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CN108070569A - 一种产前基因芯片检测的改良方法 - Google Patents

一种产前基因芯片检测的改良方法 Download PDF

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CN108070569A CN201810120370.7A CN201810120370A CN108070569A CN 108070569 A CN108070569 A CN 108070569A CN 201810120370 A CN201810120370 A CN 201810120370A CN 108070569 A CN108070569 A CN 108070569A
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Abstract

一种用于医学领域的产前基因芯片检测的改良方法，其特征是根据基因组异常细胞和骨髓瘤细胞的表面标志，介入特异性抗体及其抗体桥接的作用，使细胞在抗体的作用下易于胞膜接触和特异融合，增加了有效融合率，减少了无效融合，以此设计细胞融合方法，将全异常基因组植入瘤细胞并借瘤细胞的扩增而扩增，然后筛选并制备基因组异常的单克隆杂交瘤细胞株，经异常基因检测后制成标准参照细胞，用于替代现有的基因检测比对数据库而进行被检变异基因的检测比对、室内质控和室间质评以及产前基因芯片检测改良方法的建立。

Description

一种产前基因芯片检测的改良方法
技术领域
本发明涉及医学领域的一种产前基因芯片检测的改良方法，主要应用于胎儿染色体拷贝数异常或单核苷酸多态性异常的检测。
背景技术
基因芯片是最近发展起来的一项高通量的基因表达分析技术，是在尼龙膜表面打印点阵或硅玻片表面合成能代表不同基因的成千上万个寡核苷酸作为探针.与放射性同位素或荧光素标记的待测材料中的DNA或cDNA互补结合，采用放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描杂交信号，最后由计算机集中进行分析处理。获得的杂交信号强度及分布模式，可以反映被检样本中有关基因的表达情况。
基因芯片的应用取决于探针的设计，根据探针及探针组合的不同，基因芯片可分为CNV+SNP芯片、CNV芯片或SNP芯片。SNP芯片可以检测单核苷酸多态性及染色体数目异常和SNPs(杂合性缺失/单亲二倍体)，SNP+CNVs芯片可以检测拷贝数变异(缺失、重复、非平衡易位、等臂染色体)，CNV可以检测拷贝数变异。目前基因芯片已成为产前诊断的主流技术，尤其应用于生长发育迟缓、先天性疾病、自闭症患儿、超声异常病例和流产物的检测。
基因芯片检测的主要步骤包括待测细胞DNA提取、DNA浓度测定、限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接、DNA的PCR扩增、PCR产物琼脂糖凝胶电泳、磁珠法纯化DNA、DNA定量、DNA片段化、DNA末端标记、PCR扩增、杂交炉杂交、洗涤、染色、芯片扫描仪扫描和生物学分析。
基因芯片检测所得到的初始生物学数据常提示多种不同的染色体拷贝数变异，要判断这些变异是否为病理性变异，现有的技术是基于所得生物学数据与DGV、OMIM、DECIPHER基因数据库的比对。其中DGV(Database of Genomic Variants)基因组变异数据库是针对人类基因组结构突变(structual variation，SV)的综合评述，关联基因组变异(genomic variation)与表型数据，如果DGV数据库中记载的DNA变异区域与被测样本的DNA拷贝数异常一致且能完全包含被测样本的异常拷贝数，则表明拷贝数异常为常见变异，不考虑致病性可能；OMIM是关于人类基因和遗传疾病的数据库，包含所有已知的孟德尔疾病和超过15，000个基因，用于查对被测样本的DNA异常片段中是否存在OMIM基因，如果存在OMIM基因，则考虑病理性可能；DECIPHER用于区别被测样本拷贝数变异是否为致病性变异，并根据DECIPHER记载的拷贝数变异的致病性贡献及患者的临床表现来评估样本目标拷贝数变异的可能致病后果。
由于国内没有可比对的中国人基因数据库，所以传统的基因芯片检测方法是根据国外基因数据库(DGV、OMIM、DECIPHER)有关染色体变异所致相应疾病的记载来评估中国人类似染色体变异的致病性。因为不同地区、人种和个体的基因结构有先天的差别，且在不同条件下的基因检测结果也不完全一致，J等报道[J Clin Oncol.2016Dec 1；34(34)：4071-4078]，26％的所检测的基因突变得到不同的解读，11％的检测突变得到完全相反的解读，所以不同人种、不同条件下的基因检测结果难有可比性。总之，用国外基因数据库作为中国人基因检测的参照标准，显然是因受现有技术的限制而不得不为之。
为了解决这些问题，国内遗传学家提出要建立中国人自己的基因数据库，作为中国人基因检测的参照标准，但要实现这个目标并非易事。本发明人在此基础上认为，更应建立中国人基因芯片检测的参照标准。按照经典检验方法的基本原则，通常以未知含量的患者标本作为测定管，以已知被测物含量的标准品作为标准管，以空白(阴性)管消除干扰，同时介入质控(品)管，在相同条件下检测，在质控管在控的条件下，根据所得测定管、标准管的数据，以标准管为参照，计算出测定管中被测物的含量。可见经典检验方法中所用的标准品和质控品是保证检测结果准确可靠的决定因素，
但面对病例样本珍贵稀有且难以产业化扩增的罕见遗传病产前基因芯片检测，缺乏可用作标准品、质控品的已知含量的标准物。有关文献报道，鼠sp2/0瘤细胞能与致敏B淋巴细胞融合，所得杂交瘤细胞携带两者的遗传物质，既能无限扩增又能产生抗体。本发明人在此基础上，将携带致病基因的细胞与骨髓瘤细胞融合，使全致病基因组移植骨髓瘤细胞并借助骨髓瘤细胞的无限扩增而扩增，进而将其应用于制备基因芯片检测的标准参照细胞，用以替代国外基因数据库而进行被检变异基因的检测比对，并建立中国人自己的基因芯片检测参照标准以及产前基因芯片检测新方法，使被检基因变异的细胞与本发明的标准参照细胞进行相同人种和相同检测条件下的比对，以提高检测结果的准确性。
发明内容
为了建立一种以相同人种、相同检测条件、已知基因变异的标准细胞为参照而非以不同人种、不同检测条件的国外基因数据库为参照的更准确的产前基因芯片检测方法，本发明人提出了本发明。
本发明的目的是要提供一种用于染色体基因组拷贝数变异产前基因芯片检测的标准参照细胞；另一目的是要提供一种产前基因芯片检测的改良方法。
本发明的目的是这样实现的：基因组异常细胞与骨髓瘤细胞在特异性抗体和聚乙二醇的共同作用下融合为杂交瘤细胞，异常基因随瘤细胞的无限扩增而扩增，进而制成已知异常基因的标准参照细胞，用于替代现有的基因检测比对数据库而进行被检变异基因的检测比对。
较具体的说，具有染色体拷贝数变异的淋巴细胞、单核细胞、羊水细胞或绒毛细胞与SP2/0细胞或人H929骨髓瘤细胞表面存在对应的经免疫制备的免疫性抗体的结合表位或固有的天然抗体的结合表位，能通过抗体连接基因组异常细胞与骨髓瘤细胞，或通过抗体桥接连接已分别与基因组异常细胞和骨髓瘤细胞连接的抗体，间接连接基因组异常细胞与骨髓瘤细胞，在聚乙二醇的共同作用下融合为杂交瘤细胞。如通过CD138单抗的靶向捕获，使CD138单抗的IgGFc端与具有IgGFc受体的基因组异常细胞结合，而CD138单抗的IgGFab端与瘤细胞结合，形成骨髓瘤细胞-CD138单抗-基因组异常细胞的结合物，并在聚乙二醇的共同作用下促使胞膜接触和特异融合；如金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)具有IgGFc受体，1个SPA能实际结合2个IgGFc，不同的免疫性IgGFab端分别与基因组异常细胞和骨髓瘤细胞结合，通过SPA连接抗体进而连接与抗体结合的基因组异常细胞和骨髓瘤细胞，并在聚乙二醇的共同作用下促使胞膜接触和特异融合，经异常基因鉴定和扩增，制成标准参照细胞，用于替代现有的基因检测比对数据库而进行被检变异基因的检测比对。
本发明根据基因组异常细胞和骨髓瘤细胞的表面标志，介入特异性抗体及其抗体桥接的作用，使细胞在抗体的作用下易于胞膜接触和特异融合，增加了有效融合率，减少了无效融合，以此设计基因组异常细胞和骨髓瘤细胞的融合方法，首次将全异常基因组植入瘤细胞并借瘤细胞的扩增而扩增，然后筛选并制备基因组异常的单克隆杂交瘤细胞株，以高分辨染色体核型分析、荧光原位杂交、PCR或测序验证目标异常基因，制成标准参照细胞，用于替代现有的基因检测比对数据库而进行被检变异基因的检测比对、室内质控和室间质评以及产前基因芯片检测改良方法的建立。
具体实施方式
图1是本发明的CD138单抗助融示意图。
图2是本发明的SPA协同双抗体助融示意图。
图3是本发明的细胞融合实拍图
如图1，1表示具有CD138单抗Fab受体的骨髓瘤细胞，2表示CD138单抗(IgG)，3表示具有CD138单抗Fc受体的基因突变细胞，CD138单抗(IgG)的另一个Fab端还可结合一个骨髓瘤细胞，通过CD138单抗将待融合的细胞连接在一起，有利于在PEG的作用下融合。
如图2，1表示具有IgGFc受体的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)，2表示编号为6和7的待融合细胞的单克隆抗体，3表示编号为4和5的待融合细胞的单克隆抗体，在单克隆抗体[2]与编号为6和7的待融合细胞结合、单克隆抗体[3]与编号为4和5的待融合细胞结合后，再经SPA的连接，编号为4、5、6和7的细胞均有利于在PEG的作用下发生融合。
如图3，在单克隆抗体和/或SPA的助融下，经HAT筛选2周，在倒置显微镜下拍摄(40X)，得到杂交瘤细胞克隆。
下面结合图1、图2和图3，对本发明的实施方案作具体的描述。
1、待融合细胞(含致病性的目标变异基因)：包括单基因病、多基因病、染色体病、线粒体病或体细胞病的基因缺失、重复、突变及拷贝数变异的淋巴细胞、单核细胞、羊水细胞和绒毛组织细胞。本发明采集人β-地中海贫血患者的淋巴细胞；骨髓瘤细胞采用鼠SP2/0瘤细胞。
2、实验试剂
(1)预融合剂：在10％胎牛血清的DMEM培养基中配入与鼠SP2/0瘤细胞等价的CD138单抗(骨髓瘤细胞∶CD138单抗＝1∶1)；金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)。
(2)其他试剂：DMEM培养基、HAT选择培养基购自Sigma公司，胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；DMSO(--甲基亚砜)为国产分析纯试剂；CD138单抗可自制或商品购得。
3、细胞融合方法
(1)骨髓瘤细胞的准备：融合前一周从液氮罐内取出冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)，或人骨髓瘤细胞H929，立即放入热水解冻。融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3-4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合时将SP2/0从培养瓶上吹下，转入离心管中，1000r/m离心5-10min，重复洗涤细胞2次，轻轻敲打混匀，取少量悬液计数，调整好密度，使融合时的密度为80％左右(应用最多的是Sp2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链，细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h；与人体相关的实际应用中考虑选择同源细胞株，如上海复祥生物科技有限公司向ATCC细胞库引进的NCI-H929人骨髓瘤细胞株)。
(2)待融合的基因组异常细胞的准备：淋巴细胞、单核细胞、羊水细胞、绒毛组织细胞以DMEM培养液(基础培养基)调整总细胞数到1×108～2×108，以台盼兰染色、相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。
(3)预融合处理：①对于含IgGFc结合受体的有核细胞(B细胞)，在预融合处理中使CD138单抗与骨髓瘤细胞以1∶1调配，使骨髓瘤细胞的CD138受体刚好被CD138单抗结合，通过CD138单抗的IgGFc段靶向捕获B细胞，形成骨髓瘤细胞-CD138单抗-B细胞的结合物。②对于没有IgGFc结合受体的有核细胞，不做预融合处理。③预融合处理方法：将骨髓瘤细胞与CD138单抗按等效价配制于DMEM，37℃2-5小时，1000r/min离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀，加入5-10倍的B淋巴细胞混和均匀，1000r/min离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀。
(4)细胞融合：在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后在无菌条件下将预热的1000μL的30％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中，同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL基础培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，转置56℃水浴放散抗体5分钟(除去结合的抗体)，立即以1500r/m离心5min，弃去上清，加入50mL HAT培养基，适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(5)融合细胞(杂交瘤细胞株)的筛选：观察96孔板细胞生长情况，7-10天后仅为有效融合细胞能够生长，此时弃去HAT培养基，更换完全培养基。
(6)单克隆杂交瘤细胞株的筛选(亚克隆)：当细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去培养上清，选择杂交瘤细胞生长状态良好的培养孔，显微镜下标记细胞生长位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置将细胞克隆吸取到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，使后面每个孔中的细胞数为0-1个，37℃，5％CO2培养箱内培养约1周，显微镜下观察细胞生长情况，待后面(倒数)孔中的细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，选择(倒数)后面孔中的细胞再行单克隆筛选，制备单克隆杂交瘤细胞株。
4、单克隆杂交瘤细胞株的染色体核型分析：对比分析SP2/0骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞的染色体核型，计数50个分裂象，观察杂交瘤细胞中染色体数目的变化。有部分人染色体在细胞融合后没有独立存在，已与鼠骨髓瘤细胞的染色体发生融合。
5、单克隆杂交瘤细胞株变异基因的基因芯片检测：按常规基因芯片检测试剂盒的说明书，在相同条件下检测SP2/0骨髓瘤细胞、单克隆杂交瘤细胞株和杂交前的基因组异常细胞，对比检测结果，观察杂交前的基因组异常细胞与单克隆杂交瘤细胞株的基因组变化，确定基因组的拷贝数变异。检测的主要步骤包括DNA提取、DNA浓度测定、限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接、PCR扩增DNA、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测、磁珠法回收纯化DNA、DNA定量、DNA片段化、DNA末端标记、PCR扩增、杂交炉杂交、洗涤、染色、芯片扫描仪扫描和生物学分析。
6、单克隆杂交瘤细胞株变异基因的验证：采用高分辨染色体核型分析和/或荧光原位杂交(FISH)技术和/或PCR技术(QF-PCR/RT-PCR/荧光定量PCR/实时PCR)和/或测序技术(一代测序/Hiseq测序/目标区域测序/深度测序/GC校正及信息对比判定CNV/滑动窗口分析测序数据/二元分割一双向节段调节阈值分析测序数据)进一步验证变异基因组的基因芯片检测结果，确证单克隆杂交瘤细胞株的变异基因组。
7、单克隆杂交瘤细胞株变异基因的定量、分装和冻存：按DNA提取试剂盒说明书，提取单克隆杂交瘤细胞株DNA，测定DNA的浓度，按基因芯片检测试剂盒规定的DNA用量，换算为相当的细胞含量，据DNA浓度和细胞含量的关系，配制、分装单克隆杂交瘤细胞株，置-196℃液氮中冻存备用。
8、单克隆杂交瘤细胞株变异基因的稳定性监测
(1)变异基因的定期检测：每隔1个月取3支冻存的细胞株，进行基因芯片检测及高分辨染色体核型分析、荧光原位杂交、PCR或测序，检测和验证变异基因。
(2)杂交瘤细胞株的定期培养：每隔1个月取3支冻存的细胞株，进行复苏培养，传5-10代后进行基因芯片检测及高分辨染色体核型分析、荧光原位杂交、PCR或基因测序，检测和验证变异基因，稳定者继续冻存。
(3)杂交瘤细胞株的分装：按基因芯片检测所需量分装。
9、基于单克隆杂交瘤细胞株的产前基因芯片检测改良方法的建立
(1)单克隆杂交瘤细胞株作为基因芯片检测的参照标准
①分类单克隆杂交瘤细胞株：按病种或异常基因的种类进行分类，如单基因病、多基因病、染色体病、线粒体病以及具体的拷贝数异常种类，进行分类冻存和使用。
②分类被检测标本：同样按病种或异常基因的种类进行分类，如根据临床表现，初步分类为单基因病、多基因病、染色体病、线粒体病以及可能的拷贝数异常，进行分类检测。
③建立归类检测：根据被检样本可能的病种和拷贝数异常，选择同病种同拷贝数异常的对应单克隆杂交瘤细胞株，进行基因芯片检测。
④在相同条件下检测：将被检样本与单克隆杂交瘤细胞株在相同条件下检测，包括DNA提取、DNA浓度测定、限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接、PCR扩增DNA、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测、磁珠法回收纯化DNA、DNA定量、DNA片段化、DNA末端标记、PCR扩增、杂交炉杂交、洗涤、染色、芯片扫描仪扫描和生物学分析。
⑤进行质量控制：如果2株单克隆杂交瘤细胞株的检测结果均与各自所固有的基因拷贝数异常一致，则说明质控在控，样本的检测结果可靠，可以发出报告；如果2株单克隆杂交瘤细胞株的检测结果中有1株与各自所固有的基因拷贝数异常一致，而另1株不一致，则需找出误差原因后才可决定是否发放报告；如果2株单克隆杂交瘤细胞株的检测结果均与各自所固有的基因拷贝数异常不一致，则需找出原因并重新检测。
⑥替换现有比对数据库：将被检测标本与单克隆杂交瘤细胞株的基因芯片检测结果进行比对而非与现有的基因拷贝数异常比对数据库进行比对。在质控在控的情况下，如果两者的检测结果显示相同的基因拷贝数异常，则对于被测标本来说可以确诊为该拷贝数异常；如果两者的检测结果显示不相同的基因拷贝数异常，则对于被测标本来说该拷贝数异常只可以作为筛查结果或可疑结果。
(2)建立产前基因芯片检测的改良方法
基于分类单克隆杂交瘤细胞株、分类被检测标本、建立归类检测、在相同条件下检测、进行质量控制和替换现有比对数据库，将单克隆杂交瘤细胞株作为基因芯片检测的参照标准，建立产前基因芯片检测的改良方法。

Claims (9)

1.一种产前基因芯片检测的改良方法，其特征在于，在特异性抗体和聚乙二醇的共同作用下将基因组异常细胞与骨髓瘤细胞融合从而使全异常基因组植入瘤细胞并随瘤细胞扩增，进而筛选单克隆细胞并鉴定拷贝数异常基因，制成能替代现有基因异常比对数据库的标准参照细胞，用以建立产前基因芯片检测的改良方法。
2.根据权利要求1所述的一种产前基因芯片检测的改良方法，其特征在于，所述特异性抗体指免疫性抗体、天然抗体和SPA。
3.根据权利要求2所述的一种产前基因芯片检测的改良方法，其特征在于，所述免疫性抗体指CD138单抗、IgG。
4.根据权利要求1所述的一种产前基因芯片检测的改良方法，其特征在于，所述现有基因异常比对数据库指DGV、OMIM、DECIPHER。
5.根据权利要求1所述的一种产前基因芯片检测的改良方法，其特征在于，所述标准参照细胞指经检测确定的已知基因拷贝数异常的单克隆杂交瘤细胞。
6.根据权利要求1和5所述的一种产前基因芯片检测的改良方法，其特征在于，所述检测确定指使用高分辨染色体核型分析、荧光原位杂交、PCR、测序技术。
7.根据权利要求1和5所述的一种产前基因芯片检测的改良方法，其特征在于，所述改良方法指由分类单克隆杂交瘤细胞、分类被检测标本、建立归类检测、在相同条件下检测、进行质量控制和替换现有比对数据库构成的以单克隆杂交瘤细胞作为参照标准而非以基因异常比对数据库为参照标准的基因芯片检测方法。
8.根据权利要求1和5所述的一种产前基因芯片检测的改良方法，其特征在于，所述PCR包括QF-PCR、RT-PCR、荧光定量PCR和实时PCR。
9.根据权利要求1和5所述的一种产前基因芯片检测的改良方法，其特征在于，所述测序技术包括一代测序、Hiseq测序、目标区域测序、深度测序、GC校正及信息对比判定CNV、滑动窗口分析测序数据以及二元分割一双向节段调节阈值分析测序。
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刘继林等: "抗原抗体介导的细胞融合制备单克隆抗体", 《免疫学杂志》 *
吴梦等: "利用改良电融合法制备杂交瘤细胞的试验探索", 《四川畜牧兽医》 *

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