chemical IndustrieS,Osaka-SHI，Japan)手性柱。使用这些柱，研究了一系列移动相以开发化合物28异构体的手性分离，包括以下溶剂：乙腈(ACN)，甲醇(MeOH，均来自EMD Millipore，Co.，Billerica，MA)和水(Milli-Q Millipore高质量水纯化系统，Billerica,MA)，具有5-25mM含量的甲酸铵(Alfa AesaR,Ward Hill，MA)、六氟磷酸钾(KPF₆，TCI America，Portland，OR)和/或甲酸(SigmaAldrich,St.Louis,MO)并且具有3至9范围的pH。用甲酸将pH调节至更低，和用氢氧化铵(EMD Millipore Co.，Billerica，MA)将pH调节至更高。在上述方法条件的各种组合下进行超过100次注射后，没有实现化合物28的级分1混合物中异构体的质量分离。下表1凸显了没有成功分离所尝试的具体条件，以及确定这些分离不成功的原因。

表1：利用反相条件产生化合物#28异构体的不成功分离的条件的示例。

如细胞培养方案实施例中所述，由用TRPM8受体基因转染的细胞测定细胞内钙离子(Ca²⁺)含量，确定TRPM8活化，其结果示于表2和3中。

表2：化合物28的TRPM8时间进程活性

表3：化合物28异构体的TRPM8时间进程活化

表2和3中所示的TRPM8数据(其中表2对应于级分1，并且表3对应于级分2)比较化合物28的两个HPLC异构体分离(级分1、级分2)的剂量响应。如表2和表3中所示，两个级分各自在781nM下快速活化TRPM8。然而，级分1在与级分2相比越来越低的剂量下持续活化。从12.2nM剂量活化5分钟时，级分1为对照物的103.8％；而在相同时间点和剂量下的级分2是对照物的65.7％。活化10分钟时，12.2nM剂量级分1为对照物的115.5％，而12.2nM剂量级分2为对照物的71.1％。级分1在12.2nM下的读数异常高，并被认为是异常数据点。如果包含，则12.2nM的数据点将使EC50低于现实可能，因此被排除在表3中的EC50计算之外。异构体的这些差异进一步由如下表4所示的EC50值示出。

表4：异构体级分的EC50计算

实施例3细胞培养方案

为了确定测试化合物对TRPM8(SEQ ID NO:1)活化具有什么效果(如果有的话)，使用以下列出的方案。

TRPM8方案-FLIPR测定

为测定TRPM8是否活化，由具有TRPM8受体序列(SEQ ID NO:1)的转染细胞测量细胞内钙离子(Ca²⁺)含量。在设至5％CO₂的37℃哺乳动物细胞培养箱中，使采用人TRPM8稳定转染的HEK-293(人胚肾)细胞在75cm²烧瓶内的15mL生长培养基补充有10％FBS(胎牛血清)、100ug/mL青霉素/链霉素、5μg/mL杀稻瘟菌素、和100μg/mL博来霉素的高糖DMEM(杜贝克氏改良依格培养基(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium))]内生长3天。在约2-3分钟内加入2mL的胰蛋白酶-EDTA缓冲液(25200，Invitrogen，Grand Island，NY)，来分离细胞。通过加入8mL生长培养基使胰蛋白酶失活。将细胞转移至50mL管中并且以850rpm离心3分钟以除去介质。在离心后，细胞沉淀形成在管子底部，使它们与上层溶液分离。弃去上清液，将细胞沉淀物悬浮在1mL新鲜生长介质中，其中加入5μl(12.5μg)Fluo-4AM(Molecular Probes，Inc.,Eugene,OR)钙指示剂，并且轻轻振荡培养30分钟。Fluo-4AM是用于定量在100nM至1微摩尔范围内的细胞Ca²⁺浓度的荧光染料。在30分钟结束时，加入45mL分析缓冲液(1xHBSS(Hank平衡盐溶液)、20mM HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸))以洗涤细胞，然后将所得混合物在850rpm下离心3分钟以除去过量的缓冲液和Fluo-4AM钙指示剂。

将沉淀的细胞重新悬浮在10mL分析缓冲液中，并且将90μL等分试样(约50,000个细胞)/孔递送至96-孔的包含10μL受试化合物(1mM，在分析缓冲液中，最终浓度100μM)或者缓冲液对照物的检测板上，并且在室温下温育30分钟。在30分钟后，将板置于荧光成像读板仪(FLIPR TETRA，得自Molecular Devices，Sunnyvale，CA)中，并且记录基底的荧光(激发波长488nm，以及发射波长510nm)。然后将20μl的180μM TRPM8激动剂WS5凉爽剂溶液加入分析缓冲液中，并通过FLIPR自动记录荧光信号。为了确定受试化合物对TRPM8的直接效应，在添加每种化合物之后立即测定荧光(表2和3)。FLIPR方法的附加讨论可见于Smart等人的“Characterization using FLIPR of human vanilloid VR1receptor pharmacology”(European Journal of Pharmacology 417，51-58，2001)和Liu等人的“Development andvalidation of a platelet calcium flux assay using a fluorescent imaging platereader”(Analytical Biochemistry 357，216-224，2006)。

实施例4使用超临界流体色谱条件对化合物28异构体进行手性分离和表征

由于使用反相条件开发化合物28异构体的有效手性分离有困难，评估了超临界流体色谱法(SFC)对化合物28异构体的综合分离的潜力。对于超临界流体手性分离方法的开发，将Waters超高效合相色谱仪(UPC2，Waters Corporation，Milford，MA)与AppliedBiosystems API 4000三重四极质谱仪(Applied BiosystemS,Toronto，Canada)组合。

评估了直链淀粉三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯](AS-H)、直链淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(AD-H)、纤维素3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯(OD-H)、纤维素三(甲基苯甲酸酯)(OJ-H)固定相(全部250mm×4.6mm，5μm颗粒，Chiral Technologies Inc.，WestChesteR,PA)和纤维素三-(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)(150mm×3mm，2.5μm颗粒，WatersCorporation,Milford,MA)固定相以及超临界流体移动相，超临界流体移动相由以下的组合组成：高压二氧化碳(Matheson，Coleman Instrument级，Matheson Tri-GaS,Inc.，Basking Ridge，NJ)、甲醇(LC-MS级，Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)、异丙醇(LC-MS级，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)和乙醇(HPLC梯度级，Merck&Co.，Inc.，Kenilworth，NJ)，以及添加剂诸如乙酸铵(LC-MS级，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)、三乙胺(LC-MS级，Sigma Aldrich Corporation，St.LouiS,MO)和甲酸(LC-MS级，SigmaAldrich Corporation，St.LouiS,MO)。使用在正电离大气压化学电离(+APCI)，选定的反应监测(SRM)模式下操作的API 4000三重四极质谱仪和连续记录来自m/z 374至83转变的响应实现检测。利用氮气目标气体以碰撞能量为47eV，碰撞出口电势为5V，去除电势为120V，源温度为500℃，针电流为3，碰撞气体压力为5的第二个四极中实现碰撞激活。

总体而言，尝试了超过100种不同的SFC条件组合，而未实现化合物28异构体的SFC成功分离。不能接受的分离的原因与表1中反相手性分离所列出的相同，并且包括化合物28异构体保留不充分，无法从柱中洗脱化合物28异构体，和/或无法实现良好分离充分保留和洗脱的异构体。

化合物28异构体的有效手性分离显然是非常具有挑战性的并且不明显，尤其是考虑到其多官能度，五个手性中心和32种异构可能性。经过上述大量调查并进行战略优化后，最终发现Chiralpak AS-H和Chiralpak AD-H柱在按照AS-H其后跟随AD-H的顺序串联组合时，在优化的移动相下，能够成功地分离迄今为止产生的化合物28的所有异构体。应当指出的是，AD-H意味着包括利用直链淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)化学品的任何柱，并且AS-H包括利用直链淀粉三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯]化学品的任何柱。同样，其中指定的任何其它柱化学品都是指包括这些相应化学品的所有柱，而不仅仅是由特定供应商制造的一种特定类型的柱。

对于成功的手性分离，使用Chiralpak AS-H柱，接着Chiralpak AD-H柱，其中移动相由二氧化碳、乙醇和20mM乙酸铵组成。通过将样品混合物在加压CO₂[150巴背压]的超临界流体流中以1.0ml/min的流速以在40℃保持恒定的柱温注射到含有10％乙醇(具有20mM乙酸铵)的移动相中来进行梯度分离。在返回初始条件之前，乙醇的百分比以0.25％/分钟线性斜升至最大26％。在注射之前，将样品溶解在甲基叔丁基醚中并注入7.5μL。在上述条件下通过监测m/z 374至83的SRM转变，用API 4000三重四极杆实现检测。

表5：通过非立体定向和立体定向合成途径产生的物质的手性SFC色谱分析测定的合成混合物中化合物28异构体含量。峰面积占总量>0.5％的异构体包括在该表中并在图5 中标记。

除了立体选择性合成之外，质量色谱纯化是分离化合物28的高纯度单一异构体的另一种方法。我们已经发现，手性选择剂AD-H和AS-H与最佳移动相一起串联使用时，可以成功分离这些异构化合物，这对于异构纯化将非常有用。考虑到其复杂的官能度、五个手性中心和32种可能的异构体，所以化合物28异构体的手性分离非常困难并且不明显。通过战略优化和开发，基于AD-H和AS-H手性选择剂的组合，开发了独特的分离技术。预期直链淀粉基的手性固定相与亚临界、超临界或增强流动性醇/CO₂移动相组合的最佳使用可以提供化合物28异构体的良好分离。出于化合物28异构体纯化的目的，期望限制任何非挥发性或半挥发性添加剂的使用，以便于在收集纯化的化合物28异构体时去除移动相。例如，在某些实施方案中，移动相可以包含按移动相的重量计小于约0.2％的非挥发性添加剂或半挥发性添加剂(诸如乙酸铵)。另外，按照给定应用的要求，也可以使用质量分离的两个或更多个连续阶段来增加每个异构体级分的纯度。

本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个这样的量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。

除非明确排除或以其它方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。任何文献的引用不是对其作为与本发明任何公开或本文受权利要求书保护的现有技术的认可，或不是对其自身或与任何其它参考文献或多个参考文献的组合提出、建议或公开了此发明任何方面的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文件中相同术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。

虽然已举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明实质和范围的情况下可作出多个其它变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

序列表

<110> 宝洁公司

<120> 色谱分离的方法

<130> 14075M

<160> 1

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 3315

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

atgtccttcg agggagccag gctcagcatg aggagccgca gaaatggtac tatgggcagc 60

acccggaccc tgtactccag tgtatctcgg agcacagacg tgtcctacag tgacagtgat 120

ttggtgaatt ttattcaggc aaattttaaa aaacgagaat gtgtcttctt taccagagac 180

tccaaggcca tggagaacat atgcaagtgt ggttatgccc agagccagca catcgaaggc 240

acccagatca accaaaatga gaagtggaac tacaaaaaac ataccaagga gtttccaaca 300

gacgccttcg gggacattca gtttgagact ctggggaaga aaggcaagta cttacgcttg 360

tcctgtgaca ccgactctga aactctctac gaactgctga cccagcactg gcacctcaaa 420

acacccaacc tggtcatttc agtgacgggt ggagccaaaa actttgcttt gaagccacgc 480

atgcgcaaga tcttcagcag gctgatttac atcgcacagt ctaaaggtgc gtggattctc 540

actggaggca ctcactacgg cctgatgaag tacataggcg aggtggtgag agacaacacc 600

atcagcagga actcagaaga gaacatcgtg gccattggca tcgcagcatg gggcatggtc 660

tccaacaggg acaccctcat caggagctgt gatgatgagg gacatttttc agctcaatac 720

atcatggatg actttaccag agaccctcta tacatcctgg acaacaacca tacccacctg 780

ctgcttgtgg acaacggttg tcatggacac cccacagtgg aagccaagct ccggaatcag 840

ctggaaaagt acatctctga gcgcaccagt caagattcca actatggtgg taagatcccc 900

atcgtgtgtt ttgcccaagg aggtggaaga gagactctaa aagccatcaa cacctctgtc 960

aaaagcaaga tcccttgtgt ggtggtggaa ggctcggggc agattgctga tgtgatcgcc 1020

agcctggtgg aggtggagga tgttttaacc tcttccatgg tcaaagagaa gctggtacgc 1080

tttttaccac gcactgtgtc ccggctgcct gaagaggaaa ttgagagctg gatcaaatgg 1140

ctcaaagaaa ttcttgagag ttctcaccta ctcacagtaa ttaagatgga agaggctgga 1200

gatgagattg tgagcaacgc catttcctat gcgctgtaca aagccttcag cactaatgag 1260

caagacaagg acaactggaa tggacagctg aagcttctgc tggagtggaa ccagttggac 1320

cttgccagtg atgagatctt caccaatgat cgccgctggg agtctgccga ccttcaggag 1380

gtcatgttca cggctctcat aaaggacaga cccaagtttg tccgcctctt tctggagaat 1440

ggcctgaatc tgcagaagtt tctcaccaat gaagtcctca cagagctctt ctccacccac 1500

ttcagcaccc tagtgtaccg gaatctgcag atcgccaaga actcctacaa tgacgcactc 1560

ctcacctttg tctggaagtt ggtggcaaac ttccgtcgaa gcttctggaa agaggacaga 1620

agcagcaggg aggacttgga tgtggaactc catgatgcat ctctcaccac ccggcacccg 1680

ctgcaagctc tcttcatctg ggccattctt cagaacaaga aggaactctc caaggtcatt 1740

tgggagcaga ccaaaggctg tactctggca gccttggggg ccagcaagct tctgaagacc 1800

ctggccaaag ttaagaatga tatcaacgct gctggggaat cggaggaact ggccaatgaa 1860

tatgagaccc gagcagtgga gttgttcacc gagtgttaca gcaatgatga agacttggca 1920

gaacagctac tggtctactc ctgcgaagcc tggggtggga gcaactgtct ggagctggca 1980

gtggaggcta cagatcagca tttcatcgct cagcctgggg tccagaattt cctttctaag 2040

caatggtatg gagagatttc ccgagacacg aagaactgga agattatcct gtgtctattc 2100

atcatcccct tagtgggctg tggcctcgta tcatttagga agaaacccat tgacaagcac 2160

aagaagctgc tgtggtacta tgtggccttc ttcacgtcgc ccttcgtggt cttctcctgg 2220

aacgtggtct tctacatcgc cttcctcctg ctgtttgcct atgtgctgct catggacttc 2280

cactcagtgc cacacacccc cgagctgatc ctctacgccc tggtcttcgt cctcttctgt 2340

gatgaagtga ggcagtggta catgaacgga gtgaattatt tcaccgacct atggaacgtt 2400

atggacaccc tgggactctt ctacttcata gcgggtattg tattccggct ccactcttct 2460

aataaaagct cgttgtactc tgggcgcgtc attttctgtc tggattacat tatattcacg 2520

ctaaggctca tccacatttt caccgtcagc aggaacttgg gacccaagat tataatgctg 2580

cagcggatgc tgatcgacgt tttcttcttc ctgttcctct ttgctgtgtg gatggtggcc 2640

tttggcgtgg ccagacaggg gatcctaagg caaaatgaac agcgctggag atggatcttc 2700

cgctctgtca tctatgagcc ctacctggcc atgtttggcc aggttcccag tgacgtggat 2760

agtaccacat atgacttctc ccactgtacc ttctcgggaa atgagtccaa gccactgtgt 2820

gtggagctgg atgagcacaa cctgccccgc ttccctgagt ggatcaccat tccgctggtg 2880

tgcatctaca tgctctccac caatatcctt ctggtcaacc tcctggtcgc catgtttggc 2940

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aatgcctgct gtttcagaaa tgaggacaat gagactttgg cgtgggaggg tgtcatgaag 3180

gagaattacc ttgtcaagat caacacgaaa gccaacgaca actcagagga gatgaggcat 3240

cggtttagac aactggactc aaagcttaac gacctcaaaa gtcttctgaa agagattgct 3300

aataacatca agtaa 3315

Claims

1.一种使用超临界流体色谱法分离特定立体异构体的方法，所述方法包括：

a.提供具有直链淀粉三[(S)-α-甲基苄基氨基甲酸酯](AS-H)的柱；

b.提供具有直链淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(AD-H)的柱；

c.提供化合物28；

其中化合物28流过AS-H柱，并且然后流过AD-H柱来分离立体异构体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述AD-H柱包含含有二氧化碳、乙醇和乙酸铵的移动相，优选其中所述乙酸铵为0mM至50mM。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分离是使用直链淀粉基的手性固定相与加压CO₂的超临界流动性束流、加压CO₂的亚临界流动性束流或加压CO₂的增强流动性束流中的至少一种一起使用来实现的。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述AS-H柱与包含二氧化碳、醇或乙酸铵中的至少一种的移动相组合使用，优选其中所述醇是乙醇。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述AD-H柱与包含二氧化碳、醇或乙酸铵中的至少一种的移动相组合使用，优选其中所述醇是乙醇。

6.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述AS-H柱与包含加压CO₂的超临界流动性束流、加压CO₂的亚临界流动性束流或加压CO₂的增强流动性束流中的至少一种的梯度分离组合使用。

7.根据权利要求1或5所述的方法，其中所述AD-H柱与包含加压CO₂的超临界流动性束流、加压CO₂的亚临界流动性束流或加压CO₂的增强流动性束流中的至少一种的梯度分离组合使用。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述移动相包含以所述移动相的重量计小于约0.2％的非挥发性添加剂或半挥发性添加剂，优选其中所述移动相包含小于约0.2％的乙酸铵。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中分离的立体异构体具有至少约70％的纯度，优选其中所述分离的立体异构体具有至少约85％的纯度，更优选其中所述分离的立体异构体具有至少约95％的纯度。