CN107922963A

CN107922963A - 细胞测定方法

Info

Publication number: CN107922963A
Application number: CN201680047633.5A
Authority: CN
Inventors: 南条祐子; 浅野宏幸; 宫川功; 高田仁夫
Original assignee: Kurashiki Spinning Co Ltd
Current assignee: Kurashiki Spinning Co Ltd
Priority date: 2015-08-26
Filing date: 2016-08-17
Publication date: 2018-04-17
Also published as: WO2017033809A1; CA2993629A1; US20180252636A1; HK1248774A1; JP6767981B2; JPWO2017033809A1; US10514334B2

Abstract

本发明提供一种精度高的细胞测定方法。本发明的细胞测定方法包括：将所培养的靶细胞以色素染色的步骤；获取第1图像及第2图像的步骤，所述第1图像及第2图像为相对于所述色素的吸光度不同的第1光及第2光的透射图像；将所述第1图像及所述第2图像分别分割为多个分割区域，在每个所述分割区域中将所述第1图像与所述第2图像进行比较而排除噪声的步骤；以及通过在排除了所述噪声的图像中对每个所述分割区域的细胞量的指标进行累计来评价所述靶细胞量的步骤。

Description

细胞测定方法

技术领域

本发明涉及一种细胞量的测定方法。

背景技术

在针对上皮性恶性肿瘤(epithelial malignant tumor)或肉瘤(sarcoma)等的抗癌剂的感受性试验中，通过将与抗癌剂接触的癌细胞和不与抗癌剂接触的癌细胞在相同条件下进行培养，将培养后的癌细胞的增殖度进行比较，来评价癌细胞对抗癌剂的感受性。癌细胞的增殖越少则越为优异的抗癌剂。

作为癌细胞的培养法，专利文献1～专利文献5中记载有将癌细胞包埋于胶原凝胶中来培养的方法。已知所述胶原凝胶包埋培养法与在琼脂等的表面培养癌细胞的表面培养法相比，癌细胞的增殖良好地进行。

作为所培养的癌细胞的定量方法，专利文献1中记载有如下方法：利用TV照相机等来拍摄增殖的癌细胞，对所获得的图像信息进行电子性图像分析，算出癌细胞菌落的推定体积值。另外，专利文献3中记载有如下方法：将在胶原凝胶内培养的癌细胞以色素染色来拍摄，基于图像浓度来定量癌细胞。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特开平3-285696号公报

专利文献2：国际公开第95/18216号

专利文献3：日本专利特开平10-115612号公报

专利文献4：日本专利第3363445号公报

专利文献5：日本专利特开2008-11797号公报

发明内容

发明所要解决的问题

专利文献1或专利文献3中记载的癌细胞的定量方法中，存在定量精度的进一步提高的课题。抗癌剂的感受性试验以前是以从癌患者体内摘除的外科手术材料作为起始材料来进行。近年来，出于减轻患者的身体负担的目的，对于以使用穿刺针等来采集细胞的生检材料作为起始材料的抗癌剂感受性试验的迫切期望提高。但是，生检材料中，与手术材料相比，可采集的组织片小，在抗癌剂感受性试验中，要求精度良好地定量现有的十分之一以下的细胞量。专利文献1或专利文献3中，难以精度良好地定量如此少量的癌细胞。

本发明是考虑到以上所述而形成，目的在于提供一种定量精度更高的细胞测定方法。

解决问题的技术手段

本发明的细胞测定方法包括：将所培养的靶细胞以色素染色的步骤；获取第1图像及第2图像的步骤，所述第1图像及第2图像为相对于所述色素的吸光度不同的第1光及第2光的透射图像；将所述第1图像及所述第2图像分别分割为多个分割区域，在每个所述分割区域中将所述第1图像与所述第2图像进行比较而排除噪声的步骤；以及通过在排除了所述噪声的图像中对每个所述分割区域的细胞量的指标进行累计来评价所述靶细胞量的步骤。

此处，所谓靶细胞是指所要测定的细胞。另外，所谓噪声是指并非由经染色的靶细胞而来的不需要的图像信息。另外，所谓细胞量的指标，是指图像的浓淡、或根据图像的浓淡来算出的吸光度等与细胞的多寡对应而增减的指标。通过所述方法，可排除成为误差的原因的噪声的影响，从而精度良好地测定细胞量。

优选的是，排除所述噪声的步骤是在每个所述分割区域中将所述第1图像与所述第2图像进行比较，当所比较的分割区域的明度的差或比小于既定值时，将所述分割区域从成为所述靶细胞量的评价的基础的数据中除外的步骤。

或者优选的是，排除所述噪声的步骤是在每个所述分割区域中将所述第1图像与所述第2图像进行比较，当所比较的分割区域的吸光度的差或比小于既定值时，将所述分割区域从成为所述靶细胞量的评价的基础的数据中除外的步骤。

优选的是所述靶细胞为癌细胞。

优选的是所述靶细胞为经三维培养的细胞，更优选的是所述细胞为包埋于胶原凝胶中来培养的细胞。

优选的是，所述第1图像及所述第2图像是通过对同时照射所述第1光及所述第2光并利用1台彩色照相机进行拍摄而得的图像进行分色而获取。

或者优选的是，所述第1图像及所述第2图像是通过依次照射所述第1光与所述第2光并利用1台彩色照相机随时进行拍摄而获取。

优选的是，所述靶细胞量的评价是通过在每个所述分割区域中根据图像明度来算出吸光度，并遍及多个所述分割区域对所获得的吸光度进行累计以算出靶细胞的推定体积值来进行。

发明的效果

根据本发明的细胞测定方法，即便所培养的靶细胞为少量，也可精度良好地评价细胞量。

附图说明

图1是表示本发明的第1实施方式中所使用的细胞测定装置的构成例的图。

图2是本发明的第1实施方式的癌细胞定量方法的流程图。

图3是用以对图像的明度进行说明的图。

图4是用以对利用本发明的第1实施方式的癌细胞定量方法所获得的原图像进行说明的图。

图5为中性红的吸收光谱。

图6为实施例中将癌细胞定量的试样的原图像。

图7为实施例中将癌细胞定量的试样的原图像。

具体实施方式

作为本发明的细胞测定方法的第1实施方式，以下对抗癌剂感受性试验中的癌细胞的定量方法进行说明

对于从生物中采集的组织，在培养之前通过切碎、细胞分散酵素处理来进行细胞间质的消化等分散处理。视情况，然后进行在预备培养中去除血液等不需要的细胞来回收活细胞的分离处理。

培养试样的制作可使用多种公知的方法。其中，优选的是使用三维培养法。更优选的是宜使用胶原凝胶包埋培养法。所述方法中，即便培养中使用的癌细胞的量少，也可进行良好的培养以及其后的癌细胞的定量。

利用胶原凝胶包埋培养法的顺序如下所述。将经分离·分散处理的细胞混合于胶原溶液中。此时，在胶原溶液中，除了胶原以外也可预先添加培养所必需的各种成分。例如，可在胶原溶液中添加与作为目标的细胞的生理性条件相同或者近似的缓冲液。将所述包含癌细胞的胶原溶液滴加于培养容器内的支持面上而形成滴块状的胶原凝胶，在培养容器内添加液体培养基。同样地制备若干试样。一部分的试样中，在培养容器中添加抗癌剂，经过既定时间后将抗癌剂洗涤去除，再次进行培养。

培养结束后，在培养容器中添加色素，将作为靶细胞的癌细胞染色。染色方法可应用通常的癌细胞培养中的染色方法。具体而言可列举：吉姆沙(Giemsa)液染色法、结晶紫(crystal violet)染色法、中性红(neutral red，NR)染色法、二乙酸荧光素酯(fluorescein diacetate，FDA)染色法或者使用其他荧光试剂的染色法。作为染色法，优选的是可将癌细胞选择性地染色，且尽可能不将癌细胞以外的成分染色的方法。若使用将活细胞选择性地染色的活细胞染色法，则适合于测定抗癌剂的感受性等。NR染色法作为可仅将癌细胞中的活细胞选择性地染色的方法而优选。

染色完毕后，利用福尔马林将色素固定于细胞内，使其干燥。胶原凝胶干燥物是从滴块状胶原凝胶中去除水分而成为平坦的面状。

继而，对包含靶细胞的试样的拍摄与图像处理的方法进行说明。图2中示出处理的流程图。

图1中，本实施方式的测定装置10包括：载置试样20的试样平台11、从下方照射试样的照明12、拍摄试样的透射图像的彩色照相机16、以及图像处理装置17。照明12具有1个发光二极管(light emitting diode，LED)封装体13，连接于照明电源14上。在照明与试样平台之间插入光扩散板15。各LED封装体中，组装有射出第1光的LED芯片(未图示)、与射出第2光的LED芯片(未图示)。

第1光及第2光对于将试样染色的色素的吸光度不同。本实施方式中，将第1光与第2光同时朝向试样照射，利用1台彩色照相机进行拍摄而获取1张原图像。通过将所述原图像进行分色，而获取相对于第1光的透射图像即第1图像、以及相对于第2光的透射图像即第2图像。

第1光及第2光的对于所述色素的吸光度的差异越大越优选。为了获得充分的测定精度，第1光及第2光透过试样时的衰减量的比优选的是1.5倍以上，进而优选的是2倍以上。为此，两者的吸光度的差优选的是以上，更优选的是以上。由于吸光度随着测定条件而变化，故而为了在实际的测定条件下获得如上所述的差，优选的是对第1光及第2光的波长进行选择。

作为例子，图5中示出中性红(NR)的pH＝7.1时的吸收光谱(小畠理加(RikaObata)等人，中和滴定与酸碱指示剂的可见吸收光谱，以庆应义塾大学日吉纪要自然科学、2011年9月第50期第77-102页为基础而制成)。NR在所述pH下在约380nm～600nm的范围内具有吸收带，且在462nm与518nm处具有吸收峰值。所述情况下，第1光中可选择波长分布与所述吸收带重叠的绿色光，第2光中可选择波长分布不与所述吸收带重叠的红色光。

照明的光源优选的是使用LED。其原因在于，LED的波长分布狭窄，第1图像与第2图像的差异容易明确地出现。此外，照明的物理形态并无特别限定。例如，LED封装体的数量并无特别限定。另外，例如，如本实施方式所述，射出第1光的LED芯片与射出第2光的LED芯片可组装于一个LED封装体中，也可将射出第1光的LED封装体与射出第2光的LED封装体交替排列。

图像是作为大量的像素数据的集合而构成。各像素中包含表示与照相机的拍摄元件所捕捉的光的强度对应的明度的信息。例如若拍摄的取入阶度为8位，则明度是由0～255的256个数值所表示。若在光通过试样时具有吸收，则在透射图像上所述部分映得暗，即明度小。

相对于第1光的透射图像即第1图像由于NR的吸收大，故而若在培养试样中存在经NR染色的癌细胞，则所述部分的透射光强度变小。而且，癌细胞的厚度越大，透射光强度变得越小，图像的明度变得越小。另一方面，相对于第2光的透射图像即第2图像不太反映癌细胞的存在量。

此处，将第1图像及第2图像分别利用相同的方法分割为多个分割区域。所谓利用相同方法来分割，是指分割为第1图像与第2图像的对应的分割区域彼此为相同大小，且为映出试样的相同部位的分割区域。在每个分割区域的各者中进行以下所述的图像的处理。本实施方式中，将一个像素作为一个分割区域。第1图像及第2图像是由一个原图像所获得，因此各像素为利用相同方法将两图像分割而成的区域。

首先，将由不包含癌细胞的试样的图像信息所获得的空白图像明度W、以及由暗黑状态的图像信息所获得的暗图像明度B作为上下限，对每个像素求出相对于所述上下限值的明度的相对值，对第1图像及第2图像进行修正。空白图像是对除了不添加癌细胞以外，经过与癌细胞的培养试样相同的步骤来处理的空白试样进行拍摄而获得的最明亮的状态的图像。但，由于存在胶原凝胶基质等，故而并非完全的白图像。暗图像是将摄影透镜的快门关闭等而使光不进入的最暗的状态下的图像。如图3所示，第1图像的明度T₁与第2图像的明度T₂位于空白图像的明度W与暗图像的明度B之间。

继而，将第1图像与第2图像进行比较，排除噪声的影响。

在将第1图像与第2图像的各像素进行比较，明度的差或比小于既定的阈值的情况下，判断所述像素的区域不为癌细胞，将所述像素除外。更详细而言，将所述像素的数据从成为后述评价癌细胞量时的基础的数据中除外。具体而言，例如，只要将第1图像进行修正，以所述空白图像的明度来替换所述像素的明度即可。由此，所述像素的明度不会对癌细胞量的评价造成影响，实质上被除外。

作为所述阈值，在将明度的差作为基准的情况下，例如可将阈值设为明度的阶度数的八分之一。即，当明度由8位·256阶度来表示时，只要在第1图像与第2图像的明度的差小于32的情况下将所述像素除外即可。或者，在将明度的比作为基准的情况下，只要在第1图像与第2图像的明度的比小于既定的阈值的情况下将所述像素除外即可。更优选的是这些阈值通过预备实验而求出。

或者，也可根据各像素的明度来求出吸光度，在吸光度的差或比小于既定的阈值的情况下，判断所述像素的区域不为癌细胞。

不透明的污物不论波长如何，光均不会透过，因此在第1图像中及第2图像中均同样映出得暗。另外，胶原凝胶干燥物中所含的气泡由于光的折射而在图像上映出得暗，因此仍然不论光源的波长如何，在第1图像中及第2图像中均同样映出得暗。因此，通过在第1图像与第2图像中将明度无差异的区域除外，可排除它们的噪声。

此外，在胶原凝胶包埋培养法中细胞量少的情况下，气泡尤其成为问题。若细胞量少，则有时在胶原凝胶干燥物中残留气泡。其原因并不明确，但认为：在细胞量多的情况下，凝胶内的气体通过凝胶滴块中的细胞与基质的界面而去除至外部，与此相对，若细胞量变少，则凝胶内的气体无法完全去除而残存。

图4中示出经NR所染色的试样的透射图像(原图像)。第1光是主波长为528nm的绿色光，第2光是主波长为625nm的红色光。其中，图4是将作为彩色图像的原图像转变为白黑图像者，分辨率也发生了转变。中央部的圆形的范围为试样(胶原凝胶干燥物)。在试样中大量分散存在的细小的暗点为癌细胞或者其菌落，在原图像中表现为红色，在第1图像中表现为暗，在第2图像中未出现。但，由虚线包围的暗点为污物，在原图像中表现出灰色，在第1图像及第2图像中表现为暗。上方的实心的椭圆与下方的中空的椭圆为由气泡引起的噪声，在原图像中表现为灰色，在第1图像及第2图像中表现为暗。

噪声的其他原因中有纤维母细胞的混入。纤维母细胞的影响可通过专利文献3中所记载的方法而排除。纤维母细胞与癌细胞一并由NR等色素所染色，但与癌细胞相比极其难以被染色，图像的明度与癌细胞相比明显提高。因此，在第1图像中，在某像素的明度超过既定的阈值的情况下，判断所述像素的区域为纤维母细胞，将所述像素除外。具体而言，例如，只要将第1图像进行修正，以所述空白图像的明度来替换所述像素的明度即可。阈值可通过预备实验来求出。

或者，作为排除纤维母细胞的影响的另一方法，也可如专利文献1所述，通过图像分析，针对癌细胞与纤维母细胞根据它们的形状来进行识别，且仅导出癌细胞的信息。

通过遍及试样的全部范围反复进行以上的处理，可排除并非由癌细胞的光吸收所引起的噪声的影响。

继而，根据排除了噪声的图像来定量癌细胞。

癌细胞量可通过将每个像素各自的细胞量的指标进行累计来评价。优选的是通过推定体积值来评价癌细胞量。其原因在于，通过胶原凝胶包埋培养法，癌细胞的菌落三维地发展，因此通过考虑其厚度，可进行更准确的评价。推定体积值是通过根据各像素的明度来求出吸光度，遍及试样范围整体将吸光度累计而求出。其原因在于，各区域中，吸光度与细胞厚度呈线性相关。

根据朗伯-比尔定律(Lambert-Beer’s law)，若将对试样的入射光强度设为I₀，将透射光强度设为I，则存在

I/I₀＝exp(-αL)

的关系。此处，α为经染色的癌细胞的吸光系数，L为光在癌细胞中通过的距离、即癌细胞的厚度。各像素的癌细胞的吸光度A是由

A＝-log(I/I₀)

＝(αL)/2.303

所表示，因此吸光度A与癌细胞厚度L成比例。吸光度A为所述像素的细胞量的指标，可通过遍及试样的全部范围而将所述吸光度A累计来求出细胞的体积。此外，log为常用对数。

另一方面，吸光度A是根据经修正的第1图像，由

A＝log{(W-B)/(T₁-B)}

来求出。此处，W为空白图像的像素的明度，B为暗图像的像素的明度，T₁为经修正的第1图像的像素的明度。

根据以上，癌细胞量的推定体积值V是由

V＝∑L＝C∑A＝C∑[log{(W-B)/(T₁-B)}] (式1)

来求出。此处，C为常数。如上所述，可通过根据各像素的明度来求出吸光度，遍及试样范围整体而将吸光度累计，从而求出细胞的推定体积值。

此外，当由于某些原因而经修正的第1图像的像素的明度T₁与暗图像的像素的明度B相等(T₁＝B)时，式1的右边对数的真数的分母成为0，无法计算。针对于此，优选的是，为了使试样图像不会变得过于暗而调节光源的明亮度等，并且在T₁＝B的情况下进行适当的例外处理。

此外，为方便起见，也可将各像素的明度进行累计，根据其累计值来求出吸光度。推定体积值V_p是由

V_p＝C_pA_p＝C_plog{(∑W∑B)/(∑T₁∑B)}

所表示。此处，C_p为常数，A_p为吸光度。所述式是将试样范围整体作为一个区域来求出吸光度，但若细胞量多，例如在将手术材料作为起始材料的情况下，则也可获得充分的精度。在使用所述式的情况下，也已经通过所述图像处理排除了由污物等所引起的噪声的影响。

抗癌剂的感受性试验中，通过利用未添加抗癌剂的对照试样与添加有抗癌剂的试样，将培养后的癌细胞量进行比较，来评价抗癌剂的感受性。

再次叙述本实施方式的癌细胞定量方法的效果。

由污物或气泡引起的噪声在现有技术中难以排除。依据本实施方式的方法，可通过使用第1光及第2光，来排除污物的混入或气泡的残存的影响，从而精度良好地定量癌细胞。不透明的污物仅在第1图像中被误识别为癌细胞，进而由于在图像中映出得暗而被误识别为厚的癌细胞，因此大幅度损及定量精度。气泡仅在第1图像中仍然被误识别为癌细胞，且大多比癌细胞的菌落大，因此大幅度损及定量精度。

进而，通过所述式1，若在试样图像的每个分割区域求出吸光度，将其累计，则可更准确地算出癌细胞的推定体积值。

继而，对本发明的细胞测定方法的第2实施方式进行说明。

本实施方式与第1实施方式同样，是涉及一种抗癌剂感受性试验中的癌细胞的定量方法。本实施方式的方法的第1图像及第2图像的获取方法与第1实施方式不同。其他步骤与第1实施方式相同。

本实施方式中，使发出第1光的第1光源与发出第2光的第2光源依次点亮，在各光源点亮时利用1台照相机随时进行拍摄。由此，通过第1光源点亮时的拍摄而获得第1图像，通过第2光源点亮时的拍摄而获得第2图像。此外，本实施方式中，光源的物理形态也并无特别限定。例如，作为第1光源的LED芯片与作为第2光源的LED芯片可组装于一个LED封装体中，也可使用不同的LED封装体作为第1光源与第2光源，使它们交替排列。

本实施方式中，可使用单色照相机(monochrome camera)。所述情况下，单色照相机较彩色照相机而言可获取更高分辨率者，因此可获得更精细的图像。

[实施例]

利用实施例对所述第1实施方式进行更具体的说明。

使用由人类大肠癌而来的细胞株HCT-116作为癌细胞，利用胶原凝胶包埋法进行培养。作为包埋细胞的胶原凝胶溶液，在8体积的细胞基质TypeCD(仓敷纺织股份有限公司)中，添加1体积的10倍的哈姆(Ham)F12培养液(不含碳酸氢钠)、1体积的再构成用缓冲溶液(包含260mM碳酸氢钠以及200mM-HEPES的50mM-NaOH溶液)，保存于冰中。以最终密度成为4×10⁴细胞/mL的方式，在胶原溶液中添加HCT-116株，充分混合而制备胶原混合液。使用微量吸管，将所述胶原混合液在24孔板的1孔中，以10μL为单位，隔开适当的间隔而滴加于3处。然后，在CO₂恒温箱中以37℃加温1小时，制作包含癌细胞的胶原基质。在所获得的胶原凝胶基质中，添加1mL的含10％FBS的DF培养基，进行16小时培养。然后，在孔中注入NR染色剂，进行福尔马林固定·干燥，获得胶原凝胶干燥物。

将所获得的胶原凝胶干燥物载置于试样平台上，从下方以照明来照射，利用彩色照相机来拍摄透射图像。照明是使用1个LED封装体(科锐有限公司(CREE Inc.)，MC-E色(MC-E Color))。LED封装体中搭载有RGB3色的LED芯片，仅使其中的R及G的芯片点亮来使用。第1光是主波长为528nm的绿色光，第2光是主波长为625nm的红色光。彩色照相机(索尼股份有限公司，XCL5005CR)是以像素数2448×2050、RGB各8位阶度，使用光学倍率为1.3倍的透镜。此时图像的分辨率约为2.7μm。

将所拍摄的原图像转变为白黑图像而成者为图6(无气泡的试样)以及图7(气泡多的试样)。图6及图7中所示的试样中包含基本上为相同程度的量的癌细胞。此外，前文所述的图4也为利用与本实施例相同的方法而获得的图像。将原图像分色为RGB 3色，将G图像作为第1图像，将R图像作为第2图像。对于每个像素将第1图像与第2图像进行比较，在明度的差为35以内的情况下，判断为不为癌细胞。根据所述式1，对每个像素算出吸光度，遍及试样的全部范围进行累计，求出癌细胞的推定体积值。此时，式1的常数C的值使用2.0×10^-4。

作为比较例，不利用第2图像，根据第1图像的明度来算出吸光度，遍及试样的全部范围进行累计，同样地求出癌细胞的推定体积值。

关于利用实施例的方法来获得的推定体积值，图6为0.42，图7为0.44。比较例的方法中，图6为0.47，图7为1.54。在无气泡的图6中，实施例与比较例中获得相同程度的推定体积值。另一方面，在气泡多的图7中，比较例的推定体积值为实施例的推定体积值的约3倍。这是由气泡引起的噪声的影响，实施例中可排除由气泡引起的噪声。

本发明的细胞测定方法并不限定于所述实施方式或实施例，可在其技术思想的范围内进行多种变形。

例如，所述实施方式中，以明度的相对化(空白修正)、通过第1图像与第2图像的比较的污物·气泡等的噪声排除、纤维母细胞的噪声排除的顺序来实施，但它们也可分别调换顺序来实施。

另外，例如可使用白色照明，依次切换设置于照相机前方的彩色滤光片来进行摄影，获取第1图像及第2图像。

另外，例如也可在照明中使用具有连续光谱的白色光源，利用彩色照相机来拍摄并进行分色，由此获取第1图像与第2图像。但，彩色照相机的拍摄元件通常由于感度光谱广而一部分重复，故而使用波长不同的2个光源者可更清晰地获得第1图像与第2图像的差异。

符号的说明

10：测定装置

11：试样平台

12：照明

13：LED封装体

14：照明电源

15：光扩散板

16：彩色照相机

17：图像处理装置

20：试样

Claims

1.一种细胞测定方法，包括：

将所培养的靶细胞以色素染色的步骤；

获取第1图像及第2图像的步骤，所述第1图像及所述第2图像为相对于所述色素的吸光度不同的第1光及第2光的透射图像；

将所述第1图像及所述第2图像分别分割为多个分割区域，在每个所述分割区域中将所述第1图像与所述第2图像进行比较而排除噪声的步骤；以及

通过在排除了所述噪声的图像中对每个所述分割区域的细胞量的指标进行累计来评价所述靶细胞量的步骤。

2.根据权利要求1所述的细胞测定方法，其中

排除所述噪声的步骤是在每个所述分割区域中将所述第1图像与所述第2图像进行比较，当所比较的分割区域的明度的差或比小于既定值时，将所述分割区域从成为所述靶细胞量的评价的基础的数据中除外的步骤。

3.根据权利要求1所述的细胞测定方法，其中

排除所述噪声的步骤是在每个所述分割区域中将所述第1图像与所述第2图像进行比较，当所比较的分割区域的吸光度的差或比小于既定值时，将所述分割区域从成为所述靶细胞量的评价的基础的数据中除外的步骤。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞测定方法，其中

所述靶细胞为癌细胞。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞测定方法，其中

所述靶细胞为包埋于胶原凝胶中来培养的细胞。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞测定方法，其中

所述第1图像及所述第2图像是通过对同时照射所述第1光及所述第2光并利用1台彩色照相机进行拍摄而得的图像进行分色而获取。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞测定方法，其中

所述第1图像及所述第2图像是通过依次照射所述第1光与所述第2光并利用1台彩色照相机随时进行拍摄而获取。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞测定方法，其中

所述靶细胞量的评价是通过在每个所述分割区域中根据图像明度来算出吸光度，并遍及多个所述分割区域对所获得的吸光度进行累计以算出靶细胞的推定体积值来进行。