CN108118069A - 新的模拟阿尔茨海默病的人诱导多潜能干细胞系及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备阿尔茨海默病(AD)的细胞模型的方法，其包括将AD相关基因整合到hiPSC中以诱导hiPSC的β‑分泌酶水平增加和/或Aβ‑42肽增加，同时还涉及由该方法制备的阿尔茨海默病(AD)的细胞模型。

Description

新的模拟阿尔茨海默病的人诱导多潜能干细胞系及其用途

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别是为阿尔茨海默病(AD)创建生理学相关 的细胞模型。具体地，本发明涉及通过遗传修饰人诱导多潜能干细胞(hiPSC) 制备AD细胞模型的方法。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是慢性神经退行性疾病，是痴呆症的最常见原因。基 于双胞胎和家庭的研究综述，阿尔茨海默病的基因遗传率范围是从49％到 79％^1-2。大约0.1％的病例是家族性的常染色体(非性别连锁)显性遗传，其在 65岁以前发病³。这种形式的疾病称为早发性家族阿尔茨海默病。大多数常 染色体显性家族性AD可归因于以下三种基因之一的突变：编码淀粉样前体 蛋白(APP)以及早老素1和2的那些基因⁴。APP和早老素基因中的大部分 突变增加称为Aβ42的小蛋白质的产生，Aβ42是老年斑的主要成分⁵。

阿尔茨海默病的大多数病例不表现为常染色体-显性遗传，其称为散发 性AD，其中环境和遗传差异可能是危险因素。最显著的遗传危险因素是载 脂蛋白E的ε4等位基因的遗传(APOE)^6-7。40％至80％的患有AD的人至少 有一种APOEε4等位基因⁷。APOEε4等位基因将疾病的风险在杂合子中提 高三倍，在纯合子中提高15倍³。

TREM2基因突变与高出3至5倍的阿尔茨海默病发生风险相关^8-9。普 通认可的作用机制是当TREM2突变时，大脑中的白细胞不再能够控制β淀 粉样蛋白的存在量。

AD具有两个不同的特征：一个是存在含有淀粉样蛋白β-蛋白(Aβ)的细 胞外噬斑，另一个是细胞内神经原纤维缠结(NFT)。虽然AD的真实病理仍 然不清楚，但数十年研究的积累为淀粉样蛋白级联假说提供了有力的证据。 根据这一假设，导致AD的关键事件似乎是在淀粉样前体蛋白(APP)的加工 过程中形成特定的肽，其中淀粉样蛋白β肽42(Aβ₄₂)是易于聚集形成Aβ₄₂寡聚体和随后形成淀粉样蛋白斑块的粘性肽，这是AD的第一个特征。Aβ₄₂聚集体和淀粉样蛋白斑块的存在可以引发神经元的炎症，并且增加钙激活的 激酶的表达，其反过来诱导tau蛋白的过度磷酸化，tau蛋白稳定神经元中的 细胞骨架微管。tau蛋白的超磷酸化导致神经元中神经原纤维缠结的形成， 即AD的第二个特征，并且随后导致神经元死亡^10-14。

三种酶，α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶参与APP的切割。在正常过程 中，APP首先被α-分泌酶或β-分泌酶切割，而γ-分泌酶将进一步切割的产 物加工成具有不同长度的肽的混合物。如果APP被β-分泌酶切割，则产物 将被γ-分泌酶进一步切割，以产生可溶性的40个氨基酸淀粉样肽(Aβ₄₀)或 42个氨基酸的肽(Aβ₄₂)，所述42个氨基酸的肽聚集在一起形成不溶性聚集 体，因此形成淀粉样斑块。淀粉样蛋白级联假说的有力证据来自家族性AD(FAD)的研究，其显示所有家族性AD患者的APP或早老素(PS)基因都具 有突变。APP基因突变导致异常的APP蛋白，所述异常的APP蛋白优先被 β-分泌酶切割产生更多的Aβ肽；而PS基因突变导致优先产生Aβ₄₂肽，Aβ₄₂肽为淀粉样蛋白斑块的成分。另一个重要的观测结果是，AD患者中β-分泌 酶的表达和酶活性显著升高，特别是在代表90％以上AD群体的散发性AD (SAD)患者中。受淀粉样蛋白沉积影响的脑区域中β-分泌酶蛋白和活性水平 升高并且这种升高一直保持，但是AD中的神经元和突触明显丢失^15-17。

β-分泌酶1(BACE1)，也称为β-位点淀粉样前体蛋白切割酶1、β位点 APP切割酶1、膜相关天冬氨酸蛋白酶2、memapsin-2、天冬氨酰蛋白酶2 和ASP2，是在外周神经细胞中形成髓鞘时重要的天冬氨酸蛋白酶¹⁸。在人 中，它由BACE1基因编码。通过BACE1进行细胞外切割APP产生可溶性 细胞外片段和称为C99的细胞膜结合片段。通过γ-分泌酶在其跨膜结构域内 切割C99释放APP的细胞内结构域并且产生淀粉样蛋白β。由于γ-分泌酶 切割APP比BACE1切割APP更接近细胞膜，因此γ-分泌酶去除淀粉样蛋 白-β肽的片段。通过α-分泌酶而不是BACE1初步切割APP可防止最终产生 淀粉样蛋白β。

不同于APP和早老素(PS)蛋白，没有已知的编码BACE1的基因突变引 起早发性家族性阿尔茨海默病，这是罕见的疾病形式。然而，已经显示这种 酶的水平在更常见的晚发性散发性阿尔茨海默氏症中升高。BACE切割APP 和其它跨膜蛋白的生理学目的是未知的。BACE2是与BACE1近系的同源物， 其中没有体内APP切割的报道。

由于Aβ-42肽的产生在淀粉样蛋白斑块的形成中起主要作用，因此过去 二十年左右的所有药物开发工作都集中在通过抑制β-分泌酶活性或抑制 Aβ-42聚集减少Aβ-42肽^19-26。然而，AD药物开发的主要问题之一是缺乏 合适的AD模型。迄今为止最著名的AD模型是通过将突变的APP和PS1 基因插入小鼠基因组中以在老龄小鼠中显示AD表型而产生的5xFAD转基 因小鼠²⁷。尽管5xFAD小鼠模型广泛使用，但其在药物开发中具有关于其 效用上的两个主要缺点。第一，人的中枢神经系统与小鼠的中枢神经系统非 常不同，因此在5xFAD模型上测试的候选药物通常对于其对人的影响的预 测性较差。第二，5xFAD小鼠需要6到8个月或更长才能显现表型，因此该 模型显然不适合早期筛选AD候选药物。

多潜能干细胞在制备细胞模型方面具有很大的发展前景，因为它们可以 无限繁殖，并且在人体中产生其它细胞类型，如神经元、心脏、胰腺细胞和 肝细胞。人诱导多潜能干细胞(hiPSC)是一种多潜能干细胞，其可直接从成 体细胞产生。iPSC技术是由ShinyaYamanaka在日本京都的实验室中开创的， 他在2006年公开，引入编码转录因子的四个特定基因可将成体细胞转化为 多潜能干细胞。这种突破性技术是体细胞重编程技术，使研究者能够将终末 分化细胞如皮肤成纤维细胞转化回胚胎干细胞阶段^28-29。

hiPSC可以从患有各种疾病的患者获得并且无限繁殖，因此提供无限的 细胞来源。更重要的是，这些来自患者的hiPSC可以再分化为疾病相关的原 代细胞，并且在细胞水平显示疾病表型^30-36。这构成用于创建基于hiPSC的 细胞疾病模型的一种常见策略。该策略是从明确诊断患有疾病的患者中产生 hiPSC，然后将来自患者的hiPSC分化为靶细胞类型，以在体外显示疾病表 型。

除了来自患者的hiPSC之外，研究者一直在尝试建立细胞疾病模型的另 一策略。他们从非患病者产生hiPSC，然后通过基因组编辑技术将致病基因 引入hiPSC。

为了从hiPSC产生合适的AD细胞模型，必须符合以下几个标准：必须 在生理学上等同于人功能性神经元；必须在相对较短的时间内在体外显示 AD表型；并且必须能够一致地再现大量与AD相关的人神经元。尽管经过 数十年的研究，但至今没有真正成功制备出这种细胞模型。

发明内容

本发明通过提供制备阿尔茨海默病(AD)的细胞模型的方法来满足至少 一些上述需求，所述方法包括基因修饰hiPSC以产生与衍生出细胞模型的等 基因hiPSC相比更高水平的β-分泌酶和β-42肽。

对于本发明，本发明人将AD相关基因引入非病变hiPSC，得到等基因 系，即具有相同的遗传背景的病变细胞系和非病变细胞系，并且由于基因组 编辑技术引入的AD相关基因的堆积效应，病变细胞系在相对较短的时间内 在体外在细胞水平表现AD表型。

在一个方面，本发明提供产生阿尔茨海默病(AD)的细胞模型的方法，其 包括将AD相关基因与hiPSC整合以诱导β-分泌酶水平和/或Aβ-42肽增加。 在一个实施方式中，所述AD相关基因在hiPSC中为组成性过表达。在一个 实施方式中，所述AD相关基因为引起AD发病的突变APP或PS基因，特 别是PS1dE9基因。在一个实施方式中，所述AD相关基因为BACE1基因。 在一个实施方式中，所述AD相关基因选自引起AD发病的突变APP、PS1dE9 基因和BACE1基因中的一种或多种。

在某些实施方式中，所述AD相关基因通过位点特异性的方式整合到 hiPSC中。优选地，所述AD相关基因在AAVS1位点整合到hiPSC中。

在一个方面，本发明提供由上述方法产生的阿尔茨海默病(AD)的细胞模 型。

在一个方面，本发明包括修饰hiPSC的方法，其包括导入AD相关基因 至hiPSC以使其组成性过表达。在一个实施方式中，所述AD相关基因通过 表达载体导入至hiPSC，所述表达载体包含编码AD相关蛋白和报道分子的 核苷酸序列，其中核苷酸序列与启动子可操作地连接，所述启动子为用于驱 动哺乳动物表达载体中的基因高水平表达的启动子。在一个实施方式中，所 述启动子为PGK启动子或CAG启动子。在一个实施方式中，将由启动子控 制的药物筛选基因在包含编码AD相关蛋白和报道分子的核苷酸序列的相同 表达载体中或在单独的表达载体中进一步引入到hiPSC中，所述启动子为用 于驱动哺乳动物表达载体中的基因高水平表达的启动子。在一个实施方式 中，所述启动子为PGA启动子或CAG启动子。在一个实施方式中，表达载 体进一步包含用于位点特异性整合的核苷酸序列，优选地，与人AAVS1位 点同源的核苷酸序列。

在一个方面，本发明提供表达载体，其包含编码AD相关蛋白和报道分 子的核苷酸序列，其中核苷酸序列与启动子可操作地连接，所述启动子为用 于驱动哺乳动物表达载体中的基因高水平表达的启动子。在一个实施方式 中，所述启动子为PGK-1启动子或CAG启动子。在一个实施方式中，所述 载体进一步包含编码由启动子控制的药物筛选基因的核苷酸序列，所述启动 子为用于驱动哺乳动物表达载体中的基因高水平表达的启动子。在一个实施 方式中，所述启动子为PGK-1启动子或CAG启动子。在一个实施方式中， 所述载体进一步包含用于位点特异性整合的核苷酸序列，优选地，与人 AAVS1位点同源的核苷酸序列。在一个实施方式中，药物筛选基因为抗生 素抗性基因，优选地，嘌呤霉素、新霉素、卡那霉素或遗传霉素抗性基因。 在一个实施方式中，报道基因为编码绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白的基因。 在一个实施方式中，载体中的所有元件都按有利于所述AD相关基因表达的 顺序排列。优选地，载体中的所有元件按顺式顺序排列。

在一个方面，本发明提供遗传构建体，其包含的核酸序列编码如下：第 一启动子；由第一启动子控制的药物筛选基因；第二启动子；与由第二启动 子控制的报道基因连接的相关基因；与人AAVS1位点同源的序列，其中所 有元件都为顺式排列。在一个实施方式中，所述第一启动子为PGK-1或CAG 启动子；所述药物筛选基因为抗生素抗性基因；所述第二启动子为PGK-1 或CAG启动子；所述AD相关基因为BACE1和所述报道基因为编码绿色荧 光蛋白或红色荧光蛋白的基因，优选地，编码绿色荧光蛋白的基因。在一个 实施方式中，所述第一启动子为PGK-1或CAG启动子；所述药物筛选基因 为抗生素抗性基因；所述第二启动子为PGK-1或CAG启动子；所述AD相 关基因为PS1dE9和所述报道基因为GFP。在一个实施方式中，抗生素抗性 基因为嘌呤霉素、新霉素、卡那霉素或遗传霉素抗性基因。

在一个方面，本发明提供由上述表达载体中的任一种或上述遗传构建体 中的任一种转化的hiPSC细胞系，在一个实施方式中，所述hiPSC细胞系用 于产生AD细胞模型。

在一个方面，本发明提供用作AD细胞模型的基因修饰的hiPSC，其在 人AAVS1位点整合BACE1基因和组成性过表达整合的BACE1基因。在一 个实施方式中，与没有整合所述BACE1基因的等基因hiPSC相比，经修饰 的hiPSC显示β-分泌酶水平、Aβ42/Aβ-40比、和/或Aβ-42肽增加。在一个 实施方式中，经修饰的hiPSC在人AAVS1位点整合PS1dE9基因和组成性过表达整合的PS1dE9基因。

在一个方面，本发明包括基因修饰的hiPSC用于高通量筛选AD治疗药 物的用途。

在一个方面，本发明提供用于高通量筛选AD的治疗剂的方法，其包括

i)由hiPSC通过向hiPSC导入如上所述表达载体或如上所述遗传构建 体制备阿尔茨海默病(AD)的细胞模型，

ii)用细胞模型培养候选化合物两天至两周，

iii)在加入所述候选化合物之前和之后，测量β-分泌酶水平、Aβ-42浓 度和Aβ42/Aβ-40比；

iv)一种或多种选自β-分泌酶水平、Aβ-42浓度、Aβ42/Aβ-40比、和 Aβ42/Aβ-40比的测量值减少，表示所述候选化合物为治疗AD的潜在治疗 剂。

在一个实施方式中，所述hiPSC来自人供体，优选来自未患有AD的正 常人供体，并且通过常规的重编程方法在体外转化为hiPSC。在一个实施方 式中，所述方法用于筛选早期AD药物。

在一个方面，本发明提供筛选β-分泌酶或Aβ-42抑制剂的药物筛选方 法，其包括

i)通过组成性过表达BACE1基因或PS1dE9基因修饰hiPSC细胞系，

ii)将hiPSC细胞系再分化为功能性神经元，

iii)在候选药物化合物存在下培养所述功能性神经元，和

iv)测量β-分泌酶水平、Aβ42/Aβ-40比、和/或Aβ-42浓度和筛选可减 少β-分泌酶水平、Aβ42/Aβ-40比、和/或Aβ-42浓度的化合物。

在一个实施方式中，所述方法包括在候选药物化合物存在下培养所述功 能性神经元达两天至两周。在一个实施方案中，所述hiPSC来自人供体，优 选来自未患有AD的正常人供体，并且通过常规的重编程方法在体外转化为 hiPSC。在一个实施方案中，通过向hiPSC导入如上所述表达载体或如上所 述遗传构建体制备所述hiPSC。

具体地，本发明涉及：

1.一种制备阿尔茨海默病(AD)的细胞模型的方法，其包括将AD相关 基因整合到hiPSC中以诱导hiPSC的β-分泌酶水平增加和/或Aβ-42肽增加。

2.项1的方法，其中所述AD相关基因在hiPSC中组成性过表达。

3.项1或2的方法，其中所述AD相关基因为引起AD发病的突变APP 基因或突变PS基因。

4.项3的方法，其中所述突变PS基因为PS1dE9基因。

5.项1或2的方法，其中所述AD相关基因为BACE1基因。

6.项1-5任一项的方法，其中所述AD相关基因选自引起AD发病的突 变APP基因、PS1dE9基因和BACE1基因。

7.项1-6任一项的方法，其中所述AD相关基因通过位点特异性的方式 整合到hiPSC中。

8.项7的方法，其中所述AD相关基因在AAVS1位点整合到hiPSC中。

9.通过项1-8任一项的方法产生的阿尔茨海默病(AD)的细胞模型。

10.一种修饰hiPSC的方法，其包括导入AD相关基因至hiPSC以使其 组成性过表达。

11.项10的方法，所述AD相关基因通过表达载体导入至hiPSC，所述 表达载体包含编码AD相关蛋白和报道分子的核苷酸序列，其中所述核苷酸 序列与启动子可操作地连接，所述启动子为用于驱动哺乳动物表达载体中的 基因高水平表达的启动子。

12.项11的方法，其中所述启动子为PGK-1启动子或CAG启动子。

13.项11或12的方法，由启动子控制的药物筛选基因通过包含编码 AD相关蛋白和报道分子的核苷酸序列的相同表达载体或通过单独的表达载 体进一步引入到所述hiPSC中，所述启动子为用于驱动哺乳动物表达载体中 的基因高水平表达的启动子。

14.项13的方法，其中所述启动子为PGK-1启动子或CAG启动子。

15.项10-14任一项的方法，其中所述表达载体进一步包含用于位点特 异性整合的核苷酸序列。

16.项15的方法，其中所述用于位点特异性整合的核苷酸序列为与人 AAVS1位点同源的核苷酸序列。

17.一种表达载体，其包含编码AD相关蛋白和报道分子的核苷酸序列， 其中所述核苷酸序列与启动子可操作地连接，所述启动子为用于驱动哺乳动 物表达载体中的基因高水平表达的启动子。

18.项17的载体，其中所述启动子为PGK-1启动子或CAG启动子。

19.项17或18的载体，其进一步包含编码由启动子控制的药物筛选基 因的核苷酸序列，所述启动子为用于驱动哺乳动物表达载体中的基因高水平 表达的启动子。

20.项19的载体，其中所述启动子为PGK-1启动子或CAG启动子。

21.项17-20任一项的载体，其进一步包含用于位点特异性整合的核苷 酸序列。

22.项21的载体，其中所述用于位点特异性整合的核苷酸序列为与人 AAVS1位点同源的核苷酸序列。

23.项17-22任一项的载体，其中所述药物筛选基因为抗生素抗性基因。

24.项17-23任一项的载体，其中所述报道基因为编码绿色荧光蛋白或 红色荧光蛋白的基因。

25.项17-24任一项的载体，其中所述载体中的所有元件都按有利于所 述AD相关基因表达的顺序排列。

26.项25的载体，其中所述载体中的所有元件都为顺式排列。

27.一种遗传构建体，其包含如下核酸序列：第一启动子；由所述第一 启动子控制的药物筛选基因；第二启动子；与由所述第二启动子控制的报道 基因连接的AD相关基因；和与人AAVS1位点同源的序列，其中上述元件 都为顺式排列。

28.项27的遗传构建体，其中所述第一启动子为PGK-1或CAG启动 子；所述药物筛选基因为抗生素抗性基因；所述第二启动子为PGK-1或CAG 启动子；所述AD相关基因为编码BACE1的基因和所述报道基因为编码绿 色荧光蛋白或红色荧光蛋白的基因。

29.项27的遗传构建体，其中所述第一启动子为PGK-1或CAG启动 子；所述药物筛选基因为抗生素抗性基因；所述第二启动子为PGK-1或CAG 启动子；所述AD相关基因为编码PS1dE9的基因和所述报道基因为编码GFP 的基因。

30.项28或29的遗传构建体，其中抗生素抗性基因为嘌呤霉素、新霉 素、卡那霉素或遗传霉素抗性基因。

31.通过项16-26任一项的表达载体或项27-30任一项的遗传构建体转 化的hiPSC细胞系。

32.项31的hiPSC细胞系用于产生AD细胞模型的用途。

33.用作AD细胞模型的基因修饰的hiPSC，其在人AAVS1位点整合 BACE1基因并且组成性过表达所述整合的BACE1基因。

34.项33的基因修饰的hiPSC，其与没有整合所述BACE1基因的等基 因hiPSC相比，显示β-分泌酶和/或Aβ-42肽增加。

35.用作AD细胞模型的基因修饰的hiPSC，其在所述人AAVS1位点整 合PS1dE9基因并且组成性过表达所述整合的PS1dE9基因。

36.项35的基因修饰的hiPSC，其与没有整合所述PS1dE9基因的等基 因hiPSC相比，显示β-分泌酶和/或Aβ-42肽增加。

37.项33-36任一项基因修饰的hiPSC用于高通量筛选AD治疗药物的 用途。

38.一种用于高通量筛选AD治疗剂的方法，其包括

i)通过向hiPSC导入项16-26任一项的表达载体或导入项27-30任一项 的遗传构建体，由hiPSC制备阿尔茨海默病(AD)的细胞模型，

ii)用上述细胞模型培养候选化合物两天至两周，

iii)在加入所述候选化合物之前和之后，测量β-分泌酶水平、Aβ-42浓 度和Aβ42/Aβ-40比；

其中，一种或多种选自β-分泌酶水平、Aβ-42浓度和Aβ42/Aβ-40比的 测量值减少，表示所述候选化合物为治疗AD的潜在治疗剂。

39.项38的方法，所述hiPSC来自人供体，通过常规的重编程方法在 体外转化为hiPSC。

40.项39的方法，其中所述hiPSC来自未患有AD的正常人供体，通 过常规的重编程方法在体外转化为hiPSC。

41.项38-40任一项的高通量筛选方法，其用于筛选早期AD药物。

42.一种筛选β-分泌酶或Aβ-42抑制剂的药物筛选方法，其包括

i)通过组成性过表达BACE1基因或PS1dE9基因修饰hiPSC细胞系，

ii)将所述hiPSC细胞系再分化为功能性神经元，

iii)在候选药物化合物存在下培养所述功能性神经元，和

iv)测量β-分泌酶水平、Aβ42/Aβ-40比、和/或Aβ-42浓度和筛选可减 小β-分泌酶水平、Aβ42/Aβ-40比、和/或Aβ-42浓度的化合物。

43.项42的方法，其包括在候选药物化合物存在下培养所述功能性神 经元达两天至两周。

44.项42或43的方法，所述hiPSC来自人供体，通过常规的重编程方 法在体外转化为hiPSC。

45.项44的方法，其中所述hiPSC来自未患有AD的正常人供体，通 过常规的重编程方法在体外转化为hiPSC。

46.项42-45任一项的方法，其中通过向hiPSC导入项16-26任一项的 表达载体或导入项27-30任一项的遗传构建体制备所述hiPSC。

附图说明

从以下描述并且参考附图，本发明实施方式的这些和其它方面和优点将 变得显而易见并且更容易理解，其中：

图1.亲本hiPSC细胞系(UCIS3007)的产生和表型鉴定的实例：分离来 自健康非患病供体的尿细胞并且通过使用4种转录因子(Oct4，Sox2，Klf4 和cMyc)的标准重编程方法将其转化为hiPSC细胞。A.重编程尿细胞的过 程，显示形态学变化和碱性磷酸酶(AP)染色；B.免疫染色多潜能干细胞的 生物标志物(Nanog、Tra-1-60、Tra-1-81、SSEA3和SSEA4)；C-E.其它的 多能性测试(转基因沉默、内源性多能性基因的表达、表面标志物的FACS 分析、启动子去甲基化(demythelation)、核型分析、胚状体形成和胚层标记 的表达)；和F.畸胎瘤形成，显示三个胚层。

图2.来自亲本hiPSC细胞系的神经干细胞和神经元细胞(NSC、混合神 经元、多巴胺能神经元和运动神经元)。

图3.用于在AAVS1位点产生具有AD相关基因异位表达的hiPSC细胞 系的供体载体的图。涉及靶向整合的核酸序列包括与人AAVS1位点(HA-L 和HA-R)同源的序列、PGK-1启动子、药物选择标记基因、CAG启动子， AD相关基因和报道基因，所有都按顺式方式排列。不同的AD相关基因可 以通过使用Xho-I和BglII的限制酶消化来容易地替代。A.骨架载体 CIB-PCBEB；B.用于靶向整合BACE1基因的供体载体；和C.用于靶向整合 PS1dE9基因的供体载体。

图4.靶向整合BACE1基因进入AAVS1位点。AAVS1位点位于 PPP1R12C基因座的外显子1和外显子2的内含子区域。F1、F2、F3、R1、 R2和R3是用于验证通过连接PCR插入的引物。A.靶向整合策略；B.通过 连接PCR筛选单细胞克隆(上板：使用F1+R1引物进行5′末端连接PCR， 克隆21是具有插入片段的IPSN0041-21，克隆24是无插入片段的阴性克隆； 下板：3′末端连接PCR)；C.IPSN0041-21中插入片段的5′末端和3′末端序列。

图5.将PS1dE9基因靶向整合到AAVS1位点。AAVS1位点位于 PPP1R12C基因座的外显子1和外显子2的内含子区域中。F1、F2、F3、R1、 R2和R3是用于通过连接PCR验证插入的引物。A.靶向整合策略；B.通过 连接PCR筛选单细胞克隆(上板：使用F1+R1引物进行5’末端连接PCR。 74是选择的具有用于进一步表征的插入片段的克隆，67是没有插入片段的 阴性克隆；下板：3’末端连接PCR)；C.克隆74中插入片段的5’末端和3’末 端的序列；D.iPSC(UCIS3007-74)中的PS1dE9基因过表达。

图6.由HiPSC制备大量神经元细胞的制备方法，显示神经干细胞 (NSC)作为中间阶段是缩短测定过程和减少变异的关键步骤。神经干细胞 用NSC特异性生物标志物sox-1(红色，染色核)和巢蛋白(绿色，染色细胞质) 进行免疫染色。功能性神经元用神经元特异性生物标志物TujI(红色)和 Dapi(蓝色)进行免疫染色。

图7.与亲代细胞系IPSN0041相比，IPSN0041-21中BACE1基因过表 达，同时显示出IPSN0041-21与亲代细胞系IPSN0041相比中，BACE1基因 在RNA和蛋白质水平上，具有明显更高的表达。A.hiPSC和来自hiPSC的 神经元中的IPSN0041-21和IPSN0041之间的mRNA表达；B.神经干细胞和 来自hiPSC细胞系的神经元中的BACE1蛋白表达。

图8.与IPSN0041相比，IPSN0041-21中Aβ-42肽的过表达。A.来自 hiPSC的神经元中的Aβ-42浓度，显示来自IPSN0041-21的神经元具有比来 自IPSN0041的神经元更高的Aβ-42浓度；B.IPSN0041-21和IPSN0041之 间Aβ-42表达的时程研究，显示不同的表达模式。

图9.使用IPSN0041-21的药物筛选实施例，显示之前未报道的两种小 分子化合物，B3和B16减少来自hiPSC的神经元中Aβ-40和Aβ-42肽的产 生，但不影响Aβ-42/40比。使用已知的β-分泌酶抑制剂(10uM)作为阳性对 照。数据来自三个生物学重复。A.B3和B16减少Aβ-40的产生；B.B3和 B16减少Aβ-42的产生；和C.Aβ-42相对于Aβ-40的比

具体实施方式

除非另有定义，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技 术人员通常理解的相同的含义。例如，对于申请提供的生物领域中的术语， 研究者特别参考Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual， 第二版，Cold Spring HarborPress,Plainsview,New York(1989)；和Ausubel 等人，Current Protocols in MolecularBiology(Supplement 47),John Wiley& Sons,New York(1999)。这些术语不应解释为具有比本领域普通技术人员理 解的更小的范围。

术语“包括”用于本说明书和权利要求书中，其没有排除其它元素或步 骤。除非另有明确说明，当提及单数名词使用不定冠词或定冠词“一个”或“一 种”、“这个”、“这种”时，其包括该名词的复数。

“AD相关基因”表示与阿尔茨海默病(AD)发病相关的任何基因。虽然对 于阿尔茨海默病的病因了解甚少，但认为约70％的风险与许多通常涉及的基 因有遗传关系，所述基因例如编码淀粉样前体蛋白(APP)以及早老素(PS)1和 2的突变基因。APP基因突变导致异常APP蛋白，所述异常APP蛋白优先 被β-分泌酶切割，产生更多的Aβ肽；而PS基因突变导致优先产生Aβ42 肽，所述Aβ42肽为淀粉样蛋白斑块的成分。虽然在FAD或SAD患者中没 有发现编码β-分泌酶的基因发生突变，但清楚地发现升高的BACE1表达导 致Aβ肽的表达升高，从而增加AD患者中Aβ-42肽的水平。这些基因，连 同发现或将发现的与AD发病密切相关的其它基因，统称为本发明中的AD 相关基因。

本申请中的突变淀粉样前体蛋白(APP)或早老素(PS)1和2基因表示引 起AD发病的突变的APP或PS1或PS2基因。这些基因的突变可以天然存 在于AD患者中或在体外遗传产生。当本发明中描述术语“BACE1基因”时， 其不仅包括天然存在的基因，而且包括其功能变体。功能变体可以与氨基酸 序列中天然存在的基因略有不同，例如与天然存在的BACE1蛋白的氨基酸 序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、96％、97％、98％、 99％的同源性，但是它们仍然具有与天然BACE1蛋白相同的功能。

“组成性表达”是指与仅仅根据需要进行转录的兼性基因相比连续转录 的基因表达。“过表达”是指过高或过量的基因表达水平，其产生明显的基因 相关表型。就本发明而言，整合到hiPSC中的所述AD相关基因在hiPSC中 为组成性过表达，并且在淀粉样前体蛋白的处理过程中导致出现AD表型。

本发明的“AD表型”与在淀粉样前体蛋白处理过程中的表型有关，所述 表型通过整合AD相关基因并且整合的AD相关基因组成性过表达诱导产 生，所述AD表型包括但不限于β-分泌酶水平增加、淀粉样蛋白β肽增加、 Aβ-42浓度增加和/或Aβ42/Aβ-40增加。

本发明中，所述AD相关基因整合到hiPSC中用于组成性过表达所述 AD相关基因，以产生AD表型。优选通过位点特异性方式、最优选通过使 用与安全港位点同源的序列即人AAVS1位点进行整合。需要基因的“同源” 以实现同源重组，从而将外源基因整合到靶位点。基于公知常识，本领域技 术人员知道如何设计与目标整合位点上的核酸序列同源的核酸序列，以实现 同源重组的目的。因此，本发明在提到同源序列时，包括但不限于实施例所使用的同源序列，同时还包括本领域技术人员可以通过常规技术为实现在人 AAVS1位点整合而设计的任何同源序列。

载体

本发明的AD细胞模型可以使用遗传重组方法产生，以将AD相关基因 导入到来自非患病者的hiPSC中。对于重组产生AD细胞模型，将编码AD 相关蛋白例如突变的APP或PS蛋白、或者BACE1酶的核酸分离并且插入 到可复制载体中，用于进一步克隆(扩增DNA)或表达。可以将编码所述蛋白 的DNA使用本领域的常规方法容易地分离和测序。

为了本发明的目的，许多载体可用于进一步的改造。载体中的组分通常 包括但不限于以下中的一个或多个：复制起点、一个或多个标记基因、一个 或多个报告基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

复制起点

表达和克隆载体两者都含有使载体能够在所选宿主细胞中复制的核酸 序列。

通常，在克隆载体中，该序列是使载体能够独立于宿主染色体DNA而 复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。这种序列对于各种细菌、 酵母和病毒是众所周知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰 氏阴性细菌，2μ质粒起点适用于酵母，各种病毒起点(SV40、多瘤、腺病毒、 VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体 不需要复制成分起点(可通常使用SV40起点，仅因为其含有早期启动子)。

选择基因成分

表达和克隆载体可以含有选择基因，也称为选择性标记。典型的选择基 因编码下述蛋白质：其(a)赋予对于抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉 素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素、尿嘧啶、卡那霉素和遗传霉素；(b)补充营 养缺陷型缺陷；或(c)提供从复合培养基不可得的关键营养素，例如编码芽孢 杆菌属的D-丙氨酸消旋酶的基因。

选择方案的一个实例使用药物以阻止宿主细胞的生长。用异源基因成功 转化的那些细胞产生赋予耐药性的蛋白，从而在选择方案中存活。这种显性 选择的实例使用药物新霉素、尿素、卡那霉素以及遗传霉素和潮霉素。

用于哺乳动物细胞的合适的选择性标记的另一个实例是能够鉴定有能 力吸收编码核酸的抗体的细胞，例如DHFR、谷氨酰胺合成酶(GS)、胸苷激 酶、金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷20脱氨酶、鸟 氨酸脱羧酶等。

例如，通过在含有甲氨蝶呤(Mtx)、DHFR的竞争性拮抗剂的培养基中 培养转化体来鉴定用DHFR基因转化的细胞。在这些条件下，DHFR基因与 任何其它共转化核酸一起进行扩增。

或者，通过在含有L-甲硫氨酸亚砜亚胺(Msx)、GS抑制剂的培养基中培 养转化体来鉴定用GS基因转化的细胞。在这些条件下，GS基因与任何其 它共转化核酸一起进行扩增。GS选择/扩增系统可以与上述DHFR选择/扩 增系统结合使用。

报道基因成分

报道基因(通常简称报道分子)是研究者附于生物体所关注的另一种基因 的调节序列中的基因。选择某些基因作为报道分子，因为这些基因赋予表达 它们的生物体的特征易于鉴定和测量，或因为这些基因是选择性标记。报道 基因经常用作指示某一基因是否被细胞或生物群体接受或表达。

为了将报道基因引入生物体，科学家将报道基因和目的基因置于相同的 DNA构建体中以插入细胞或生物体中。常用的诱导视觉鉴定特征的报道基 因通常涉及荧光和发光蛋白。实例包括编码水母绿色荧光蛋白(GFP)以及来 自基因dsRed的红色荧光蛋白的基因，所述水母绿色荧光蛋白基因会引起表 达这个基因的细胞在蓝光下发绿光。

启动子成分

表达和克隆载体通常含有启动子，所述启动子通过宿主细胞进行识别并 且可操作地连接到编码目的蛋白的核酸。

启动子序列对于真核生物是已知的。几乎所有的真核生物基因都有一个 富含AT的区域，所述区域大约位于起始转录位点上游的碱基。从许多基因 转录起始点的上游的70至80个碱基所得的另一个序列是CNCAAT区域， 其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'末端是AATAAA序列， 其可以是将polyA尾添加到编码序列的3'末端的信号。所有这些序列都适当 地插入到真核表达载体中。

来自hiPSC中的载体的AD致病蛋白质转录可以例如通过如下启动子控 制：从病毒基因组获得的启动子，所述病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病 毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、 乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)；或从异源哺乳动物启动子获得的启动子， 例如肌动蛋白启动子或免疫启动子；从热休克启动子获得的启动子，条件是 这种启动子与宿主细胞系统相容。

SV40病毒的早期和晚期启动子可以作为包含SV40病毒复制起点的 SV40限制性片段方便地获得。人巨细胞病毒的即时早期启动子作为HindIII E限制性片段方便地获得。美国专利4,419,446中公开使用牛乳头瘤病毒作 为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利4,601,978中描述该系 统的改进。也参见Reyes等人，Nature 297:598-601(1982)，关于在单纯疱疹 病毒的胸苷激酶5启动子控制下的小鼠细胞中人p-干扰素cDNA的表达。或 者，Rous肉瘤病毒长终端重复可以用作启动子。

CAG启动子是强大的合成启动子，其经常用于驱动哺乳动物表达载体 中的基因高水平表达^37-38。它是从以下序列构建的：

(C)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件，

(A)启动子、第一外显子和鸡β-肌动蛋白基因的第一个内含子，

(G)兔β-珠蛋白基因的剪接受体。

所得的合成元件用于pCAGGS表达载体。

虽然整个构建体通常称为“CAG启动子”，但它不是严格意义上的启动 子，因为它包含转录序列和内含子的一部分)和增强子元件。除了CMV即时 早期增强子之外，鸡β肌动蛋白基因的内含子还含有在脊椎动物中高度保守 的增强子元件。启动子的3'部分具有高GC含量，因此不适合PCR扩增。

PGK-1基因编码持家酶、3-磷酸甘油酸激酶，并且是广泛表达的。该基 因位于哺乳动物的X染色体上，并且除了其与雌性体细胞或雄性生殖细胞 的无活性X染色体上的大多数其它基因一起沉默之外，总是表达的。 Pgk(PGK)-1启动子位于富含核苷酸G和C的区域内。该启动子可以有效地 驱动大肠杆菌lacZ和neo等报道基因的高水平表达。转录起始位点上游的 120bp作为核心启动子。其上游是320bp的区域，其以取向和位置独立的方 式增强核心启动子的转录。该320bp的区域不增强SV40早期区核心启动子 的转录。核蛋白与该320bp片段结合，但是可以用凝胶迁移率变动分析法证 明结合的限制区域，从而表明增强子的活性可由多个位点结合的因子介导， 每个位点具有低亲和力³⁹。

增强子元件成分

通过将增强子序列插入载体，高等真核生物中的编码目的蛋白的DNA 转录经常增加。现从哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋 白和胰岛素)获知许多增强子序列。然而，通常会使用来自真核细胞病毒的 增强子。实例包括复制起点后侧(100-270bp)的SV40增强子、巨细胞病毒早 期启动子增强子、复合起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。也参见 Yaniv，Nature 297:17-18(1982)关于激活真核启动子的增强元件。可以在抗体编码序列的5'或3'位、但优选位于启动子的5'位点，将增强子剪接到载体 中。

转录终止成分

用于真核宿主细胞例如人细胞中的表达载体也将含有终止转录和稳定 mRNA所需的序列。这种序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶 尔3'的非翻译区获得。这些区域包含在编码目的蛋白的mRNA的非翻译部 分中转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。

在一个实施方式中，本发明的载体设计用于将与阿尔茨海默病(AD)相关 基因有关的基因高效率地靶向整合到人多潜能干细胞(hiPSC)中。因此，载 体也设计成包含用于位点特异性整合的序列。

通过具有靶向识别能力的酶在已知位置插入基因是一种基因组定向编 辑技术，该技术能够使研究者以高的效率和精确度删除、插入或修饰基因组 水平的任何基因或DNA片段^40-42。这种技术还包括在例如US8697359、 US8771945、US8795965中公开的最近广泛使用的CRISPRcas9基因编辑技 术。在本发明的某些实施方式中，将AD相关基因通过CRISPRcas9基因编 辑技术特异性整合到安全港位点，即AAVS1位点。

AAVS1位点是人染色体19上的天然AAV整合位点。该区域(AAVS1) 具有使其成为转基因的理想靶标的特征。

在本发明的一个具体实施方式中，载体包含由第一启动子控制的药物选 择标记基因、与由第二启动子控制的报道基因连接的AD相关基因、以及与 人AAVS1位点的序列同源的序列。

在本发明的一个具体实施方式中，供体载体主链包含按顺式排列的用于 靶向整合的左臂(HA-L)、PGK-1启动子、嘌呤基因、CAG启动子、GFP报 道基因和用于靶向整合的右臂(HA-RL)(图4A)。

如本文所用，用于靶向整合的左臂(HA-L)包含以下序列：

TGCTTTCTCTGACCAGCATTCTCTCCCCTGGGCCTGTGCCGCTTTCTGTCTGCAGCTTGTGGCCTGGGTCACCTCTACGGCTGGCCCAGATCCTTCCCTGCCGCCTCCTTCAGGTTCCGTCTTCCTCCACTCCCTCTTCCCCTTGCTCTCTGCTGTGTTGCTGCCCAAGGATGCTCTTTCCGGAGCACTTCCTTCTCGGCGCTGCACCACGTGATGTCCTCTGAGCGGATCCTCCCCGTGTCTGGGTCCTCTCCGGGCATCTCTCCTCCCTCACCCAACCCCATGCCGTCTTCACTCGCTGGGTTCCCTTTTCCTTCTCCTTCTGGGGCCTGTGCCATCTCTCGTTTCTTAGGATGGCCTTCTCCGACGGATGTCTCCCTTGCGTCCCGCCTCCCCTTCTTGTAGGCCTGCATCATCACCGTTTTTCTGGACAACCCCAAAGTACCCCGTCTCCCTGGCTTTAGCCACCTCTCCATCCTCTTGCTTTCTTTGCCTGGACACCCCGTTCTCCTGTGGATTCGGGTCACCTCTCACTCCTTTCATTTGGGCAGCTCCCCTACCCCCCTTACCTCTCTAGTCTGTGCTAGCTCTTCCAGCCCCCTGTCATGGCATCTTCCAGGGGTCCGAGAGCTCAGCTAGTCTTCTTCCTCCAACCCGGGCCCCTATGTCCACTTCAGGACAGCATGTTTGCTGCCTCCAGGGATCCTGTGTCCCCGAGCTGGGACCACCTTATATTCCCAGGGCCGGTTAATGTGGCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGGGGC。

PGK-嘌呤霉素盒包含以下序列：ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCCCCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGGAATTCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGATAGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT。

CAG启动子包含以下序列：

ATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGTCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGTGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGGCGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCCTCGACCTCGAG。

GFP报道基因包含以下序列：

AGATCTGGCAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGTTCGAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAAGGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGACCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA。

用于靶向整合的右臂(HA-RL)包含以下序列：

TACTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTGGGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGGTGACACACCCCCATTTCCTGGAGCCATCTCTCTCCTTGCCAGAACCTCTAAGGTTTGCTTACGATGGAGCCAGAGAGGATCCTGGGAGGGAGAGCTTGGCAGGGGGTGGGAGGGAAGGGGGGGATGCGTGACCTGCCCGGTTCTCAGTGGCCACCCTGCGCTACCCTCTCCCAGAACCTGAGCTGCTCTGACGCGGCTGTCTGGTGCGTTTCACTGATCCTGGTGCTGCAGCTTCCTTACACTTCCCAAGAGGAGAAGCAGTTTGGAAAAACAAAATCAGAATAAGTTGGTCCTGAGTTCTAACTTTGGCTCTTCACCTTTCTAGTCCCCAATTTATATTGTTCCTCCGTGCGTCAGTTTTACCTGTGAGATAAGGCCAGTAGCCAGCCCCGTCCTGGCAGGGCTGTGGTGAGGAGGGGGGTGTCCGTGTGGAAAACTCCCTTTGTGAGAATGGTGCGTCCTAGGTGTTCACCAGGTCGTGGCCGCCTCTACTCCCTTTCTCTTTCTCCATCCTTCTTTCCTTAAAGAGTCCCCAGTGCTATCTGGGACATATTCCTCCGCCCAGAGCAGGGTCCCGCTTCCCTAAGGCCCTGCTCTGGGCTTCTGGGTTTGAGTCCTTGGCAAGCCCAGGAGAGGCGCTCAGGCTTCCCTGTCCCCCTTCCTCGTCCACCATCTCATGCCCCTGGCTCTCCTGCCCCTTCCCTACAGGGGTTCCTGGCTCTGCT CT。

在另一具体实施方式中，供体载体包含在BgIII和XhoI位点插入载体骨 架中的BACE1基因(图4B)；BACE1基因的cDNA序列在Genbank公开， 为基因座NM_138973.3(Homosapiensβ-分泌酶1、转录变体d、mRNA)。如 本文所用，“BACE1”表示由BACE1基因编码的跨膜蛋白酶。BACE1催化由 淀粉样前体蛋白形成淀粉样β肽的第一步。淀粉样蛋白β肽是淀粉样蛋白β 斑块的主要成分，其积聚在人类阿尔茨海默病患者的大脑中。

供体载体中BACE1基因的DNA序列描述为：

ATGGCCCAAGCCCTGCCCTGGCTCCTGCTGTGGATGGGCGCGGGAGTGCTGCCTGCCCACGGCACCCAGCACGGCATCCGGCTGCCCCTGCGCAGCGGCCTGGGGGGCGCCCCCCTGGGGCTGCGGCTGCCCCGGGAGACCGACGAAGAGCCCGAGGAGCCCGGCCGGAGGGGCAGCTTTGTGGAGATGGTGGACAACCTGAGGGGCAAGTCGGGGCAGGGCTACTACGTGGAGATGACCGTGGGCAGCCCCCCGCAGACGCTCAACATCCTGGTGGATACAGGCAGCAGTAACTTTGCAGTGGGTGCTGCCCCCCACCCCTTCCTGCATCGCTACTACCAGAGGCAGCTGTCCAGCACATACCGGGACCTCCGGAAGGGTGTGTATGTGCCCTACACCCAGGGCAAGTGGGAAGGGGAGCTGGGCACCGACCTGCTTTGTGGTGCTGGCTTCCCCCTCAACCAGTCTGAAGTGCTGGCCTCTGTCGGAGGGAGCATGATCATTGGAGGTATCGACCACTCGCTGTACACAGGCAGTCTCTGGTATACACCCATCCGGCGGGAGTGGTATTATGAGGTGATCATTGTGCGGGTGGAGATCAATGGACAGGATCTGAAAATGGACTGCAAGGAGTACAACTATGACAAGAGCATTGTGGACAGTGGCACCACCAACCTTCGTTTGCCCAAGAAAGTGTTTGAAGCTGCAGTCAAATCCATCAAGGCAGCCTCCTCCACGGAGAAGTTCCCTGATGGTTTCTGGCTAGGAGAGCAGCTGGTGTGCTGGCAAGCAGGCACCACCCCTTGGAACATTTTCCCAGTCATCTCACTCTACCTAATGGGTGAGGTTACCAACCAGTCCTTCCGCATCACCATCCTTCCGCAGCAATACCTGCGGCCAGTGGAAGATGTGGCCACGTCCCAAGACGACTGTTACAAGTTTGCCATCTCACAGTCATCCACGGGCACTGTTATGGGAGCTGTTATCATGGAGGGCTTCTACGTTGTCTTTGATCGGGCCCGAAAACGAATTGGCTTTGCTGTCAGCGCTTGCCATGTGCACGATGAGTTCAGGACGGCAGCGGTGGAAGGCCCTTTTGTCACCTTGGACATGGAAGACTGTGGCTACAACATTCCACAGACAGATGAGTCAACCCTCATGACCATAGCCTATGTCATGGCTGCCATCTGCGCCCTCTTCATGCTGCCACTCTGCCTCATGGTGTGTCAGTGGCGCTGCCTCCGCTGCCTGCGCCAGCAGCATGATGACTTTGCTGATGACATCTCCCTGCTGA。

和BACE1的蛋白质序列描述为： MAQALPWLLLWMGAGVLPAHGTQHGIRLPLRSGLGGAPLGLRLPRETDEEPEEPGRRGSF VEMVDNLRGKSGQGYYVEMTVGSPPQTLNILVDTGSSNFAVGAAPHPFLHRYYQRQLSST YRDLRKGVYVPYTQGKWEGELGTDLLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLWYTPIRREWYYEVIIVRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNIFPVISLYLMGEVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIMEGFYVVFDRARKRIGFAVSACHVHDEFRTAVEGPFVTLDMEDCGYNIPQTDESTLMTIAYVMAAICALFMLPLCLMVCQWRCLRCLRQQHDDFAD DISLLK。

在另一具体实施方式中，供体载体包含插入载体骨架中的BgIII和XhoI 位点的PS1dE9基因(图5B)。PS1dE9是其中PS1基因外显子9缺失的PS1 基因的突变体。如本文所用，术语“PS1”表示由早老素1基因编码的蛋白质。 PS1基因的cDNA序列在Genbank公开为基因座NM_000021.3(Homo sapiens、早老素1、转录变体1、mRNA)。早老素1是早老素复合物中四种 核心蛋白之一，其介导细胞中几种蛋白质的调节蛋白水解事件，包括γ分泌 酶。术语“PS1dE9”表示PS1的突变基因，其导致异常的γ-分泌酶裂解，其 有利于Aβ-42肽的产生，从而导致阿尔茨海默氏病的早期发病。

供体载体中PS1dE9的DNA序列如下所述(突出显示为缺失序列)：

ATGACAGAGTTACCTGCACCGTTGTCCTACTTCCAGAATGCACAGATGTCTGAGGACAACCACCTGAGCAATACTGTACGTAGCCAGAATGACAATAGAGAACGGCAGGAGCACAACGACAGACGGAGCCTTGGCCACCCTGAGCCATTATCTAATGGACGACCCCAGGGTAACTCCCGGCAGGTGGTGGAGCAAGATGAGGAAGAAGATGAGGAGCTGACATTGAAATATGGCGCCAAGCATGTGATCATGCTCTTTGTCCCTGTGACTCTCTGCATGGTGGTGGTCGTGGCTACCATTAAGTCAGTCAGCTTTTATACCCGGAAGGATGGGCAGCTAATCTATACCCCATTCACAGAAGATACCGAGACTGTGGGCCAGAGAGCCCTGCACTCAATTCTGAATGCTGCCATCATGATCAGTGTCATTGTTGTCATGACTATCCTCCTGGTGGTTCTGTATAAATACAGGTGCTATAAGGTCATCCATGCCTGGCTTATTATATCATCTCTATTGTTGCTGTTCTTTTTTTCATTCATTTACTTGGGGGAAGTGTTTAAAACCTATAACGTTGCTGTGGACTACATTACTGTTGCACTCCTGATCTGGAATTTTGGTGTGGTGGGAATGATTTCCATTCACTGGAAAGGTCCACTTCGACTCCAGCAGGCATATCTCATTATGATTAGTGCCCTCATGGCCCTGGTGTTTATCAAGTACCTCCCTGAATGGACTGCGTGGCTCATCTTGGCTGTGATTTCAGTATATGATTTAGTGGCTGTTTTGTGTCCGAAAGGTCCACTTCGTATGCTGGTTGAAACAGCTCAGGAGAGAAATGAAACGCTTTTTCCAGCTCTCATTTACTCCT CAAGTATAATGCAGAAAGCACAGAAAGGGAGTCACAAGACACTGTTGCAGAGAATGATGATGGCGGGTTCAGTGAGGAATGGGAAGCCCAGAGGGACAGTCATCTAGGGCCTCATCGCTCTACACCTGAGTCACGAGCTGCTGTCCAGGAACTTTCCAGCAGTATCCTCGCTGGTGAAGACCCAGAGGAAAGGGGAGTAAAACTTGGATTGGGAGATTTCATTTTCTACAGTGTTCTGGTTGGTAAAGCCTCAGCAACAGCCAGTGGAGACTGGAACACAACCATAGCCTGTTTCGTAGCCATATTAATTGGTTTGTGCCTTACATTATTACTCCTTGCCATTTTCAAGAAAGCATTGCCAGCTCTTCCAATCTCCATCACCTTTGGGCTTGTTTTCTACTTTGCCACAGATTATCTTGTACAGCCTTTTATGGACCAATTAGCATTCCATCAATTTTATATCTAG。

和PS1dE9的蛋白质序列如下所述(突出显示的是由于缺失外显子9导致 错误翻译的部分)：

MTELPAPLSYFQNAQMSEDNHLSNTVRSQNDNRERQEHNDRRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAKHVIMLFVPVTLCMVVVVATIKSVSFYTRKDGQLIYTPFTEDTETVGQRALHSILNAAIMISVIVVMTILLVVLYKYRCYKVIHAWLIISSLLLLFFFSFIYLGEVFKTYNVAVDYITVALLIWNFGVVGMISIHWKGPLRLQQAYLIMISALMALVFIKYLPEWTAWLILAVISVYDLVAVLCPKGPLRMLVETAQERNETLFPALIYSS

在本发明的另一个实施方式中，本发明的供体载体可以包含BACE1的 任何变体和/或PS1的任何变体。变体包括例如不同个体的等位基因变体(例 如多态性)、可选剪接形式等引起的天然存在的变体。变体优选基本与根据 本发明的序列同源，即表现出与本发明的序列通常至少约80％、优选至少约 90％、更优选至少约95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸序列同一性。 本发明基因的变体也包括在严格杂交条件下与如上定义的序列(或其互补链) 杂交的核酸序列。典型的严格杂交条件包括温度高于42℃，盐度等于或小 于200mM。

hiPSC细胞系

在一个实施方式中，本发明涉及通过本发明的方法在安全港位点 (AAVS1位点)整合AD相关基因产生hiPSC细胞系。本发明创建的hiPSC细 胞系组成性过表达整合的基因，并且显示与等同基因对照hiPSC细胞系相 比，β-分泌酶和/或Aβ-42肽增加。

在一个具体实施方式中，通过本发明的方法制备的hiPSC细胞系具有在 AAVS1位点整合的外源核酸序列。核酸序列包含PGK-1启动子、嘌呤霉素 基因、CAG启动子、BACE1基因和GFP基因以及连接不同片段的序列。插 入的核酸序列如下所述(下划线显示的部分是BACE1基因)：

ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCCCCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGGAATTCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGATAGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCGGCCGCAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGTCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGTGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGGCGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCCTCGACCTCGAGATGGCCCAAGCCCTGCCCTGGCTCCTGCTGTGGATGGGCGCG GGAGTGCTGCCTGCCCACGGCACCCAGCACGGCATCCGGCTGCCCCTGCGCAGCGGCCTGGGGGGCGCCCCCCTGGG GCTGCGGCTGCCCCGGGAGACCGACGAAGAGCCCGAGGAGCCCGGCCGGAGGGGCAGCTTTGTGGAGATGGTGGACA ACCTGAGGGGCAAGTCGGGGCAGGGCTACTACGTGGAGATGACCGTGGGCAGCCCCCCGCAGACGCTCAACATCCTG GTGGATACAGGCAGCAGTAACTTTGCAGTGGGTGCTGCCCCCCACCCCTTCCTGCATCGCTACTACCAGAGGCAGCT GTCCAGCACATACCGGGACCTCCGGAAGGGTGTGTATGTGCCCTACACCCAGGGCAAGTGGGAAGGGGAGCTGGGCA CCGACCTGCTTTGTGGTGCTGGCTTCCCCCTCAACCAGTCTGAAGTGCTGGCCTCTGTCGGAGGGAGCATGATCATT GGAGGTATCGACCACTCGCTGTACACAGGCAGTCTCTGGTATACACCCATCCGGCGGGAGTGGTATTATGAGGTGAT CATTGTGCGGGTGGAGATCAATGGACAGGATCTGAAAATGGACTGCAAGGAGTACAACTATGACAAGAGCATTGTGG ACAGTGGCACCACCAACCTTCGTTTGCCCAAGAAAGTGTTTGAAGCTGCAGTCAAATCCATCAAGGCAGCCTCCTCC ACGGAGAAGTTCCCTGATGGTTTCTGGCTAGGAGAGCAGCTGGTGTGCTGGCAAGCAGGCACCACCCCTTGGAACAT TTTCCCAGTCATCTCACTCTACCTAATGGGTGAGGTTACCAACCAGTCCTTCCGCATCACCATCCTTCCGCAGCAAT ACCTGCGGCCAGTGGAAGATGTGGCCACGTCCCAAGACGACTGTTACAAGTTTGCCATCTCACAGTCATCCACGGGC ACTGTTATGGGAGCTGTTATCATGGAGGGCTTCTACGTTGTCTTTGATCGGGCCCGAAAACGAATTGGCTTTGCTGT CAGCGCTTGCCATGTGCACGATGAGTTCAGGACGGCAGCGGTGGAAGGCCCTTTTGTCACCTTGGACATGGAAGACT GTGGCTACAACATTCCACAGACAGATGAGTCAACCCTCATGACCATAGCCTATGTCATGGCTGCCATCTGCGCCCTC TTCATGCTGCCACTCTGCCTCATGGTGTGTCAGTGGCGCTGCCTCCGCTGCCTGCGCCAGCAGCATGATGACTTTGC TGATGACATCTCCCTGCTGAAGGTCGACAGATCTGGCAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGTTCGAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAAGGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGACCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGAGAGCTCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCGATCG。

插入片段和宿主基因组之间的5'末端连接处的序列表示为：

ACCCCACAGTGGGGCAAGCTTGGATCCTC及其互补序列。

插入片段和宿主基因组之间的3'末端连接处的序列表示为：

CGATCGGCGGCCGCTACTAGGGACAGGATT及其互补序列。

在一个具体实施方式中，通过本发明的方法制备的hiPSC细胞系具有在 AAVS1位点整合的外源核酸序列。核酸序列包括PGK-1启动子、嘌呤霉素 基因、CAG启动子、突变体PS1基因(PS1dE9)和GFP基因以及连接不同片 段的序列。插入的核酸序列如下所述(下划线显示的部分是PS1dE9基因)： ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCA AGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCCCCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGGAATTCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGATAGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCGGCCGCAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGTCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGTGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGGCGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCCTCGACCTCGAGATGACAGAGTTACCTGCACCGTTGTCCTACTTCCAGAATGCA CAGATGTCTGAGGACAACCACCTGAGCAATACTGTACGTAGCCAGAATGACAATAGAGAACGGCAGGAGCACAACGA CAGACGGAGCCTTGGCCACCCTGAGCCATTATCTAATGGACGACCCCAGGGTAACTCCCGGCAGGTGGTGGAGCAAG ATGAGGAAGAAGATGAGGAGCTGACATTGAAATATGGCGCCAAGCATGTGATCATGCTCTTTGTCCCTGTGACTCTC TGCATGGTGGTGGTCGTGGCTACCATTAAGTCAGTCAGCTTTTATACCCGGAAGGATGGGCAGCTAATCTATACCCC ATTCACAGAAGATACCGAGACTGTGGGCCAGAGAGCCCTGCACTCAATTCTGAATGCTGCCATCATGATCAGTGTCA TTGTTGTCATGACTATCCTCCTGGTGGTTCTGTATAAATACAGGTGCTATAAGGTCATCCATGCCTGGCTTATTATA TCATCTCTATTGTTGCTGTTCTTTTTTTCATTCATTTACTTGGGGGAAGTGTTTAAAACCTATAACGTTGCTGTGGA CTACATTACTGTTGCACTCCTGATCTGGAATTTTGGTGTGGTGGGAATGATTTCCATTCACTGGAAAGGTCCACTTC GACTCCAGCAGGCATATCTCATTATGATTAGTGCCCTCATGGCCCTGGTGTTTATCAAGTACCTCCCTGAATGGACT GCGTGGCTCATCTTGGCTGTGATTTCAGTATATGATTTAGTGGCTGTTTTGTGTCCGAAAGGTCCACTTCGTATGCT GGTTGAAACAGCTCAGGAGAGAAATGAAACGCTTTTTCCAGCTCTCATTTACTCCTGCACAGAAAGGGAGTCACAAG ACACTGTTGCAGAGAATGATGATGGCGGGTTCAGTGAGGAATGGGAAGCCCAGAGGGACAGTCATCTAGGGCCTCAT CGCTCTACACCTGAGTCACGAGCTGCTGTCCAGGAACTTTCCAGCAGTATCCTCGCTGGTGAAGACCCAGAGGAAAG GG GAGTAAAACTTGGATTGGGAGATTTCATTTTCTACAGTGTTCTGGTTGGTAAAGCCTCAGCAACAGCCAGTGGAGACTGGAACACAACCATAGCCTGTTTCGTAGCCATATTAATTGGTTTGTGCCTTACATTATTA CTCCTTGCCATTTTCAAGAAAGCATTGCCAGCTCTTCCAATCTCCATCACCTTTGGGCTTGTTTTCTACTTTGCCAC AGATTATCTTGTACAGCCTTTTATGGACCAATTAGCATTCCATCAATTTTATATCTAGAGATCTGGCAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCT TCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGTTCGAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAAGGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGACCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGAGAGCTCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCGATCG。

插入片段和宿主基因组之间的5'末端连接处的序列表示为：

ACCCCACAGTGGGGCAAGCTTGGATCCTC及其互补序列。

插入片段和宿主基因组之间的3'末端连接处的序列表示为：

CGATCGGCGGCCGCTACTAGGGACAGGATT及其互补序列。

在另一个实施方式中，插入的核酸序列可以包含编码BACE1的任何变 体和/或PS1的任何变体的序列。变体包括例如不同个体的等位基因变体(例 如多态性)、可变剪接形式等引起的天然存在的变体。变体优选基本与根据 本发明的序列同源，即表现出与本发明的序列通常至少约80％、优选至少约 90％、更优选至少约95％的核苷酸序列同一性。本发明基因的变体也包括在 严格杂交条件下与如上定义的序列(或其互补链)杂交的核酸序列。典型的严 格杂交条件包括温度高于42℃，盐度等于或小于200mM。

药物筛选方法

在一个实施方式中，本发明涉及通过使用本发明方法创建的hiPSC细胞 系筛选用于治疗AD的治疗剂的方法。该方法可以包括以下多个步骤：将 hiPSC细胞系再分化为功能性神经元；将药物化合物施用到神经元培养基中； 在药物化合物存在下培养神经元一段时间；以及测定β-分泌酶水平、Aβ-40 浓度、Aβ-42浓度和Aβ42/Aβ-40比等。

本发明β-分泌酶水平可以通过本领域常规方法在RNA水平和蛋白质水 平来检测。

在一个具体实施方式中，过表达BACE1基因的hiPSC细胞系将用于产 生大量的功能性神经元。来自hiPSC细胞系的神经元细胞将在96孔板中培 养。将待筛选的化合物添加到神经元培养基中2天至2周。化合物对减少β- 分泌酶水平和/或Aβ-42肽的作用将进行平行测量。

在另一个具体实施方式中，过表达PS1dE9基因的hiPSC细胞系用于产 生大量的功能性神经元。来自hiPSC细胞系的神经元细胞在96孔板中培养。 待筛选的化合物将添加到神经元培养基中2天至2周。测量化合物对Aβ-42 肽减少的作用。

在另一个实施方式中，使用过表达AAVS1位点处的BACE1基因的任 何变体和/或PS1基因的任何变体的hiPSC细胞系以产生大量的功能性神经 元。变体包括例如不同个体的等位基因变体(例如多态性)、可选剪接形式等 引起的天然存在的变体。变体优选基本与根据本发明的序列同源，即表现出 与本发明的序列通常至少约80％、优选至少约90％、更优选至少约95％的 核苷酸序列同一性。本发明基因的变体也包括在严格杂交条件下与如上定义 的序列(或其互补链)杂交的核酸序列。典型的严格杂交条件包括温度高于42 ℃，盐度等于或小于200mM。

本申请中参考附图描述的实施方式是解释性的、说明性的，并且用于一 般地理解本发明。实施方式不应解释为限制本发明。在整个描述中，相同或 相似的元件和具有相同或相似功能的元件由相同的附图标记表示。也应当理 解，本申请所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不意在限制， 因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。

实施例

提供实施例仅用于说明的目的。

实施例1：产生用于基因组编辑的亲本hiPSC细胞系

产生两个hiPSC细胞系，UCIS3007和IPSN0041，并且用作亲本hiPSC 细胞系，用于制备等基因病变hiPSC细胞系。UCIS3007来源于非患病女性 供体的尿细胞，所述尿细胞通过逆转录病毒载体介导的重编程方法使用四种 转录因子(Oct4、Sox1、Klf4和cMyc)产生。使用尿上皮细胞增殖培养基(CIB， 目录号UC-0302)培养供体尿上皮细胞。在病毒感染前一天，将约20,000个 尿液上皮细胞接种到12孔板中。将用逆转录病毒载体转染的细胞使用hiPSC 重编程血清培养基(CIB，目录号RE-0201)培养。在第6天，将细胞接种到含 有饲养细胞的T25烧瓶上并且用丝裂霉素C处理。将约10,000个细胞接种 在每个T25烧瓶中并且与重编程培养基一起培养约20天，直到出现hiPSC 克隆。然后，将克隆挑取到Matrigel(Corning，目录号352477)包被的板上用 于进一步纯化和扩增。

IPSN0041来源于非患病供体的脐带基质细胞，所述脐带基质细胞通过 无足迹方法(footprint-free method)使用具有六个转录因子的附加型载体产 生。将约100万个脐带基质细胞使用Amaxa Nucleofector试剂盒II与核转移 试剂(Lonza，目录号VPI-1005)混合的附加质粒(3μgpCEP4-EO2S-EN2K、 2.4μgpCEP4-M2L、3.2μgpCEP4-EO2S-1)一起进行电转移。将转染的细胞立 即接种到用Matrigel(Corning，目录号352477)包被的两个T25烧瓶中，使用 hiPSC重编程培养基(CIB，目录号RE-0202)培养。转染后第15天，将培养 基更换为mTeSR1，另外培养7天，直至出现hiPSC菌落。选择具有典型hiPSC 形态的克隆用于进一步纯化和扩增。

hiPSC克隆的鉴定遵循国际标准^43-44，包括外源基因沉默和多能性标记 表达检测、外源基因整合测定、启动子脱甲基化分析、核型分析试验、分化 潜能试验(胚状体形成)、畸胎瘤试验和细胞ID(STR)测试等(图1)。此外，在 进行基因组编辑工作之前，也验证这两种亲本hiPSC细胞系的神经谱系分化 潜力(图2)。

实施例2：构建供体载体和靶向载体

使用最常用的基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统进行hiPSC基因工程 改造。对于AD相关基因靶向整合到安全港位点(AAVS1位点)，构建靶向 AAVS1位点的特异性CRISPRsgRNA载体。sgRNA设计和构建遵循文献中 描述的方法²⁹。BpiI酶的靶位点位于载体上，识别位点位于切割部分。因此， 目标位点间隔序列可以通过一步消化克隆到载体中。消化后，载体含有 5'GTGG3'和5'GTTT3'的粘性末端。通过合成CACC+靶标间隔序列的粘性 末端和AAAC+反向互补序列的粘性终端，sgRNA变成具有额外的粘性末端 的双链寡核苷酸序列，其可连接到cas9载体。CRISPR-cas9质粒通常通过两 步法构建。第一步是处理合成的寡核苷酸序列的切割位点。第二步是将处理 的寡核苷酸序列与通过限制酶消化处理的CRISPR-Cas9载体连接。

对于供体构建，首先产生包含PGK-PURO-SV40PA、P2A-EGFP-BGHPA 和CAG启动子的骨架载体和多克隆位点(MSC)。为了构建最终的供体，产 生5种质粒：1)T-HindIII-CAG-EcoRI；2)T-SalI-P2A-EGFP-BGHPA-NotI；3)T- HindⅢ-PGK-PURO-SV40PA-HindIII；4)合成的 PUC19-EcoRI-BACE1cds-SalI；和5)PZD载体(Sigma-Aldrich)。第一步是消 化质粒1、2、4和5，回收四个片段，HindIII-CAG-EcoRI-、 -LALI-EGA-EGFP-BGHPA-NotI-、EcoRI-BACE1cds-SalI-和HindIII-PZDonor -HindIII-，然后将所有片段连接在一起。转化DH5α细胞后，将阳性克隆鉴 定为PCBEB6的中间载体。通过HindIII消化，然后连接PCBEB6和 T-HindIII-PGK-PURO-SV40PA-HindIII，产生最终的供体载体。该供体载体 命名为CIB-PCBEB(图3A)。通过在两端合成具有BglII和XhoI切割位点的 基因序列，完成AAVS1位点过表达的所有外源基因。将目的基因通过用BglII 和XhoI消化载体插入载体，然后将插入片段与所述载体连接。最终供体质 粒用于转化DH5α细胞，然后通过测序验证。BACE1基因和PS1dE9基因过 表达的供体构建如图3B和3C所示。

实施例3:在AAVS1位点靶向整合AD相关基因

为了将AD相关基因引入AAVS1位点，将亲本hiPSC用mTeSR1(StemcellTechnologies，目录号05850)在包被Matrigel(Corning，目录号354277)的6孔板上在 37℃、5％CO₂下培养。以80％汇合收获细胞，并且通过电穿孔法(Amaxa Nucleofector II，程序A-024)与Cas9-sgRNA质粒和供体质粒共转染。每个转染反应的细胞数为0.5 至1×10⁶，和质粒的数量为：Cas9-sgRNA 2.5μg和供体质粒4μg。将转染的细胞立 即接种到用Matrigel包被的六孔板中，与mTeSR1和10μMY-27632(Sigma，目录号 Y0503)一起孵育。孵育48小时后，将0.5μg/ml的嘌呤霉素(Xiya Reagent，目录号 1014553)加入到培养基中24小时用于药物筛选。单细胞克隆通过如下制备：将霉素 抗性细胞以1000个细胞/ml的密度接种到Matrigel包被的T25烧瓶上，用mTeSR1 和10uM Y-27632孵育。10天后，用显微镜辅助挑取单细胞克隆，然后转移到Matrigel 包被的96孔板中。将每个克隆分成两等份，并且在两个96孔板上培养，一个用于 繁殖，一个用于鉴定。为了验证基因整合，通过DNA裂解试剂盒(QuickExtract ^TM DNA Extraction Solution 1.0，Epicenter，目录号QE09050)裂解细胞，然后通过连接PCR鉴 定存在插入片段(图4B)。通过连接PCR鉴定的阳性克隆，通过测序进一步验证(图 4C)。此外，选择的克隆也进行多能性测试和核型分析以消除由单细胞克隆过程引入 的变异。使用类似的策略产生组成性过表达BACE1和PS1dE9基因的两个hiPSC细 胞系(图4A和图5A)。

实施例4：大规模产生神经细胞

如上所述，能够一致地和可重复地产生大量与AD相关的人神经元，对 于建立用于药物筛选的生理细胞平台是至关重要的。在目前的技术中，hiPSC 分化为功能性神经元涉及冗长的过程，并且经受一系列培养条件的变化。因 此，在96孔板中直接接种hiPSC以产生神经元，导致巨大的分化神经元的 数量和质量方面的孔间变异。这种巨大的变异不适合于药物筛选。为了解决 这个问题，开发步进式流程(Step-wise process)以控制变异。第一步是从hiPSC 产生高质量的神经干细胞(NSC)。该步骤使从hiPSC到成熟神经元的整个过 程缩短6-8周。第二步是将NSC分化成神经祖细胞(NPC)，其进一步减少产 生成熟神经元的分化时间。为了产生NSC原种，将hiPSC接种在含有神经 诱导培养基(StemcellTechnologies，目录号05835)和10uM Y-27632(Sigma， 目录号Y0503)的12孔板上。5天后，将形成的胚状体球平铺在Matrigel包 被的12孔板上，在37℃的CO₂培养箱中孵育，并且每天更换神经诱导培养 基。7天后，挑取NSC样玫瑰花结细胞，并且转移到24孔板中。培养基用NSC增殖培养基(CIB，目录号NE-0603)代替。7至8天后，挑取NSC样细 胞并且转移到48孔板中。当NSC密度达到90％汇合时，将其转移到6孔板 中用于进一步扩增和储存。为了产生功能性神经元，将约8×10⁴/cm²的NSC 转移到包被有聚-L-鸟氨酸(Sigma，Cat。No.P4957)和层粘连蛋白(Sigma，目 录号2020)的6孔板中，并且在神经元诱导培养基(StemcellTechnologies，目 录号08500)中培养。7天后，将培养基更换为神经元成熟培养基(Stemcell Technologies，目录号08510)，继续培养2至3周。通过免疫染色神经元特 异性生物标志物如Tuj1来证实成熟神经元(图6)。

实施例5：过表达经修饰的hiPSC细胞系中的β-分泌酶

如上所述，使用由本发明创建的载体产生两个hiPSC细胞系。一个hiPSC 细胞系(IPSN0041-21)在AAVS1位点含有组成性表达的BACE1(β-分泌酶1) 基因。对于该系，将BACE1基因在RNA和蛋白质水平的表达与其等基因 亲本系(IPSN0041)在RNA和蛋白质水平的表达进行比较。为了定量BACE1 mRNA表达，用TRIzol(Sigma，目录号T9424)提取总的RNA。使用ABITM 7500系统和荧光染料SYBR Premix EXTaqTMII(TaKaRa，目录号RR820A) 进行qPCR。持家基因β-肌动蛋白用作参考，每个数据点为三次重复平均值。 结果显示，与IPSN0041相比，IPSN0041-21的BACE1 mRNA表达在iPSC 和来自iPSC的神经元中高得多，表明转入的BACE1基因在IPSN0041-21 中确实为过表达(图7A)。BACE1蛋白的表达使用ELISA试剂盒(Thermo Fisher，目录号P0013)进行。使用上述方法获得NSC和成熟神经元，通过蛋白质裂解缓冲液(Biyuntian Biotechnology，目录号P0013)裂解细胞，并且使 用ELISA试剂盒根据制造商的说明书测定BACE1蛋白浓度。类似于RNA 结果，IPSN0041-21中的BACE1蛋白(β-分泌酶1)水平显著高于来自hiPSC 的NSC和神经元中亲本系IPSN0041的BACE1蛋白水平(图7B)。

实施例6：表达经修饰的hiPSC细胞系中的Aβ-42肽

对于Aβ-42肽检测，将成熟神经元在神经元成熟培养基(Stemcell Technologies，目录号08510)中培养至多7周。以1周为间隔收集上清液。 使用人/大鼠Aβ42ELISA试剂盒(WAKO，目录号290-62601)测量Aβ-42肽的 浓度。为了标准化，也测量每次收集的总蛋白(Thermo-Fisher，Pierce BCA Protein Assay Kit，目录号23225)。正如预期的那样，观测到IPSN0041-21 神经元培养基中表达Aβ-42肽的表达量高于IPSN0041神经元中表达Aβ-42肽的表达量(图8A)。经六周时间的进一步研究表明，与来自IPSN0041的神 经元相比，来自IPSN0041-21的神经元具有不同的表达模式。来自IPSN0041 神经元(野生型)中的Aβ-42肽水平在神经元培养第一周非常低，其随着时间 推移增加，第五周达到高峰，第六周下降；而来自IPSN0041-21神经元中的 Aβ-42表达在神经元培养前两周高，随时间推移减少(图8B)。由于体外神经 元细胞培养6周模拟成熟神经元的老化过程，因此观测结果表明，对于野生型神经元，Aβ-42水平在神经元衰老过程中增加，这与AD的疾病机制相一 致。Aβ-42在第六周的下降可能是由于培养基中的神经元死亡。另一方面， 早期IPSN0041-21神经元中Aβ-42的高水平表达可以解释为BACE1转基因 的过表达，3周后Aβ-42表达的降低是由于成熟前神经元功能障碍或由于β- 分泌酶过多导致所述神经元死亡。该观测结果表明β-分泌酶表达升高对神经 元存活有害。

实施例7：使用经修饰的hiPSC细胞系筛选药物化合物

已经从经修饰的hiPSC细胞系IPSN0041-21产生大量的神经元祖细胞 (NPC)。为了进行化合物筛选测定，将NPC接种在细胞密度为50,000个细 胞/孔的96孔板中。NPC在神经元成熟培养基(Stemcell Technologies，目录 号08510)中培养至多4周。以一周为间隔收集上清液。使用人/大鼠 Aβ42ELISA试剂盒(WAKO，目录号290-62601)在两周、三周或四周测量 Aβ-40和Aβ-42浓度。待测试的化合物在测量Aβ-40和Aβ-42肽前一周加入 神经元培养基中。如图9所示，测试两种新型化合物(B3和B16)对Aβ肽产 生的影响。结果显示，B3和B16减少Aβ-40和Aβ-42肽的产生，但不影响 Aβ-42与Aβ-40的比例。令人关注的是，与B3和B16处理的情形相比，阳 性对照(常用的β-分泌酶抑制剂(Sigma-Aldrich，目录号S4562))不成比例地减 少Aβ-42肽和Aβ-40肽的产生，如较高的Aβ-42与Aβ-40的比例所示。该 结果表明，由于BACE1基因的过表达导致IPSN0041-21中的Aβ肽的表达 升高，确实提高了Aβ-40和Aβ-42肽测定的灵敏度，从而使得潜在药物化合 物对不同类型Aβ肽的影响得以区分。特别地，该系统能够筛选更有效减少 Aβ-42生产的化合物。

结论

本发明描述通过hiPSC中的AD相关基因过表达创建生理学相关的AD 细胞模型，所述AD相关基因例如BACE1和PS1及其变体。已经产生几种 独特的供体载体，用于高效率地在人类基因组中的安全港位点(AAVS1)靶向 整合AD相关基因。在AAVS1位点进行靶向整合AD相关基因提供安全和 受控的转基因表达，克服了常用随机整合方法的缺点，例如未知拷贝数和对 内源基因的潜在破坏。使用这些供体载体产生的hiPSC细胞系显示出高水平 的β-分泌酶活性和/或高水平的Aβ-42肽，所述Aβ-42肽是淀粉样蛋白斑形 成的主要成分。本发明建立了新的细胞测定平台，其使用来自hiPSC细胞系 的神经元细胞进行过表达AD相关基因。潜在药物候选化合物的初步筛选表 明，与本领域目前现有技术相比，本发明创建的细胞测定平台为筛选新型β- 分泌酶抑制剂和/或Aβ-42肽抑制剂提供了明显优势。

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Claims (10)

1.一种制备阿尔茨海默病(AD)的细胞模型的方法，其包括将AD相关基因整合到hiPSC中以诱导hiPSC的β-分泌酶水平增加和/或Aβ-42肽增加。

2.权利要求1的方法，其中所述AD相关基因在hiPSC中组成性过表达。

3.权利要求1或2的方法，其中所述AD相关基因为引起AD发病的突变APP基因或突变PS基因。

4.权利要求3的方法，其中所述突变PS基因为PS1dE9基因。

5.权利要求1或2的方法，其中所述AD相关基因为BACE1基因。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述AD相关基因选自引起AD发病的突变APP基因、PS1dE9基因和BACE1基因。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述AD相关基因通过位点特异性的方式整合到hiPSC中。

8.权利要求7的方法，其中所述AD相关基因在AAVS1位点整合到hiPSC中。

9.通过权利要求1-8任一项的方法产生的阿尔茨海默病(AD)的细胞模型。

10.一种修饰hiPSC的方法，其包括导入AD相关基因至hiPSC以使其组成性过表达。