CN108025050B - 昆虫叮咬高敏症的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预防或治疗马科哺乳动物，优选马的昆虫叮咬高敏症的组合物、免疫原性或疫苗组合物和药物组合物。此外，本发明提供预防或治疗马科哺乳动物，优选马的昆虫叮咬高敏症的方法。

Description

昆虫叮咬高敏症的治疗

技术领域

本发明涉及用于预防或治疗马科哺乳动物，优选马的昆虫叮咬高敏症的组合物、免疫原性或疫苗组合物和药物组合物。此外，本发明提供预防或治疗马科哺乳动物，优选马的昆虫叮咬高敏症的方法。

背景技术

昆虫叮咬高敏症(IBH)也称为“甜痒”或“夏季湿疹”，是马科哺乳动物，尤其是马中最常见的过敏性皮肤病，并且表现为由在世界各地发现的库蠓 (Culicoides)属昆虫叮咬引起的慢性复发性季节性过敏性皮炎。各种研究表明IBH与针对来自库蠓的唾液腺蛋白的IgE介导的反应有关。此外，最近的研究表明，IBH的特征在于辅助性T细胞2(Th2)和调节性T细胞(T_reg) 免疫应答之间的不平衡(Schaffartzik A.等,Vet Immunol Immunopathol,2012, 147:113–126)。在过去的十年中，一些研究已经证明，库蠓的唾液腺蛋白被 IBH感染的马的IgE识别(Hellberg,W.等,2006,Vet Immunol Immunopathol 113:99-112)。迄今为止，已经鉴定了超过700个库蠓物种，其中130个是吸血物种(Van Grevenhof,E.M.等,2007,Equine Vet J 36:69-73)。

在世界范围内，大约5-10％的马受到IBH的感染(Bjornsdottir,S.等,2006, ActaVet.Scand.48:3)。英国的患病率约为3％，德国约为38％，澳大利亚昆士兰州约为60％(Anderson,G.S.等,1996,J.Med.Entomol.33:458–466； Littlewood,J.D.等,1998,Vet.Rec.142,66–67；以及其中引用的参考文献)。原则上，所有品种都可能受到感染，但是疾病已被描述为针对季马、纯种马、阿拉伯马、暖血马、草马、弗里斯马、夏尔马、不同的小马品种和冰岛马(Van Grevenhof,E.M.等,2007,Equine Vet J 36:69-73和其中引用的参考文献)。

IBH的临床迹象来源于对吸血昆虫叮咬的过敏反应所引起的剧烈瘙痒症。这种疾病最初的特点在于刮擦和摩擦后众多的丘疹、簇毛、感觉过敏和皮肤过敏。这种自我创伤导致局部脱发和排斥，导致继发性感染的持续存在。如果疾病进展并变成慢性，则可能导致纤维化、表皮组织肥大、以及明显的角化过度和苔癣化，并且在皮肤增厚、结垢、横向脊和皱褶的形成中可见 (Schaffartzik A.等,Vet Immunol Immunopathol,2012,147:113–126)。此外，在受感染的动物皮肤中存在的库蠓抗原诱导炎性细胞浸润，在T细胞募集后具有早期嗜酸性粒细胞聚集。在IBH损伤中的T细胞细胞因子概况尚未被广泛研究，尽管在已确定的损伤中已经报道了急性损伤中增加的白细胞介素IL-4、 IL-5和IL-13mRNA表达以及增加的趋化因子CCL11(eotaxin，即，嗜酸性粒细胞趋化因子)和CCL2mRNA表达(Cunningham,F.M.等.2008,Vet.J. 177:334-344；Benarafa,C.等,2002,Vet Rec 151:691–693)。

由于昆虫优选的吸食部位，损伤大部分位于背部中线、鬃毛和尾巴的基部、和/或沿着腹中线、偶尔在耳朵处。IBH感染的马表现出季节性表现，迹象的严重性随着时间逐渐发展。临床迹象出现在从春季到秋季的温暖月份，即当库蠓活跃时，在冬季没有暴露期间退化，但在严重的慢性病例中，临床迹象在冬季期间也可能持续应答(Schaffartzik A.等,Vet Immunol Immunopathol,2012,147:113–126)。

在过去，已经描述了不同的IBH治疗方法，但目前唯一安全有效的方法是避免库蠓过敏原。试图通过用代表IBH最常见治疗的毛毯的机械保护来实现避免或降低的过敏原暴露(Olsen,L.等,2010,Vet.J.187:347–351)。除毛毯外，从中午到中上午，将马保存具有防虫环境的马厩中，或者将其转移到可以较大减少库蠓出现的其它地方。

昆虫驱避剂也被用来使吸血昆虫远离马。而且，糖皮质激素还被用于IBH 的对症治疗(Petersen,A.等,2009,Vet.Dermatol.20:615–622)。严重受感染的马，特别是有明显瘙痒症状的那些可能需要使用全身性类固醇进行抗炎治疗。糖皮质激素在长期治疗中的缺点是毒副作用，例如免疫抑制、肌肉萎缩、骨质疏松和蹄叶炎(Cunningham,F.M.等.2008,Vet.J.177:334-344)。

过敏原特异性免疫治疗(SIT)通常是皮下注射过敏原提取物，可有效用于人和小动物皮肤科，赋予长期益处。描述SIT在马上的实验应用的报告并不多。但是，已经报道了对具有库蠓全身提取物(WBE)的SIT的功效的有争议结果。在免疫疗法试验中，IBH感染的马被皮下注射WBE。在第一年每周注射期间，90％的IBH感染马减少临床迹象(Anderson等,1996)。两年的免疫治疗后，37.5％的这些马完全没有临床迹象，而62.5％的临床迹象明显减轻(Anderson等,1996)。相反，一项随机、双盲、安慰剂对照的临床研究显示，在进行6个月期间的SIT后，IBH感染的马的健康状况没有任何改善 (Barbet等,1990)。总之，与人过敏症相反，马的SIT尚未建立，其它长期治疗方法也不存在。

因此，目前还没有令人满意的IBH治疗(Cunningham,F.M.等.2008,Vet. J.177:334-344；Schaffartzik A.等,Vet Immunol Immunopathol,2012, 147:113–126)。

发明内容

现在我们惊奇地发现，本发明的组合物对于预防和治疗马科哺乳动物，特别是马中的昆虫叮咬高敏症(IBH)是有效的。因此，我们发现将本发明的组合物施用于马可以有效地降低IBH疾病的参数和症状。具体而言，我们已经表明，将本发明的组合物施用于马不仅导致自身抗体的诱导和马血液和皮肤中嗜酸性粒细胞水平的降低，而且所述嗜酸性粒细胞水平的降低与 IBH疾病症状的降低相关。此外，我们已经表明，将本发明的组合物施用于马可以有效降低IBH感染的马的皮肤损伤的严重性等级。

因此，第一方面，本发明提供一种组合物，其包含：(a)具有至少一个第一附接位点的核心颗粒；(b)具有至少一个第二附接位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是(i)马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述 eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ IDNO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；或(ii)马嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)抗原(eEotaxin抗原)，其中所述eEotaxin抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:6的氨基酸序列的蛋白质，具有与SEQ ID NO:6有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；(iii)马白细胞介素-31抗原 (eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:12 的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:12有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；

其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附接位点和所述至少一个第二附接位点经由至少一个非肽共价键连接。

在一个优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原 (eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5的氨基酸序列的蛋白质。

在另一个优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)抗原(eEotaxin抗原)，其中所述eEotaxin抗原包含或优选是具有选自SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10的氨基酸序列的蛋白质。

在另一个优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-31抗原 (eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:12、 SEQ ID NO:14的氨基酸序列的蛋白质。

在另一个优选的实施方式中，所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP，并且所述VLP包含RNA噬菌体Qβ的重组外壳蛋白、基本上由上述组成或由上述组成，并且其中所述重组外壳蛋白包含SEQ ID NO:31或优选由其组成。

在进一步优选的实施方式中，所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的VLP，其中所述CMV的经修饰的VLP包含至少一种经修饰的CMV 多肽、基本上由上述组成或由上述组成，其中所述经修饰的CMV多肽包含以下或优选由以下组成：(a)CMV多肽，和(b)辅助性T细胞表位；并且其中所述CMV多肽包含以下或优选由以下组成：(i)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待突变的氨基酸序列是CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV的外壳蛋白显示出至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性。优选地，所述辅助性T细胞表位置换所述CMV多肽的N-末端区域，并且其中所述CMV多肽的所述N-末端区域对应于SEQ ID NO:15的氨基酸2-12。优选的Th细胞表位是PADRE序列，并且其中所述 Th细胞表位包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列或优选由其组成；或其中所述 Th细胞表位来源于破伤风毒素，并且其中所述Th细胞表位具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列或优选由其组成。因此，在非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的氨基酸序列，或优选由上述组成。

另一方面，本发明提供包含有效量的本发明的免疫原性或疫苗组合物，任选地所述免疫原性或疫苗组合物还包含佐剂。

另一方面，本发明提供药物组合物，其包含：(a)本发明的组合物或本发明的免疫原性或疫苗组合物；和(b)药学上可接受的载体。

另一方面，本发明提供免疫方法，其中所述方法包括将本发明的组合物、本发明的免疫原性或疫苗组合物或本发明的药物组合物施用于马科哺乳动物，优选施用于马。

另一方面，本发明提供本发明的组合物、本发明的免疫原性或疫苗组合物或本发明的药物组合物作为药物的用途。

另一方面，本发明提供本发明的组合物、本发明的免疫原性或疫苗组合物或本发明的药物组合物在预防或治疗马科哺乳动物，优选马的昆虫叮咬高敏症的方法中的用途，其中将有效量的所述本发明的组合物、所述本发明的免疫原性或疫苗组合物或所述本发明的药物组合物施用于所述马科哺乳动物，优选施用于所述马。优选地，与在所述施用之前的至少一种IBH参数或症状相比，所述本发明的组合物、所述本发明的免疫原性或疫苗组合物或所述本发明的药物组合物的所述施用降低所述至少一种IBH参数或症状，并且其中优选所述至少一种IBH参数或症状是皮肤损伤的水平或严重性等级，并且其中进一步优选所述皮肤损伤的水平或严重性等级的所述降低通过症状损伤评分测试来确定，通常且优选地如实施例13中所述。

另一方面，本发明提供预防或治疗昆虫叮咬高敏症的方法，其中所述方法包括将有效量的所述本发明的组合物、所述本发明的免疫原性或疫苗组合物或所述本发明的药物组合物施用于马科哺乳动物，优选施用于马。

另一方面，本发明提供所述本发明的组合物、所述本发明的免疫原性或疫苗组合物、或所述本发明的药物组合物在制造用于预防或治疗昆虫叮咬高敏症的药物中的用途，其中通常且优选地将有效量的所述本发明的组合物、所述本发明的免疫原性或疫苗组合物或所述本发明的药物组合物施用于马科哺乳动物，优选施用于马。

另一方面，本发明提供包含有效量的第一组合物和有效量的第二组合物的免疫原性或疫苗组合物，其中所述第一组合物包含(a)具有至少一个第一附接位点的第一核心颗粒；(b)具有至少一个第二附接位点的至少一种第一抗原，其中所述至少一种第一抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中所述第二组合物包含(c)具有至少一个第一附接位点的第二核心颗粒；(d)具有至少一个第二附接位点的至少一种第二抗原，其中所述至少一种第二抗原是马嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)抗原(eEotaxin抗原)，其中所述eEotaxin 抗原包含或优选是具有选自SEQ IDNO:6的氨基酸序列的蛋白质，具有与 SEQ ID NO:6有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(a)和(b) 通过所述至少一个第一附接位点和所述至少一个第二附接位点经由至少一个非肽共价键连接，并且其中(c)和(d)通过所述至少一个第一附接位点和所述至少一个第二附接位点经由至少一个非肽共价键连接；并且其中任选地所述免疫原性或疫苗组合物还包含佐剂。

附图说明

图1：用NiNTA纯化eIL-5-C-His的SDS-PAGE分析。将包涵体制备和纯化的各个阶段的样品应用于4-12％Bis-Tris凝胶(NuPAGE,Novex, Invitrogen Life Technologies)并在还原条件下运行。蛋白质用考马斯蓝染色。泳道M，大小标记(参见Blue,pre-stained,NuPAGE,Novex,Invitrogen Life Technologies)，泳道1，裂解液(样品A)，泳道2，可溶部分(样品B)，泳道3，溶解的包涵体(样品C)，泳道4，流经液(未结合物质，样品D)，泳道5，来自Ni-NTA柱的混合eIL-5单体(eIL-5，m)洗脱液(样品E)。

图2：SDS-PAGE重折叠的重组eIL-5-C-His。如上所述将蛋白质重折叠并浓缩。等分试样在4-12％Bis-Tris凝胶(NuPAGE,Novex,Invitrogen Life Technologies)上分离并在天然条件(+SDS，无DTT，不加热)下运行。蛋白质用考马斯蓝染色：eIL-5单体(eIL-5，m)，eIL-5二聚体(eIL-5，d)。泳道M，大小标记(参见Blue,pre-stained,NuPAGE,Novex,Invitrogen Life Technologies)，泳道1，来自Ni-NTA柱的混合变性洗脱液，泳道2，重折叠和同型二聚体富集的eIL-5-C-His。

图3A：重折叠的重组eIL-5-C-His的正确结构。与PBS缓冲液(虚线) 相比，重折叠和同型二聚体富集的eIL-5-C-His的圆二色性(CD)光谱。 IL-5-C-His的二级结构反映了由远UV(紫外)CD光谱测量的α-螺旋和β-薄片。

图3B：重折叠的重组体eIL-5-C-His的正确结构。同型二聚体富集的 eIL-5-C-His可以通过市售的抗eIL-5抗体检测。将涂布有抗His抗体的ELISA 平板与重组表达和重折叠的同型二聚体富集的eIL-5一起温育，并通过市售的抗马IL-5抗体(R&D Systems,UK)进行检测。

图4：SDS-PAGE重折叠的重组eEototin-C-His。

将包涵体制备和纯化的各个阶段的样品应用于4-12％Bis-Tris凝胶 (NuPAGE,Novex,Invitrogen Life Technologies)并在还原条件下运行。蛋白质用考马斯蓝染色。泳道M，大小标记(参见Blue,pre-stained,NuPAGE,Novex, Invitrogen LifeTechnologies)，泳道1，裂解液(样品A)，泳道2，可溶部分 (样品B)，泳道3，流经液(未结合的材料，样品D)，泳道4，来自Ni-NTA 柱的混合洗脱液(样品E)。

图5：重折叠的重组eEotaxin-C-His的正确结构。eEotaxin-C-His可以通过市售的抗eEotaxin抗体来检测。将涂布有抗His抗体的ELISA板与重组表达和重折叠的eEotaxin-C-His一起温育，并通过市售的可识别马嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)的抗嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)抗体检测。

图6：SDS-PAGE重折叠的重组eIL-31-C-His。

将包涵体制备和纯化的各个阶段的样品应用于4-12％Bis-Tris凝胶 (NuPAGE,Novex,Invitrogen Life Technologies)并在还原条件下运行。蛋白质用考马斯蓝染色。泳道M，大小标记(参见Blue,pre-stained,NuPAGE,Novex, Invitrogen LifeTechnologies)，泳道1，裂解液(样品A)，泳道2，可溶部分 (样品B)，泳道3，溶解的包涵体(样品C)，泳道4，来自Ni-NTA柱的eIL-31 单体(eIL-31，m)洗脱液(样品E)。

图7：重折叠的重组eIL-31-C-His的正确结构。

如上所述将蛋白质重折叠并浓缩。等分试样在4-12％Bis-Tris凝胶 (NuPAGE,Novex,Invitrogen Life Technologies)上分离并在天然条件(+SDS，无DTT，不加热)下运行。蛋白质用考马斯蓝染色。泳道M，大小标记(参见Blue,pre-stained,NuPAGE,Novex,Invitrogen Life Technologies)，泳道1，来自Ni-NTA柱的混合洗脱液，泳道2，重折叠的eIL-31-C-His。

图8：重组重折叠的马eIL-31-C-His的生物学活性。注射部位瘙痒的次数。条1，eIL-5-C-His对照，条2，eIL-31-C-His。

图9：pET-CMVwt质粒图谱。表示所有相关基因和限制酶位点的相对位置。

图10A：纯化的CMVwt VLP的动态光散射。通过使用Zetasizer Nano ZS (MalvernInstruments Ltd.,United Kingdom)检测颗粒的大小。

图10B：纯化的CMVwt VLP的电子显微镜分析。对于VLP的形态学分析，使用JEM-1230电子显微镜(Jeol Ltd.,Tokyo,Japan)。

图11：纯化的CMV衍生的VLP的质谱分析。基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)-TOFMS分析在Autoflex MS(Bruker Daltonik,Germany)上进行。蛋白质分子量(MM)校准标准II(22.3-66.5kDa；Bruker Daltonik)用于质量测定。

图11A：CMV野生型(“wt”)；理论MM＝24069；发现MM＝24058

图11B：CMV-Npadr；理论MM＝24161(没有第一Met)；发现MM＝24160

图11C：CMV-Ntt830；理论MM＝24483(没有第一Met)；发现MM＝24477

图12A：纯化的CMV-Ntt830VLP的动态光散射。通过使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd.,United Kingdom)检测颗粒的大小。

图12B：纯化的CMV-Ntt830VLP的电子显微镜分析。对于VLP的形态学分析，使用JEM-1230电子显微镜(Jeol Ltd.,Tokyo,Japan)。

图13A：纯化的CMV-Npadr VLP的动态光散射。通过使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd.,United Kingdom)检测颗粒的大小。

图13B：纯化的CMV-Npadr VLP的电子显微镜分析。对于VLP的形态学分析，使用JEM-1230电子显微镜(Jeol Ltd.,Tokyo,Japan)。

图14A：eIL-5-C-His-Qβ的偶联反应分析。通过SDS-PAGE。将蛋白质用考马斯蓝染色：eIL-5单体(eIL-5，m)，eIL-5二聚体(eIL-5，d)，Qβ单体(Qβ，m)偶联(c)。泳道M，大小标记(参见Blue,pre-stained,NuPAGE, Novex,Invitrogen Life Technologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的Qβ-VLP，泳道2，TCEP活化的eIL-5-C-His，泳道3，eIL-5-C-His-Qβ偶合反应。

图14B：eIL-5-C-His-Qβ的偶联反应分析。通过Western-blot。用α-His 抗体染色：eIL-5单体(eIL-5，m)，eIL-5二聚体(eIL-5，d)，偶联(c)。泳道M，大小标记(参见Blue,pre-stained,NuPAGE,Novex,Invitrogen Life Technologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的Qβ-VLP，泳道2， TCEP活化的eIL-5-C-His，泳道3，eIL-5-C-His-Qβ偶合反应。

图15A：eIL-5-C-His与VLP CMV-Npadr和CMVtt830的偶联反应分析。通过SDS-PAGE。蛋白质用考马斯蓝染色：eIL-5单体(eIL-5，m)，eIL-5二聚体(eIL-5，d)，VLP(VLP，m)，偶联(c)。泳道M，大小标记(参见 Blue,pre-stained,NuPAGE,Novex,Invitrogen LifeTechnologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的CMV-Npadr-VLP，泳道2，TCEP活化的eIL-5-C-His，泳道3，eIL-5-C-His-CMV Npadr偶联反应，泳道4，用化学交联剂SMPH衍生后的CMVtt830-VLP，泳道5，TCEP活化的eIL-5-C-His，泳道6，eIL-5-C His-CMVtt830偶联反应。

图15B：eIL-5-C-His与VLP CMV-Npadr和CMVtt830的偶联反应分析。通过Western-blot。用α-His抗体染色：eIL-5单体(eIL-5，m)，eIL-5二聚体 (eIL-5，d)，偶联(c)。泳道M，大小标记(参见Blue,pre-stained,NuPAGE, Novex,Invitrogen Life Technologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的CMV-Npadr-VLP，泳道2，TCEP活化的eIL-5-C-His，泳道3， eIL-5-C-His-CMV Npadr偶联反应，泳道4，用化学交联剂SMPH衍生后的 CMVtt830-VLP，泳道5，TCEP活化的eIL-5-C-His，泳道6，eIL-5-C His-CMVtt830偶联反应。

图16A：小鼠中抗体滴度的ELISA。来自小鼠的血清。从用eIL5-C-His-Qβ疫苗接种的小鼠收集免疫前的血清(虚线)和第21天的血清，并通过ELISA 分析针对eIL-5-C-His的抗体。

图16B：马中抗体滴度的ELISA。来自马的血清。从用eIL5-C-His-Qβ免疫的5只马收集免疫前的和第56天的血清，并通过ELISA分析针对 eIL-5-C-His的抗体。数据显示了第56天的血清被免疫前的值减去。

图16C：马中抗体滴度的ELISA。来自马的血清。从单只马收集在免疫前的和eIL-5-C-His-CMV-Ntt830疫苗接种第1次、第2次和第3次后的血清，分析血清中针对eIL-5的抗体。该马已在第0、21和42天免疫。数据显示了第14、35和56天的血清被免疫前的值减去。

图16D：马中抗体滴度的ELISA。来自马的血清。从单只马收集在免疫前的和eIL-5-C-His-CMV-Ntt830疫苗接种第1次、第2次和第3次后的血清，分析血清中针对CMV-Ntt830的抗体。数据显示了第16、51和67天的血清被免疫前的值减去。

图16E：马中抗体滴度的ELISA。来自马的血清。从4只马收集在免疫前的和eIL-5-C-His-CMV-Ntt830疫苗接种第3次(第84天)后的血清，分析血清中针对eIL-5的抗体。数据显示了第84天的血清被免疫前的值减去。

图17A：疾病症状与血液中嗜酸性粒细胞水平的相关性。在血液中测量 12只甜痒感染的马的嗜酸性粒细胞水平，并针对季节期间的IBH损伤的疾病症状评分进行印迹。相关精度由R²＝0.9227，p<0.0001，n＝12表示。

图17B：疾病症状与血液中嗜酸性粒细胞水平的相关性。在血液中测量 48只甜痒感染的马的嗜酸性粒细胞水平，并针对季节期间的IBH损伤的疾病症状评分进行印迹。相关精度由R²＝0.3115，p<0.0001，n＝48表示。

图18A：通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH疾病参数。抗体滴度的时间过程。已经在注射后几个时间点(通过箭头表示)收集血液样品，分析血清中的抗eIL-5IgG自身抗体。

图18B：通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH疾病参数。血液中嗜酸性粒细胞水平的时间过程。已经在注射后几个时间点(通过箭头表示)收集血液样品，分析EDTA-血液样品。

图18C：通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH疾病参数。疾病损伤时间过程。记录尾部和鬃毛上损伤的严重性等级。

图18D：通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH疾病参数。抗体滴度与嗜酸性粒细胞水平的相关性。IgG抗eIL-5抗体应答与嗜酸性粒细胞水平相关。

图18E：通过eIL-5-C-His-CMVtt830有效降低IBH疾病参数。抗体滴度的时间过程。已经分析了血液样品的抗eIL-5(黑线)和抗CMVtt830IgG抗体(灰线)。已在注射后的几个时间点(用箭头表示，第0、33、53天)收集血液样品，并分析血清(第0、16、51和67天)中的抗eIL-5IgG自身抗体和抗CMVtt830抗体。

图18F：通过eIL-5-C-His-CMVtt830有效降低IBH疾病参数。血液中嗜酸性粒细胞水平的时间过程(黑线)和总损伤严重性(灰线)。已收集血液样本并分析EDTA血液样本。第0、33、53天的注射用箭头表示。

图18G：在双盲安慰剂对照随机研究中通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH 疾病参数。抗体滴度的时间过程。已在注射后的几个时间点收集血液样品(疫苗注射用箭头表示)，并分析血清中的抗QβIgG抗体。来自疫苗接种马(黑线)和安慰剂马(灰线)的血清的数据时间点1为01.01.2015，时间点2为 20.03.2015，时间点3为03.04.2015，时间点4为30.04.2015，时间点5为 28.05.2015，时间点6为25.06.2015，时间点7为30.07.2015，时间点8为 27.08.2015，时间点9为是30.09.2015。

图18H：在双盲安慰剂对照随机研究中通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH 疾病参数。抗体滴度的时间过程。已在注射后几个时间点收集血液样品(疫苗注射用箭头表示)，并分析血清中的抗eIL-5IgG自身抗体。来自疫苗接种马(黑线)和安慰剂马(灰线)的血清的数据时间点1为01.01.2015，时间点2为20.03.2015，时间点3为03.04.2015，时间点4为30.04.2015，时间点 5为28.05.2015，时间点6为25.06.2015，时间点7为30.07.2015，时间点8 为27.08.2015，时间点9为是30.09.2015。

图18I：在双盲安慰剂对照随机研究中通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH 疾病参数。活性马(1，黑条)与安慰剂马(2，灰条)在治疗前的时期(时期2014)中的平均损伤严重性。

图18J：在双盲安慰剂对照随机研究中通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH 疾病参数。活性马(1，黑条)与安慰剂马(2，灰条)在治疗时的时期(时期2015)中的平均损伤严重性。

图18K：在双盲安慰剂对照随机研究中通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH 疾病参数。接受eIL-5-C-His-Qβ疫苗(黑线)和安慰剂疫苗(灰线)的个体马在治疗前的时期(2014年)和治疗时的时期(2015年)中显示的损伤严重性。

图18L：在双盲安慰剂对照随机研究中通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH 疾病参数。eIL-5-Qβ疫苗的治疗效果显示，在治疗时的时期中改善的马数量 (第一，黑条)或保持稳定或变差的马数量(第二，灰条)。

图18M：在随访时期通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH疾病参数。在同一季节，10只活性马(1，黑条)与15只安慰剂马(2，灰条)在随访时期中的平均损伤严重性。统计分析通过非参数Mann-Whitney检验进行。

图18N：在双盲安慰剂对照随机研究中通过eIL-5-C-His-CMVtt830有效降低IBH疾病参数。活性马(1，黑条)和安慰剂马(2，灰条)在治疗前的时期(2015年，4月至6月)中的平均损伤严重性。

图18O：双盲安慰剂对照随机研究中通过eIL-5-C-His-CMVtt830有效降低IBH疾病参数。活性马(1，黑条)和安慰剂马(2，灰条)在治疗时的时期(2016年，4月至6月)中的平均损伤严重性。

图18P：通过双盲安慰剂对照随机研究中的eIL-5-C-His-CMVtt830有效降低IBH疾病参数。活性马(1，黑条)和安慰剂马(2，灰条)从2016年减去2015年的从4月至6月测量的平均损伤严重性的变量增量。统计分析通过非参数Mann-Whitney检验进行。

图19A：eEotaxin-C-His-Qβ的偶联反应分析。通过SDS-PAGE。蛋白质用考马斯蓝染色：eEotaxin单体(eEotaxin，m)，Qβ单体(Qβ，m)偶联(c)。泳道M，大小标记(参见Blue,prestained,NuPAGE,Novex,Invitrogen Life Technologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的Qβ-VLP，泳道2， TCEP活化的eEotaxin-C-His，泳道3，eEotaxin-C-His-Qβ偶联反应。

图19B：eEotaxin-C-His-Qβ的偶联反应分析。通过Western-blot。用α-His 抗体染色：eEotaxin单体(eEotaxin，m)，偶联(c)。泳道M，大小标记(参见Blue,prestained,NuPAGE,Novex,Invitrogen Life Technologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的Qβ-VLP，泳道2，TCEP活化的eEotaxin-C-His，泳道3，eEotaxin-C-His-Qβ偶联反应。

图20A：eIL-31-C-His-Qβ的偶联反应分析。通过SDS-PAGE。将蛋白质用考马斯蓝染色：eIL-31单体(eIL-31，m)，eIL-31二聚体(eIL-31，d)， Qβ单体(Qβ，m)偶联(c)。泳道M，大小标记(参见Blue,prestained,NuPAGE, Novex,Invitrogen Life Technologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的Qβ-VLP，泳道2，TCEP活化的eIL-31-C-His，泳道3，eIL-31-C-His-Qβ偶联反应。

图20B：eIL-31-C-His-Qβ的偶联反应分析。通过Western-blot。用α-His 抗体染色：eIL-31单体(eIL-31，m)，eIL-31二聚体(eIL-31，d)，偶联(c)。泳道M，大小标记(参见Blue,prestained,NuPAGE,Novex,Invitrogen Life Technologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的Qβ-VLP，泳道2， TCEP活化的eIL-31-C-His，泳道3，eIL-31-C-His-Qβ偶联反应。

图20C：eIL-31-C-His-CMVtt830的偶联反应分析。通过SDS-PAGE。蛋白质用考马斯蓝染色：eIL-31单体(eIL-31，m)，CMVtt830单体(CMV，m)， CMVtt830二聚体(CMV，d)，偶联(c)。泳道M，大小标记(参见Blue,prestained, NuPAGE,Novex,Invitrogen LifeTechnologies)，泳道1，TCEP活化的 eIL-31-C-His，泳道2，用化学交联剂SMPH衍生化的CMVtt830-VLP，泳道 3，泳道3，eIL-31-C-His-CMVtt830偶联反应。

图20D：eIL-31-C-His-CMVtt830的偶联反应分析。通过Western-blot。用α-His抗体染色：eIL-31单体(eIL-31，m)，eIL-31二聚体(eIL-31，d)，偶联(c)。泳道M，大小标记(参见Blue,prestained,NuPAGE,Novex,Invitrogen Life Technologies)，泳道1，TCEP活化的eIL-31-C-His，泳道2，用化学交联剂SMPH衍生化的CMVtt830-VLP，泳道3，eIL-31-C-His-CMVtt830偶联反应。

具体实施方式

除非另外定义，否则如本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

病毒样颗粒(VLP)：如本文所用的术语“病毒样颗粒(VLP)”是指非复制性或非感染性的，优选非复制性和非感染性的病毒颗粒，或者是指非复制性或非感染性的，优选非复制性和非感染性的类似于病毒颗粒的结构，优选病毒衣壳。如本文所用，术语“非复制性”是指不能复制VLP所包含的基因组。如本文所用，术语“非感染性”是指不能进入宿主细胞。根据本发明的病毒样颗粒是非复制性和非感染性的，因为它缺少全部或部分的病毒基因组或基因组功能。根据本发明的病毒样颗粒可以含有不同于其基因组的核酸。重组产生的病毒样颗粒通常含有宿主细胞衍生的RNA。根据本发明的病毒样颗粒的典型和优选的实施方式是由本发明的多肽组成的病毒衣壳。病毒样颗粒通常是由病毒的外壳蛋白组成的大分子组装体，每个病毒样颗粒通常包含60、 120、180、240、300、360或大于360个蛋白质亚基。通常且优选地，这些亚基的相互作用导致具有固有重复性组织的病毒衣壳或病毒衣壳样结构的形成。病毒样颗粒的一个特征是其亚基的高度有序和重复排列。

RNA噬菌体的病毒样颗粒：如本文所用，术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指RNA噬菌体的包含其外壳蛋白、突变体或片段，或者优选基本上由上述组成或由上述组成的病毒样颗粒。此外，类似RNA噬菌体结构的RNA 噬菌体的病毒样颗粒是非复制性和/或非感染性的，并且至少缺少编码RNA 噬菌体复制机制的一个或多个基因，并且通常也缺乏编码负责病毒附接或进入宿主的一个或多个蛋白质的一个或多个基因。还包括这种RNA噬菌体的病毒样颗粒，其中上述一个或多个基因仍然存在但是无活性，因此也导致RNA 噬菌体的非复制性和/或非感染性病毒样颗粒。衍生自RNA噬菌体的优选 VLP显示二十面体对称性并由180个亚基(单体)组成。使RNA噬菌体的病毒样颗粒非复制和/或非感染的优选方法是通过物理、化学灭活如UV照射、甲醛处理，典型并优选地通过遗传操作来进行的。

CMV的病毒样颗粒：术语“CMV的病毒样颗粒”或CMV VLP是指包含至少一种CMV多肽的病毒样颗粒，或优选基本上由上述组成或优选由上述组成。优选地，CMV的病毒样颗粒包含所述CMV多肽作为主要的，甚至更优选作为衣壳结构的唯一蛋白质组分。通常且优选地，CMV的病毒样颗粒类似于CMV衣壳的结构。CMV的病毒样颗粒是非复制性和/或非感染性的，并且至少缺少编码CMV复制机制的一个或多个基因，并且通常也缺少编码负责病毒附接或进入宿主的一个或多个蛋白质的一个或多个基因。该定义还包括其中前述一个或多个基因仍然存在但是无活性的病毒样颗粒。使CMV的病毒样颗粒非复制和/或非感染的优选方法是通过物理或化学灭活如UV照射、甲醛处理来进行的。优选地，CMV的VLP缺少编码CMV复制机制的一个或多个基因，并且也缺少编码负责病毒附接或进入宿主的一个或多个蛋白质的一个或多个基因。还更优选地，通过重组基因技术获得非复制性和/ 或非感染性病毒样颗粒。根据本发明的重组产生的CMV病毒样颗粒一般优选不包含病毒基因组。包含多于一种多肽的病毒样颗粒(通常称为嵌合VLP) 也包括在本发明中。因此，在一个实施方式中，根据本发明的病毒样颗粒包含至少两种不同种类的多肽，其中至少一种所述多肽的种类是CMV多肽。优选地，CMV的VLP是由每个VLP通常包含180个外壳蛋白亚基的CMV 的外壳蛋白组成的大分子组装体。通常且优选地，本文所用的CMV的VLP 包含至少一种CMV多肽，或者基本上由上述组成或由上述组成，至少一种 CMV多肽包含以下或优选由以下组成：(i)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待突变的氨基酸序列是CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示出至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性。

抗原：如本文所用，术语“抗原”是指如果由MHC分子呈递则能够与抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。如本文所用，术语“抗原”也指T细胞表位。抗原另外能够被免疫系统识别和/或能够诱导导致B-和/或T-淋巴细胞激活的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。然而，至少在某些情况下，这可能要求抗原包含或连接到Th细胞表位和/或在佐剂中施用。抗原可以具有一个或多个表位(B和T表位)。上面提到的具体反应意味着抗原将优选地以高度选择性的方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原引起的大量其它抗体或TCR反应。如果没有另外指示，则如本文所用的术语“抗原”不是指包含在本发明的组合物、免疫原性或疫苗组合物和/或药物组合物中的核心颗粒或病毒样颗粒。

外壳蛋白：术语“外壳蛋白”是指病毒蛋白，优选病毒的天然衣壳的亚基，优选RNA噬菌体或植物病毒的亚基，其能够并入病毒衣壳或VLP。术语“外壳蛋白”包括天然存在的外壳蛋白以及重组表达的外壳蛋白。还包括外壳蛋白的突变体和片段，其中所述突变体和片段保留形成VLP的能力。

多肽：如本文所用的术语“多肽”是指由通过肽键(也称为酰胺键)线性连接的氨基酸单体组成的聚合物。术语多肽是指连续的氨基酸链，并不是指产物的特定长度。因此，肽和蛋白质被包括在多肽的定义中。

黄瓜花叶病毒(CMV)多肽：如本文所用的术语“黄瓜花叶病毒(CMV) 多肽”是指包含以下或优选由以下组成的多肽：(i)黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白的氨基酸序列，(ii)突变的氨基酸序列，其中待突变的氨基酸序列是CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列(即所述CMV的外壳蛋白)显示出至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性。通常且优选地，CMV多肽能够在通过自组装表达时形成CMV的病毒样颗粒。

黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)：如本文所用，术语“黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)”是指天然存在的黄瓜花叶病毒的外壳蛋白。由于黄瓜花叶病毒的宿主范围非常宽，所以已知许多不同的CMV品系和分离物，并且已经确定了所述品系和分离物的外壳蛋白的序列，并因此对本领域技术人员也是已知的。所述CMV的外壳蛋白(CP)的序列描述于已知的数据库如Genbank、www.dpvweb.net或www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/中并可从中获取。EP申请号14189897.3中描述了实例。CMV的外壳蛋白的其它实例在SEQ ID NO:15-17中提供。值得注意的是，这些品系和分离物在不同的蛋白结构域(包括外壳蛋白的N-末端)具有高度相似的外壳蛋白序列。具体而言，在所有完全测序的CMV分离物中的98.1％在其外壳蛋白序列的前 28个氨基酸内共享大于85％的序列同一性，并且在所有完全测序的CMV分离物中的仍79.5％在其外壳蛋白序列的前28个氨基酸内共享大于90％的序列同一性。

通常且优选地，用于本发明的CMV的外壳蛋白能够在通过自组装表达时形成CMV的病毒样颗粒。优选地，用于本发明的CMV的外壳蛋白能够在大肠杆菌中在通过自组装表达时形成CMV的病毒样颗粒。

黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)：如本文所用，术语“黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的病毒样颗粒(VLP)”是指CMV的 VLP，其是经修饰的，例如其包含至少一种经修饰的CMV多肽，或者优选基本上由上述组成或优选由组成，其中所述经修饰的CMV多肽包含CMV多肽和辅助性T细胞表位，或优选由上述组成。通常且优选地，所述辅助性T 细胞表位(i)与所述CMV多肽的N-末端融合，(ii)与所述CMV多肽的C- 末端融合，(iii)置换所述CMV多肽的连续氨基酸区域，其中所述置换的所述CMV多肽的连续氨基酸区域与所述辅助性T细胞表位之间的序列同一性是至少15％，优选至少20％，或(iv)置换所述CMV多肽的N-末端区域，并且其中所述置换的所述CMV多肽的N-末端区域由5至15个连续氨基酸组成。优选地，所述辅助性T细胞表位置换所述CMV多肽的N-末端区域，并且其中所述置换的所述CMV多肽的N-末端区域由5至15个连续氨基酸，优选9至14个连续氨基酸，更优选11至13个连续氨基酸，最优选11、12或 13个连续氨基酸组成。优选地，本发明的CMV的所述经修饰的VLP是CMV 的重组修饰的VLP。

经修饰的CMV多肽：如本文所用，术语“经修饰的CMV多肽”是指如本文所定义的经修饰的CMV多肽，所述经修饰的CMV多肽包含CMV多肽和辅助性T细胞表位或优选由上述组成。通常，经修饰的CMV多肽能够在通过自组装表达时形成CMV的病毒样颗粒。优选地，经修饰的CMV多肽是重组修饰的CMV多肽，并且能够在大肠杆菌中在通过自组装表达时形成CMV的病毒样颗粒。

CMV多肽的N-末端区域：如本文所用，术语“CMV多肽的N-末端区域”是指所述CMV多肽的N-末端，特别是CMV的外壳蛋白的N-末端，或者指所述CMV多肽或所述CMV的外壳蛋白的N-末端区域，但是如果所述CMV 多肽或所述外壳蛋白包含N-末端甲硫氨酸残基，则从所述CMV多肽或所述 CMV的外壳蛋白的N-末端的第二个氨基酸开始。优选地，在所述CMV多肽或所述外壳蛋白包含N-末端甲硫氨酸残基的情况下，从实际观点来看，编码起始密码子的甲硫氨酸通常会被缺失并添加到Th细胞表位的N-末端。进一步优选地，为了克隆的目的，可以任选地在起始甲硫氨酸和Th细胞表位之间插入一个、两个或三个另外的氨基酸，优选一个氨基酸。如本文所用的术语“CMV多肽或CMV的外壳蛋白的突变的氨基酸序列的N-末端区域”是指所述 CMV多肽或所述CMV的外壳蛋白的所述突变的氨基酸序列的N-末端，或者指所述CMV多肽或所述CMV的外壳蛋白的所述突变的氨基酸序列的N-末端区域，但是如果所述突变的氨基酸序列包含N-末端甲硫氨酸残基，则从所述CMV多肽或CMV的外壳蛋白的所述突变的氨基酸序列的N-末端的第二个氨基酸开始。优选地，在所述CMV多肽或所述外壳蛋白包含N-末端甲硫氨酸残基的情况下，从实际观点来看，编码起始密码子的甲硫氨酸通常会被缺失并添加到Th细胞表位的N-末端。进一步优选地，为了克隆的目的，可以任选地在起始甲硫氨酸和Th细胞表位之间插入一个、两个或三个另外的氨基酸，优选一个氨基酸。

重组多肽：在本发明上下文中，术语“重组多肽”是指通过包含至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的多肽。通常且优选地，在原核表达系统中产生重组多肽。对技术人员显而易见的是，在原核表达系统例如大肠杆菌中表达的重组产生的多肽可以包含N-末端甲硫氨酸残基。在重组多肽成熟期间，N-末端甲硫氨酸残基通常从表达宿主中的重组多肽上切割。然而，N-末端甲硫氨酸的切割可能是不完整的。因此，重组多肽的制备物可以包含具有和不具有N-末端甲硫氨酸残基的其它相同多肽的混合物。通常且优选地，重组多肽的制备物包含少于10％，更优选少于5％，还更优选少于1％的具有 N-末端甲硫氨酸残基的重组多肽。

重组CMV多肽：术语“重组CMV多肽”是指如上定义的通过包含至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的CMV多肽。通常且优选地，重组CMV 多肽的制备物包含少于10％，更优选少于5％，还更优选少于1％的具有N- 末端甲硫氨酸残基的重组CMV多肽。因此，本发明的重组病毒样颗粒可以包含具有和不具有N-末端甲硫氨酸残基的其它相同的重组多肽。

重组修饰的CMV多肽：术语“重组修饰的CMV多肽”是指通过包含至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的如上所定义的经修饰的CMV多肽。通常且优选重组修饰的CMV多肽的制品包含小于10％，更优选小于5％，还更优选小于1％的具有N-末端甲硫氨酸残基的重组修饰的CMV多肽。因此，本发明的重组病毒样颗粒可以包含具有和不具有N-末端甲硫氨酸残基的其他相同的重组多肽。

重组病毒样颗粒：在本发明上下文中，术语“重组病毒样颗粒”是指通过包含至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的病毒样颗粒(VLP)。通常且优选地，通过在宿主中，优选在细菌细胞中表达重组病毒的外壳蛋白来获得重组VLP。通常且优选地，重组病毒样颗粒包含至少一种重组多肽，优选重组CMV多肽或重组修饰的CMV多肽。最优选地，重组病毒样颗粒由重组 CMV多肽或重组修饰的CMV多肽构成或由上述组成。因此，如果在本发明的上下文中，本发明的重组VLP的定义是参考包含N-末端甲硫氨酸残基的特定氨基酸序列来实现的，则这些本发明的重组VLP的范围涵盖由所述特定氨基酸序列形成的VLP，而没有所述N-末端甲硫氨酸残基，即使通常在本文中指出的是次要量，VLP由所述特定氨基酸序列与所述N-末端甲硫氨酸形成。此外，如果本发明的重组VLP的定义是参考包含N-末端甲硫氨酸残基的特定氨基酸序列来实现的，则涵盖包含两个氨基酸序列的VLP，所述氨基酸序列还包含所述N-末端甲硫氨酸残基和缺乏N-末端甲硫氨酸残基的氨基酸序列。

突变的氨基酸序列：术语“突变的氨基酸序列”是指通过向待突变的氨基酸序列中引入确定的一组突变而获得的氨基酸序列。在本发明的上下文中，所述待突变的氨基酸序列通常优选是CMV的外壳蛋白的氨基酸序列。因此，突变的氨基酸序列在至少一个氨基酸残基上不同于CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示出至少 90％的序列同一性。通常且优选地，所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示出至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或 99％的序列同一性。优选地，所述突变的氨基酸序列和所述待突变的序列在至多11、10、9、8、7、6、4、3、2或1个氨基酸残基上不同，其中进一步优选所述差异选自插入、缺失和氨基酸交换。优选地，突变的氨基酸序列与 CMV的外壳蛋白的氨基酸序列在至少一个氨基酸上不同，其中优选所述差异是氨基酸交换。

对应于残基...的位置：对应于另一个氨基酸序列的给定残基的氨基酸序列上的位置可以通过序列比对来识别，通常且优选地通过使用BLASTP算法，最优选使用标准设置。通常且优选的标准设置是：预期阈值：10；字大小：3；最大匹配查询范围：0；矩阵：BLOSUM62；差距成本：存在11，扩展1；构图调整：条件构图分数矩阵调整。

序列同一性：基于两个序列的比对确定两个给定氨基酸序列的序列同一性。用于确定序列同一性的算法对于技术人员是可用的。优选地，使用公众可获得的计算机同源程序如“BLAST”程序 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)或“CLUSTALW”(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)，并由此优选地通过在NCBI主页http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上提供的“BLAST”程序，使用其中提供的默认设置来确定两个氨基酸序列的序列同一性。通常且优选的标准设置是：预期阈值：10；字大小：3；最大匹配查询范围：0；矩阵：BLOSUM62；差距成本：存在11，扩展1；构图调整：条件构图分数矩阵调整。

氨基酸交换：术语氨基酸交换是指氨基酸序列中给定氨基酸残基被具有不同化学结构的任何其它氨基酸残基，优选通过另一种蛋白氨基酸残基交换。因此，与插入或缺失氨基酸相反，氨基酸交换不会改变所述氨基酸序列的氨基酸总数。在本发明的上下文中非常优选的是交换所述氨基酸序列的氨基酸残基以通过赖氨酸残基或半胱氨酸残基突变。

表位：术语表位指抗原，优选多肽的连续或不连续部分，其中所述部分可以在MHC分子的上下文中通过抗体或T细胞受体特异性结合。对于抗体，特异性结合不包括非特异性结合，但不一定排除交叉反应性。表位通常包含空间构象的5-20个氨基酸，其对于抗原位点是独特的。

辅助性T(Th)细胞表位：如本文所用，术语“辅助性T(Th)细胞表位”是指能够被辅助性Th细胞识别的表位。在另一个优选的实施方式中，所述辅助性T细胞表位是通用辅助性T细胞表位。

通用Th细胞表位：如本文所用的术语“通用Th细胞表位”是指能够结合至少一个，优选多于一个MHC II类分子的Th细胞表位。确定肽序列是否是通用Th细胞表位的最简单方法是测量肽与单个MHC II类分子结合的能力。这可以通过该肽和已知的Th细胞表位肽与MHC II类分子的结合竞争的能力来测量。HLA-DR分子的代表性选择描述于例如AlexanderJ等,Immunity (1994)1:751-761。Th细胞表位对于MHC II类分子的亲和力应该至少为 10^{- 5}M。确定Th细胞表位的“普遍性”的另一种更繁琐但更相关的方式是证明更大比例的人(>30％)在免疫时产生可测量的T细胞应答，一个月后用含有在IFA中配制的Th细胞表位的蛋白质加强。在Panina-Bordignon P等,Eur J Immunol(1989)19:2237-2242中给出了存在于不同个体中的MHC II类分子的代表性集合。因此，如本文所用的术语“通用Th细胞表位”优选是指多于 30％的选定个体组在免疫和加强(一个月后用含有在IFA中配制的Th细胞表位的蛋白质)的情况下产生可测量的T细胞应答的Th细胞表位，如 Panina-Bordignon P等,Eur J Immunol(1989)19:2237-2242中所述的。此外，再次进一步优选的是，如本文所用的术语“通用Th细胞表位”优选是指能够结合至少一个，优选至少两个，甚至更优选至少三个DR等位基因的Th细胞表位，所述DR等位基因选自DR1、DR2w2b、DR3、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DR52a、DRw53、DR2w2a；并且优选选自亲和力至少为500nM的DR1、 DR2w2b、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DRw53、DR2w2a(如Alexander J 等,Immunity(1994)1:751-761和本文引用的参考文献中描述的)；评估所述亲和力的优选结合测定法是由Sette A等,J Immunol(1989)142:35-40描述的测定法。在再次更优选的方式中，如本文所用的术语“通用Th细胞表位”是指能够结合至少一个，优选至少两个，甚至更优选结合至少三个DR等位基因的 Th细胞表位，所述DR等位基因选自亲和力至少为500nM的选自DR1、 DR2w2b、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DRw53、DR2w2a(如Alexander J 等,Immunity(1994)1:751-761和本文引用的参考文献中描述的)；评估所述亲和力的优选结合测定法是由Sette A等,J Immunol(1989)142:35-40描述的测定法。

通用Th细胞表位描述于例如Alexander J等,Immunity(1994)1:751-761、Panina-Bordignon P等,Eur J Immunol(1989)19:2237-2242、Calvo-Calle JM等, JImmunol(1997)159:1362-1373和Valmori D等,J Immunol(1992) 149:717-721，并且是本领域技术人员已知的。

佐剂：如本文所用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激剂或允许在宿主中产生储库的物质，当分别与本发明的疫苗和药物组合物结合时，可以提供甚至更强化的免疫应答。优选的佐剂是完全和不完全的弗氏佐剂，含铝佐剂，优选氢氧化铝和经修饰的胞壁酰二肽。进一步优选的佐剂为矿物凝胶例如氢氧化铝，表面活性物质例如溶血卵磷脂、普鲁兰尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚，以及人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。这样的佐剂在本领域中也是众所周知的。可与本发明的组合物一起施用的其它佐剂包括但不限于单磷酰脂质免疫调节剂、 AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、 OM-197、OM-294和病毒体佐剂技术。佐剂也可以包含这些物质的混合物。通常已将病毒样颗粒描述为佐剂。然而，在本申请的上下文中使用的术语“佐剂”是指不是本发明的病毒样颗粒的佐剂。而“佐剂”涉及本发明的组合物、疫苗或药物组合物的另外的独特组分。

有效量：如本文所用，术语“有效量”是指实现期望的生物效应所必需或足够的量。有效量的组合物或者药物组合物将是达到该选定结果的量，并且该量可以由本领域技术人员按常规确定。优选地，如本文所用的术语“有效量”是指有效降低至少一种IBH参数或症状所必需或足够的量，其中优选所述至少一种IBH参数或症状是皮肤损伤的水平或严重性等级，并且其中进一步优选地，所述皮肤损伤的所述水平或严重性等级的所述降低通过症状损伤评分测试来确定。有效量可以根据施用的特定组合物和受试者的大小而变化。本领域普通技术人员可凭经验确定本发明的特定组合物的有效量，而不需要过度的实验。

治疗：如本文所用，术语“治疗”是指预防性和/或治疗性的。在一个实施方式中，术语“治疗”是指治疗性治疗。在另一个实施方式中，术语“治疗”是指预防性治疗。

第一附接位点：如本文所用，短语“第一附接位点”是指与病毒样颗粒天然存在的或人工添加到病毒样颗粒的元件，并且第二附接位点可以被连接。第一附接位点优选为蛋白质，多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛、金属离子、苯基甲基磺酰氟)或化学反应性基团如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酸基或其组合。作为第一附接位点的化学反应性基团的优选实施方式是氨基酸残基的氨基，优选赖氨酸残基的氨基。第一附接位点通常位于VLP 的表面上，并且优选位于VLP的外表面上。多个第一附接位点存在于VLP 的表面上，优选在VLP的外表面上，通常以重复配置存在。在优选的实施方式中，第一附接位点通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键与VLP结合。在进一步优选的实施方式中，第一附接位点与VLP天然存在。或者，在优选的实施方式中，将第一附接位点人工添加到VLP。在非常优选的实施方式中，所述第一附接位点是所述VLP多肽的氨基酸序列的赖氨酸残基的氨基。

第二附接位点：如本文所用，短语“第二附接位点”是指与抗原天然存在或人工添加到抗原，且第一附接位点可与其连接的元件。抗原的第二附接位点优选为蛋白质、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛、金属离子、苯基甲基磺酰氟)或化学反应性基团如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酸基或其组合。作为第二附接位点的化学反应性基团的优选实施方式是巯基，优选氨基酸半胱氨酸的巯基，最优选半胱氨酸残基的巯基。术语“具有至少一个第二附接位点的抗原”因此是指包含抗原和至少一个第二附接位点的构建体。然而，特别是对于抗原内不天然存在的第二附接位点，这种构建体通常并且优选进一步包含“连接子”。在另一个优选的实施方式中，第二附接位点通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键与抗原结合。在另一个实施方式中，第二附接位点天然存在于抗原内。在另一个进一步优选的实施方式中，通过连接子将第二附接位点人工添加到抗原，其中所述连接子包含半胱氨酸或者由上述组成。优选地，连接子通过肽键与抗原融合。

连接的：如本文所用的术语“连接的”或“连接”是指通过所有可能的方式，优选化学相互作用，使至少一个第一附接位点和至少一个第二附接位点连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价相互作用。非共价相互作用的通常实例是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键，如酯、醚、磷酸酯、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。在某些优选的实施方式中，第一附接位点和第二附接位点通过至少一个共价键，优选通过至少一个非肽键，甚至更优选仅通过非肽键连接。然而，如本文所用的术语“连接的”不仅应该是指至少一个第一附接位点和至少一个第二附接位点的直接连接，而另外并优选地是指至少一个第一附接位点和至少一个第二附接位点通过中间分子，并因此通常且优选地通过使用至少一个，优选一个异双功能交联剂而间接连接。在其它优选的实施方式中，第一附接位点和第二附接位点通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键，甚至更优选仅通过肽键连接。

连接子：如本文所用的“连接子”将第二附接位点与抗原相关联或已经包含第二附接位点，或者基本上由上述组成或由上述组成。优选地，如本文所用，“连接子”已经包含第二附接位点，通常且优选地(但不一定)作为一个氨基酸残基，优选作为半胱氨酸残基。优选的连接子是氨基酸连接子，即含有至少一个氨基酸残基的连接。术语“氨基酸连接子”并不意味着这种连接子仅由氨基酸残基组成。然而，仅由氨基酸残基组成的连接子是本发明的优选实施方式。连接子的氨基酸残基优选由本领域已知的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸的全-L或全-D或其混合物组成。根据本发明的连接子的进一步优选的实施方式是包含巯基或半胱氨酸残基的分子，因此这样的分子也包括在本发明内。连接子与抗原的关联优选通过至少一个共价键，更优选通过至少一个肽键的方式。

马科哺乳动物：如本文所用的“马科哺乳动物”是包括马、小马、驴子(驴) 和斑马在内的马科中的哺乳动物。优选地，如本文所用的术语“马科哺乳动物”是指马、小马、驴子(驴)和斑马。还更优选地，如本文所用，术语“马科哺乳动物”是指马。

因此，第一方面，本发明提供了一种组合物，其包含：(a)具有至少一个第一附接位点的核心颗粒；(b)具有至少一个第二附接位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是(i)马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ IDNO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；或(ii)马嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)抗原(eEotaxin抗原)，其中所述eEotaxin 抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:6的氨基酸序列的蛋白质，或者具有与SEQ ID NO:6有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；(iii)马白细胞介素 -31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:12的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:12有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；

其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附接位点和所述至少一个第二附接位点经由至少一个非肽共价键连接。

在一个实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5 抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或者具有与SEQ ID NO:1有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或者具有与SEQ ID NO:1有至少95％，优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质或具有与SEQ ID NO:1有至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

在一个优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原 (eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37 和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5 抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:35、SEQID NO:36和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有SEQ ID NO:1 的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5 抗原包含或优选是具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的蛋白质。在非常进一步优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5 抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有SEQ ID NO:36 的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的蛋白质。在另一个非常优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述 eIL-5抗原包含或优选是具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。

在一个实施方式中，所述至少一种抗原是马嗜酸性粒细胞趋化因子 (Eotaxin)抗原(eEotaxin抗原)，其中所述eEotaxin抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:6的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:6有至少90％，优选至少92％，更优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

在一个优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)抗原(eEotaxin抗原)，其中所述eEotaxin抗原包含或优选是具有选自SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ IDNO:42的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin) 抗原(eEotaxin抗原)，其中所述eEotaxin抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10的氨基酸序列的蛋白质。

在一个实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31 抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:12的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:12有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

在一个优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-31抗原 (eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:12、 SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46 的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14的氨基酸序列的蛋白质。

在进一步优选的实施方式中，所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，优选重组VLP。在又一个优选的实施方式中，所述VLP来源于植物病毒或噬菌体，并且其中优选所述噬菌体是RNA噬菌体。

因此，在进一步优选的实施方式中，所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，并且其中所述VLP来源于RNA噬菌体。

进一步优选的是作为本发明的核心颗粒的RNA噬菌体的重组VLP。在进一步优选的实施方式中，所述VLP包含RNA噬菌体的重组外壳蛋白、基本上由RNA噬菌体的重组外壳蛋白组成或由RNA噬菌体的重组外壳蛋白组成，并且其中优选所述VLP包含RNA噬菌体Qβ或RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白、基本上由上述组成或由上述组成，并且其中进一步优选所述VLP 包含RNA噬菌体Qβ的重组外壳蛋白、基本上由上述组成或由上述组成。

在进一步优选的实施方式中，所述VLP包含重组外壳蛋白、基本上由上述组成或由上述组成，所述重组外壳蛋白包含以下的氨基酸序列或优选由其组成：选自(a)SEQ ID NO:31；(b)SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的混合物；或(c)SEQ ID NO:33。在进一步优选的实施方式中，所述VLP是RNA 噬菌体Qβ的VLP。在进一步优选的实施方式中，所述VLP包含RNA噬菌体Qβ的重组外壳蛋白、基本上由上述组成或由上述组成。在又进一步优选的实施方式中，所述VLP包含由包含SEQ ID NO:31或优选由上述组成的重组外壳蛋白、基本上由上述组成或由上述组成。

在另一个优选的实施方式中，所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP，并且所述VLP包含RNA噬菌体Qβ的重组外壳蛋白、基本上由上述组成或由上述组成，并且其中所述重组外壳蛋白包含SEQ ID NO:31或优选由上述组成。

在一个实施方式中，所述VLP不是RNA噬菌体的VLP，优选所述VLP 不是RNA噬菌体的重组VLP。在一个实施方式中，所述病毒样颗粒不是RNA 噬菌体Qβ的病毒样颗粒。

在进一步优选的实施方式中，所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，并且其中所述VLP来源于植物病毒。在另一个优选的实施方式中，所述VLP是重组VLP，并且其中优选所述重组VLP来源于植物病毒。在另一个优选的实施方式中，所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的VLP。

在一个优选的实施方式中，所述VLP是经修饰的VLP，其包含至少一个经修饰的VLP多肽、基本上由上述组成或由上述组成，其中所述经修饰的 VLP多肽包含以下或者优选由以下组成：(a)VLP多肽和(b)辅助性T细胞表位，其中所述VLP多肽包含以下或优选由以下组成：(i)病毒的外壳蛋白的氨基酸序列，优选植物病毒的外壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待突变的氨基酸序列是所述病毒的外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述病毒的外壳蛋白显示出至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性。

在一个优选的实施方式中，所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的VLP，其中所述CMV的经修饰的VLP包含至少一种经修饰的CMV多肽、基本上由上述组成或由上述组成，其中所述经修饰的CMV多肽包含以下或优选由以下组成：(a)CMV多肽和(b)辅助性T细胞表位；并且其中所述CMV多肽包含以下或优选由以下组成：(i)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待突变的氨基酸序列是CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV的外壳蛋白显示出至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性。

在一个优选的实施方式中，所述CMV多肽包含CMV的外壳蛋白的氨基酸序列或优选由上述组成。在另一个优选的实施方式中，所述CMV多肽包含突变的氨基酸序列或优选由上述组成，其中待突变的氨基酸序列是CMV 的外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV的外壳蛋白显示出至少90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性。通常且优选地，所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列在至少一个和至多11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸残基上不同，并且其中优选这些差异选自(i)插入、(ii)缺失、(iii) 氨基酸交换以及(iv)(i)至(iii)的任何组合。

在另一个优选的实施方式中，所述CMV多肽包含以下或优选由以下组成：(i)(a)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:15或优选由上述组成；或(b)与SEQ ID NO:15具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，进一步更优选至少90％，还更优选至少95％，再更优选地至少98％，并且还再更优选地至少99％的序列同一性的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中所述待突变的氨基酸序列是如该权利要求的(i)中限定的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示出至少95％，优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性。

在另一个优选的实施方式中，所述CMV多肽包含以下或优选由以下组成：(a)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:15或优选由上述组成；或(b)与SEQ ID NO:15具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，进一步更优选至少90％，还更优选至少95％，再更优选至少98％，还再更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列。

在另一个优选的实施方式中，所述CMV多肽包含以下或优选由以下组成：(i)(a)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:34；或(b)包含氨基酸序列区域的CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO:34具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，进一步更优选至少90％，还更优选至少95％，再更优选至少98％，还再更优选至少99％的序列同一性；或(ii)突变的氨基酸序列，其中所述待突变的氨基酸序列是如该权利要求的(i)中限定的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示出至少 95％，优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性。

在进一步优选的实施方式中，所述CMV多肽包含以下或优选由以下组成：(a)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:34；或(b)包含氨基酸序列区域的CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO:34具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，进一步更优选至少90％，还更优选至少95％，再更优选至少98％，还再更优选至少99％的序列同一性。

在另一个优选的实施方式中，所述CMV多肽包含以下或优选由以下组成：(i)(a)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:15或优选由上述组成；或(b)与SEQ ID NO:15具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，进一步更优选至少90％，还更优选至少95％，再更优选地至少98％，并且还再更优选地至少99％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中如该权利要求中的(a)或(b)中定义的所述氨基酸序列包含 SEQID NO:34；或其中如该权利要求中的(a)或(b)中定义的所述氨基序列包含氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO:34具有至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，进一步更优选至少90％，还更优选至少95％，再更优选地至少98％，并且还再更优选地至少99％的序列同一性；或(ii)突变的氨基酸序列，其中所述待突变的氨基酸序列是如该权利要求的(i)中定义的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示出至少98％，优选至少99％的序列同一性。

在另一个优选的实施方式中，所述CMV多肽包含以下或优选由以下组成：(a)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:15或优选由其组成；或(b)与SEQ ID NO:15具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中如该权利要求中的(a)或(b)中定义的所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:34；或其中如该权利要求中的(a)或(b)中定义的所述氨基酸序列包含氨基酸序列区域，其中所述氨基酸序列区域与SEQ ID NO:34具有至少90％的序列同一性。

在另一个优选的实施方式中，所述辅助性T细胞表位置换所述CMV多肽的N-末端区域。在另一个优选的实施方式中，所述N-末端区域的氨基酸数量置换为等于或低于由所述辅助性T细胞表位组成的氨基酸数量。

在另一个非常优选的实施方式中，所述辅助性T细胞表位置换所述CMV 多肽的N-末端区域，并且其中置换的所述N-末端区域的氨基酸数量等于或低于由所述辅助性T细胞表位组成的氨基酸数量。通常且优选地，所述CMV 多肽的所述置换N-末端区域由5至15个连续氨基酸，优选9至14个连续氨基酸，更优选11至13个连续氨基酸组成。

在另一个非常优选的实施方式中，所述CMV多肽的所述N-末端区域对应于SEQ IDNO:15的氨基酸2-12。

在另一个非常优选的实施方式中，所述辅助性T细胞表位是通用辅助性 T细胞表位。在另一个优选的实施方式中，所述辅助性T细胞表位由最多20 个氨基酸组成。

在一个非常优选的实施方式中，所述Th细胞表位是PADRE序列。在进一步非常优选的实施方式中，所述Th细胞表位包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或优选由其组成。在另一个非常优选的实施方式中，所述Th细胞表位是 PADRE序列，并且其中所述Th细胞表位包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或优选由其组成。

在另一个优选的实施方式中，所述辅助性T细胞表位来源于人疫苗。在一个非常优选的实施方式中，所述Th细胞表位来源于破伤风毒素。在进一步非常优选的实施方式中，所述Th细胞表位具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列或优选由其组成。在另一个非常优选的实施方式中，所述Th细胞表位来自破伤风毒素，并且其中所述Th细胞表位具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列或优选由其组成。

在一个非常优选的实施方式中，所述Th细胞表位是PADRE序列，并且其中所述Th细胞表位包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或优选由其组成；或其中所述Th细胞表位来自破伤风毒素，并且其中所述Th细胞表位具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列或优选由其组成。

在一个非常优选的实施方式中，所述CMV多肽包含CMV的外壳蛋白的氨基酸序列或优选由其组成，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:15或与 SEQ ID NO:15具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列，或优选由上述组成；并且其中所述氨基酸序列包含SEQ IDNO:34，并且其中所述辅助性T细胞表位置换所述CMV多肽的N-末端区域，并且其中所述CMV多肽的所述置换的N-末端区域由11至13个连续的氨基酸，优选11个连续的氨基酸组成，并且其中所述CMV多肽的所述N-末端区域进一步优选对应于SEQ ID NO:15的氨基酸2-12。

在另一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成。在另一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或优选由其组成。

在一个非常优选的实施方式中，所述第一附接位点和所述第二附接位点通过至少一个共价非肽键连接。在另一个非常优选的实施方式中，所述第一附接位点包含或优选是氨基，优选赖氨酸的氨基。在另一个非常优选的实施方式中，所述第二附接位点包含或优选是巯基，优选半胱氨酸的巯基。

在一个非常优选的实施方式中，至少一个第一附接位点是氨基，优选赖氨酸残基的氨基，并且至少一个第二附接位点是巯基，优选半胱氨酸残基或已经化学附接到本发明的至少一种抗原的巯基。在进一步优选的实施方式中，仅一个所述第二附接位点通过至少一个非肽共价键与所述第一附接位点结合，导致所述抗原与所述经修饰的病毒样颗粒的单一且均一类型的结合，其中与所述第一附接位点结合的所述仅一个第二附接位点是巯基，并且其中所述抗原和所述经修饰的病毒样颗粒通过所述结合以形成有序且重复的抗原阵列。

在本发明的一个优选实施方式中，抗原通过化学交联的方式与经修饰的 VLP连接，通常且优选地通过使用异双功能交联剂。在优选的实施方式中，异双功能交联剂含有官能团，该官能团能够与优选的第一附接位点，优选与氨基，更优选与经修饰的VLP的赖氨酸残基的氨基反应；以及另一个官能团，其能够与优选的第二附接位点(即巯基，优选固有的半胱氨酸残基或人工添加到抗原)反应，并且任选地还可用于还原反应。几种异双功能交联剂是本领域已知的。这些包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、 Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、 Sulfo-KMUS SVSB、SIA以及其它交联剂，例如可得自Pierce Chemical Company，并具有对氨基具有反应性的一个官能团和对巯基具有反应性的一个官能团。上述交联剂全部导致在与氨基反应后形成酰胺键和与巯基基团形成硫醚键。适用于本发明实践的另一类交联剂的特征在于在偶联时在抗原和经修饰的VLP之间引入二硫键。属于这一类的优选的交联剂包括例如SPDP 和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。

根据上述优选方法，通过使用异双功能交联剂将抗原连接到经修饰的 VLP允许抗原以定向方式偶联到经修饰的VLP。将抗原连接到修饰的VLP 的其它方法包括其中使用碳二亚胺EDC和NHS将抗原交联到经修饰的VLP 的方法。抗原还可以通过反应例如用SATA、SATP或亚氨基硫杂环戊烷以首先进行硫醇化。如果需要，在去保护后，抗原可以如下与经修饰的VLP偶联。分离过量的硫醇化试剂后，抗原与预先用包含半胱氨酸反应性部分的异双功能交联剂活化的经修饰的VLP反应，因此显示至少一个或几个对半胱氨酸残基有反应性的官能团，如上所述，硫醇化抗原可以与其反应。任选地，反应混合物中包含少量的还原剂。在进一步的方法中，使用同型双官能交联剂如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3、(Pierce)或其它已知的具有对经修饰的 VLP的胺基或羧基具有反应性的官能团的同型双官能交联剂将抗原连接到经修饰的VLP。

在本发明的非常优选的实施方式中，抗原通过已添加到抗原的N-末端或 C-末端的半胱氨酸残基或抗原内的天然半胱氨酸残基，与经修饰的病毒样颗粒的赖氨酸残基连接。在一个优选的实施方式中，本发明的组合物进一步包含连接子，其中所述连接子将所述抗原与所述第二附接位点结合，并且其中优选所述连接子包含第二附接位点或可选地由上述组成。

在本发明的另一个非常优选的实施方式中，所述核心颗粒是病毒样颗粒 (VLP)，优选重组VLP，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5 抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有选自SEQ IDNO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少95％，优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5 抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:38的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述 eIL-5抗原包含或者优选是具有选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述 eIL-5抗原包含或者优选是具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。

在本发明的另一个非常优选的实施方式中，所述核心颗粒是根据本发明的经修饰的VLP，优选重组修饰的VLP，根据本发明，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5 抗原包含或者优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少95％，优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV 多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:35、 SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。

在本发明的另一个非常优选的实施方式中，所述核心颗粒是VLP，优选重组VLP，其中所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的VLP，其中所述CMV的经修饰的VLP包含至少一种经修饰的CMV多肽、基本上由上述组成或由上述组成，其中所述经修饰的CMV多肽包含以下或优选由以下组成：(a)CMV多肽，和(b)辅助性T细胞表位；并且其中所述CMV多肽包含以下或优选由以下组成：(i)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列；或(ii) 突变的氨基酸序列，其中待突变的氨基酸序列是CMV的外壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV的外壳蛋白显示出至少 90％，优选至少95％，进一步优选至少98％，还更优选至少99％的序列同一性，并且其中所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQID NO:1有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原 (eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有选自SEQ ID NO:1 的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少95％，优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38 的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5 抗原包含或者优选是具有选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。

在本发明的另一个非常优选的实施方式中，所述核心颗粒是VLP，优选重组VLP，其中所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的VLP，其中所述CMV的经修饰的VLP包含至少一种经修饰的CMV多肽、基本上由上述组成或由上述组成，并且其中所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20 的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1 的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少 95％，优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5 抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有选自SEQ ID NO:35、 SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原 (eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有SEQ ID NO:36 的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5 抗原包含或者优选是具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。

所述核心颗粒是VLP，优选重组VLP，其中所述VLP是黄瓜花叶病毒 (CMV)的经修饰的VLP，其中所述CMV的经修饰的VLP包含至少一种经修饰的CMV多肽、基本上由上述组成或由上述组成，并且其中所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

另一方面，本发明提供包含有效量的本发明组合物的免疫原性或疫苗组合物，其中任选地所述免疫原性或疫苗组合物还包含佐剂。

另一方面，本发明提供药物组合物，其包含：(a)本发明的组合物或本发明的免疫原性或疫苗组合物；和(b)药学上可接受的载体。

另一方面，本发明提供免疫的方法，其中所述方法包括将本发明的组合物、本发明的免疫原性或疫苗组合物或本发明的药物组合物施用于马科哺乳动物，优选施用于马。

另一方面，本发明提供本发明的组合物、本发明的免疫原性或疫苗组合物或本发明的药物组合物作为药物的用途。

另一方面，本发明提供了本发明的组合物、本发明的免疫原性或疫苗组合物或本发明的药物组合物在预防或治疗马科哺乳动物，优选马的昆虫叮咬高敏症的方法中的用途，其中将有效量的所述本发明的组合物、所述本发明的免疫原性或疫苗组合物或所述本发明的药物组合物施用于所述马科哺乳动物，优选施用于所述马。优选地，与在所述施用之前的至少一种IBH参数或症状相比，所述本发明的组合物、所述本发明的免疫原性或疫苗组合物或所述本发明的药物组合物的所述施用降低所述至少一种IBH参数或症状，并且其中优选所述至少一种IBH参数或症状是皮肤损伤的水平或严重性等级，并且其中进一步优选所述皮肤损伤的水平或严重性等级的所述降低通过症状损伤评分测试来确定，通常且优选地如实施例13中所述。在一个优选的实施方式中，所述马科哺乳动物，优选所述马的皮肤损伤的水平或严重性的所述降低通过较不积极的症状损伤评分测试来表示，其中通常且优选地所述症状损伤评分测试如实施例13中所述进行。

另一方面，本发明提供本发明的组合物、本发明的免疫原性或疫苗组合物或本发明的药物组合物在治疗马科哺乳动物，优选马的昆虫叮咬高敏症的方法中的用途，其中将有效量的所述本发明的组合物、所述本发明的免疫原性或疫苗组合物或所述本发明的药物组合物施用于所述马科哺乳动物，优选施用于所述马。优选地，与在所述施用之前的至少一种IBH参数或症状相比，所述本发明的组合物、所述本发明的免疫原性或疫苗组合物或所述本发明的药物组合物的所述施用降低所述至少一种IBH参数或症状，并且其中优选所述至少一种IBH参数或症状是皮肤损伤的水平或严重性等级，并且其中进一步优选所述皮肤损伤的水平或严重性等级的所述降低通过症状损伤评分测试来确定，通常且优选地如实施例13中所述。在一个优选的实施方式中，所述马科哺乳动物，优选所述马的皮肤损伤的水平或严重性的所述降低通过较不积极的症状损伤评分测试来表示，其中通常且优选地所述症状损伤评分测试如实施例13中所述进行。

另一方面，本发明提供本发明的组合物、本发明的免疫原性或疫苗组合物或本发明的药物组合物在治疗马的昆虫叮咬高敏症的方法中的用途，其中将有效量的所述本发明组合物、所述本发明的免疫原性或疫苗组合物或所述本发明的药物组合物施用于所述马，并且其中所述核心颗粒是VLP，优选重组VLP，其中所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的VLP，其中所述CMV的经修饰的VLP包含至少一种经修饰的CMV多肽、基本上由上述组成或由上述组成，并且其中所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原 (eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少 95％，优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5 抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原 (eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5抗原包含或者优选是具有SEQ ID NO:36 的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中所述eIL-5 抗原包含或者优选是具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。在另一个非常优选的实施方式中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或优选由其组成，并且所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原 (eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

另一方面，本发明提供预防或治疗昆虫叮咬高敏症的方法，其中所述方法包括将有效量的所述本发明的组合物、所述本发明的免疫原性或疫苗组合物或所述本发明的药物组合物施用于马科哺乳动物，优选施用于马。

另一方面，本发明提供治疗昆虫叮咬高敏症的方法，其中所述方法包括将有效量的所述本发明的组合物、所述本发明的免疫原性或疫苗组合物或所述本发明的药物组合物施用于马科哺乳动物，优选施用于马。

另一方面，本发明提供包含有效量的第一组合物和有效量的第二组合物的免疫原性或疫苗组合物，其中所述第一组合物包含(a)具有至少一个第一附接位点的第一核心颗粒；(b)具有至少一个第二附接位点的至少一种第一抗原，其中所述至少一种第一抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:1有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中所述第二组合物包含(c)具有至少一个第一附接位点的第二核心颗粒；(d)具有至少一个第二附接位点的至少一种第二抗原，其中所述至少一种第二抗原是马嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)抗原(eEotaxin抗原)，其中所述eEotaxin 抗原包含或优选是具有选自SEQ IDNO:6的氨基酸序列的蛋白质，具有与 SEQ ID NO:6有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(a)和(b) 通过所述至少一个第一附接位点和所述至少一个第二附接位点经由至少一个非肽共价键连接，并且其中(c)和(d)通过所述至少一个第一附接位点和所述至少一个第二附接位点经由至少一个非肽共价键连接；并且其中任选地所述免疫原性或疫苗组合物还包含佐剂。

在一个优选的实施方式中，所述免疫原性或疫苗组合物还包含第三组合物，其中所述第三组合物包含(e)具有至少一个第一附接位点的第三核心颗粒；和(f)具有至少一个第二附接位点的至少一种第三抗原，其中所述至少一种第三抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO:12的氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQ ID NO:12有至少90％，优选至少92％，进一步优选至少95％，还更优选至少 98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(e)和(f)经由所述至少一个第一附接位点和所述至少一个第二附接位点通过至少一个非肽共价键连接。

另一方面，本发明提供了本发明的免疫原性或疫苗组合物在预防或治疗马科哺乳动物，优选马的昆虫叮咬高敏症的方法中的用途，其中将有效量的所述组合物施用于所述马科哺乳动物，优选施用于所述马。在一个优选的实施方式中，与在所述施用之前的至少一种IBH参数或症状相比，所述本发明的免疫原性或疫苗组合物的所述施用降低所述至少一种IBH参数或症状，并且其中优选所述至少一种IBH参数或症状是皮肤损伤的水平或严重性等级，并且其中进一步优选所述皮肤损伤的水平或严重性等级的所述降低通过症状损伤评分测试来确定。

另一方面，本发明提供用于预防或治疗昆虫叮咬高敏症的试剂盒，其包含本发明的组合物、本发明的免疫原性或疫苗组合物或本发明的药物组合物以及所述试剂盒的使用说明书。

另一方面，本发明提供了用于治疗IBH的方法，其包括将有效量的本发明的组合物、或免疫原性或疫苗组合物、或药物组合物施用于马科哺乳动物，优选施用于马，其中有效量足以改善IBH的一种或多种症状。

实施例

实施例1

马白细胞介素-5(eIL-5)的克隆、表达和纯化

A.eIL-5-C-His的克隆和在大肠杆菌中作为包涵体的表达

通过基因合成产生编码成熟eIL-5(成熟白细胞介素-5，马；UniProt O02699)及其片段的DNA序列。已经产生了SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 和SEQ ID NO:3。SEQ ID NO:1对应于SEQ ID NO:2，但缺少SEQ ID NO:2 的第一个氨基酸L，而SEQ ID NO:3对应于鉴定为UniProt O02699的全长 eIL-5序列。

另外在C-末端添加连接子(GGC)。该插入片段的侧翼为5'NdeI和 3'XhoI，并被整合到pET 42b(+)中，其含有辛组氨酸标签(以便于纯化) 和框内终止密码子。该构建体被称为pET42b-eIL-5(SEQ ID NO:4)。克隆程序的保真度通过DNA测序来确认。将构建体pET42b-eIL-5(SEQ ID NO:4) 转化到大肠杆菌菌株BL21-DE3中。在大肠杆菌中表达的重组蛋白被称为 eIL-5-C-His(SEQ ID NO:5)。类似地，已经制备了SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQID NO:37，其全部包含含有连接子和His-标签的半胱氨酸残基，其中SEQ ID NO:35和SEQID NO:36在C-末端包含连接子(GGC)和His- 标签。SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36和SEQ ID NO:37在本文中可互换地称为“eIL-5-C-His”。此外，当在本实施例部分和所述图中涉及 eIL-5-C-His时，已经使用了这些eIL-5-C-His重组蛋白之一，在各种实施例中甚至多于一种或全部使用在重复的实验中。非常优选使用的eIL-5-C-His是 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。在BL21-DE3细胞中进行克隆pET42b-eIL5-C-His的eIL-5-C-His的更大规模表达。为此，将含有 pET42b-eIL-5-C-His的克隆BL21-DE3细胞在180ml含有50mg/L卡那霉素的 LB中生长过夜。用这种培养物接种含有50mg/L卡那霉素的10L LB。培养物生长至光密度OD_600nm为0.7，通过加入10ml 1.0M异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)储存液诱导表达4小时。重组eIL-5-C-His以不溶形式表达并位于诱导细胞的包涵体部分中。以流动的方式证实eIL-5-C-His的表达。诱导后4小时进行培养，并在4℃下以4200×g离心10分钟。使用分散机(800rpm) 将粒料用重悬浮缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8.0，4℃，1mM EDTA)(3ml/g 细胞)重悬。将重悬浮的细胞收集在Falcon管中并在液氮中震荡冷冻并在-20 ℃下储存过夜。重悬浮的细胞在室温下解冻，并通过细胞裂解器或杜恩斯匀浆器和超声仪(50μl样品用于凝胶分析：样品A＝裂解物，50μl)打开细胞。加入0.5体积的冷triton缓冲液(60mM EDTA，1.5M NaCl，用NaOH调节至 pH 7.0，然后加入6％(v/v)Triton-X-100)，并在4℃下搅拌30分钟。此后，将裂解物在4800×g和4℃(50μl样品用于凝胶分析：样品B＝可溶级分，50ml) 下离心30分钟。将包涵体用分散机重悬于洗涤缓冲液(100mMTris/HCl pH 8.0，4℃，20mM EDTA)中，并在48000×g和4℃下离心10分钟。重复该洗涤步骤四次以去除triton-x 100，最后将包涵体储存在-20℃下。将包涵体在室温下解冻，并使用分散机通过重悬于溶解缓冲液(6M GdmCl，20mM Immidazol，100mM Tris-HCl pH 8，在室温下)(20ml/g包涵体)中而溶解并在室温下搅拌1-2小时。将溶解的包涵体在20℃下以平均100000×g超离心 20分钟(50μl凝胶用于分析样品：样品C＝溶解的IBs 50μl)。

B.eIL-5-C-His的纯化和重折叠

通过Ni-NTA树脂(Ni-NTA Sepharose 6Fast Flow，Amersham，目录号 17-5318-01或Ni-NTA Sepharose SUperflow，Quiagen，目录号1018142)柱，用溶解缓冲液作为结合缓冲液A并用缓冲液B(6M GdmCl，100mM NaH₂PO₄， 10mM TrisHCl，pH 4.5)洗脱(50μl样品用于凝胶分析：样品D＝流经体NiNTA； 50μl，样品E＝峰NiNTA 50μl)来纯化蛋白质。通过SDS-PAGE分析纯化。合并来自含有eIL-5-C-His的洗脱步骤的级分，并使用10kDa截留膜在室温下对 6M GdmCl，100mM NaH₂PO₄，10mM Tris，pH8.0透析2小时。

用6M盐酸胍从洗涤剂洗涤的包涵体中提取不溶性eIL-5-C-His。通过 SDS-PAGE(图1)分析不同的洗涤步骤：裂解物(图1，泳道1)，可溶性级分(图1，泳道2)，溶解的包涵体(图1，泳道3)。通过金属螯合亲和层析以纯化溶解的蛋白质，并通过SDS-PAGE分析(图1，泳道4，流经体，泳道5，合并的级分洗脱液)。发现重组eIL-5-C-His通过该程序被高度富集。通过在非还原条件下(用SDS，无DTT，不加热样品)进行的SDS-PAGE(图 2)评估天然蛋白质(图2，泳道1)，发现主要为单体蛋白质。如下所述使变性蛋白进行重折叠程序，并任选地通过尺寸排阻色谱进一步纯化。

为了重折叠eIL-5-C-His，蛋白质通过以下缓冲液依次透析：缓冲液1(2M 尿素，50mM NaH₂PO₄，5mM还原型谷胱甘肽，0.5mM氧化型谷胱甘肽，0.5M 精氨酸，10％甘油)，缓冲液2(50mM NaH₂PO₄，5mM还原型谷胱甘肽，0.5mM 氧化型谷胱甘肽，0.5M精氨酸，10％甘油)，缓冲液3(50mM NaH₂PO₄，10％甘油)，缓冲液4(PBS)。任选地将重折叠的蛋白质通过离心过滤器(Amicon， Ultrafree-15Millipore，10kDa截留值)浓缩，并在具有PBS缓冲液的HiLoad26/60Superdex 75制备级(GE Healthcare，目录号28-9893-34)上纯化。将洗脱的级分合并，并通过非还原性SDS-PAGE进行分析。通过UV-VIS或 Bradford测定来测量蛋白质浓度。

由于具有生物活性的天然IL-5是二硫键连接的同型二聚体，通过在非还原条件下进行的SDS-PAGE来评估纯化的重组eIL-5-C-His在重折叠后形成二聚体的能力(图2，泳道2)。如通过约28kDa的分子量所判断的，证实了 eIL-5-C-His在性质上是二聚体，表明天然三级结构的保守性。

C.富含eIL-5-C-His的重组同型二聚体的结构

为了确认正确的二级结构(图3A)，测量通过远-UV显示的α-螺旋和β- 薄片的CD光谱。

进行质谱分析(消解的eIL-5-C-His的MALDI/MS/MS，随后进行HPLC) 以确认蛋白质的二级以外的一级、三级和四级结构。通常，IL-5单体通过两个分子间二硫键连接成同二聚体，从而导致两个单体的头对尾位置。

通过ELISA测试市售抗体与重组eIL-5-C-His结合的能力(图3B)。 Maxisorp 96孔ELISA板(Nunc)用50μl的0.5mg/L抗His抗体涂布过夜。用PBS-Tween 0.1％(v/v)(PBST)洗涤平板3次，然后用Superblock(Thermo Scientific)在37℃封闭1小时。用PBST洗涤平板两次，加入纯化的重组 eIL-5-C-His(10mg/L)并温育1小时。然后用PBST洗涤平板3次，并以1/3 稀释度从4μg/ml滴定抗eIL-5抗体(马IL-5亲和纯化多克隆抗体，R&D Systems，UK，目录号AF2470)，并在室温下温育2小时。随后用PBST洗涤平板3次，并与缀合有HRP(稀释度1：2000)的第二抗山羊IgG在室温下温育30分钟。再次用PBS洗涤平板3次，加入50μl/孔显色溶液(TMB)。在室温下反应2分钟后，用25μl/孔5％H₂SO₄终止ELISA。在Tecan M200分光光度计(Tecan,Austria)上在450nm处测量吸光度。

通过圆二色性(CD)光谱法测量重组eIL-5-C-His的正确重折叠，并且如预期的，在大多数α-螺旋和β-薄片中也可以发现(图3A)。由MALDI/MS/MS 进一步证实了两个单体的通过两个分子间二硫键的连接。质量2505、2633 和2761m/z的MSMS级分显示通常的二硫化物片段模式32/2/32。两个单体经由2个二硫键连接，因为在分子间Cys44连接到Cys86(光谱未显示)。此外，在ELISA中重折叠的马IL-5-C-His可通过市售的抗马IL-5抗体检测(图 3B)。

实施例2

马嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)(eEotaxin)的克隆、表达和纯化

A.eEotaxin-C-His的克隆和在大肠杆菌中作为包涵体的表达

通过基因合成产生编码成熟eEotaxin(成熟Eotaxin，马；UniProt Q9TTQ4) 及其片段的DNA序列。已经产生了SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。SEQ ID NO:6对应于SEQ ID NO:7，但缺少SEQ ID NO:7的第一个氨基酸Q，而SEQ ID NO:8对应于鉴定为UniProt Q9TTQ4的全长eEotaxin序列。

另外在C-末端添加连接子(GGC)。该插入片段的侧翼为5'NdeI和3'XhoI，并被整合到pET 42b(+)中，其含有辛组氨酸标签(以便于纯化)和框内终止密码子。该构建体被称为pET42b-eEotaxin(SEQ ID NO:9)。克隆程序的保真度通过DNA测序来确认。将构建体pET42b-eEotaxin(SEQ ID NO:9)转化到大肠杆菌菌株BL21-DE3中。在大肠杆菌中表达的重组蛋白被称为 eEotaxin-C-His(SEQ ID NO:10)。

在BL21-DE3细胞中进行克隆pET42b-eEotaxin-C-His的eEotaxin-C-His 的更大规模表达。为此，将含有pET42b-eEotaxin-C-His的克隆BL21-DE3细胞在180ml含有50mg/L卡那霉素的LB中生长过夜。用这种培养物接种含有 50mg/L卡那霉素的10L LB。培养物生长至光密度OD_600nm为0.7，通过加入 10ml 1.0M异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)储存液诱导表达4小时。重组eEotaxin-C-His以不溶形式表达并位于诱导细胞的包涵体部分中。以流动的方式证实eEotaxin-C-His的表达。诱导后进行培养4小时，并在4℃下以 4200×g离心10分钟。使用分散机(800rpm)将粒料用重悬浮缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8.0，4℃，1mMEDTA)(3ml/g细胞)重悬。将重悬浮的细胞收集在Falcon管中并在液氮中震荡冷冻并在-20℃下储存过夜。重悬浮的细胞在室温下解冻，并通过细胞裂解器或杜恩斯匀浆器和超声仪(50μl样品用于凝胶分析：样品A＝裂解物，50μl)打开细胞。加入0.5体积的冷triton缓冲液(60mM EDTA，1.5M NaCl，用NaOH调节至pH 7.0，然后加入6％(v/v) Triton-X-100)，并在4℃下搅拌30分钟。此后，将裂解物在4800×g和4℃(50μl 样品用于凝胶分析：样品B＝可溶级分，50ml)下离心30分钟。将包涵体用分散机重悬于洗涤缓冲液(100mM Tris/HCl pH8.0，4℃，20mM EDTA)中，并在48000×g和4℃下离心10分钟。重复该洗涤步骤四次以去除triton-x 100，最后将包涵体储存在-20℃下。将包涵体在室温下解冻，并使用分散机通过重悬于溶解缓冲液(6M GdmCl，20mM Immidazol，100mM Tris-HCl pH 8，在室温下)(20ml/g包涵体)中而溶解并在室温下搅拌1-2小时。将溶解的包涵体在20℃下以平均100000×g超离心20分钟(50μl样品用于凝胶分析：样品 C＝溶解的IB 50μl)。

B.eEotaxin-C-His的纯化和重折叠

通过Ni-NTA树脂(Ni-NTA Sepharose 6Fast Flow，Amersham，目录号 17-5318-01或Ni-NTA Sepharose SUperflow，Quiagen，目录号1018142)柱，用溶解缓冲液作为结合缓冲液A并用缓冲液B(6M GdmCl，100mM NaH₂PO₄， 10mM TrisHCl，pH 4.5)洗脱(50μl样品用于凝胶分析：样品D＝流经体NiNTA； 50μl，样品E＝峰NiNTA 50μl)来纯化蛋白质。通过SDS-PAGE分析纯化。合并来自含有eEotaxin-C-His的洗脱步骤的级分，并使用10kDa截留膜在室温下对6M GdmCl，100mM NaH₂PO₄，10mM Tris，pH8.0透析2小时。通过在重折叠缓冲液(0.1MTrisHCl，pH 8.0，4℃，1mM氧化型谷胱甘肽，0.1mM 还原型谷胱甘肽)中快速稀释以在4℃和50μg/ml下重折叠蛋白质12小时。使用交叉流进一步浓缩重折叠的蛋白质，并将缓冲液更换为PBS(Sartorius， VivaFlow 200，5kDa截留值)。任选地将重折叠的蛋白质通过离心过滤器 (Amicon，Ultrafree-15Millipore，3kDa截留值)浓缩，并在具有PBS缓冲液的HiLoad26/60Superdex 75制备级(GE Healthcare，目录号28-9893-34) 上纯化。通过UV-VIS或Bradford测定来测量蛋白质浓度。

用6M盐酸胍从洗涤剂洗涤的包涵体中提取不溶性eEotaxin-C-His。通过 SDS-PAGE分析不同的洗涤步骤(图4)：裂解物(图4，泳道1)，可溶性级分(图4，泳道2)。通过金属螯合亲和层析以从包涵体纯化溶解的蛋白质，并通过SDS-PAGE重折叠和分析(图4，泳道3，流经体，泳道4，柱重折叠洗脱液的合并级分)。发现重组eEotaxin-C-His通过该程序被高度富集，并发现主要为单体形式。任选地通过尺寸排除色谱进一步纯化。

C.重组重折叠的马嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)的结构

通过ELISA测试市售抗体与重组eEotaxin-C-His结合的能力(图5)。测试孔：将50μl 10mg/L的eEotaxin-C-His或市售的马CCL-11蛋白质(重组马 CCL-11，KingfisherBiotech Inc.,目录号RP0066E)涂布在Maxisorp 96孔 ELISA平板(Nunc)上过夜。用PBS-Tween 0.1％(v/v)(PBST)洗涤平板3 次，然后用Superblock(Thermo Scientific)在室温下封闭2小时。用PBST 洗涤平板3次，并以1/3稀释度从4μg/ml滴定抗CCL-11抗体(对马CCL-11 具有反应性的抗CCL-11多克隆抗体，Aviva，目录号ARP30865_P050)，并在室温下温育2小时。随后用PBST洗涤平板3次，并与缀合有HRP(稀释度1：2000)的第二抗兔IgG在室温下温育30分钟。再次用PBS洗涤平板3 次，加入50μl/孔显色溶液(TMB)。在室温下反应2分钟后，用25μl/孔5％H₂SO₄终止ELISA。在Tecan M200分光光度计(Tecan,Austria)上在450nm处测量吸光度。eEotaxin的适当重折叠通过ELISA确认。重折叠的马eEototin-C-His 可通过对马CCL-11具有反应性的市售抗CCL11抗体检测(图5)。

实施例3

马IL-31(eIL-31)的克隆、表达和纯化

A.eIL-31-C-His的克隆和在大肠杆菌中作为包涵体的表达

通过基因合成产生编码成熟eIL-31(成熟嗜酸性粒细胞趋化因子 (Eotaxin)，马；UniProt F7AHG9)(SEQ ID NO:11)及其片段(SEQ ID NO:12) 的DNA序列。

另外在C-末端添加连接子(GGC)。该插入片段的侧翼为5'NdeI和3'XhoI，并被整合到pET 42b(+)中，其含有辛组氨酸标签(以便于纯化)和框内终止密码子。该构建体被称为pET42b-eIL-31(SEQ ID NO:13)。克隆程序的保真度通过DNA测序来确认。将构建体pET42b-eIL-31(SEQ ID NO:13)转化到大肠杆菌菌株BL21-DE3中。在大肠杆菌中表达的重组蛋白被称为 eIL-31-C-His(SEQ ID NO:14)。

在BL21-DE3细胞中进行克隆pET42b-eIL31-C-His的eIL-31-C-His的更大规模表达。为此，将含有pET42b-eIL-31-C-His的克隆BL21-DE3细胞在 180ml含有50mg/L卡那霉素的LB中生长过夜。用这种培养物接种含有 50mg/L卡那霉素的10L LB。培养物生长至光密度OD_600nm为0.7，通过加入 10ml 1.0M异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)储存液诱导表达4小时。重组eIL-31-C-His以不溶形式表达并位于诱导细胞的包涵体部分中。以流动的方式证实eIL-31-C-His的表达。诱导后进行培养4小时，并在4℃下以 4200×g离心10分钟。使用分散机(800rpm)将粒料用重悬浮缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8.0，4℃，1mM EDTA)(3ml/g细胞)重悬。将重悬浮的细胞收集在Falcon管中并在液氮中震荡冷冻并在-20℃下储存过夜。重悬浮的细胞在室温下解冻，并通过细胞裂解器或杜恩斯匀浆器和超声仪(50μl样品用于凝胶分析：样品A＝裂解物，50μl)打开细胞。加入0.5体积的冷triton缓冲液 (60mMEDTA，1.5M NaCl，用NaOH调节至pH 7.0，然后加入6％(v/v) Triton-X-100)，并在4℃下搅拌30分钟。此后，将裂解物在4800×g和4℃(50μl 样品用于凝胶分析：样品B＝可溶级分，50ml)下离心30分钟。将包涵体用分散机重悬于洗涤缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8.0，4℃，20mM EDTA)中，并在48000×g和4℃下离心10分钟。重复该洗涤步骤四次以去除triton-x100，最后将包涵体储存在-20℃下。将包涵体在室温下解冻，并使用分散机通过重悬于溶解缓冲液(6M GdmCl，20mM咪唑，100mM Tris-HCl pH 8，在室温下)(20ml/g包涵体)中而溶解并在室温下搅拌1-2小时。将溶解的包涵体在 20℃下以平均100000×g离心20分钟(50μl样品用于凝胶分析：样品C＝溶解的IBs 50μl)。

B.eIL-31-C-His的纯化和重折叠

通过Ni-NTA树脂(Ni-NTA Sepharose 6Fast Flow，Amersham，目录号 17-5318-01或Ni-NTA Sepharose SUperflow，Quiagen，目录号1018142)柱，用溶解缓冲液作为结合缓冲液A并用缓冲液B(6M GdmCl，100mM NaH₂PO₄， 10mM TrisHCl，pH 4.5)洗脱(50μl样品用于凝胶分析：样品D＝流经体NiNTA； 50μl，样品E＝峰NiNTA 50μl)来纯化蛋白质。通过SDS-PAGE分析纯化。合并来自含有eIL-31-C-His的洗脱步骤的级分，并使用8kDa截留膜在室温下对 6M GdmCl，100mM NaH₂PO₄，10mM Tris，pH8.0透析2小时。

用6M盐酸胍从洗涤剂洗涤的包涵体中提取不溶性eIL-31-C-His。通过 SDS-PAGE分析不同的洗涤步骤(图6)：裂解物(图6，泳道1)，可溶性级分(图6，泳道2)，溶解的包涵体(图6，泳道3)。通过金属螯合亲和层析来纯化溶解的蛋白质，并通过SDS-PAGE分析(图6，泳道4，合并的级分洗脱液)。发现重组eIL-31-C-His通过该程序被高度富集。通过在非还原条件下进行的SDS-PAGE评估天然蛋白质(图7，泳道1)，发现主要为单体蛋白质。如下所述使变性蛋白进行重折叠程序，并任选地通过尺寸排除色谱进一步纯化。

为了重折叠eIL-31-C-His，蛋白质通过以下缓冲液依次透析：缓冲液1 (2M尿素，50mM NaH₂PO₄，5mM还原型谷胱甘肽，0.5mM氧化型谷胱甘肽，0.5M精氨酸，10％甘油)，缓冲液2(50mM NaH₂PO₄，5mM还原型谷胱甘肽，0.5mM氧化型谷胱甘肽，0.5M精氨酸，10％甘油)，缓冲液3(50mM NaH₂PO₄，10％甘油)，缓冲液4(PBS)。任选地将重折叠的蛋白质通过离心过滤器(Amicon，Ultrafree-15Millipore，10kDa截留值)浓缩，并在具有PBS 缓冲液的HiLoad 26/60Superdex 75制备级(GE Healthcare，目录号 28-9893-34)上纯化。将洗脱的级分合并并通过非还原性SDS-PAGE(用SDS，无DTT，不加热样品)进行分析。通过UV-VIS或Bradford测定来测量蛋白质浓度。

通过在非还原条件下进行的SDS-PAGE来评估纯化的重组eIL-31-C-His 在重折叠后形成二聚体的能力(图7，泳道2)。如通过约33kDa的分子量所判断那样，证实了eIL-31-C-His部分地以二聚体结构存在。

C.重组重折叠的马eIL-31-C-His的生物学活性

将eIL-31-C-His皮下注射到马的颈部。瘙痒定义为在注射部位(颈部) 发痒≥5秒。在注射后1小时开始，每小时计数总计5小时的划痕/瘙痒数量。将注射eIL-31-C-His后的瘙痒与注射eIL-5-C-His对照进行比较。对 eIL-31-C-His记录的瘙痒数量比对照记录的数量增加(图8)。

实施例4

黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)的分离与克隆

根据制造商的说明，使用TRI试剂(Sigma，Saint Louis，USA)从CMV 感染的百合叶中分离总RNA。对于cDNA合成，使用OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen,Venlo,Netherlands)。为了扩增CMV CP基因，在分析来自GenBank 的CMV序列之后选择引物序列：CMcpF (CACCAT GGACAAATCTGAATCAACCAGTGCTGGT)(SEQ ID NO:22)和 CMcpR(CAAAGCTTATCAAACTGGGAGCACCCCAGATGTGGGA)(SEQ ID NO:23)；NcoI和HindIII位点标有下划线。将相应的PCR产物克隆到 pTZ57R/T载体(Fermentas，Vilnius，Lithuania)中。使用大肠杆菌XL1-Blue 细胞作为宿主用于克隆和质粒扩增。为了避免选择含有PCR错误的克隆，使用BigDye循环测序试剂盒和ABI Prism 3100遗传分析仪(Applied Biosystems，Carlsbad，USA)对含有CP基因的几个pTZ57质粒克隆进行测序。测序后，将编码SEQ ID NO:15的CMV外壳蛋白的无序列错误的CMVCP 基因(SEQ ID NO:24)的cDNA亚克隆到pET28a(+)表达载体(Novagen， San Diego，USA)的NcoI/HindIII位点中，导致表达质粒pET-CMVwt(图9)。

实施例5

SEQ ID NO:15的CP在大肠杆菌中的表达导致CMV的VLP

为了获得CMV VLP，用含有CMV CP基因的质粒pET-CMVwt转化大肠杆菌C2566细胞(New England Biolabs，Ipswich，USA)。在选择具有最高表达水平的靶蛋白的克隆后，将大肠杆菌培养物在旋转振荡器(200转/分钟； Infors，Bottmingen，Switzerland)上在含有卡那霉素(25mg/l)的2xTY培养基中于30℃生长至OD600为0.8-1.0。然后，用0.2mM IPTG诱导细胞，并向培养基中补充5mM MgCl₂。在20℃的旋转振荡器上继续温育18小时。通过低速离心收集得到的生物质，并在-20℃下冷冻。在冰上解冻后，将细胞悬浮于含有50mM柠檬酸钠、5mM硼酸钠、5mM EDTA、5mM巯基乙醇(pH 9.0，缓冲液A)的缓冲液中，并通过超声波处理破碎。通过离心(13000rpm，5 ℃下30分钟)去除不溶性蛋白质和细胞碎片。使用饱和硫酸铵(1：1，体积 /体积)在+4℃过夜以将澄清的裂解物中的可溶性CMV CP蛋白质沉淀。沉淀的蛋白质在+4℃溶解在相同的缓冲液A(不含巯基乙醇)中4小时。通过低速离心(13000rpm，4℃下15分钟)去除不溶蛋白。通过超速离心(SW28 转子，Beckman，Palo Alto，USA；25000rpm，6小时，5℃)，以蔗糖梯度(缓冲液A中含20-60％蔗糖，不含巯基乙醇，补充有0.5％Triton X-100)将含有可溶性CMV CP的蛋白质溶液与细胞蛋白质分离。将梯度分成六个级分，从梯度的底部开始，通过SDS-PAGE分析级分(数据未显示)。将含有重组CMV CP的级分2和级分3合并，并用200体积的缓冲液(5mM硼酸钠，2mM EDTA， pH9.0)透析以去除蔗糖和Triton X-100。透析后，将CMV CP溶液通过0.2μm 过滤器过滤灭菌。接着，使用Type70转子(Beckman，Palo Alto，USA)在无菌条件下(50000rpm，4小时，+5℃)通过20％蔗糖“缓冲物”超速离心以浓缩CMV CP。使用QuBit荧光计根据制造商的建议(Invitrogen，Eugene， USA)估计纯化的CMVwt的浓度。将浓缩的VLP溶液(大约3mg/ml)在+4 ℃储存在5mM硼酸钠，2mM EDTA缓冲液(pH9.0)中。涉及VLP表达和纯化的所有步骤通过使用12.5％凝胶的SDS-PAGE监测。

CMV外壳蛋白能够成功地在大肠杆菌细胞中表达并且获得的显著的部分能够为可溶级分。此外，这些蛋白质以等距VLP的形式直接在大肠杆菌细胞中发现，通过蔗糖梯度分析(图10A)、动态光散射和电子显微术分析(图 10B)证实。

实施例6

含有破伤风类毒素表位的CMV的经修饰的外壳蛋白的克隆 (CMV-Ntt830)

为了用破伤风类毒素表位编码序列取代SEQ ID NO:15的CMV CP的N- 末端的原始氨基酸，将pET-CMVwt质粒用于PCR扩增和诱变。位于CMVwt 基因内的SalI位点(图9)用于克隆相应的PCR产物。

为了将破伤风类毒素表位编码序列引入CMVwt基因，使用两步PCR诱变。对于第一步扩增，使用以下引物：来自多连接子上游的pET-220(SEQ ID NO:25)，扩增的区域包含BglII位点)和CMV-tt83-1R(SEQ ID NO:26)。对于第二轮，将来自第一扩增的PCR产物以1：50稀释并用引物pET-220(SEQ ID NO:25)和CMV-tt83Sal-R2(SEQ ID NO:27)再扩增。将得到的PCR产物 (编码SEQ ID NO:20的CMV-Ntt830的SEQ ID NO:28的cDNA)亚克隆到 pET-CMVwt的BglII/SalI位点中。正确的克隆通过测序鉴定并命名为 pET-CMV-Ntt830。

实施例7

CMV-Ntt830在大肠杆菌中的表达导致CMV的经修饰的VLP

为了获得CMV-Ntt830VLP，用含有CMV-Ntt830基因的质粒 pET-CMV-Ntt830转化大肠杆菌C2566细胞(New England Biolabs，Ipswich， USA)。在选择具有最高表达水平的靶蛋白的克隆后，将大肠杆菌培养物在旋转振荡器(200转/分钟；Infors，Bottmingen，瑞士)上在含有卡那霉素(25mg/l) 的2xTY培养基中于30℃生长至OD600为0.8-1.0。然后，用0.2mM IPTG诱导细胞，并向培养基中补充5mM MgCl₂。在20℃的旋转振荡器上继续温育 18小时。通过低速离心收集所得的生物质，并在-20℃下冷冻。在冰上解冻后，将细胞悬浮于含有50mM柠檬酸钠、5mM硼酸钠、5mM EDTA、5mM巯基乙醇(pH9.0，缓冲液A)的缓冲液中，并通过超声破碎。通过离心(13000rpm， 5℃下30分钟)去除不溶性蛋白质和细胞碎片。使用饱和硫酸铵(1：1，体积/体积)在+4℃过夜以将澄清的裂解物中的可溶性CMV CP蛋白质沉淀。沉淀的蛋白质在+4℃溶解在缓冲液A(不含巯基乙醇)中4小时。通过低速离心(13000rpm，4℃下15分钟)去除不溶蛋白。通过超速离心(SW28转子， Beckman，Palo Alto，USA；25000rpm，6小时，5℃)，以蔗糖梯度(缓冲液 A中含20-60％蔗糖，不含巯基乙醇，补充有0.5％Triton X-100)将含有可溶性CMV CP的蛋白质溶液与细胞蛋白质分离。从梯度的底部开始将梯度分成六个级分。将含有重组CMV-Ntt830的级分合并，并用200体积的5mM硼酸钠、2mM EDTA(pH9.0)透析以去除蔗糖和Triton X-100。透析后，将 CMV-Ntt830溶液通过0.2μm过滤器过滤灭菌。接着，使用Type70转子 (Beckman，Palo Alto，USA)在无菌条件下(50000rpm，4小时，+5℃)通过20％蔗糖“缓冲物”超速离心以浓缩CMV-Ntt830。使用QuBit荧光计根据制造商的建议(Invitrogen，Eugene，USA)估计纯化的CMV-Ntt830的浓度。将浓缩的VLP溶液(大约3mg/ml)在+4℃储存在5mM硼酸钠、2mM EDTA 缓冲液(pH9.0)中。涉及VLP表达和纯化的所有步骤通过使用12.5％凝胶的SDS-PAGE监测。为了证明CMV VLP中破伤风类毒素表位的存在，使用纯化的CMV-Ntt830VLP的质谱分析。如图11C中所示，如果在大肠杆菌细胞中蛋白质合成期间发生的第一次甲硫氨酸被去除，则获得的主峰对应于蛋白质的理论分子量。动态光散射和电子显微术证实与CMVwt VLP相似的等距颗粒形态学(图12A和12B)。

实施例8

含有PADRE表位的CMV的经修饰的外壳蛋白的克隆 (CMV-Npadr)

为了将PADRE表位编码序列引入CMVwt基因，使用扩增和亚克隆 pET-CMVwt质粒(也参见实施例5和6)作为模板进行PCR诱变。为了扩增，使用以下引物：pET-220(SEQ IDNO:25)和CMV-padrSal-R(SEQ ID NO:29)。将得到的PCR产物(编码SEQ ID NO:21的CMV-Npadr的SEQ ID NO:30的 cDNA)再次亚克隆到pET-CMVwt的BglII/SalI位点中。正确的克隆通过测序鉴定并命名为pET-CMV-Npadr。

实施例9

CMV-Npadr在大肠杆菌中的表达导致CMV的经修饰的VLP

CMV-Npadr的表达和纯化程序基本上与CMV-Ntt830相同，如实施例7 中所述。为了证明CMV VLP中PADRE表位的存在，使用纯化的CMV-Npadr VLP的质谱分析。如图11B中所示，如果在大肠杆菌细胞中蛋白质合成期间发生的第一次甲硫氨酸被去除，则获得的主峰对应于蛋白质的理论分子量。动态光散射和电子显微术分析证实等距颗粒形态(图13A和图13B)。

实施例10

eIL-5抗原与不同VLP的偶联，马的免疫，以及在IBH倾向的马中的效力的证明

A.eIL5-C-His与Qβ的VLP的偶联

如WO02/056905中所述产生包含SEQ ID NO:31的外壳蛋白的QβVLP，并与10倍摩尔过量的异双功能交联剂琥珀酰亚胺基-6(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)(Pierce)反应。通过穿过PD-10脱盐柱(GE Healthcare) 去除未反应的交联剂。重组、纯化和重折叠的eIL-5-C-His用等摩尔过量的 PBS(pH 8.0)中的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原1小时，以还原连接子中所含的半胱氨酸残基。然后将还原的eIL-5-C-His与衍生的Qβ VLP以1：2的Qβ单体与eIL-5-C-His蛋白的摩尔比混合，并在22℃下共温育4小时以允许交联。任选地，使用300kDa截留透析膜对pH 7.4的PBS透析反应12小时，或使用100kDaMWCO通过切向流过滤去除游离未偶联的 eIL-5-C-His。

分析：SDS-PAGE的考马斯染色(图14A)：通过SDS-PAGE分离Qβ、 eIL5-C-His和eIL5-C-His-QβVLP。随后将凝胶用考马斯蓝(0.025％考马斯亮蓝R-250，40％甲醇，10％乙酸)染色并用脱色剂(40％甲醇，10％乙酸)去染色。

用抗His抗体进行蛋白质印迹染色(图14B)：通过SDS-PAGE分离Qβ、 eIL5-C-His和IL5-C-His-Qβ疫苗，并电印迹到硝酸纤维素膜上。用含有5％ (w/v)BSA粉末的PBST将膜封闭1小时，然后与10ml以1：800稀释的抗 His抗体(Penta-His抗体，无BSA，小鼠单克隆IgG1，目录号34660)在含有1％BSA(w/v)粉末的PBST中一起温育。将膜用PBST洗涤15分钟，然后与以1：10000稀释的与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的PBST抗小鼠IgG 抗体(含有10ml 1％(w/v)BSA)温育1小时。将膜在PBS中洗涤15分钟，并用ECL(Amersham Pharmacia，瑞典)显影并暴露于照相胶片。

通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析来评估eIL5-C-His与病毒样颗粒Qβ的共价化学偶联。偶联反应的考马斯蓝染色的凝胶证明了，条带的出现对应于与Qβ共价连接的马IL5-C-His所预测的分子量(图14A)。此外，蛋白质印迹分析显示在用抗His抗体染色时共定位这些条带(图14B)。

B.eIL5-C-His与CMV-Npadr VLP和与CMV-Ntt830VLP的偶联

如上所述产生CMV-Npadr VLP和CMV-Ntt830VLP，并与10倍摩尔过量的异双功能交联剂琥珀酰亚胺基-6(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)-己酸酯 (SMPH)(Pierce)反应。通过穿过PD-10脱盐柱(GE Healthcare)去除未反应的交联剂。重组、纯化和重折叠的eIL-5-C-His用等摩尔过量的PBS(pH 8.0)中的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原1小时，以还原连接子中所含的半胱氨酸残基。然后将还原的eIL-5-C-His与衍生的CMV-Npadr或 CMV-Ntt830VLP以1：2的VLP单体与eIL-5-C-His蛋白的摩尔比混合，并在22℃下共温育4小时以允许交联。任选地，使用300kDa截留透析膜对pH 7.4的PBS透析反应12小时，或使用100kDa MWCO通过切向流过滤去除游离未偶联的eIL-5-C-His。

分析：SDS-PAGE的考马斯染色(图15A)：通过SDS-PAGE分离 CMV-Npadr和CMV-Ntt830、eIL5-C-His、eIL5-C-His-CMV-Npadr VLP和 eIL5-C-His-CMV-Ntt830VLP。随后将凝胶用考马斯蓝(0.025％考马斯亮蓝 R-250，40％甲醇，10％乙酸)染色并用脱色剂(40％甲醇，10％乙酸)去染色。

用抗His抗体进行蛋白质印迹染色(图15B)：通过SDS-PAGE分离 CMV-Npadr和CMV-tt830、eIL5-C-His、eIL5-C-His-CMV-Npadr VLP和 eIL5-C-His-CMV-Ntt830VLP，并电印迹到硝酸纤维素膜上。用含有5％(w/v) BSA粉末的PBST将膜封闭1小时，然后与10ml以1：1000稀释的抗His 抗体(单克隆抗His标签抗体HRPO缀合物，Novagen目录号71840)在含有1％(w/v)BSA粉末的PBST中一起温育。将膜用PBST洗涤15分钟，然后用ECL(AmershamPharmacia，瑞典)显影并暴露于照相胶片。

通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析评估eIL5-C-His与CMV-Npadr VLP 和CMV-Ntt830VLP的共价化学偶联。偶联反应的考马斯蓝染色的凝胶证明了条带的出现对应于与CMV-Npadr和CMV-tt830共价连接的马IL5-C-His所预测的分子量(图15A)。此外，蛋白质印迹分析显示在用抗His抗体染色时共定位这些条带(图15B)。

C.免疫方案

小鼠。为了在小鼠中产生针对马IL-5的抗体，在第0天和第14天向 C57BL/6或BALB/c小鼠皮下或静脉内注射含有25μg eIL5-C-His-QβVLP的 100μl PBS。在免疫之前和免疫方案的第21天将小鼠放血。通过ELISA分析血清。

马(eIL-5-C-His-QβVLP)。为了产生马IL-5的自身反应性抗体，在第0 天、第21天和第42天向马皮下注射在注射前30min与300μl明矾混合的含有300μg eIL5-C-His-QβVLP的1000μl PBS。当表明时，在第124天给予加强剂。或者在0天、28天、56天和84天时在没有佐剂的存在下向马皮下注射含有300μg eIL5-C-His-QβVLP的1000μl PBS。对于第二年治疗的随访，在没有佐剂的存在下用含有300μg eIL5-C-His-QβVLP的1000μl PBS以每周四次的间隔向马皮下加强免疫2次。在免疫之前和至少在免疫方案的第42 天和第56天以及第56天后各种另外的时间点对马进行放血。通过ELISA分析血清。通过ELISA分析血清。

马(eIL-5-C-His-CMVtt830)。为了产生马IL-5的自身反应性抗体，在第 0、33、53天或第0、28、56和84天向马皮下注射含有300μg或400μg eIL5-C-His-CMVtt830VLP的1000μl PBS。在免疫之前和至少在免疫方案的第16、51、67或56、84天以及第84天后的各种另外的时间点对马进行放血。通过ELISA分析血清。通过ELISA分析血清。

D.通过ELISA分析血清

Maxisorp 96孔ELISA板(Nunc)用50μl纯化的eIL-5-C-His、Qβ或纯化的CMV-Ntt830(10μg/ml)涂布过夜。用含有2％BSA的PBS在室温下封闭2小时的PBST洗涤平板3次。然后用PBST洗涤平板3次，并将3倍稀释的小鼠或马血清加入含有2％BSA的PBS中，并在室温下温育2小时。随后用PBST洗涤平板3次，并与缀合有HRP(1：2000稀释)的抗小鼠IgG 或抗马IgG在室温下温育30分钟。再次用PBS洗涤平板4次，加入50μl/孔显色溶液(TMB)。在室温下反应约2分钟后，用25μl/孔5％H₂SO₄终止ELISA。在Tecan M200分光光度计(Tecan,Austria)上在450nm处测量吸光度。

将疫苗接种eIL5-C-His-QβVLP的小鼠的免疫前血清和第21天血清(图 16A)以及疫苗接种eIL5-C-His-QβVLP的马免疫前血清和第56天血清(图 16B)收集，并通过ELISA分析针对eIL-5-C-His的抗体。收集单只马的免疫前血清和在eIL-5-C-His-CMV-Ntt830的第1次、第2次和第3次疫苗接种后的血清，并分析血清中针对eIL-5-C-His的抗体(图16C)和CMV-Ntt830的抗体(图16D)。另外，针对eIL-5-C-His抗体分析了疫苗接种 eIL-5-C-His-CMVtt830VLP的马的免疫前血清和第84天血清(图16E)。将所有马血清印迹为变量增量OD(ΔOD)值，通过减去OD样品血清减OD 原始血清来计算每种稀释度。马中疫苗接种的结果显示克服了对自身抗原 IL-5的免疫耐受性。响应峰值的半数最大滴度在1：1000-1：50000之间的范围内。

E.体内效力

马。将血液中的嗜酸性粒细胞水平与IBH疾病症状相关联。

采集12只IBH感染的冰岛马的EDTA血液，并分析嗜酸性粒细胞水平。在时期期间，即在4月至10月的月份期间评估进一步的疾病症状评分。将血液中嗜酸性粒细胞的水平与通过损伤症状评分测量的平均疾病症状相关联。根据实施例13进行损伤症状评分。实际上发现病马血液中嗜酸性粒细胞的数量与IBH损伤强度评分之间呈正相关(R²＝0.9227，p<0.0001，n＝12)(图17A)，显示了本发明的组合物及其在免疫IBH感染的马的方法中的使用对于治疗 IBH是有益的。总共48只IBH感染的马(图17B)(R²＝0.3115，p<0.0001， n＝48)在时期期间的血液嗜酸性粒细胞(％)与平均损伤严重性的另外相关性证实了疾病严重性与血液中嗜酸性粒细胞百分比的联系。

案例研究：为了评估疫苗接种对疾病症状和血液嗜酸性粒细胞增多的影响，向IBH感染的冰岛马皮下疫苗接种eIL-5-C-His-Qβ。第一只马已经使用 eIL-5-C-His-Qβ皮下疫苗接种三次。在每次疫苗接种中注射含有300μg eIL-5-C-His-Qβ的1ml PBS。前两次注射物没有明矾，第三次注射物与0.3ml 明矾(Imject Alum，Thermo Scientific，目录号77161)新鲜地(注射前约30 分钟)预混合。最终体积为1.3ml，皮下注射。马在第4天、第32天和第59天进行注射。直接在指定时间点疫苗接种之前和之后，采取血液并分析所述血液中的嗜酸性粒细胞计数，特别是针对eIL-5的抗体滴度；此外，IBH介导的皮肤损伤通过症状评分进行分级。

该实验测试了通过用eIL-5-C-His-Qβ疫苗接种产生的抗eIL5抗体下调内源性eIL-5的体内作用的能力。用eIL-5-C-His-Qβ的免疫诱导了马中的抗马 IL-5抗体滴度(图18A)。与建立抗eIL-5抗体滴度相一致，血液中的嗜酸性粒细胞水平下降(图18B)。此外，当建立抗体滴度并且嗜酸性粒细胞数量下降时，IBH感染损伤开始愈合。根据实施例13的损伤评分，通过尾部和鬃毛上的IBH损伤症状评分(图18C)量化损伤愈合。因此，IBH感染损伤的疾病症状在疫苗接种时消失。不受此限制，相信嗜酸性粒细胞的减少证明了通过用eIL-5-C-His-Qβ免疫产生的自身抗体呈现为高度有序的免疫阵列，其识别内源性靶分子并从而减少IBH感染的马的疾病症状评分。嗜酸性粒细胞水平可以与抗体滴度相关(R²＝0.8098)(图18D)，表明增加的抗体滴度与嗜酸性粒细胞下降相关。

在进一步的案例研究中，为了评估疫苗接种对疾病症状和血液嗜酸性粒细胞增多的影响，向IBH感染的马皮下疫苗接种eIL5-C-His-CMV-Ntt830 VLP。使用eIL5-C-His-CMV-Ntt830VLP向马皮下疫苗接种三次。在每次疫苗接种中注射含有300μg eIL5-C-His-CMV-Ntt830VLP的1ml PBS。第一次注射物在与0.3ml明矾(Imject Alum，Thermo Scientific，目录号77161)新鲜地(注射前约30分钟)预混合的存在明矾的情况下施用，后面两次注射物在没有明矾下进行。最终体积为1.3ml，皮下注射。马在第0天、第33天和第 53天进行注射。直接在指定时间点疫苗接种之前和之后，采取血液并分析所述血液中的嗜酸性粒细胞计数，特别是针对eIL-5的抗体滴度；此外，IBH 介导的皮肤损伤通过症状评分进行分级。

用eIL-5-C-His-CMVtt830疫苗接种时，马建立了针对eIL-5和CMVtt830 的抗体滴度(图18E)。嗜酸性粒细胞水平和损伤严重性随时间变化(图18F)。一旦建立抗eIL-5的抗体滴度，血液中的嗜酸性粒细胞水平下降，并且随时间延迟，损伤严重性相应地降低。

双盲安慰剂对照随机研究IL-5-C-His-Qβ。为了评估疫苗接种对疾病症状和血嗜酸性粒细胞增多的影响，将10只IBH感染的冰岛马加入双盲安慰剂对照随机研究中。在疫苗接种之前的IBH时期(4月-10月)，评估所有马的双周症状评分，并且在8月初对血液嗜酸性粒细胞增多进行量化。在以下IBH 时期开始之前，在第0、21和42天(2月/3月)，6只冰岛马使用300μg eIL-5-C-His-Qβ进行免疫，并且4只冰岛马接受安慰剂。疫苗在1ml PBS中施用。所有注射剂在与0.3ml明矾(Imject Alum，Thermo Scientific，目录号 77161)新鲜地(注射前约30分钟)预混合的情况下施用。所有马在第124 天接受加强免疫接种，并且从3月至10月每月测量抗体滴度和嗜酸性粒细胞计数。此外，损伤分级评估每两周一次。此外，在3月和10月分析了马的健康状况和寄生状况。

随后在整个时期追踪针对Qβ(图18G)和eIL-5(图18H)的抗体滴度的时间线。马已通过从2月开始以三周间隔进行三次注射而疫苗接种，然后在最后一次注射后约两个月进行加强免疫。在活性马中针对eIL-5建立的抗体滴度在开始时变化很大，但是在加强后滴度对于效力方面变化较小(图 18H)。大部分滴度在加强前下降，在该时期中期几乎为零。尽管在本时期中期抗体滴度下降，与治疗之前的2014年相比(图18I)，疫苗接种的马在2015 年治疗期间可以总体上改善其平均损伤严重程度(图18J)。差异无统计学意义，但由于给予的马数量少，时期内的抗体滴度下降，且预评估2014年的平均损伤严重性在活性组中已经高于安慰剂组，但效果仍然卓越。安慰剂马在 2015年的平均损伤严重性是稳定的，或者2例(50％)甚至更恶化，更可能是由于2015的早期、长期和温暖的春季、夏季和秋季。总之，即使抗体滴度不同，疫苗组中的所有马都在治疗年中有所改善，而安慰剂组中的所有马均比上一年稳定或甚至恶化(10％差异上升或下降被确定为在时期性变化之内并且被判断为稳定的)(图18K和图18L)。6只经治疗的马中有6只有所改善； 4只安慰剂马为稳定或恶化，导致统计学显著的治疗效果(图18L)。

随访研究IL-5-C-His-Qβ。使用IL-5-C-His-Qβ对双盲安慰剂对照随机研究中的10只马在随后的2016年中进行了随访。之前的6只活性马在2月和 3月接受了300μg eIL-5-C-His-Qβ的两次加强免疫，间隔4周。之前的4只安慰剂马在第0、28、56和84天接受了300μgeIL-5-C-His-Qβ的活性免疫。所有马的疫苗在1ml PBS中施用，不存在佐剂。从1月和3月至6月每月测量抗体滴度和嗜酸性粒细胞计数，并将随访至10月。此外，损伤分级已是和将是每两周至每月评估。此外，马的健康状况以及寄生状况已在或将在1月和 10月进行分析。从4月至6月随访损伤严重性，并与15只新安慰剂马的损伤严重性进行比较。损伤严重性将随访到十月。

该研究正在进行，但是中期分析比较了这10只随访马与“双盲安慰剂对照随机研究IL-5-His-CMVtt830”的15只安慰剂马在4月至6月的损伤严重性值(图18M)，与安慰剂相比时，在免疫马中显示统计学显著的损伤严重性。

双盲安慰剂对照随机研究IL-5-C-His-CMVtt830。为了评估疫苗接种对疾病症状和血嗜酸性粒细胞增多的影响，将33只IBH感染的冰岛马封闭在双盲安慰剂对照随机研究中。在疫苗接种之前的IBH时期(2015年4月至 10月)，评估所有马匹的每月症状评分，并在时期期间的一个时间点对血液嗜酸性粒细胞增多进行量化。在以下IBH时期开始之前，在第0、28、56和 84天(1月至4月)，18只冰岛马用400μg eIL-5-C-His-CMVtt830免疫，15 只冰岛马接受安慰剂。疫苗在1ml PBS中施用，不存在佐剂。所有马匹在第 126天接受加强疫苗接种，从1月和3月至6月期间每月测量抗体滴度和嗜酸性粒细胞计数，并将随访至10月。此外，马的健康状况以及寄生状况已在或将在1月份和10月份进行分析。从4月到6月随访损伤严重性。损伤严重性将随访到十月。

该研究正在进行，但中期分析比较了2015年4月至6月(图18N)和 2016年(图18O)的损伤严重性值，与先前未经治疗的时期2015和安慰剂相比时，在2016年治疗期间的活性疫苗组中显示损伤严重性降低。对于活性疫苗组和安慰剂组，用从2015年4月至6月的损伤严重性减去2016年4月至6月的损伤严重性的变量增量，导致活性疫苗组中更高的积极(改善)值，而安慰剂组中几乎没有差异(图18P)。因此，IL-5-C-His-CMVtt830疫苗对损伤严重性具有有益作用，因此在治疗上改善疾病症状。

实施例11

eEotaxin抗原与VLP的偶联、马的免疫以及在IBH倾向的马中的效力的证明

A.马Eotaxin-C-His与Qβ的VLP的偶联

如WO02/056905中所述产生包含SEQ ID NO:31的外壳蛋白的QβVLP，并与2.3倍摩尔过量的异双功能交联剂琥珀酰亚胺基-6(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)(Pierce)。通过穿过PD-10脱盐柱(GE Healthcare)去除未反应的交联剂。重组、纯化和重折叠的eEotaxin-C-His用等摩尔过量的PBS (pH 8.0)中的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原1小时，以还原连接子中所含的半胱氨酸残基。然后将还原的eEotaxin-C-His与衍生的QβVLP 以2.4：2的Qβ单体与eEotaxin-C-His蛋白的摩尔比为来混合，并在22℃下共温育4小时以允许交联。任选地，使用300kDa截留透析膜对pH 7.4的PBS 透析反应12小时，或使用100kDa MWCO通过切向流过滤去除游离未偶联的 eIL-5-C-His。

分析：SDS-PAGE的考马斯染色(图19A)：通过SDS-PAGE分离Qβ、 eEotaxin-C-His和eEotaxin-C-His-QβVLP。随后将凝胶用考马斯蓝(0.025％考马斯亮蓝R-250，40％甲醇，10％乙酸)染色并用脱色剂(40％甲醇，10％乙酸)去染色。

用抗His抗体进行蛋白质印迹染色(图19B)：通过SDS-PAGE分离Qβ、eEotaxin-C-His和eEotaxin-C-His-Qβ疫苗，并电印迹到硝酸纤维素膜上。用含有5％(w/v)BSA粉末的PBST将膜封闭1小时，然后与10ml以1：800 稀释的抗His抗体(Penta-His抗体，无BSA，小鼠单克隆IgG1，目录号34660) 在含有1％BSA(w/v)粉末的PBST中一起温育。将膜用PBST洗涤15分钟，然后与以1：10000稀释的与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的PBST抗小鼠IgG 抗体(含有10ml 1％(w/v)BSA)温育1小时。将膜在PBS中洗涤15分钟，并用ECL(AmershamPharmacia，瑞典)显影并暴露于照相胶片。

通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析来评估eEotaxin-C-His与病毒样颗粒 Qβ的共价化学偶联。偶联反应的考马斯蓝染色的凝胶证明了，条带的出现对应于与Qβ共价连接的马Eotaxin-C-His所预测的分子量(图19A)。此外，蛋白质印迹分析显示在用抗His抗体染色时共定位这些条带(图19B)。

B.eEotaxin-C-His与CMV-Ntt830VLP的偶联

如上所述产生CMV-Ntt830VLP，并与2.3倍摩尔过量的异双功能交联剂琥珀酰亚胺基-6(β-马来酰亚胺丙酰胺基)-己酸酯(SMPH)(Pierce)反应。通过穿过PD-10脱盐柱(GEHealthcare)去除未反应的交联剂。重组、纯化和重折叠的eEotaxin-C-His用等摩尔过量的PBS(pH 8.0)中的三(2-羧乙基) 膦盐酸盐(TCEP)还原1小时，以还原连接子中所含的半胱氨酸残基。然后将还原的eEotaxin-C-His与衍生的CMV-Ntt830VLP以2.4：2的VLP单体与eEotaxin-C-His蛋白的摩尔比混合，并在22℃下共温育4小时以允许交联。任选地，使用300kDa截留透析膜对pH 7.4的PBS透析反应12小时，或使用100kDa MWCO通过切向流过滤去除游离未偶联的eEotaxin-C-His。

分析：SDS-PAGE的考马斯染色：通过SDS-PAGE分离eEotaxin-C-His、 CMV-Ntt830和eEotaxin-C-His-CMV-Ntt830VLP。随后将凝胶用考马斯蓝 (0.025％考马斯亮蓝R-250，40％甲醇，10％乙酸)染色并用脱色剂(40％甲醇，10％乙酸)去染色。

用抗His抗体进行蛋白质印迹染色：通过SDS-PAGE分离eEotaxin-C-His、 CMV-Ntt830和eEotaxin-C-His-CMV-Ntt830VLP，并电印迹到硝酸纤维素膜上。用含有5％(w/v)BSA粉末的PBST将膜封闭1小时，然后与10ml以1： 1000稀释的抗His抗体(单克隆抗His标签抗体HRPO缀合物，Novagen目录号71840)在含有1％(w/v)BSA粉末的PBST中一起温育。将膜用PBST 洗涤15分钟，然后用ECL(Amersham Pharmacia，Sweden)显影并暴露于照相胶片。

B.免疫方案

小鼠。为了在小鼠中产生针对马嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)的抗体，在第0天和第14天向C57BL/6或BALB/c小鼠皮下或静脉内注射含有25μg 马Eotaxin-C-His-QβVLP的100μl PBS。在免疫之前和免疫方案的第21天将小鼠放血。通过ELISA分析血清。

马。为了产生马IL-5和马嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)的自身反应性抗体，在第0天、第21天和第42天向马皮下注射在注射前30min与300μl 明矾混合的含有300μgeIL5-C-His-Qβ/eEotaxin-C-His-Qβ疫苗的1000μl PBS。在免疫之前和至少在免疫方案的第42天和第56天以及第56天后各种另外的时间点对马进行放血。通过ELISA分析血清。

C.通过ELISA分析血清

Maxisorp 96孔ELISA板(Nunc)用50μl纯化的eEotaxin-C-His(10μg/ml) 涂布过夜。用含有2％BSA的PBS在室温下封闭2小时的PBST洗涤平板3 次。然后用PBST洗涤平板3次，并将3倍稀释的小鼠或马血清加入含有2％ BSA的PBS中，并在室温下温育2小时。随后用PBST洗涤平板3次，并与缀合有HRP(1：2000稀释)的抗小鼠IgG或抗马IgG在室温下温育30分钟。再次用PBS洗涤平板4次，加入50μl/孔显色溶液(TMB)。在室温反应约2 分钟后，用25μl/孔5％H₂SO₄终止ELISA。在Tecan M200分光光度计(Tecan, Austria)上在450nm处测量吸光度。

将疫苗接种eEotaxin-C-His-QβVLP的小鼠的免疫前血清和第21天血清 (图16A)，以及疫苗接种eEotaxin-C-His-QβVLP的马免疫前血清和指定时间点血清(图16B)收集，并通过ELISA分析。

D.体内效力

马。案例研究。为了评估疫苗接种对疾病症状和血液嗜酸性粒细胞增多的影响，向IBH感染的冰岛马皮下疫苗接种eIL-5-C-His-Qβ和 eEotaxin-5-C-His-Qβ。第一只马已经使用eIL-5-C-His-Qβ/eEotaxin-5-C-His-Qβ皮下疫苗接种三次。在每次疫苗接种中注射含有300μg各疫苗的1ml PBS与明矾。通过与0.3ml明矾(Imject Alum，Thermo Scientific，目录号77161) 新鲜地(注射前约30分钟)预混合而加入明矾。最终体积为1.3ml，皮下注射。马在第0天，第21天和第42天进行注射。在疫苗接种之前和之后，分析血液中的嗜酸性粒细胞计数，并按照实施例13中描述的症状评分对IBH 介导的皮肤损伤进行分级。

实施例12

eIL-31抗原与VLP的偶联、马的免疫以及在IBH倾向的马中的效力的证明

A.马IL-31-C-His与Qβ的VLP的偶联

如WO02/056905中所述产生包含SEQ ID NO:31的外壳蛋白的QβVLP，并与7.5倍摩尔过量的异双功能交联剂琥珀酰亚胺基-6(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)(Pierce)。通过穿过PD-10脱盐柱(GE Healthcare)去除未反应的交联剂。重组、纯化和重折叠的eIL-31-C-His用等摩尔过量的PBS (pH 8.0)中的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原1小时，以还原连接子中所含的半胱氨酸残基。然后将还原的eIL-31-C-His与衍生的QβVLP以1： 1的Qβ单体与eIL-31-C-His蛋白的摩尔比为来混合，并在22℃下共温育4 小时以允许交联。任选地，使用300kDa截留透析膜对pH 7.4的PBS透析反应12小时，或使用100kDa MWCO通过切向流过滤去除游离未偶联的 eIL-5-C-His。

分析：SDS-PAGE的考马斯染色(图20A)：通过SDS-PAGE分离Qβ、 eIL-31-C-His和eIL-31-C-His-QβVLP。随后将凝胶用考马斯蓝(0.025％考马斯亮蓝R-250，40％甲醇，10％乙酸)染色并用脱色剂(40％甲醇，10％乙酸) 去染色。

用抗His抗体进行蛋白质印迹染色(图20B)：通过SDS-PAGE分离Qβ、 eIL-31-C-His和eIL-31-C-His-Qβ疫苗，并电印迹到硝酸纤维素膜上。用含有 5％(w/v)BSA粉末的PBST将膜封闭1小时，然后与10ml以1：800稀释的抗His抗体(Penta-His抗体，无BSA，小鼠单克隆IgG1，目录号34660) 在含有1％BSA(w/v)粉末的PBST中一起温育。将膜用PBST洗涤15分钟，然后与以1：10000稀释的与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的PBST抗小鼠IgG 抗体(含有10ml1％(w/v)BSA)温育1小时。将膜在PBS中洗涤15分钟，并用ECL(Amersham Pharmacia，Sweden)显影并暴露于照相胶片。

通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析来评估eIL-31-C-His与病毒样颗粒 Qβ的共价化学偶联。偶联反应的考马斯蓝染色的凝胶证明了，条带的出现对应于与Qβ共价连接的马IL-31-C-His所预测的分子量(图20A)。此外，蛋白质印迹分析显示在用抗His抗体染色时共定位这些条带(图20B)。

B.eIL31-C-His与CMV-Ntt830VLP的偶联

如上所述产生CMV-Ntt830VLP，并与10倍摩尔过量的异双功能交联剂琥珀酰亚胺基-6(β-马来酰亚胺丙酰胺基)-己酸酯(SMPH)(Pierce)反应。通过穿过PD-10脱盐柱(GEHealthcare)去除未反应的交联剂。重组、纯化和重折叠的eIL-31-C-His用等摩尔过量的PBS(pH 8.0)中的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原1小时，以还原连接子中所含的半胱氨酸残基。然后将还原的eIL-31-C-His与衍生的CMV-Ntt830VLP以1：2的VLP单体与 eIL-31-C-His蛋白的摩尔比混合，并在22℃下共温育4小时以允许交联。任选地，使用300kDa截留透析膜对pH 7.4的PBS透析反应12小时，或使用 100kDa MWCO通过切向流过滤去除游离未偶联的eIL-31-C-His。

分析：SDS-PAGE的考马斯染色(图20C)：通过SDS-PAGE分离 eIL-31-C-His、CMV-Ntt830和eIL31-C-His-CMV-Ntt830VLP。随后将凝胶用考马斯蓝(0.025％考马斯亮蓝R-250，40％甲醇，10％乙酸)染色并用脱色剂 (40％甲醇，10％乙酸)去染色。

用抗His抗体进行蛋白质印迹染色(图20D)：通过SDS-PAGE分离 eIL-31-C-His、CMV-Ntt830和eIL31-C-His-CMV-Ntt830VLP，并电印迹到硝酸纤维素膜上。用含有5％(w/v)BSA粉末的PBST将膜封闭1小时，然后与10ml以1：1000稀释的抗His抗体(单克隆抗His标签抗体HRPO缀合物， Novagen目录号71840)在含有1％(w/v)BSA粉末的PBST中一起温育。将膜用PBST洗涤15分钟，然后用ECL(Amersham Pharmacia，瑞典)显影并暴露于照相胶片。

通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析评估eIL5-C-His与CMV-Ntt830VLP 的共价化学偶联。偶联反应的考马斯蓝染色的凝胶证明了，条带的出现分别对应于与CMV-tt830共价连接的马IL5-C-His所预测的分子量(图20C)。此外，蛋白质印迹分析显示在用抗His抗体染色时共定位这些条带(图20D)。

B.免疫方案

小鼠。为了在小鼠中产生针对马IL-31的抗体，在第0天和第14天向 C57BL/6或BALB/c小鼠皮下或静脉内注射含有25μg马IL-31-C-His-QβVLP 的100μl PBS。在免疫之前和免疫方案的第21天将小鼠放血。通过ELISA分析血清。

马。为了产生马IL-5和马IL-31的自身反应性抗体，在第0天、第21 天和第42天向马皮下注射在注射前30min与300μl明矾混合的含有300μg eIL5-C-His-Qβ/eIL-31-C-His-Qβ疫苗的1000μl PBS。在免疫之前和至少在免疫方案的第42天和第56天以及第56天后各种另外的时间点对马进行放血。通过ELISA分析血清。

C.通过ELISA分析血清：

Maxisorp 96孔ELISA板(Nunc)用50μl纯化的eIL-31-C-His(10μg/ml) 涂布过夜。用含有2％BSA的PBS在室温下封闭2小时的PBST洗涤平板3 次。然后用PBST洗涤平板3次，并将3倍稀释的小鼠或马血清加入含有2％ BSA的PBS中，并在室温下温育2小时。随后用PBST洗涤平板3次，并与缀合有HRP(1：2000稀释)的抗小鼠IgG或抗马IgG在室温下温育30分钟。再次用PBS洗涤平板4次，加入50μl/孔显色溶液(TMB)。在室温反应约2 分钟后，用25μl/孔5％H₂SO₄终止ELISA。在Tecan M200分光光度计(Tecan, Austria)上在450nm处测量吸光度。

将疫苗接种eIL-31-C-His-QβVLP的小鼠的免疫前血清和第21天血清(图 16A)，以及疫苗接种eIL-31-C-His-QβVLP的马免疫前血清和指定时间点血清(图16B)收集，并通过ELISA分析。

D.体内效力：案例研究。为了评估疫苗接种对疾病症状和血液嗜酸性粒细胞增多的影响，向IBH感染的冰岛马皮下疫苗接种eIL-5-C-His-Qβ和 eIL-31-C-His-Qβ。

第一只马已经使用eIL-5-C-His-Qβ/eIL-31-C-His-Qβ皮下疫苗接种三次。在每次疫苗接种中注射含有300μg各疫苗的1ml PBS与明矾。通过与0.3ml 明矾(Imject Alum，Thermo Scientific，目录号77161)新鲜地(注射前约30 分钟)预混合而加入明矾。最终体积为1.3ml，皮下注射。马在第0天，第 21天和第42天进行注射。在疫苗接种之前和之后，分析血液中的嗜酸性粒细胞计数，并按照实施例13中描述的症状评分对IBH介导的皮肤损伤进行分级。

实施例13

IBH症状损伤评分

对于IBH症状评分，记录出现IBH损伤的部位(尾巴，鬃毛，腹部，侧腹，面部，耳朵和腿部等)。每个部位分为三个部分：上，中，下。进一步根据损伤的数量，每个部位分为轻和强。根据感染的部位(上/中/下)数量和每个部位的损伤数量(轻/强)，可以评分为1到4分(1分＝一个部分受感染，损伤轻；4分＝全部三个部分受感染，损伤强)。

而且，这些部位被分类为另外的6个性质：大小(直径)、血液、脱发、比例、结痂和苔藓化/肿胀。对于所有这些属性也可以得分1至4分。大小分为<0.5cm(1分)、0.5≥x>1cm(2分)、1≥x>2cm(3分)和≥2cm(4分)。血液分为完整表皮(1分)、轻度(2分)、中度(3分)和重度(4分)。脱发分为轻度(1分)、中度(2分)、重度(3分)和无毛(4分)。比例分为无(1 分)、微小、少(2分)、中等大小(3分)和许多大(4分)。结痂分为无(1 分)、小(2分)、一半(3分)和全部(4分)。苔藓化/肿胀分为无(1分)、轻度(2分)、中度(3分)和重度(4分)。

此外，如果鞘管或乳房肿胀，则可以评分最少5分或最多20分：1级(5 分)、2级(10分)、3级(15分)和4级(20分)。

最后所有评分相加则是IBH症状评分。

Claims (21)

1.一种用于预防或治疗马科哺乳动物的昆虫叮咬高敏症的组合物，其包含：

(a)具有至少一个第一附接位点的核心颗粒，其中所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，并且其中所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的VLP或RNA噬菌体的VLP；和

(b)具有至少一个第二附接位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是

(i)马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中具有所述至少一个第二附接位点的所述eIL-5抗原是具有选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:38的氨基酸序列的蛋白质；或

(ii)马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中具有所述至少一个第二附接位点的所述eIL-31抗原是具有选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQID NO:46的氨基酸序列的蛋白质；

其中，(a)和(b)通过所述至少一个第一附接位点和所述至少一个第二附接位点经由至少一个非肽共价键连接。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，具有所述至少一个第二附接位点的所述至少一种抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，并且其中具有所述至少一个第二附接位点的所述eIL-5抗原是具有选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的氨基酸序列的蛋白质。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，具有所述至少一个第二附接位点的所述至少一种抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中具有所述至少一个第二附接位点的所述eIL-31抗原是具有选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQID NO:46的氨基酸序列的蛋白质。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述核心颗粒是重组VLP。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述VLP是RNA噬菌体的VLP。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP，其中所述RNA噬菌体Qβ的VLP包含重组外壳蛋白或由重组外壳蛋白组成，该重组外壳蛋白包含SEQ ID NO:31或由SEQ ID NO:31组成。

7.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述VLP是经修饰的VLP，其包含至少一种经修饰的VLP多肽，其中，所述经修饰的VLP多肽包含以下或由以下组成：

(a)VLP多肽，和

(b)辅助性T细胞表位；

其中，所述VLP多肽包含RNA噬菌体的外壳蛋白的氨基酸序列或由RNA噬菌体的外壳蛋白的氨基酸序列组成。

8.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的经修饰的VLP，其中所述CMV的经修饰的VLP包含至少一种经修饰的CMV多肽，其中所述经修饰的CMV多肽包含以下或由以下组成：

(a)CMV多肽，和

(b)辅助性T细胞表位；并且

其中，所述CMV多肽包含CMV的外壳蛋白的氨基酸序列或由CMV的外壳蛋白的氨基酸序列组成。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述辅助性T细胞表位置换所述CMV多肽的N-末端区域，并且其中所述CMV多肽的所述N-末端区域对应于SEQ ID NO:15的氨基酸2-12。

10.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述CMV的外壳蛋白的氨基酸序列是SEQ IDNO:15，并且其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:34，并且其中所述辅助性T细胞表位置换所述CMV多肽的N-末端区域，并且其中所述CMV多肽的所述置换的N-末端区域由11至13个连续的氨基酸组成。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述CMV多肽的所述置换的N-末端区域由11个连续的氨基酸组成，并且其中所述CMV多肽的所述N-末端区域对应于SEQ ID NO:15的氨基酸2-12。

12.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。

13.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

14.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述经修饰的CMV多肽由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成。

15.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述经修饰的CMV多肽由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。

16.一种药物组合物，其包含：

(a)权利要求1至15中任一项所述的组合物；和

(b)药学上可接受的载体。

17.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物或根据权利要求16所述的药物组合物在制备用于预防或治疗马科哺乳动物的昆虫叮咬高敏症的药物中的用途，其中将有效量的所述组合物施用于所述马科哺乳动物。

18.根据权利要求17所述的用途，其中，所述马科哺乳动物是马。

19.根据权利要求18所述的用途，其中，与在所述施用之前的至少一种IBH参数或症状相比，所述组合物的所述施用降低至少一种IBH参数或症状。

20.根据权利要求19所述的用途，其中，所述至少一种IBH参数或症状是皮肤损伤的水平或严重性等级。

21.根据权利要求20所述的用途，其中，所述皮肤损伤的水平或严重性等级的所述降低通过症状损伤评分测试来确定。

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