CN108060229A - 一种TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法，首先通过第一步PCR反应扩增出含有SNP位点的片段，而非单独扩增SNP位点，以提高样品的可操作性以及后续操作的精度；通过SAP对步骤S1得到的扩增产物进行去磷酸化处理，防止DNA分子5'端与3'端连接，在后续步骤准备好之前让DNA分子保持线性状态，从而保证后续实验的准确度；最后通过步骤S3对rs10069690位点进行单碱基延伸，利用变性‑退火内循环使DNA双链充分解螺旋、分离，从而实现不同SNP的精确分型。通过上述方法，可以快速、准确地获得TERT基因的rs10069690位点的SNP分型信息，操作简便、可靠性强，可以为后续的相关研究提供可靠的参考信息。

Description

一种TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法

技术领域

本发明属于SNP检测技术领域，特别涉及一种TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

TERT基因位于5号染色体上，用于指导端粒酶逆转录酶(TRET)的合成。端粒(telomere)是染色体末端一种特殊结构，一方面可减少末端缩短，另一方面还可避免相邻染色体末端融合，在细胞增殖和衰老等过程发挥着关键作用；端粒酶负责端粒末端重复序列生成，避免端粒缩短。端粒酶逆转录酶是端粒酶的催化亚基，可有效保持端粒结构完整性，是决定端粒长度的关键因素。研究表明，肿瘤发生的特征之一是端粒酶的表达量增加，而端粒酶逆转录酶的表达与端粒酶的表达呈高度正相关关系。目前已有研究指出，黑色素瘤、皮肤癌、卵巢癌以及膀胱癌等疾病均与端粒酶逆转录酶的表达具有正相关性。

TERT基因上存在中多SNP位点，每个SNP位点的不同表达形式均可能对上述病症产生不同的影响。因此，提供一种高效、准确的SNP检测方法，将会为研究TERT对上述疾病的影响机制提供重要的参考信息和理论支持。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明一方面提供了一种TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测引物组，包括如下引物：

上游引物rs10069690-F：5`-ACGTTGGATGTCAGTTGCCTGGGCTTA TTG-3`(如SEQ.ID.No.1所示)；

下游引物rs10069690-R：5`-ACGTTGGATGCTGAGCACTACCCATGA TAG-3`(如SEQ.ID.No.2所示)；

延伸引物rs10069690-E：5`-GGAAGGGAGATTTTGACAG-3`(如SEQ.ID.No.3所示)；

TERT基因rs10069690位点野生型碱基序列如SEQ.ID.No.4所示。

本发明另一方面提供了一种应用该引物组的TERT基因的rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法，包括如下步骤：

S1：用上游引物rs10069690-F和下游引物rs10069690-R进行第一轮PCR，对模板DNA进行扩增，得到含有所述rs10069690位点的片段；

S2：对步骤S1得到的片段进行去磷酸化处理，得到脱磷酸片段；

S3：用延伸引物rs10069690-E对所述脱磷酸片段进行单碱基延伸，对不同SNP进行分型；

S4：对步骤S3得到的样品进行脱盐处理，用质谱仪进行检测。

进一步地，步骤S1中，第一轮PCR的反应体系中包括如下组分：

模板DNA 2ng/μl、rs10069690-F引物0.05μM、rs10069690-R引物0.05μM、Mg2+4mM、1×PCR Buffer、dNTP 10μM以及Taq DNA聚合酶1U。

进一步地，步骤S1中，第一轮PCR的反应条件如下：

(1)预变性：95℃2min；

(2)扩增：95℃30s，56℃30s，72℃60s，共45个循环；

(3)延伸：72℃5min，4℃∞。

步骤S1的目的是扩增出含有SNP位点的片段，而非单独扩增SNP位点，以提高样品的可操作性以及后续操作的精度；“4℃∞”即为保持在4℃下，以防止外界温度剧烈变化对扩增产物造成影响。

进一步地，步骤S2中，去磷酸化的反应体系在第一轮PCR扩增产物的基础上还包括如下成分：

0.24×SAP Buffer以及SAP酶0.5U。

进一步地，步骤S2中，去磷酸化的反应条件如下：

(1)去磷酸化：37℃40min；

(2)SAP酶灭活：85℃5min，4℃∞。

步骤S2的目的是通过SAP对步骤S1得到的扩增产物进行去磷酸化处理，防止DNA分子5'端与3'端连接，在后续步骤准备好之前让DNA分子保持线性状态，从而保证后续实验的准确度。

进一步地，步骤S3中，单碱基延伸的反应体系在去磷酸化产物的基础上还包括如下成分：

0.222×iPLEX GOLD Buffer、1×iPLEX Termination mix、iPLEX延伸引物0.15μM以及1×iPLEX Enzyme。

进一步地，步骤S3中，单碱基延伸的反应条件如下：

(1)预变性：94℃30s；

(2)扩增内循环：94℃5s，52℃5s，共5个循环；

(3)扩增外循环：94℃5s，52℃5s，80℃5s，共40个循环；

(4)延伸：72℃4min，4℃∞。

步骤S3的目的是对rs10069690位点的序列进行单碱基延伸，从而实现不同SNP的分型。

本方案中，在变性-退火-延伸的外循环中间还对变性-退火设置内循环，以便充分将DNA的双链解旋、分离，从而提高DNA单链的分离程度以及单碱基延伸的准确性

进一步地，所述步骤S4包括如下步骤：

S4.1：在树脂板上铺好洁净树脂待用，每孔6mg树脂，风干10～20分钟；

S4.2：向样本板的样本空内加入待测样品，每个样本孔再加15～20μL ddH2O，用封口膜密封，进行瞬时离心；

S4.3：打开覆盖所述样本孔的封口膜，将所述样本板倒扣在所述树脂板上固定，将固定好的样本板和树脂板整体翻转，轻敲树脂板，以使树脂板中的树脂完全落入样本板上相应样本孔，用封口膜密封，进行瞬时离心；

S4.4：将样本树脂混合物摇匀，在旋转器上慢速旋转15min后，在4000rpm条件下离心5min，离心后点样上机、用质谱仪对样品进行检测。

步骤S4的目的是去除样品中溶解的盐类，防止盐类对质谱系统造成污染、影响信号的生成，从而保证测量结果的可靠性。

本发明的有益效果如下：本发明提供了一种TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法，首先通过第一步PCR反应扩增出含有SNP位点的片段，而非单独扩增SNP位点，以提高样品的可操作性以及后续操作的精度；通过SAP对步骤S1得到的扩增产物进行去磷酸化处理，防止DNA分子5'端与3'端连接，在后续步骤准备好之前让DNA分子保持线性状态，从而保证后续实验的准确度；最后通过步骤S3对rs10069690位点进行单碱基延伸，利用变性-退火内循环使DNA双链充分解螺旋、分离，从而实现不同SNP的精确分型。通过上述方法，可以快速、准确地获得TERT基因的rs10069690位点的SNP分型信息，操作简便、可靠性强，可以为后续的相关研究提供可靠的参考信息。

附图说明

图1为实验例1中不同方法的rs10069690位点SNP分型结果比较；

图2为实验例2中所有样品的rs10069690位点SNP分型示意图；

图3为实验例2中样品rs10069690位点的CT杂合型的质谱图；

图4为实验例2中样品rs10069690位点的TT纯合型的质谱图；

图5为实验例2中样品rs10069690位点的CC纯合型的质谱图。

具体实施方式

实施例

一种TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法，包括如下步骤：

S1：用上游引物rs10069690-F和下游引物rs10069690-R进行第一轮PCR，对模板DNA进行扩增，引物的碱基序列如下：

上游引物rs10069690-F：5`-ACGTTGGATGTCAGTTGCCTGGGCTTA TTG-3`；

下游引物rs10069690-R：5`-ACGTTGGATGCTGAGCACTACCCATGA TAG-3`；

反应体系如下：

反应条件如下：

(1)预变性：95℃2min；

(2)扩增：95℃30s，56℃30s，72℃60s，共45个循环；

(3)延伸：72℃5min，4℃∞；

S2：对所述步骤S1得到的扩增产物进行去磷酸化处理，得到脱磷酸片段，去磷酸化操作使用的SAP混合液体系如下：

	使用浓度	加入量(μL)
			Nanopure Water,Autoclaved	N/A	1.53
SAP Buffer	0.24×	0.17
			SAP Enzyme(1.7U/μL)	0.5U	0.30
总体积[μL]		2/rnx

将上述SAP混合液加入到步骤S1得到的扩增产物中，并按照如下反应条件进行去磷酸化处理：

(1)去磷酸化：37℃40min；

(2)SAP酶灭活：85℃5min，4℃∞；

S3：用延伸引物rs10069690-E对所述脱磷酸片段进行单碱基延伸，对不同SNP进行分型，延伸引物的碱基序列如下：

rs10069690-E：5`-GGAAGGGAGATTTTGACAG-3`；

反应体系如下：

	使用浓度	加入量(μL)
			Nanopure water	N/A	0.619
iPLEX GOLD Buffer	0.222×	0.200
			iPLEX Termination mix	1×	0.200
iPLEX延伸引物	0.11	0.940
			iPLEX Enzyme	1×	0.041
Volume(μL)		2.000
			SAP+PCR reaction		7.000
总体积(μL)		9.000

反应条件如下：

(1)预变性：94℃30s；

(2)扩增内循环：94℃5s，52℃5s，共5个循环；

(3)扩增外循环：94℃5s，52℃5s，80℃5s，共40个循环；

(4)延伸：72℃4min，4℃∞；

S4：对所述步骤S3得到的样品进行脱盐处理，用质谱仪进行检测，具体包括如下步骤：

S4.1：在树脂板上铺好洁净树脂待用，每孔6mg树脂，风干10～20分钟；

S4.2：向样本板的样本空内加入待测样品，每个样本孔再加15～20μL ddH2O，用封口膜密封，进行瞬时离心；

S4.3：打开覆盖所述样本孔的封口膜，将所述样本板倒扣在所述树脂板上固定，将固定好的样本板和树脂板整体翻转，轻敲树脂板，以使树脂板中的树脂完全落入样本板上相应样本孔，用封口膜密封，进行瞬时离心；

S4.4：将样本树脂混合物摇匀，在旋转器上慢速旋转15min后，在4000rpm条件下离心5min，离心后点样上机、用质谱仪对样品进行检测。

对照例

一种TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法，其中单碱基扩增的反应条件如下：

(1)预变性：94℃30s；

(2)扩增内循环：52℃5s，80℃5s，共5个循环；

(3)扩增外循环：94℃5s，52℃5s，80℃5s，共40个循环；

(4)延伸：72℃4min，4℃∞；

其余步骤和反应体系均与实验例相同。

实验例1

以本发明提供的方法作为实验组，以对照例提供的方法作为对照组1，以常规的Taqman方法作为对照组2，分别对15ng的TERT基因rs10069690位点标准品(包括5ng CT杂合、5ng CC纯合以及5ng TT纯合)进行检测，并对各组实验的分型定量结果进行比较。

如图1所示，实验组与对照组1的分型结果均好于对照组2，并且实验组的定量结果高于对照组1、更加接近标准品的含量。表明本发明提供的方法对TERT基因rs10069690位点的SNP分型检测较现有方法更加准确、效果更好，同时说明本方法在单碱基延伸过程中设置的变性-退火内循环，比常规的退火-延伸内循环具有更好的SNP分离和延伸效果。

实验例2

随机选取26名健康的成年(18～60周岁)志愿者，分别采集血样并提取全血基因组，按照实施例中提供的方法对26个样品进行rs10069690位点SNP检测，并对上述多个样品的质谱检测结果进行分析。

实验结果如图2～5所示，共有22个样品得到了可分析的结果，其中15个样品为CT杂合，5个样品为TT纯合，2个样品为CC纯合。表明该SNP位点上C-T的杂合子较多，TT的纯合子以及CC纯合子也有检出。图2中不同基因型的样品点彼此分离、互相无相交，同时图3～5中不同分型的峰型和分离情况良好，表明本发明提供的引物特异性良好、灵敏度高，分型结果准确。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 沃森克里克（北京）生物科技有限公司

<120> 一种TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

acgttggatg tcagttgcct gggcttattg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

acgttggatg ctgagcacta cccatgatag 30

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

ggaagggaga ttttgacag 19

<210> 4

<211> 201

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

ccacccagac ccgggaccta gaacccctcc cagcttcctc agaccctgtt tgaaacgggt 60

tcctggccgc atgtgtgttg cacacgggat cctcatgcca cacctctgtc cacctcaccc 120

cacactctcc tcagatgacg gggtcaccgc agccaccgca gccacagggg tggggtgcag 180

gagccgtggg gcaaggtcca g 201

Claims (9)

1.一种TERT基因的rs10069690位点SNP核酸质谱检测引物组，其特征在于，包括如下引物：

上游引物rs10069690-F：5`-ACGTTGGATGTCAGTTGCCTGGGCTTATTG-3`；

下游引物rs10069690-R：5`-ACGTTGGATGCTGAGCACTACCCATGATAG-3`；

延伸引物rs10069690-E：5`-GGAAGGGAGATTTTGACAG-3`。

2.一种应用权利要求1所述引物组的TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：用上游引物rs10069690-F和下游引物rs10069690-R进行第一轮PCR，对模板DNA进行扩增，得到含有所述rs10069690位点的片段；

S2：对步骤S1得到的片段进行去磷酸化处理，得到脱磷酸片段；

S3：用延伸引物rs10069690-E对所述脱磷酸片段进行单碱基延伸，对SNP碱基序列进行扩增，从而实现不同SNP的分型；

S4：对步骤S3得到的样品进行脱盐处理，用质谱仪进行检测。

3.如权利要求2所述的TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S1中，第一轮PCR的反应体系中包括如下组分：

模板DNA 2ng/μl、rs10069690-F引物0.05μM、rs10069690-R引物0.05μM、Mg²⁺4mM、1×PCR Buffer、dNTP 10μM以及Taq DNA聚合酶1U。

4.如权利要求3所述的TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S1中，第一轮PCR的反应条件如下：

(1)预变性：95℃ 2min；

(2)扩增：95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s，共45个循环；

(3)延伸：72℃ 5min，4℃ ∞。

5.如权利要求2所述的TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S2中，去磷酸化的反应体系在第一轮PCR扩增产物的基础上还包括如下成分：

0.24×SAP Buffer以及SAP酶0.5U。

6.如权利要求5所述的TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S2中，去磷酸化的反应条件如下：

(1)去磷酸化：37℃ 40min；

(2)SAP酶灭活：85℃ 5min，4℃ ∞。

7.如权利要求2所述的TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S3中，单碱基延伸的反应体系在去磷酸化产物的基础上还包括如下成分：

0.222×iPLEX GOLD Buffer、1×iPLEX Termination mix、iPLEX延伸引物混合物0.84～1.57μM以及1×iPLEX Enzyme。

8.如权利要求7所述的TERT基因rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤S3中，单碱基延伸的反应条件如下：

(1)预变性：94℃ 30s；

(2)扩增内循环：94℃ 5s，52℃ 5s，共5个循环；

(3)扩增外循环：94℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s，共40个循环；

(4)延伸：72℃ 4min，4℃ ∞。

9.如权利要求2所述的TERT基因的rs10069690位点SNP核酸质谱检测方法，其特征在于，所述步骤S4包括如下步骤：

S4.1：在树脂板上铺好洁净树脂待用，每孔6mg树脂，风干10～20分钟；

S4.2：向样本板的样本空内加入待测样品，每个样本孔再加15～20μL ddH₂O，用封口膜密封，进行瞬时离心；

S4.3：打开覆盖所述样本孔的封口膜，将所述样本板倒扣在所述树脂板上固定，将固定好的样本板和树脂板整体翻转，轻敲树脂板，以使树脂板中的树脂完全落入样本板上相应样本孔，用封口膜密封，进行瞬时离心；

S4.4：将样本树脂混合物摇匀，在旋转器上慢速旋转15min后，在4000rpm条件下离心5min，离心后点样上机、用质谱仪对样品进行检测。