CN108003253B - 一种油茶粕多糖、制备方法及拮抗口蹄疫疫苗对公牛精液损伤的作用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油茶粕多糖、制备方法及拮抗口蹄疫疫苗对公牛精液损伤的作用，该油茶粕多糖从小果油茶粕中分离得到，平均分子量为75‑95kDa，具体包括：步骤S1，将小果油茶粕粉碎，提取，过滤，浓缩；步骤S2，浓缩液添加无水乙醇，离心收集沉淀；步骤S3，沉淀溶于去离子水，加样于DEAE‑52层析柱，依次用纯水和不同浓度氯化钠溶液梯度洗脱，分别收集纯水洗脱液、0.3mol/L和0.5mol/L氯化钠洗脱液；步骤S4，分别将纯水洗脱液、0.3mol/L和0.5mol/L氯化钠洗脱液浓缩上样于Sephadex G‑l00层析柱，去离子水洗脱，分别收集洗脱峰、冷冻干燥。本发明油茶粕多糖可以有效拮抗口蹄疫疫苗对公牛精液造成的损伤。
Description
技术领域
本发明属于畜牧领域，涉及一种油茶粕多糖、制备方法及拮抗口蹄疫疫苗对公牛精液损伤的作用。
背景技术
小果油茶(Camellia meiocarpa Hu.)是我国山茶属中栽培面积和年产量仅次于普通油茶(Camellia oleifera Abel.)的主栽物种，主要分布于我国淮河、长江以南的福建、江西、广西、湖南、贵州等地。小果油茶又名江西子、小茶、鸡心子、小叶油茶、羊屎子等。果小、叶小、芽小，芽、苞片没有毛是其显著特征。
小果油茶粕是小果油茶提取油脂后得到的副产品。虽然，目前已有茶场将这些油茶粕脱毒后用作动物饲料，但是，由于工艺不成熟，绝大部分油茶粕仍然是当废料扔掉，或者堆腐后用作茶场的肥料，利用度低，附加值低。为了提高小谷油茶粕的利用度，提高其经济附加值，申请人对茶粕进行了深度研究与开发。
目前，尚未见小果油茶粕的多糖深度开发的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种油茶粕多糖、制备方法及拮抗口蹄疫疫苗对公牛精液损伤的作用。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种油茶粕多糖，从小果油茶粕中分离得到，平均分子量为75-95k Da。
优选地，以小果油茶粕为原料，经水提醇沉、DEAE-52纤维素柱层析、Sephadex G-l00柱层析纯化得到。
优选地，平均分子量为75.3、85.6或94.7k Da。
优选地，所述小果油茶粕指小果油茶的果实经过压榨处理或浸出法处理去除油脂后得到的固体残渣。
上述油茶粕多糖的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1，将小果油茶粕粉碎至80-100目，沸水回流提取，过滤，合并滤液，浓缩；
步骤S2，向浓缩液中添加加入4-5倍体积的无水乙醇，低温沉淀，离心收集沉淀；
步骤S3，将沉淀溶于去离子水中，加样于DEAE-52层析柱，依次用纯水和不同浓度氯化钠溶液梯度洗脱，分别收集纯水洗脱液、0.3mol/L氯化钠洗脱液和0.5mol/L氯化钠洗脱液；
步骤S4，分别将纯水洗脱液、0.3mol/L氯化钠洗脱液和0.5mol/L氯化钠洗脱液浓缩后的浓缩液上样于Sephadex G-l00层析柱，用去离子水洗脱，分别收集洗脱峰、冷冻干燥。
优选地，步骤S2沉淀条件优选4℃静置24小时；离心条件优选5×103rpm离心5分钟。
优选地，步骤S4用硫酸-苯酚法检测各管多糖的含量，以收集的管数为横坐标、紫外吸光度值为纵坐标，绘制Sephadex G-100色谱洗脱曲线，各浓缩液经Sephadex G-100层析柱分离后各得1个主要洗脱峰，收集洗脱峰、冷冻干燥。
优选地，紫外检测波长为490nm。
优选地，步骤S2醇沉前先用Sevag法脱蛋白。
上述油茶粕多糖拮抗口蹄疫疫苗对公牛精液损伤的用途。
本发明的优点：
1、本发明提供的油茶粕多糖可以有效拮抗口蹄疫疫苗对公牛精液造成的损伤，从而可以用于降低接种口蹄疫疫苗对农场的损失；
2、本发明提供的油茶粕多糖的制备方法步骤少，分离纯化效果好，均为单一组分。
附图说明
图1为DEAE-52层析柱纯水洗脱液经Sephadex G-100柱层析的洗脱曲线；
图2为DEAE-52层析柱0.3mol/L氯化钠洗脱液经Sephadex G-100柱层析的洗脱曲线；
图3为DEAE-52层析柱0.5mol/L氯化钠洗脱液经Sephadex G-100柱层析的洗脱曲线；
图4为各组荷斯坦牛接种口蹄疫疫苗前后精液活率比较。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
下述实施例中，以1982-1983年春定植在福建省闽侯桐口国有林场油茶种质资源收集圃的小果油茶(Camellia meiocarpa Hu.)为原材料，经压榨工艺去除油脂得小果油茶粕，备用。
实施例1：油茶粕多糖1-3的制备和平均分子量测定
包括如下步骤：
步骤S1，将小果油茶粕粉碎至80-100目，取1kg加15L水沸水回流提取3次，每次提取2小时，将每次提取液过滤，合并滤液，减压浓缩至150mL，Sevag法脱蛋白；
步骤S2，向脱蛋白后的浓缩液中添加加入4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后置于4℃低温静置24小时，5×103rpm离心5分钟，收集沉淀；
步骤S3，将沉淀溶于去离子水中，加样于DEAE-52层析柱，依次用纯水、0.3mol/L氯化钠溶液、0.5mol/L氯化钠溶液梯度洗脱各洗脱15个柱体积，流速1.0mL/min，分别收集纯水洗脱液、0.3mol/L氯化钠洗脱液和0.5mol/L氯化钠洗脱液；
步骤S4，将纯水洗脱液浓缩至5mL，上样于Sephadex G-100层析柱(60cm×2.6cm)中，流速0.3mL/min，用去离子水洗脱，分步收集(每管10min)。用硫酸-苯酚法检测各管多糖的含量(A490)，以收集的管数为横坐标、A490为纵坐标，绘制Sephadex G-100色谱洗脱曲线(如图1所示)，合并主要洗脱峰对应的洗脱液，冷冻干燥得油茶粕多糖1；
步骤S5，将0.3mol/L氯化钠洗脱液浓缩至5mL，上样于Sephadex G-100层析柱(60cm×2.6cm)中，流速0.3mL/min，用去离子水洗脱，分步收集(每管10min)。用硫酸-苯酚法检测各管多糖的含量(A490)，以收集的管数为横坐标、A490为纵坐标，绘制Sephadex G-100色谱洗脱曲线(如图2所示)，合并主要洗脱峰对应的洗脱液，冷冻干燥得油茶粕多糖2；
步骤S6，将0.5mol/L氯化钠洗脱液浓缩至5mL，上样于Sephadex G-100层析柱(60cm×2.6cm)中，流速0.3mL/min，用去离子水洗脱，分步收集(每管10min)。用硫酸-苯酚法检测各管多糖的含量(A490)，以收集的管数为横坐标、A490为纵坐标，绘制Sephadex G-100色谱洗脱曲线(如图3所示)，合并主要洗脱峰对应的洗脱液，冷冻干燥得油茶粕多糖3。
分子排阻HPLC法测定油茶粕多糖1-3的平均分子量：
将已知分子量的多糖对照品用流动相配成1.0mg/mL标准溶液，参考文献条件(Structural analysis of a polysaccharide isolated from the aqueous extract ofan edible mushroom,Pleurotus sajor-caju,cultivar Black Japan.Carbohyd Res,2008)，用分子排阻HPLC法测定。以多糖对照品分子量的对数值为纵坐标、保留时间为横坐标作图，得多糖分子量的标准曲线方程。称取适量油茶粕多糖1-3样品，配制1.0mg/mL溶液，用0.45μm滤膜过滤，在相同条件下进行HPLC分析。将各样品保留时间代入标准曲线方程，计算得油茶粕多糖1、2、3的平均分子量分别为75.3、85.6、94.7kDa。油茶粕多糖1-3均为单一对称峰，为单一组分。
实施例2：油茶粕多糖1-3拮抗口蹄疫疫苗对公牛精液损伤
一、实验材料
公牛品种为荷斯坦牛；公牛精液稀释液采用TCM-199。
口蹄疫疫苗为口蹄疫病毒O型亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗，接种剂量2.5mL/头。
分别精确称取油茶粕多糖1-3用生理盐水溶解，制成浓度5mg/mL的注射液。
二、实验方法
1、精液的采集、检查、分组(采集和检查方法参考文献：注射口蹄疫疫苗对种公牛精液品质的影响研究，中国牛业科学，2014)
所用的器械事先要进行冲洗，消毒；玻璃器皿洗净后送入干燥箱干燥，假阴道和其他器械等用75％酒精棉球擦拭消毒，假阴道安装好套上保护套，消毒后的假阴道只能使用一次。假阴道内注水温度在40℃左右，注水量约在300mL，恒温箱内温度控制在40℃-42℃，采精时的内胎温度保持在38℃-40℃之间，内胎温度可根据不同的牛做适当的调整，最高不可超过43℃。润滑剂均匀涂抹在假阴道内胎的前2/3，润滑剂用白凡士林与液态石蜡油按1：1比例调制。假阴道的内胎压力(采精前从假阴道活塞孔打气)以假阴道口呈三角形为宜。台牛要健壮、性情温顺、无疫病，外阴、臀部清洗干净。公牛采精时采取引诱、被爬跨、反复空爬等方法刺激公牛兴奋。还可更换采精地点，更换台牛等方法增加种公牛的兴奋度。采精场地应保持安静，地面清洁并铺设防滑垫，以免公牛采精时滑倒。当公牛性欲旺盛时采精，采精员右手持假阴道，站在公牛右后方，当公牛起跳，前肢爬上台牛后迅速向前托着公牛包皮，右手持假阴道与台牛成40度夹角，假阴道口斜向下方，左右手配合将公牛阴茎自然地引入假阴道内，公牛向前一冲即完成射精动作，待公牛前肢落地，缓慢地把假阴道脱出。打开活塞放气，小心取下集精管，迅速转移至精液检测室进行检测。选取新鲜精液(应呈乳白稍带黄色或奶油色不透明液体)，取一滴原精液加盖玻片后在400倍的恒温(37℃)可视显微镜下观察呈直线运动精子的百分数，选择精液活率约为80％的荷斯坦牛随机分为对照组、油茶粕多糖1组、油茶粕多糖2组、油茶粕多糖3组，每组5只。各组荷斯坦牛正常饲养30天，其中，油茶粕多糖1组、油茶粕多糖2组、油茶粕多糖3组荷斯坦牛每三天分别按照5mg/100kg的剂量肌肉注射给药油茶粕多糖1-3。正常饲养30天后各组荷斯坦牛注射口蹄疫病毒O型亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗，接种剂量2.5mL/头，观察期30天。经观察和检测，所有荷斯坦牛均免疫成功。观察期结束10天后，按照上述方法对各组荷斯坦牛再次采精，测定精液活率。
2、统计学方法
采用SPSS19.0软件统计分析，数据以均值±偏差表示，组间比较采用单因素方差分析。
三、实验结果
实验结果显示，对照组荷斯坦牛经口蹄疫疫苗免疫后，精液活率显著降低(P＜0.05)；与对照组相比，油茶粕多糖1组、油茶粕多糖2组、油茶粕多糖3组荷斯坦牛精液活率显著升高(P＜0.05)。结果如表1和图4所示。
表1各组荷斯坦牛接种口蹄疫疫苗前后精液活率比较(n＝5)
综上可见，本发明提供的油茶粕多糖可以有效拮抗口蹄疫疫苗对公牛精液造成的损伤，从而可以用于降低接种口蹄疫疫苗对农场的损失；本发明提供的油茶粕多糖的制备方法步骤少，分离纯化效果好，均为单一组分。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
Claims (2)
1.一种油茶粕多糖用于拮抗口蹄疫疫苗对公牛精液损伤的用途，其特征在于，该油茶粕多糖由如下步骤制备得到：
步骤S1，将小果油茶粕粉碎至80-100目，沸水回流提取，过滤，合并滤液，浓缩，Sevag法脱蛋白；
步骤S2，向脱蛋白后的浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，4℃沉淀，离心收集沉淀；
步骤S3，将沉淀溶于去离子水中，加样于DEAE-52层析柱，依次用纯水、0.3mol/L氯化钠溶液、0.5mol/L氯化钠溶液梯度洗脱各洗脱15个柱体积，分别收集纯水洗脱液、0.3mol/L氯化钠洗脱液和0.5mol/L氯化钠洗脱液；
步骤S4，分别将纯水洗脱液、0.3mol/L氯化钠洗脱液和0.5mol/L氯化钠洗脱液浓缩后的浓缩液上样于Sephadex G-l00层析柱，用去离子水洗脱，分别根据Sephadex G-l00色谱洗脱曲线收集洗脱峰对应的洗脱液，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：步骤S2沉淀条件为4℃静置沉淀24小时；离心条件为5×103rpm离心5分钟。
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