CN108034599B - 一株源自白酒酿造体系的高效合成γ-氨基丁酸的短乳杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株源自白酒酿造体系的高效合成γ‑氨基丁酸的短乳杆菌，属于食品微生物技术领域。本发明的短乳杆菌菌株D17，分离自传统白酒酿造体系，已于2017年7月6日保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号CGMCCNO.14385。本发明的短乳杆菌D17菌株筛选于白酒酿造体系，可耐受高酸高醇等环境，GAD系统可快速被谷氨酸钠诱导，且菌株的GABA合成与生长耦联，菌体自身可在高浓度的底物和产物中保持活力，因此具有高效合成GABA的能力。利用该菌株，采用控酸补料法分批发酵，GABA累积浓度达132.63g/L，生产效率为3.16g/L/h。本发明中的短乳杆菌D17菌株因具有高效转化谷氨酸钠合成GABA的能力及纯天然菌株的来源属性，可用于高纯度GABA制备、饲料级GABA制备等。

Description

一株源自白酒酿造体系的高效合成γ-氨基丁酸的短乳杆菌

技术领域

本发明涉及一株源自白酒酿造体系的高效合成γ-氨基丁酸的短乳杆菌，属于食品微生物技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是一种非蛋白质氨基酸，参与动物、植物和微生物的多项生理活动。作为一种重要的抑制性神经递质，GABA对哺乳动物学具有安神、降低血压、改善睡眠等多种生理功能，可作为生物活性物质广泛应用于食品、医药和饲料等行业，此外还可作为合成2-吡咯烷酮、尼龙-4等化工产品的前体。因此，GABA具有广阔的市场应用前景。

目前，食品级GABA多通过天然产物提取或微生物合成两种方法获得，其中微生物合成因可以达到较高的产生效率和纯度，具有更广阔的应用前景。微生物发酵法制备GABA主要是依靠微生物的谷氨酸脱羧酶系统(GAD系统)完成的。GAD系统主要由谷氨酸脱羧酶GAD和Glu-GABA反向转运蛋白构成，在酸性条件下，Glu-GABA反向转运蛋白将胞外的谷氨酸转运至胞内，在胞内的谷氨酸脱羧酶(GAD)催化下脱去α-羧基，形成GABA，合成后的GABA再被Glu-GABA反向转运蛋白运输至胞外，该过程消耗H⁺，GABA合成过程中培养体系的pH逐渐升高。

乳酸菌是食品级生产菌株的重要来源，随着人们对食品安全的重视，越来越多的研究者聚焦在利用乳酸菌生产GABA，目前已经发现的可以合成GABA的微生物包括短乳杆菌和植物乳杆菌等。根据已报道的短乳杆菌(14株)基因组分析，13株短乳杆菌具有GAD系统，仅有1株无GAD系统，说明短乳杆菌具有成为GABA生产的细胞工厂的潜能。

目前公认的高产GABA短乳杆菌是L.brevis NCL912，GABA产量可达103g/L，菌株发酵12h菌体浓度达到最大，但随着底物的添加及产物的生成，菌株的生长受到严重抑制，无法实现菌株连续发酵生产，整个发酵周期为48～60h，生产效率不高；短乳杆菌NPS-QW-145发酵72h，GABA产量仅为25.8g/L；短乳杆菌K203发酵72h，GABA产量为44.4g/L，对于GABA产生菌而言，发酵周期越长，菌株的GABA的合成效率较低。因此，若要获得高效合成GABA的菌株，不仅要求菌株的GABA合成能力强，同时发酵周期也要降低。虽然，有些乳酸菌的GABA合成与生长可以耦联，但其GABA合成效率仍然很低。

因此，需要寻找一株能快速诱导GAD系统，产生GABA的乳酸菌，并能长时间在高渗环境中的存活，为其连续发酵合成GABA提供条件，减少发酵时间，使菌株具有高产GABA能力的同时，具有较高的GABA生产效率。(Wu,Q.Shah,N.P.“High gamma-aminobutyric acidproduction from lactic acid bacteria:emphasis on Lactobacillus brevis as afunctional dairy starter”,Critical Review in Food Science and Nutrition,1,1-46,2016.Haixing Li,Yusheng Cao,et al.“Production of gamma-aminobutyric acidby Lactobacillus brevis NCL912 using fed-batch fermentation”Microbial CellFactories,9,1-7,2010.Wu,Q.,Shah,N.P.“Gas release-based prescreening combinedwith reversed-phase HPLC quantitation for efficient selection of high-gamma-aminobutyric acid(GABA)-producing lactic acid bacteria”,Journal of DairyScience,2015,98,790-797.)。

白酒作为中国的传统食品，发酵体系中富含乳酸菌，且乳酸菌菌株可长期存活于白酒酿造体系的高酸(pH为3.5左右)、高酒精度(50-90g/L)的极端环境中，因此，有必要从传统发酵食品(白酒)中筛选具有耐高渗且高效合成GABA的食源性菌株，推进微生物发酵法合成GABA的工业化。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一株具有高效合成GABA能力的短乳杆菌，并将其应用于生物法合成GABA。本发明的短乳杆菌是从白酒酿造体系(酒醅)中分离得到的，进行控酸分批补料发酵42h合成GABA的产量可达132.63g/L，生产效率可达3.16g/L/h。

本发明的第一个目的是提供一株具有高效合成GABA能力的短乳杆菌D17，已于2017年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.14385。

所述短乳杆菌，是利用乳酸菌富集培养基(MRS培养基)，从白酒酿造体系(酒醅)中分离得到的，经16s rDNA测序鉴定为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，菌株编号D17。

本发明的第二个目的是提供含有所述短乳杆菌CGMCC NO.14385菌株的微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂含有短乳杆菌CGMCC NO.14385菌体的活细胞、冷冻干燥得到的短乳杆菌CGMCC NO.14385干菌体、固定化的短乳杆菌CGMCCNO.14385细胞、短乳杆菌CGMCC NO.14385的液体菌剂、短乳杆菌CGMCC NO.14385的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的短乳杆菌CGMCC NO.14385菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任何可以应用于食品、饲料、药物或者其制备的任意种属的菌株，比如地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等等。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任意能用于食品、饲料、药物的载体。

本发明的第三个目的是提供一种生物法合成GABA的方法，是利用本发明的短乳酸菌CGMCC NO.14385菌株进行生产。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以葡萄糖、蔗糖、乳糖或阿拉伯糖为生长碳源，以谷氨酸或谷氨酸钠为前体合成γ-氨基丁酸。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是利用短乳杆菌CGMCC NO.14385菌株进行批次发酵，发酵过程不需要进行酸碱度调节及厌氧控制。在本发明的一种实施方式中，具体是：将短乳杆菌CGMCC NO.14385接种于不同浓度葡萄糖碳源的GYP液体发酵培养基中，添加不高于50g/L的谷氨酸或谷氨酸钠作为GABA合成的底物，其中葡萄糖浓度为10～50g/L，于适合短乳杆菌的培养条件下进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括在发酵过程中对发酵体系酸碱度进行控制。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是利用短乳杆菌CGMCC NO.14385菌株进行批次补料发酵，发酵过程进行酸碱度调节，不需要进行厌氧控制。在本发明的一种实施方式中，具体是：采用生物反应器，将短乳杆菌CGMCC NO.14385接种于含谷氨酸钠的GYP发酵培养基中，采用5mol/L浓度的硫酸将发酵液的pH控制为5.0，于37℃×100rpm搅拌不通气条件下进行发酵。为避免高浓度谷氨酸钠对菌体生长的抑制，于12～24h间补充谷氨酸钠底物及葡萄糖碳源。优选地，在6h、12h、18h和24h进行谷氨酸钠底物及葡萄糖添加，GABA在发酵42h的浓度为132.63g/L，此时生产效率高达3.16g/L/h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括，先培养菌体，利用菌体作为全细胞催化剂，在合适的酸碱度转化液中，以谷氨酸或谷氨酸钠作为底物，进行全细胞催化合成γ-氨基丁酸。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是先培养获得短乳杆菌CGMCC NO.14385细胞，再利用全细胞转化法。在本发明的一种实施方式中，具体是：挑取短乳杆菌CGMCCNO.14385接于GYP含10g/L的谷氨酸钠的GYP液体发酵培养基中，37℃×200rpm培养12h，收集菌体。取湿菌体，放入30～50g/L谷氨酸钠的0.2mol/LpH4.6的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液中，于30℃×200rpm条件下反应1.5～5h。优选地，转化反应体系为40mL，初始谷氨酸钠浓度30g/L，加入1g湿菌体，转化得GABA 14.5g/L，转化效率为9.7g/L/h/g湿菌。

本发明的第四个目的是提供一种含GABA干菌粉的制备方法，包括利用本发明的短乳酸菌CGMCC NO.14385菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括：取出短乳杆菌菌株CGMCC NO.14385发酵结束后的发酵液(GABA含量不低于20～25g/L)，采用60～65℃浓缩1～3h，总固形物含量达到30～40％后，经喷雾干燥，即得所述含有GABA的干菌粉。喷雾干燥条件为：进料温度30～40℃，进口温度140～150℃，出口温度50～60℃，进口气压0.25～0.3MPa，离心转盘转速19000～20000r/min，干燥时间为5～15s。获得产品出料水分含量≤7％，冷却后密封。

本发明还提供所述短乳杆菌CGMCC NO.14385在食品、制备药物或者畜禽养殖领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明的短乳杆菌CGMCC NO.14385筛选自清香型白酒酿造体系的酒醅中，具有耐受清香型白酒制备过程中的高酸(pH为3.5左右)、高酒精度(50-90g/L)的酿造环境的特性，可在极端环境中长期保持生长，制备的高活力菌剂可应用于食品、医药、禽畜养殖等行业；菌株的GAD系统能快速受到谷氨酸钠诱导，菌株的GABA合成与菌体生长同步进行，并在高浓度底物、产物及硫酸的环境中保持活力，为连续培养菌株产生GABA提供依据，可提高GABA产量的同时缩短发酵周期，进一步提升菌株的GABA的生产效率。

生物材料保藏

短乳杆菌D17，分类学命名为短乳杆菌Lactobacillus brevis，于2017年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14385。

附图说明

图1短乳杆菌D17的菌落形态特征图；

图2短乳杆菌D17的菌体形态特征图；

图3谷氨酸钠标准品和GABA标准品高效液相色谱检测图；

图4筛选菌株发酵液GABA高效液相色谱检测图；

图5短乳杆菌D17菌株GABA合成与生长耦联；

图6短乳杆菌D17分批补料发酵高效合成GABA的菌株生长、底物利用和GABA产生曲线。

具体实施方式

实施例1：短乳杆菌的筛选

称取5g清香型白酒酒醅原料，加入50mL无菌生理盐水进行震荡。吸取菌悬液，以无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，取100-200μL涂布于含CaCO₃和谷氨酸钠的MC培养基(胰蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，酵母提取物0.5％，葡萄糖2％，乳糖2％，碳酸钙1％，谷氨酸钠1％，琼脂2％，均为质量-体积分数，pH6.8)或MRS培养基(Sigma-Aldrich购买)平板上，于37℃厌氧培养48h，当出现乳白色或浅黄色菌落，且其周围出现水解圈者初步判定为乳酸菌。挑取单菌落，进行分离、纯化后，接种入分装有MRS液体培养基的试管中，过夜培养后接种于含有谷氨酸钠的GYP液体发酵培养基中，以HPLC法检测发酵上清液中的GABA含量，对获得的GABA产生菌株进行保菌。结果证明，从白酒酿造体系中筛选出65株乳酸菌，发酵48h后，测定发酵液中的GABA浓度，其中9株乳酸菌GABA产量大于5g/L的菌株。将GABA菌株接种于GYP液体发酵培养基中，每2h取样，采用HPLC分析发酵上清中的GABA与谷氨酸钠底物含量，筛选出发酵时间短，可高效合成GABA的乳酸菌，筛选获得编号为D17的短乳杆菌菌株，发酵培养基中起始谷氨酸钠浓度10g/L，发酵12h，可得到6.5g/L GABA，生产效率为0.542g/L/h。

得到的短乳杆菌D17，其菌落形态和菌体形态如图1、图2所示。短乳杆菌D17已于2017年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.14385。

实施例2：利用短乳杆菌D17菌株进行不控酸合成GABA

GYP培养基：葡萄糖1％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，乙酸钠0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.01％，硫酸亚铁0.01％，氯化钠0.01％，均为质量-体积分数。固体培养基中添加2％浓度的琼脂，发酵培养基中添加不同浓度谷氨酸钠。

短乳杆菌为氧气耐受型乳酸菌，其在好养条件下的生长优于厌氧培养，因此推荐在好养条件下培养短乳杆菌D17菌株。

在无菌条件下，将-80℃保存的短乳杆菌D17菌株，划线于GYP固体平板上，37℃静置培养，待单菌落长出后从活化的GYP固体平板上挑取短乳杆菌D17单菌落，接种于GYP种子培养基中，37℃静置培养24h。取种子培养液，按10％的接种量接种于新的GYP种子培养基中，37℃静置培养12h后，培养液作为发酵种子。在250mL三角瓶中装入100mL的添加10～50g/L葡萄糖碳源和50g/L谷氨酸钠的GYP发酵培养基，取培养12h的发酵种子按10％的接种量接种，于37℃×200rpm培养48h。发酵上清液经高效液相色谱检测GABA含量。

实验结果如图5所示，短乳杆菌D17的GABA合成与生长耦联。采用30g/L葡萄糖作为碳源，短乳杆菌合成GABA产量为27.6g/L，生产效率为0.863g/L/h。

实施例3：利用短乳杆菌D17菌株进行控酸分批补料发酵合成GABA

将斜面上活化的菌株D17，接种于GYP液体培养基中，37℃培养24h，制成一级种子培养液，将一级种子培养液按10％接种量，接于pH为5含74.8g/L谷氨酸钠的GYP发酵培养基中，使用生物反应器控制温度37℃，200rpm搅拌，以5mol/L硫酸控制pH为5.0，在6h、12h、18h、24h时各补料(谷氨酸钠)37.3g、74.8g、37.3g、37.3g；同时在12h、18h、24h时各补加碳源(葡萄糖)5g、7.5g、15g，发酵48h。采用HPLC分析检测发酵上清液的GABA含量。

结果如图6所示，短乳杆菌D17菌株的GABA合成与生长耦联，在整个发酵过程中，菌株始终具有活力，菌体浓度逐步增加，说明菌株可在高浓度的底物、产物及酸性环境中保持高效合成GABA的能力，在发酵42h时GABA的的浓度为132.63g/L，生产效率高达3.16g/L/h。

实施例4：短乳杆菌D17菌株采用先培菌再全细胞转化法合成GABA

从活化的GYP固体斜面培养基上挑取短乳杆菌D17单菌落，接种于GYP液体培养基中，37℃静置培养24h，制成一级种子液，将一级种子液按10％的接种量接种于新鲜的GYP液体培养基中，37℃静置培养12h后，制成发酵种子。1L的摇瓶中装入500mL含1％谷氨酸钠的GYP液体培养基，取培养12h的发酵种子，按10％的接种量接种，37℃×200rpm，培养12h。取出发酵液，于4℃×6000rpm离心10min，收集菌体。将1g湿菌体重悬于含有30g/L谷氨酸钠的0.2M pH4.6的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液40mL，于30℃×200rpm条件下反应1.5h。最终转化液中的GABA含量为14.448g/L，生产效率为9.7g/L/h/g湿菌体。

实施例5：利用短乳杆菌D17制备含GABA的干菌粉

对短乳杆菌D17发酵结束后的发酵液进行浓缩，浓缩条件为60℃，1.5h，浓缩液进行喷雾干燥加工，进料浓度为40％，进料温度35℃，进口温度140℃，出口温度55℃，进口气压0.3MPa，离心转盘转速保藏20000r/min。

干燥后含GABA的干菌粉收率为：15％，水分含量5％。活菌数达6.0×10⁹cfu/g，GABA含量≥20％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株合成γ-氨基丁酸的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，于2017年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14385。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有短乳杆菌CGMCC NO.14385菌体的活细胞、冷冻干燥得到的短乳杆菌CGMCC NO.14385干菌体、固定化的短乳杆菌CGMCCNO.14385细胞、短乳杆菌CGMCC NO.14385的液体菌剂、短乳杆菌CGMCC NO.14385的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的短乳杆菌CGMCC NO.14385菌株。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中还含有任何能够应用于食品、饲料、药物或者其制备的任意种属的菌。

4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中还含有任意能用于食品、饲料或药物的载体。

5.一种制备γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1所述的短乳杆菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法是以葡萄糖、蔗糖、乳糖或阿拉伯糖为生长碳源，以谷氨酸或谷氨酸钠为前体合成γ-氨基丁酸。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括在发酵过程中对发酵体系酸碱度进行控制。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括，先培养菌体，利用菌体作为全细胞催化剂，在合适的酸碱度转化液中，以谷氨酸或谷氨酸钠作为底物，进行全细胞催化合成γ-氨基丁酸。

9.一种含有权利要求1菌株的菌剂的应用，其特征在于，所述应用包括将短乳杆菌CGMCC NO.14385的干粉加入饲料中。

10.权利要求1所述短乳杆菌在食品、制备药物或者畜禽养殖领域的应用。