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CN107922904A - 用于产生自体细胞疗法的细胞保持器 - Google Patents

用于产生自体细胞疗法的细胞保持器 Download PDF

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CN107922904A
CN107922904A CN201680031714.6A CN201680031714A CN107922904A CN 107922904 A CN107922904 A CN 107922904A CN 201680031714 A CN201680031714 A CN 201680031714A CN 107922904 A CN107922904 A CN 107922904A
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A·布兰查德
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Flourishing Biological Polytron Technologies Inc
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Abstract

在一些方面，本发明涉及自动化细胞培养培殖器及其使用方法。在一个方面，本披露提供了细胞培养培殖器，所述细胞培养培殖器具有气锁室、储存室和/或内部室。在一些方面，本披露提供了用于产生自体哺乳动物细胞培养物的方法。

Description

用于产生自体细胞疗法的细胞保持器
相关申请
本发明根据35U.S.C.119(e)要求于2015年3月31日提交的名称为“CellMaintainer For Autologous Cell Therapy Production[用于产生自体细胞治疗的细胞保持器]”的美国临时申请USSN62/141,196的权益，所述申请的全部内容通过援引并入本文。
技术领域
本发明的多个方面涉及自动化细胞培养培殖器以及使用这样的培殖器的方法。一些方面涉及用于产生自体哺乳动物细胞培养物的方法。
背景技术
自体细胞疗法是一种个性化医学技术，其中将人类细胞植入、移植、输注或转移回到原先回收细胞或组织的个体中。例如，可以将软骨细胞从患有软骨损伤的患者中分离出来，在培养系统中扩增，然后植回到患者体内，以便减轻与软骨损伤相关的关节疼痛。自体细胞疗法的其他实例包括自体树突细胞、间充质基质细胞以及T淋巴细胞。自体细胞疗法具有许多优点，包括供体可以立即使用、细胞或组织排斥减少以及移植物抗宿主疾病减少。此外，细胞的自体性质意味着不需要细胞受体的HLA匹配以及免疫抑制。尽管自体细胞疗法有许多治疗优势，但是在自体细胞培养物的制造和生产中的若干个挑战对在商业上的成功设置了障碍。
发明内容
制造自体细胞疗法的一个挑战是“外扩”，或同时从不同供体产生多批自体细胞培养物的能力。必须保持严格的无菌条件，以防止不同患者的自体培养物之间的交叉污染。一些当前使用的用于自体细胞培养的方法和装置依赖于手动培养技术，这样可能将污染物引入培养物并且使培养物暴露于非无菌条件和/或物理环境的变化(例如，温度、湿度等、或其任意组合的变化)下。其他细胞培养设备不能提供以最小的交叉污染风险对来自于多个供体的细胞进行培养的能力。因此，本文提供了新型细胞培养系统和方法，在保持严格的无菌条件的同时允许多种细胞培养物的远程保持和显著外扩能力。
在一些方面，本文提供了用于产生哺乳动物细胞培养物的方法，所述方法包括：(a)在存在生长培养基的情况下将哺乳动物细胞样本引入到细胞培养器皿中，其中，所述器皿包括被配置成允许材料无菌地转移进入或离开所述器皿的通路；并且(b)使细胞样本在培殖器中扩增成为哺乳动物细胞培养物，其中，所述培殖器包括无菌内部生长室。
在一些实施例中，通过所述通路将细胞样本引入细胞培养器皿中。在一些实施例中，器皿的通路被透气膜覆盖。在一些实施例中，培养器皿上的膜提供单向阀或“环境”界面，可以通过其在封闭的自体培养器皿内对气体环境进行控制。在一些实施例中，可以呈多个自体培养器皿的形式提供多个封闭系统(例如，在单个温度受控的环境内)。在一些实施例中，整体培殖器环境保持集合系统的环境温度。在一些实施例中，通过包含一组用于气体交换的膜“阀”的界面(例如，管道接口)来保持每个封闭的器皿的内部气体环境。在此类实施例中，这种构造便于控制、监测和记录独立的自体培养物。
在一些实施例中，所述方法还包括通过器皿中的通路将生长培养基无菌地引至细胞培养物。
在一些实施例中，所述方法还包括通过器皿中的开口将生物材料无菌地引至细胞培养物。在一些实施例中，生物材料是细胞生长因子。在一些实施例中，生物材料是核酸分子。在一些实施例中，核酸分子是核酸载体。在一些实施例中，核酸载体是转染载体。在一些实施例中，核酸载体是转导载体。在一些实施例中，核酸载体包含转基因材料。在一些实施例中，生物材料是酶(例如，核酸酶、连接酶、聚合酶或修饰核酸的其他酶)。在一些实施例中，生物材料包括核酸修饰酶与一种或多种核酸的混合物。
在一些实施例中，所述方法还包括无菌地监测生长培养基的状况。在一些实施例中，将培殖器保持在恒定的温度范围。在一些实施例中，将培殖器保持在约37摄氏度。
在一些实施例中，所述方法还包括无菌地监测细胞的状况。
在一些实施例中，所述方法还包括无菌地添加试剂以控制生长培养基的化学组成(例如，pH值、葡萄糖浓度、乳酸盐浓度、其他小分子的浓度、或生长培养基的总渗透压)。
在一些实施例中，所述方法还包括对细胞培养物进行无菌成像。在一些实施例中，所述方法还包括对细胞培养物进行过滤。在一些实施例中，所述方法还包括无菌地去除细胞培养物的等分部份。
在一些实施例中，培殖器是如本文所述的细胞培养系统。
在一些方面，本文提供了一种包括培殖器柜的细胞培养系统，所述培殖器柜包括：转移室；一个或多个内部室；从外部环境通向所述转移室的外部门；从所述转移室通向第一内部室的第一内部门；从所述转移室通向第二内部室的第二内部门；以及转移装置，所述转移装置用于使一个或多个物品在所述转移室与所述第一内部室之间和/或在所述转移室与所述第二内部室之间和/或在所述第二内部室与所述第一内部室之间移动。
在一些实施例中，细胞培养系统还包括联接至泵的灭菌介质供应源(例如，臭氧发生器)，其中，灭菌介质供应源(例如，臭氧发生器)被配置成用于向转移室供应灭菌介质(例如，臭氧气体)。在一些实施例中，灭菌介质供应源(例如，臭氧发生器)被配置成用于向一个或多个内部室供应灭菌介质(例如，臭氧气体)。
在一些实施例中，外部门在关闭时形成基本上不漏气体的密封。在一些实施例中，第一内部门和第二内部门在关闭时均形成基本上不漏气体的密封。
在一些实施例中，泵被配置成用于从转移室和/或一个或多个内部室中去除灭菌介质。
在一些实施例中，储存室包括储存位置。在一些实施例中，储存位置被配置成用于固持多个细胞培养器皿。在一些实施例中，多个细胞培养器皿中的每个器皿都容纳来自不同患者的细胞。在一些实施例中，多个细胞培养器皿中的每个器皿都标记有唯一的条形码。
在一些实施例中，内部室包括成像器和成像位置。在一些实施例中，成像器是全息成像器。在一些实施例中，成像器是显微镜，如明视场显微镜或荧光显微镜。在一些实施例中，细胞培养系统还包括用于成像器的控制器。
在一些实施例中，内部室包括操纵器和操纵位置。在一些实施例中，操纵器是细胞拾取器。在一些实施例中，操纵器包括流体处置系统。
在一些实施例中，细胞培养系统还包括用于操纵器的控制器。
在一些实施例中，内部室包括流体储存位置。在一些实施例中，内部室包括细胞分选或细胞分离设备。在一些实施例中，细胞分选或细胞分离设备是离心机。在一些实施例中，细胞分选或细胞分离设备是荧光激活细胞分选(FACS)机器。在一些实施例中，内部室包括用于成像和/或操纵单独细胞的微流体装置。
在一些实施例中，转移装置包括一个或多个机器人元件。在一些实施例中，细胞培养系统还包括用于转移装置的控制器。在一些实施例中，用于成像器的控制器、用于操纵器的控制器和/或用于转移装置的控制器在培殖器柜的外部。在一些实施例中，用于成像器的控制器、用于操纵器的控制器和/或用于转移装置的控制器包括单一处理器。在一些实施例中，用于成像器的控制器、用于操纵器的控制器和/或用于转移装置的控制器包括计算机。在一些实施例中，单一计算机控制成像器、操纵器和/或转移装置。
在一些实施例中，细胞培养系统还包括条形码扫描仪。在一些实施例中，条形码扫描仪连接至计算机，其中，计算机在培殖器柜的外部。
在一些方面，本文提供了一种包括两个或更多个细胞培养器皿的细胞培养系统，其中，每个器皿包括来自一个不同患者的细胞，并且其中，每个器皿包括被配置成允许材料无菌地进入或离开所述器皿的通路。
附图说明
附图不旨在按比例绘制。在附图中，可以由相似的数字表示不同的图中示出的每个相同或几乎相同的部件。为清楚起见，可能并不是每个图中的每个部件都标有标记。现在将参考附图通过举例来描述本发明的不同实施例，在附图中：
图1是包括培殖器柜的细胞培养系统的说明性实施例的示意图，所述培殖器柜包括容纳多个细胞培养器皿的内部室。每个细胞培养器皿都容纳来自不同受试者的细胞培养物；
图2A-2B是细胞培养系统的说明性实施例的示意图；图2A示出了包括培殖器柜的细胞培养系统的示意图，所述培殖器柜包括转移室和内部室；图2B示出了包括培殖器柜的细胞培养培殖器的示意图，所述培殖器柜包括转移室、容纳多个细胞培养器皿的内部室、臭氧发生器、以及泵；
图3是包括培殖器柜的细胞培养系统的说明性实施例的示意图，所述培殖器柜包括转移柜、容纳多个细胞培养器皿的第一内部室、以及包括成像器和操纵器的第二内部室；
图4是包括培殖器柜的细胞培养系统的说明性实施例的示意图，所述培殖器柜包括内部室、多个细胞培养器皿、以及成像器。
具体实施方式
目前使用的细胞培养培殖器对自体细胞培养的成功设置了障碍。例如，许多细胞培养培殖器要求移除细胞培养器皿并随后进行手动处置。从培殖器提供的受保护环境中移除培养的细胞的步骤增加了培养物在潜在污染物(包括来自其他自体细胞培养物的交叉污染)和/或物理环境的变化(例如，温度、湿度等或其任意组合的变化)下的暴露。此外，操作人员手动处置培养物引入了由于人为错误(例如，不恰当的灭菌技术)所产生的污染的可能性。本文件中的用于对自体细胞培养物进行远程保持(例如，以最少的人力处置)的方法和设备克服了这些障碍和问题。本文件部分地基于细胞培养器皿的发展，细胞培养器皿能够允许材料无菌地传递进出细胞培养器皿，并且同时允许同时产生来自不同受试者的多种细胞培养物、而同时使培养物之间的交叉污染以及培养物在非无菌和/或非受控的物理环境下的暴露的风险最小化。
细胞培养方法
在一个方面，本文件涉及一种用于产生哺乳动物细胞培养物的方法，包括以下步骤：在存在生长培养基的情况下将哺乳动物细胞样本引入到细胞培养器皿中，其中所述器皿具有被配置成允许材料无菌地传递进入或离开所述器皿；并且使培殖器中的细胞样本扩增成哺乳动物细胞培养物，其中，培殖器包括无菌的内部室。
如本文使用的，“细胞培养”是指在受控条件下(例如，离体) 保持和/或生长细胞的程序。在一些实施例中，在促进细胞生长和复制的条件、促进重组产物表达的条件、促进分化的条件(例如，分化成一种或多种组织特异性细胞类型)、或其中两种或更多种的组合的条件下培养细胞。
如本文使用的，术语“哺乳动物细胞样本”是指从哺乳动物受试者获得的任何细胞。哺乳动物受试者的非限制性实例包括人类、非人灵长类、小鼠、大鼠、马、狗、猫和豚鼠。在一些实施例中，哺乳动物细胞样本是从人类获得的。
在一些实施例中，细胞样本是从组织或器官(例如，人类组织或器官)(包括但不限于实体组织和器官)分离出的。在一些实施例中，细胞样本可以从胎盘、脐带、骨髓、肝脏、血液(包括脐带血)、或任何其他合适的组织分离出。在一些实施例中，从患者分离出患者特异性细胞样本，以用于培养(例如，用于细胞扩增和可选的分化)、并且随后再植入同一患者或不同患者。在一些实施例中，在本文描述的培殖器中生长的细胞可以用于同种异体或自体治疗。在一些实施例中，为了提供免疫疗法(例如，嵌合抗原受体疗法(CAR-T))或 CRISPR/Cas修饰细胞的递送)的目的，可以对在本文披露的培殖器中生长的细胞进行遗传修饰、扩增并再引入患者。
在一些实施例中，从组织或生物样本中分离出细胞以在本文描述的培殖器中进行离体培养。在一些实施例中，从血液中分离出细胞(例如，白血细胞)。在一些实施例中，使用物理和/或酶促破坏从组织或生物样本中释放细胞。在一些实施例中，使用一种或多种酶例如胶原酶、胰蛋白酶、或蛋白酶来消化细胞外基质。在一些实施例中，将组织或生物样本置于培养基中(例如，有或没有物理或酶促破坏)，并且可以分离在培养基中释放和生长的细胞以用于进一步培养。
本文所述的方法适合于培养各种各样的哺乳动物细胞类型。在一些实施例中，哺乳动物细胞样本是可用于自体细胞疗法的细胞。如本文使用的，术语“自体细胞疗法”是指将培养的细胞植入、移植、输注或转移回到获得细胞的个体中。例如，可以从患有癌症的受试者获得免疫细胞，使其扩增成细胞培养物，使用针对癌症的抗原进行引发，并且重新引入到患者体内，以便增强受试者的免疫应答。可用于自体培养的细胞的实例包括但不限于干细胞(例如，造血干细胞、成体干细胞、全能干细胞、多能干细胞、胎儿干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞和诱导性多能干细胞)、祖细胞(例如，卫星细胞、神经祖细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、成血管细胞和内皮祖细胞)、免疫细胞(例如，T-淋巴细胞、树突细胞)以及分化细胞(上皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞和软骨细胞)。
如本文所述，通路可以被配置成允许材料无菌地转移进入和离开器皿，其方式是对在同时培养来自不同受试者的哺乳动物细胞的过程中使交叉污染最小化是有用的。在一些方面，本文提供的方法涉及使用细胞培养器皿，其中，所述器皿包括被配置成允许材料无菌地转移进入或离开所述器皿的通路。如本文所使用的，术语“通路”是指允许材料移入或移出器皿的导管。例如，器皿可以是端部开放的管，其开口由可刺破的自密封膜密封。在一些实施例中，所述膜是透气膜。在一些实施例中，所述通路是与密封的透气器皿处于流体连通的无菌、用后可弃式管。在一些实施例中，所述通路是具有能够被灭菌的入口端口和出口端口的微流体通道网络，所述微流体通道网络被整合到密封的培养器皿中。
如本文所使用的，术语“无菌转移”是指材料从一个位置移动到另一个位置而不会引入污染物。例如，由于培养基的非无菌转移可能将病原体或其他污染物引入细胞培养物中，所以可能希望将培养基无菌地从储存容器转移到细胞培养器皿中。污染物包括但不限于细菌(例如，致病细菌和非致病细菌)、病毒(例如，致病病毒和非致病病毒)、霉菌、孢子、以及灰尘。在一些实施例中，污染物是细胞。例如，当同时对从不同受试者获得的细胞进行培养时，要求对材料进行无菌转移，使得不会发生交叉污染(即，将细胞或培养基从一个培养物引入一种不同培养物)。
可以使用无菌技术来防止或最小化在生长和操纵过程中对细胞培养物的污染。在一些实施例中，使用适当的技术来对用于细胞培养的设备(例如，移液管、流体处置装置、操纵装置、其他自动化装置或机器人装置等)进行灭菌。非限制性技术包括热暴露(例如，高压灭菌)、表面消毒(例如，使用酒精、漂白剂或其他消毒剂)、照射、和/或暴露于消毒气体(例如，臭氧、过氧化氢等)，如在此描述的。在一些实施例中，使用适当的技术将培养基灭菌。非限制性技术包括热暴露(例如，高压灭菌)、抗微生物/抗病毒处理、过滤、和/或辐照。
在一些实施例中，细胞培养物的操纵是在无菌条件下进行的，例如在已经被消毒并且已经过滤空气以移除潜在污染物的环境中(例如，培殖器室内)进行。
在一些实施例中，细胞培养物在符合GMP的条件下生长并保持，包括那些包括使用符合GMP的培养基或符合GMP的液体处置设备的条件。在一些情况下，通过执行与标准操作程序(SOP)结合的方法而使生长和保持细胞培养物。
在一些实施例中，可以监测和/或评估细胞培养物以检测污染。在一些实施例中，可以检测来自不同类型的生物体的细胞造成的污染。在一些实施例中，可以使用任何合适的技术检测支原体、细菌、酵母或病毒对哺乳动物细胞培养物的污染。在一些实施例中，细胞培养物污染可以通过测定是污染(例如，通过细菌或酵母)的特征、而不是在培养物中生长的细胞(例如，哺乳动物细胞)的特征的一种或多种培养物特性(例如，pH、浊度等)的变化或变化速率来检测。在一些实施例中，可以使用一种或多种分子检测测定法(例如，PCR、ELISA、 RNA标记、或其他酶促技术)或基于细胞的测定法来检测污染(例如，支原体、细菌、酵母、病毒、或其他污染)。
在一些实施例中，可以监测和/或评估细胞培养物以检测被相似类型的细胞的污染(例如，被不同人类细胞或不同哺乳动物细胞污染的人类细胞系)。在一些实施例中，可以使用DNA测序或DNA指纹分析(例如，短串联重复STR指纹分析)、同工酶分析、人淋巴细胞抗原(HLA)分型、染色体分析、核型分析、细胞形态学、或其他技术来评估细胞培养物及其潜在的污染。
在一些实施例中，使用本文描述的培殖器或方法产生的细胞可以被冷冻以保存它们供以后使用和/或用于运输。在一些实施例中，将细胞在生长和/或分化之后并且在冷冻之前与冷冻保存成分混合。可以将冷冻保存成分添加至细胞培养器皿中，或可以将细胞与冷冻保存成分一起从细胞培养器皿转移至冷冻保存器皿中。可以包含在冷冻保存成分中的冷冻保护剂的非限制性实例包括DMSO、甘油、PEG、蔗糖、海藻糖、和右旋糖。在一些实施例中，可以提供冰箱作为培殖器的部件以利于冷冻从细胞培养物分离出的细胞。例如，一个或多个冰箱可以位于内部室中和/或整合到培殖器柜中(例如，整合到培殖器柜的壁中)。
如本文使用的，“细胞培养器皿”是包括壳体和用于培养细胞的一个或多个室的装置。在一些实施例中，所述壳体是框架。所述框架可以联接至盖件上。所述一个或多个室可以包括细胞培养基，所述细胞培养基包括一个或多个膜。在一些实施例中，细胞培养器皿可以包括用于促进细胞生长的营养素。在某些实施例中，细胞培养器皿可以完全包封一个或多个细胞或细胞群。细胞培养器皿的壳体可以包括一个或多个孔隙或开口，以允许气体在细胞培养器皿与其周围环境之间传递。在某些实施例中，细胞培养器皿包括透明的或光学透亮的窗口。例如，联接至细胞培养器皿的壳体上的盖件可以包括光学透亮的部分，以用于例如用显微镜或其他成像器来观察细胞。
可以如本文所述地设计各种类型的细胞培养器皿。细胞培养器皿可以由任何非反应性生物相容性材料(如玻璃、塑料或硅酮)制成。通常，细胞培养器皿形成瓶、烧瓶、小瓶、袋子、管或培养平板。在一些实施例中，所述细胞培养器皿是小瓶。在一些实施例中，所述细胞培养器皿是瓶或烧瓶。在一些实施例中，所述细胞培养器皿是培养平板。在一些实施例中，所述平板是细胞培养皿。在一些实施例中，所述平板是多孔培养平板。通常，多孔板包括96、384或1536个孔的阵列。在一些实施例中，细胞培养器皿包括基本上非反射性的一个或多个部分。在一些实施例中，细胞培养器皿是带条形码的。在一些实施例中，培殖器包括条形码阅读器。
在一些实施例中，细胞培养器皿可以预先装备有对于特定目的所希望的一种或多种试剂，例如用于细胞生长、用于细胞分化、用于使细胞经受特定测定条件等等。在一些实施例中，预先装备的细胞培养器皿在实验之前包含对于执行特定实验有用的试剂(例如，细胞生长培养基、生长因子、选择剂、标记试剂等)。预先装备的细胞培养器皿可以通过提供不需要添加试剂的、准备好细胞培养的器皿来利于实验方案。例如，来自患者的祖细胞可以被添加到预先装备有细胞分化的试剂的细胞培养器皿中，其目的是扩增用于自体细胞治疗的分化细胞群。预先装备的细胞培养器皿可以在任何适当的温度下储存，该温度是由预先装备的细胞培养器皿内的试剂的推荐储存参数确定的。在一些实施例中，预先装备的细胞培养储存器皿在使用之前被储存在约 -80℃与约37℃之间的温度下。在一些实施例中，预先装备的细胞培养储存器皿在使用之前被储存在约-80℃与约-20℃之间的温度下。在一些实施例中，预先装备的细胞培养储存器皿在使用之前被储存在约 -20℃与约4℃之间的温度下。在一些实施例中，预先装备的细胞培养储存器皿在使用之前被储存在约4℃与约37℃之间的温度下。在一些实施例中，预先装备的细胞培养器皿是可抛弃式的。在一些实施例中，预先装备的细胞培养器皿是可重复使用的和/或可再填充的。
在一些实施例中，细胞培养器皿被配置成用于培养悬浮的细胞。在一些实施例中，细胞培养器皿被配置成用于培养贴壁细胞。在一些实施例中，细胞培养器皿被配置成用于2D或3D细胞培养。在一些实施例中，细胞培养器皿包括一个或多个表面或微载体以支持细胞生长。在一些实施例中，这些细胞培养器皿被涂覆有细胞外基质组分(例如，胶原蛋白、纤维蛋白和/或层粘连蛋白组分)以增加粘附特性并提供生长和/或分化所需的其他信号。在一些实施例中，细胞培养器皿包含一种或多种合成水凝胶，例如聚丙烯酰胺或聚乙二醇(PEG)凝胶，以支持细胞生长。在一些实施例中，细胞培养器皿包括具有嵌入的营养素(例如，凝胶或琼脂，例如用于某些细菌或酵母培养物)的固体支撑物。在一些实施例中，细胞培养器皿包含液体培养基。
在一些实施例中，将生长培养基无菌地引入到细胞培养器皿中。如本文所用，术语“生长培养基”是指含有保持细胞活力和支持增殖的营养素的用于培养细胞的培养基。在一些情况下，可以使用不同参数和条件来培养细胞。生长培养基可以含有以下适当量和组合的任何营养素：盐、缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其他糖、抗生素、血清或血清替代物、以及其他组分(如肽生长因子等)。生长培养基在本领域中是已知的，并且可以被分类为天然或人工培养基。细胞培养基的实例包括但不限于最低必需培养基(MEM)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)和Roswell Park Memorial Institute(洛斯维·帕克纪念研究所)培养基(RPMI)。可以选择适合用于对细胞进行培养的培养基。
在一些实施例中，在任何合适的培养基之一中培养细胞。可以针对不同的细胞类型或针对不同的应用使用具有不同范围的pH、葡萄糖浓度、生长因子和其他补充物的不同培养基。在一些实施例中，可以使用定制的细胞培养基或商业上可获得的细胞培养基，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、最低必需培养基、RPMI培养基、HA或HAT培养基、或可以从生命技术公司(Life Technologies)或其他商业来源获得的其他培养基。在一些实施例中，细胞培养基包含血清(例如，胎牛血清、小牛血清、马血清、猪血清、或其他血清)。在一些实施例中，细胞培养基是无血清的。在一些实施例中，细胞培养基包含人血小板裂解液(hPL)。在一些实施例中，细胞培养基包含一种或多种抗生素(例如，放线菌素 D、氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢噻肟、膦胺霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、青霉素、青霉素链霉素、多粘菌素B、链霉素、四环素、或任何其他合适的抗生素、或其中两种或更多种的任何组合)。在一些实施例中，细胞培养基包含一种或多种盐(例如，平衡盐、氯化钙、氯化钠、氯化钾、氯化镁等)。在一些实施例中，细胞培养基包含碳酸氢钠。在一些实施例中，细胞培养基包含一种或多种缓冲液 (例如，HEPES或其他合适的缓冲液)。在一些实施例中，包含一种或多种补充物。补充物的非限制性实例包括还原剂(例如，2-巯基乙醇)、氨基酸、胆固醇补充物、维生素、转铁蛋白、表面活性剂(例如，非离子型表面活性剂)、CHO补充物、原代细胞补充物、酵母溶液、或其中两种或更多种的任何组合。在一些实施例中，将一种或多种生长或分化因子添加到细胞培养基中。生长或分化因子(例如，WNT 家族蛋白、BMP家族蛋白、IGF家族蛋白等)可以单独地或组合地添加，例如作为包含用于引起向特定谱系分化的不同因子的分化混合物。可以使用整合被为本文提供的培殖器的一部分的自动化液体处理器来添加液体培养基的生长或分化因子和其他方面。
在一些实施例中，将生物材料无菌引入细胞培养器皿中。生物材料的实例包括但不限于生长因子、核酸和表达载体。生长因子是刺激细胞生长、增殖、愈合和/或分化的天然存在的物质。一般而言，生长因子是蛋白质或类固醇激素。在哺乳动物细胞培养的背景下，可以将生长因子引入培养基，以便控制细胞周期或诱导培养的细胞的增殖或分化。生长因子的非限制性实例包括血管生成素、骨形态发生蛋白 (BMP)、表皮生长因子(EGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子 (NGF)、转化生长因子β(TGF-β)、以及血管内皮生长因子(VEGF)。
在一些实施例中，生物材料是核酸或表达载体。例如，可以经由引入对重编程蛋白因子和microRNA进行编码的遗传物质而使体细胞“重编程”为诱导干细胞。在一些实施例中，本文提供的方法还包括将核酸或表达载体无菌地引入细胞培养器皿中。在一些实施例中，将核酸引入细胞培养物。核酸的实例包括DNA、RNA、siRNA、miRNA、 ami-RNA、shRNA、以及dsRNA。在一些实施例中，将表达载体引入细胞培养器皿中。术语“表达载体”是指能够人为地将外来遗传物质带入另一种细胞中并在细胞中表达遗传物质的工程分子。通常可以将表达载体分类为转染载体和转导载体。转染载体(例如，基于DNA 的质粒载体)通常用于非病毒介导地将遗传物质转移进入细胞。转导载体(例如，慢病毒载体、AAV载体、rAAV载体和逆转录病毒载体) 通常用于病毒介导地将遗传物质转移进入细胞。在一些实施例中，表达载体包含转基因。表达载体的转基因序列的组成将取决于所得到的载体所投入到的用途。例如，一种类型的转基因序列包括在表达时产生可检测的信号的报告序列。在另一个实例中，转基因对治疗性蛋白质或治疗功能性RNA进行编码。
在一些方面，本文件涉及在受控条件下(例如，在无菌和/或灭菌条件下)监测细胞的方法。在一些方面，在本文描述的方法对于细胞培养(例如，生长和保持用于重组蛋白质表达的细胞、或生长和/或分化用于治疗应用(例如植入)的细胞)是有用的。在一些实施例中，对本文提供的培殖器内的条件(例如，环境)进行监测。在一些情况下，可以监测培殖器内的温度、湿度、二氧化碳、氧气和其他气态成分。在一些实施例中，对生长培养基的状况(例如，温度、氧气、二氧化碳和pH值)进行监测。可以经由探测器和传感器之间监测、或经由比色法(例如，含有酚红的培养基)或成像技术(例如，红外或热成像)间接监测生长培养基状况。在一些实施例中，通过从培养器皿中无菌地移除包含生长培养基和细胞的等分部份、并且在培养器皿外部的位置对等分部份进行分析来监测生长培养基和细胞的状况。在一些实施例中，例如通过对等分部份进行离心过滤以从生长培养基中分离细胞。
在一些实施例中，本文描述的培殖器和方法用于监测或测定培养基的营养素耗尽、pH变化、温度变化、凋亡或坏死细胞的积聚、和/ 或细胞密度。在一些实施例中，本文描述的培殖器和方法用于在适当时修改或改变培养基或条件和/或用于传代细胞培养物。在一些实施例中，本文描述的方法是自动化的。
细胞培养系统
在一些方面，本文件涉及包括培殖器柜的细胞培养系统。如本文使用的，“培殖器柜”是壳体，所述壳体包括被配置成用于固持一个或多个细胞培养器皿的一个或多个室。在一些实施例中，培殖器柜包括转移室和内部室，其中之一或二者被配置成用于固持一个或多个细胞培养器皿。在一些实施例中，培殖器可以包括一个或多个其他元件，例如：一个或多个气体源(例如，气瓶或臭氧发生器)；管道(例如，用于传送一种或多种液体或气体，例如水、蒸馏水、去离子水、细胞培养基、空气、二氧化碳、臭氧以及氧气)；空气流动机构(例如，阀、释放阀、针孔、气体调节器、以及质量流量调节器)；压力机构 (例如，泵，例如干式涡旋泵、旋转泵、动量传输泵、扩散泵、或隔膜泵；抽吸管道；真空系统；以及鼓风机)；环境监测器和控件(例如，气体传感器和/或监测器，用于感测和/或控制例如二氧化碳、氧气和臭氧等气体的浓度；热量源或散热片；温度监测器和控件；湿度监测器；气体洗涤器；空气过滤器；用于测量颗粒物质的器械；压力计；以及流量计)；门(例如，开口或面板)；窗(例如，由玻璃、塑料、复合材料、或其他基本上透明的材料制成的光学窗口，用于观察培殖器柜内部的区域)；端口(例如，以允许引入或去除一种或多种气体或液体)；光源(例如，灯、灯泡、激光器以及二极管)；光学元件(例如，显微镜物镜、反射镜、透镜、滤光器、孔口、波板、窗口、偏振器、光纤、分束器、以及合束器)；成像元件(例如，相机、条形码读取器)；电气元件(例如，电路、电缆、电源线、以及电源，如电池、发电机、以及直流或交流电源)；计算机；机械元件 (例如，马达、轮子、齿轮、机器人元件、以及致动器，例如气动致动器、电磁致动器、具有凸轮的马达、压电致动器、以及带有导螺杆的马达)；以及控制元件(例如，转盘、按钮、键、扳机、开关、指针、螺钉、拨号盘、屏幕、以及触摸屏)。在一些实施例中，这些其他元件中的一个或多个是培殖器的一部分、但在培殖器柜的外部。在一些实施例中，这些其他元件中的一个或多个元件被包含在培殖器柜内。
在一些实施例中，本文件涉及用于在受控条件下(例如，在无菌和/或灭菌条件下)培养、操纵和/或监测细胞的培殖器和方法。在一些实施例中，细胞培养培殖器包括培殖器柜，所述培殖器柜具有用于在一个或多个细胞培养器皿中培殖细胞的内部室。在一些情况下，除了从转移室通向内部室的内部门之外，培殖器还包括从外部环境直接通向内部室的至少一个外部门(例如，1、2、3、4、或更多个外部门)，例如用于在培殖器未运行的时间段期间、例如培殖器维修期间提供到内部室的替代性通路。在一些实施例中，培殖器包括在内部室的用于储存一个或多个细胞培养器皿的储存位置。
在一些实施例中，本文提供的培殖器或培殖器柜是矩形立方体形状的。在一些实施例中，本文提供的培殖器或培殖器柜具有在1ft2至 16ft2范围内的矩形占地面积。在一些实施例中，本文提供的培殖器或培殖器柜具有最大约为1ft2、2ft2、3ft2、4ft2、5ft2、6ft2、7ft2、8ft2、 9ft2、10ft2、11ft2、12ft2、13ft2、14ft2、15ft2或16ft2的矩形占地面积。在一些实施例中，本文提供的培殖器或培殖器柜具有在1ft3至 100ft3范围内的总的室容积。在一些实施例中，本文提供的培殖器或培殖器柜具有最大约为1ft3、5ft3、10ft3、25ft3、50ft3或100ft3的室容积。在一些实施例中，本文提供的培殖器或培殖器柜具有在0.09 m2至1.78m2范围内的矩形占地面积。在一些实施例中，本文提供的培殖器或培殖器柜具有最大约为0.1m2、0.2m2、0.3m2、0.4m2、0.5 m2、0.6m2、0.7m2、0.8m2、0.9m2、1.0m2、1.1m2、1.2m2、1.3m2、1.4m2、1.5m2、1.6m2或1.7m2的矩形占地面积。在一些实施例中，本文提供的培殖器或培殖器柜具有在0.03m3至3m3范围内的总的室容积。在一些实施例中，本文提供的培殖器或培殖器柜具有最大约为 0.03m3、0.1m3、0.3m3、1m3或3m3的室容积。
在一些实施例中，培殖器柜是单层壁的。在一些实施例中，培殖器是双层壁的。在一些实施例中，在培殖器柜的双层壁之间提供隔热材料，以控制来自所述柜的热损失并且利于所述柜总的温度控制。在一些实施例中，培殖器柜的外壁包括金属片材，例如，14-20号规格的冷轧钢。在一些实施例中，培殖器柜的内壁(例如，室表面)包括电抛光的不锈钢。在一些实施例中，培殖器柜的内壁(例如，室表面) 包括耐腐蚀材料，例如钛、钴-铬、钽、铂、锆、铌、不锈钢、及其合金。然而，在一些实施例中，培殖器柜的室表面包括聚合物材料例如聚四氟乙烯(PTFE)、或者以商品名Parylene获知的聚合物材料。在一些实施例中，室表面可以具有抗微生物特性，例如结合到聚合物表面涂层中的铜或银或抗微生物复合物。
在一些实施例中，培殖器包括气锁安排，所述气锁安排可以用于帮助减少内部室暴露于外部环境或外部环境暴露于内部室。例如，培殖器柜可以包括通向转移室和内部室的外部门，其中，具有内部门的壁将转移室与内部室实际分开。在一些实施例中，为了利用气锁安排，一次打开一个门。例如，操作者可以打开外部门以进入转移室。然后操作者可以将物品(如移液管端头)插入转移室中。操作者可以通过直接操纵外部门来操作所述门。在一些实施例中，操作者可以通过远程控制门的操作(例如通过使用被配置成用于控制门的打开和关闭的自动化技术)来间接地操作门。在一些实施例中，在外部门开着时，内部室的门保持关闭。在一些实施例中，在将物品插入转移室之后， (例如，由操作者直接或间接地)关闭外部门。一旦外部门关闭，则在转移室内部的灭菌过程就用来对插入的物品灭菌。一旦灭菌完成，打开内部室的门，并且将灭菌后的物品从转移室移入内部室(例如，通过一个或多个转移装置)。
在一些实施例中，转移室和/或内部室可以例如围绕一个或多个窗口或门具有不漏气体的或密闭的密封件。在特定实施例中，密封剂(例如，油脂)和/或机械元件(例如，O形环、垫圈、隔膜、KF、LF、 QF、快速联接件)或其他密封机构可以用于建立一个或多个不漏气体的密封件。在一些实施例中，凹槽、凹陷、突出部、和/或模制的塑料元件可以便于建立一个或多个不漏气体的密封件。在一些实施例中，培殖器(例如，培殖器柜的内部室和/或转移室)包括一个或多个窗口和/或门，其在关闭时被密封以维护无菌性(例如，在培殖器的一个或多个室已被灭菌之后)。在一些实施例中，培殖器的每个密封件都是不漏空气的，达到阈值压力水平(例如，最高达1atm)。在一些实施例中，提供垫圈来确保所希望水平的密封能力。总体上，“垫圈”被理解为填充两个物体之间的空间的机械密封件，一般是用于在处于压缩下时防止这两个物体之间的泄漏。垫圈通常是通过从例如垫圈纸、橡胶、硅酮、金属、软木、毡、氯丁橡胶、丁腈橡胶、玻璃纤维或塑料聚合物(如聚三氟氯乙烯)的片材材料切割而成。通常希望的是，垫圈是由提供某种程度屈服的材料制成，使得其能够变形并且紧密地填充其被设计用于的空间(包括任何轻微的不规则性在内)。在一些实施例中，垫圈可以与直接施加密封剂至垫圈表面上来一起使用，以恰当地起作用。在一些实施例中，垫圈材料可以是不与二氧化碳或臭氧反应的闭孔氯丁橡胶泡沫。
内部室
如本文使用的，“内部室”是布置在培殖器柜内的室。内部室可以包括一个或多个窗口(例如，由玻璃、塑料、复合材料、或其他基本上透明材料制成的光学窗口，用于观察培殖器柜内部)。内部室可以包括至少一个门(例如，以允许将物品转移到内部室中或转移出来)。在一些实施例中，所述至少一个门可以被布置在内部室与转移室之间。在某些实施例中，互锁件可以防止门在不希望的时候打开(例如，当培殖器柜的一部分通向周围环境时，从而使得污染物不能进入内部室)。内部室可以具有任何适当的大小和几何形状。在一些实施例中，培殖器柜可以包括多于一个内部室。在其他实施例中，内部室可以包括一个或多个分区以限定内部室的不同区域。一个或多个内部室或其分区可以具有不同的环境条件。内部室内部的环境(例如，空气压力、气体含量、温度、光和湿度)可以由一个或多个计量器、监测器、传感器、控件、泵、阀、孔口、和/或光源来测量和/或控制。在一些实施例中，内部室可以例如围绕一个或多个窗口或门具有不漏气体的或密闭的密封件。在特定实施例中，密封剂(例如，油脂)和/或机械元件(例如，O形环、垫圈、隔膜、KF、LF、QF、快速联接件)或其他密封机构可以用于建立一个或多个不漏气体的密封件。在一些实施例中，凹槽、凹陷、突出部、和/或模制的塑料元件可以便于建立一个或多个不漏气体的密封件。
内部室可以由任何有用的材料制成。在一些实施例中，内部室可以包括一种或多种塑料、聚合物、金属、或玻璃。
如本文使用的，“门”是在被打开时允许在两个或更多个环境或区域之间实现连通、并且在被关闭时阻止这两个或更多个环境或区域之间的连通的元件。门可以为任何类型，例如滑动门、隐藏门、摆动门、铰接门、回转门、枢转门、或折叠门。门可以是手动、机械或电动运行的。例如，操作者可以通过手动地抓、拉、推和/或以其他方式与门或其元件(例如，把手)相互作用、或通过操作机械控制件(例如，按钮、扳机、转盘、键、开关、指针、螺钉、拨号盘、屏幕、或触摸屏)来打开或关闭门。在某些实施例中，门可以被电气或数字控制件、例如被计算机控制。门可以是自动打开的门。例如，门可以包括传感器，例如压力、红外、运动或远程传感器，所述传感器检测门是开着的还是关闭的和/或控制门何时打开或关闭。门可以通过机械、气动、电气或其他方式打开。在一些实施例中，一个或多个门可以包括一个或多个锁定机构。在具体环境中，一个或多个门可以包括一个或多个互锁件(例如，机械互锁件，例如销、杆或锁；或电气互锁件，例如开关)以防止一个或多个门在不希望的时刻(例如，当一个或多个室通向外部环境时)打开。
可以使用用于移动一个或多个物品的转移装置来使物品在转移室与内部室之间移动。在一些实施例中，所述转移装置包括传送带或其他类似的用于操控物品的装置。可以被转移装置移动的物品的非限制性实例包括细胞培养器皿、移液管、器皿、注射器、以及在细胞培养中使用的其他材料和器械。在一些实施例中，可以包括多于一个转移装置。在一些实施例中，一个或多个转移装置可以位于转移室中和/ 或内部室中。在一些实施例中，转移装置可以包括一个或多个机器人元件。例如，转移装置可以包括能够抓取、提升、推动、抓紧、滑动、旋转、平移、释放、升高、降低、和/或倾斜一个或多个物品(例如，移液管)的一个或多个机器人臂。
在一些实施例中，所述转移装置是细胞培养器皿转移装置。如本文使用的，“细胞培养器皿转移装置”是指可以将一个或多个细胞培养器皿从第一位置转移至第二位置的装置。在一些实施例中，所述转移装置被锚固在内部室内。在某些实施例中，所述转移装置可以将一个或多个物品从培殖器柜中的多个位置转移或转移至这些位置。例如，细胞培养器皿转移装置可以用于将细胞培养器皿从转移室移动至内部室、和/或从储存位置移动至成像位置。在一些实施例中，培殖器柜包括用于移动一个或多个物品的多于一个转移装置(例如，用于在室之间和在其之内转移物品的分开的转移装置)。细胞培养器皿转移装置可以包括一个或多个元件，例如阀(例如，电磁阀或气动阀)、齿轮、马达(例如，电动马达或步进马达)、载物台(例如，xy或xyz载物台)、活塞、制动器、线缆、滚珠丝杠组件、齿条小齿轮安排、抓取件、臂、枢转点、联结器、平移元件、或其他机械或电气元件。在一些实施例中，细胞培养器皿转移装置可以包括一个或多个机器人元件。例如，细胞培养器皿转移装置可以包括能够抓取、提升、推动、抓紧、滑动、旋转、平移、释放、升高、降低、和/或倾斜一个或多个细胞培养器皿的机器人臂。在优选实施例中，细胞培养器皿转移装置选择性地且可释放地抓取一个或多个细胞培养器皿。在某些实施例中，细胞培养器皿转移装置可以包括联接至机械抓取器上的臂。例如，臂可以在一端处或附近包括用于可释放地抓取细胞培养器皿的机械抓取器并且在另一端处或附近牢固地联接至培殖器的表面或元件上。在一些实施例中，机器人臂包括沿着所述臂的枢转点(在所述枢转点处，所述机械抓取器联接至所述臂上)以及一个或多个枢转和/或平移关节，以允许所述臂的一部分灵活地旋转和平移。以此方式，机器人臂可以触及培殖器柜内(例如，在内部室的储存阵列内)在不同的水平和竖直位置处的一个或多个细胞培养器皿。
在一些实施例中，细胞培养器皿转移装置是自动化转移装置。例如，所述自动化转移装置可以是由计算机控制的机器人臂，所述计算机被编程来将细胞培养器皿从在培殖器的内部室内的储存位置移动到在培殖器的内部室内的成像位置。在一些实施例中，细胞培养器皿转移装置是手动操作的。例如，位于培殖器的内部室内部的机器人臂可以通过受使用者控制的控制杆从在培殖器的内部室外部的位置来进行操作，以便将细胞培养器皿从在培殖器的内部室内的储存位置移动至在培殖器的内部室内的成像位置。
如本文使用的，“储存位置”是指储存一个或多个细胞培养器皿的位置(例如，在培殖器柜内)。例如，一个或多个细胞培养器皿可以被储存在储存位置并且之后被转移到不同的位置(例如，成像位置)。储存位置可以被布置在培殖器柜的内部室中。储存位置可以被配置成用于储存多个细胞培养器皿。例如，储存位置可以包括一个或多个储存阵列、支架、搁架、鸽子洞、立方体、托盘、槽缝、或其他位置或机构。在一些实施例中，储存位置可以被配置成用于水平地储存细胞培养器皿，而在其他实施例中储存位置可以被配置成用于竖直地储存细胞培养器皿。例如，储存位置可以包括多个槽缝，以用于接纳彼此竖直堆叠的细胞培养器皿。储存位置可以被配置成用于固持1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100个、或任何其他数目的细胞培养器皿。在一些实施例中，储存位置可以被配置成用于固持多于100个细胞培养器皿。在一些实施例中，处于储存位置的每个细胞培养器皿容纳来自不同受试者的细胞。在一些实施例中，储存位置可以包括用于使一个或多个储存阵列、支架、搁架、鸽子洞、立方体、托盘、槽缝、或其他位置或机构移动的机构。例如，储存位置可以包括一个或多个马达和可移动载物台(例如，xy或xyz 载物台)，以用于将储存支架从内部室内的一个位置移动至内部室内的另一个位置，例如，以利于触及被储存在不同位置中的一个或多个细胞培养器皿。在一些实施例中，培殖器柜可以包括用于移动一个或多个细胞培养器皿的一个或多个细胞培养器皿转移装置。
储存位置可以被配置成牢固地固持或接纳一个或多个细胞培养器皿。例如，储存位置的一个或多个部件可以包括一个或多个锁定机构，所述锁定机构具有一个或多个粘性、磁性、电气和/或机械部件(例如，卡扣、紧固件、锁、扣、垫圈、O形环、隔膜、弹簧、以及其他接合构件)。在一些实施例中，储存位置和/或细胞培养器皿可以包括一个或多个凹槽或凹陷、和/或可以涉及模制的塑料件。例如，细胞培养器皿可以包括一个或多个突起的特征(例如，边沿或钮状物)，所述特征被模制成用于插入在储存位置处的一个或多个对应的凹槽、孔洞、或凹陷中。在一些情况下，细胞培养器皿可以包括一个或多个凹槽、孔洞、或凹陷，其被模制成与储存位置处的一个或多个对应的突起的特征相配合。
如本文使用的，“成像器”是指用于测量光(例如，透射或散射光)、颜色、形貌、或其他可检测参数(例如，元件数量)或其组合的成像装置。成像器也可以被称为成像装置。在某些实施例中，成像器包括一个或多个透镜、光纤、相机(例如，电荷耦合器件相机或CMOS相机)、光圈、反射镜、光源(例如，激光器或灯)、或其他光学元件。成像器可以是显微镜。在一些实施例中，成像器是明视场显微镜。在其他实施例中，成像器是全息成像器或显微镜。在其他实施例中，成像器是荧光显微镜。
如本文使用的，“荧光显微镜”是指能够检测从存在于细胞或其他生物实体的表面内和/或其上的荧光标记发出的光的成像装置，所述标记响应于对不同波长的光的吸收而发出特定波长的光。
如本文使用的，“明视场显微镜”是照射样本并且基于样本所吸收的光来产生图像的成像器。任何适当的明视场显微镜都可以与本文提供的培殖器柜组合使用。
如本文使用的，“全息成像器”是通过测量电磁辐射(例如，波前)的强度和相位信息来提供关于物体(例如，样本)的信息的成像器。例如，全息显微镜测量在穿过样本之后透射的光以及通过将穿过该样本透射的光束与参考光束组合而得到的干涉图案(例如，相位信息)。
全息成像器也可以是以下装置，所述装置不干扰单独的参考光束地、并且在所述基本上相干源与检测器之间具有或不具有任何折射或反射光学元件地经由一个或多个辐射检测器记录来自基本上相干源的、被有待成像的物体直接衍射或散射的电磁辐射图案。
在一些实施例中，培殖器柜包括单一成像器。在一些实施例中，培殖器柜包括两个成像器。在一些实施例中，这两个成像器是相同类型的成像器(例如，两个全息成像器或两个明视场显微镜)。在一些实施例中，第一成像器是明视场显微镜，而第二成像器是全息成像器。在一些实施例中，培殖器柜包括多于2个成像器。在一些实施例中，细胞培养培殖器包括三个成像器。在一些实施例中，细胞培养培殖器具有3个成像器，包括：全息显微镜、明视场显微镜、以及荧光显微镜。
如本文使用的，“成像位置”是成像器对一个或多个细胞进行成像的位置。例如，成像位置可以在光源上方和/或与一个或多个光学元件(例如，镜头、光圈、反射镜、物镜、和集光器)竖直对准。
如本文使用的，“基准标记”是指利于一个或多个部件对齐的特征。在一些实施例中，基准标记可以包括在荧光介质、或印刷或压印的荧光材料上的一个或多个孔洞孔口。在其他实施例中，基准标记可以包括网格、线、或符号。在一些实施例中，一个或多个细胞培养器皿包括一个或多个基准标记，以利于一个或多个细胞培养器皿与成像器对齐。在一些实施例中，基准标记可以与移动的部分(包括转移装置和机器人装置)相关联。
在一些实施例中，细胞培养器皿与成像器基本上对齐。在一些实施例中，通过使用至少一个基准标记，使细胞培养器皿与成像器基本上对齐。如本文使用的，术语“基本上对齐”暗示着，一个或多个元件是基本上重叠、相同和/或彼此共线的。一个或多个细胞培养器皿在一个或多个位置(例如，成像位置)的基本上对齐可以通过允许获得细胞培养器皿的重叠图像而利于对样本的分析。例如，细胞培养器皿可以在第一成像位置被第一成像器成像、随后在第二成像位置被第二成像器成像。如果相应成像器的成像视野基本上对齐，则第一和第二成像器所记录的图像可以进行组合(“拼接在一起”)以进行分析。存在于一个或多个细胞培养器皿上的一个或多个基准标记可以利于基本上对齐。在一些情况下，存在于一个或多个成像或其他位置(例如，操纵或保持位置)处的一个或多个基准标记可以利于基本上对齐。
如本文使用的，“用于对细胞加以操纵的操纵器”是指用于对的内部室内的细胞加以操纵的操纵器。该操纵器可以包括一个或多个针管、毛细管、移液管、和/或微操纵器。例如，操纵器可以包括细胞拾取器。用于对细胞加以操纵的操纵器可以通过基于预定判据来检测在第一位置处存在所希望细胞或细胞群、并且将所希望细胞或细胞群从第一位置转移至第二位置来运行。细胞拾取器可以基于手动或自动分析来检测、拾取和/或转移所希望或不希望的(例如，预分化细胞去除) 细胞或细胞群。在一些实施例中，可以对成像器产生的信息进行分析以检测所希望或不希望的细胞。细胞拾取器接着可以将所希望或不希望的细胞转移至第二位置。例如，成像器可以对处于成像位置处的细胞培养器皿中或其上的细胞成像，并且将图像用于识别所希望或不希望的细胞或细胞群。细胞拾取器接着可以将所希望或不希望的细胞转移，例如通过用针管、毛细管、移液管、或微操纵器接触每个或所有所希望细胞，并且完成将这个或这些细胞从其第一位置转移至在细胞培养器皿中或其上或在内部室中其他地方的第二位置。在一些实施例中，细胞的第一位置可以在细胞培养器皿中或其上。在特定实施例中，细胞拾取器将细胞从在细胞培养器皿中或其上的第一位置转移到在同一细胞培养器皿上的第二位置。在其他实施例中，细胞拾取器将细胞从在第一细胞培养器皿中或其上的第一位置转移到在第二细胞培养器皿中或其上的第二位置。在某些其他实施例中，细胞拾取器将细胞从在细胞培养器皿中或其上的第一位置转移到在内部室中而不在细胞培养器皿中或其上的第二位置。
在一些实施例中，操纵器包括至少一个微电极。如本文使用的，术语“微电极”是指用于向细胞递送电刺激的电导体。例如，微电极可以用于通过电穿孔将遗传物质递送至细胞中。在一些实施例中，操纵器包括至少一个微注入器。一般，微注入器是玻璃微移液管，所述玻璃微移液管已被牵拉形成尖锐的中空结构，所述中空结构能够刺穿细胞膜并且用作将遗传物质引入细胞中的导管。在一些实施例中，在本文描述的培殖器和器皿内的培养期间以其他方式对细胞培养物加以操纵。例如，可以将细胞培养物用核酸(例如，DNA或RNA)转染或暴露于病毒感染(例如，使用重组病毒颗粒来递送DNA或RNA)。
在一些实施例中，操纵器包括流体处置装置。例如，操纵器可以包括一个或多个液体分配设备，如移液管端头夹持器或者细胞打印装置。在一些实施例中，流体处置装置是自动化的。在一些方面，可以使用具有自动化流体处置系统的操纵器，所述流体处置系统将生长培养基从位于培殖器的内部室内部的流体储存器皿分配到细胞培养器皿中。
在一些实施例中(例如，对于贴壁细胞培养物)，可以通过抽吸直接去除培养基，并用新鲜培养基代替。在一些实施例中(例如，对于非贴壁/悬浮培养物)，培养基的改变可以涉及将细胞培养物离心、去除旧的培养基并用新鲜培养基代替。在一些实施例中，离心机位于培殖器的内部室中。在一些实施例中，培养器皿允许连续的培养基替换。在一些实施例中，本文描述的培殖器可以包括可以用于处理、替代、供应和/或维持培养基的不同方面以支持细胞的一种或多种组分。培殖器可以包括容纳废弃培养基的储器和/或容纳新鲜培养基的储器。这样的储器可以存在于(例如，用于临时储存)培殖器内部的制冷器内或培殖器的冷藏部分内。在一些实施例中，在培殖器外部提供了一个或多个储器，并且提供了进入和离开培殖器空间的管路以用于向液体处置器单元(例如，具有抽吸器的液体处置单元)或培殖器内的临时储器进行供应或取出，以利于细胞饲养、培养基更换、以及其他相关需要。对于悬浮细胞，可以在培殖器内提供用于将细胞与废弃培养基分离的装置(例如，一个或多个离心机，以利于细胞造粒)以利于作为本文提供的培殖器的一部分的培养基自动更换。在一些实施例中，本文提供了一种系统，所述系统包括连接至计算机的细胞培养培殖器，所述计算机能够自动监测和调整细胞培养条件，以实现细胞培养物的最佳生长。
在一些实施例中，在本文描述的培殖器内传代细胞。在一些实施例中，将细胞培养物拆分，并将细胞培养物子集转移至新鲜培养器皿来进一步生长。在一些实施例中(例如，对于贴壁细胞培养物)，在将细胞转移至新鲜培养器皿之前使其从表面上解除附接(例如，机械地，例如温和铲刮，和/或以酶促方式，例如使用胰蛋白酶-EDTA或一种或多种其他的酶)。在一些实施例中(例如，对于悬浮细胞培养物)，将小体积的细胞培养物转移至新鲜培养器皿。
在一些实施例中，操纵器是手动操作的。例如，具有位于培殖器柜的内部室内部的流体处置系统的操纵器可以电子链接至位于培殖器柜的内部室之外的使用者引导的控制杆上并且受其控制。在一些实施例中，使用者引导的控制杆连接至显示装置上。在一些实施例中，显示装置示出了由培殖器柜的内部室内部的成像装置捕捉的图像。
在一些实施例中，操纵器是自动化的。例如，在培殖器柜的内部室内部的操纵器可以电子连接至在培殖器柜之外的控制器上，所述控制器引导操纵器。在一些实施例中，计算机自动记住特定细胞培养器皿在培殖器内的位置。在一些实施例中，计算机使用条形码或其他识别信息来验证所述位置被正确地记住。
用于对细胞加以操纵的操纵器的一个或多个元件可以在操纵之前被灭菌，例如通过使用灭菌成分或方法(例如，乙醇或臭氧气体)。
如本文使用的，“操纵位置”是指细胞被对细胞加以操纵的操纵器(例如，细胞拾取器)操纵所在的位置。在某些实施例中，操纵位置可以与成像位置相同。
根据一个方面，细胞培养培殖器包括具有成像位置和操纵位置的培殖器柜。细胞培养器皿的细胞在成像位置处被成像器成像、并且在操纵位置处被操纵器操纵。在一些实施例中，成像位置和操纵位置是培殖器柜内的两个不同的位置。所述细胞培养培殖器可以包括使细胞培养器皿在成像位置与储存位置之间移动的转移装置。在其他实施例中，成像位置和操纵位置相同，这样使得培养器皿的细胞在操纵位置处被成像。
在一些实施例中，可以将成像器与操纵器结合使用。例如，成像器可以对处于成像位置处的细胞培养器皿中或其上的细胞成像，并且将图像用于识别所希望的细胞或细胞群。操纵器接着可以将所希望的细胞转移，例如通过用针管、毛细管、移液管、或微操纵器接触每个或所有所希望细胞，并且完成将这个或这些细胞从其第一位置转移至在细胞培养器皿中或其上或在内部室中其他地方的第二位置。在一些实施例中，操纵器将生长培养基、生长因子或表达载体无菌地转移到细胞培养器皿中。
在一些实施例中，培殖器柜内的单一位置可以用作成像位置和操纵位置。在一些实施例中，成像位置和操纵位置是培殖器柜内的两个不同的位置。在一个实施例中，细胞在被操纵器操纵时被成像。
在一些实施例中，培殖器内的环境是由控制系统控制的，所述控制系统可以被配置成用于控制培殖器内部(例如，在一个或多个内部室中)的温度、湿度、二氧化碳、氧气和其他气态组分(例如，诸如臭氧和过氧化氢的灭菌气体)。在一些实施例中，控制系统分别地控制每个内部室内的环境条件(例如，温度、湿度、二氧化碳、氧气和其他气态组分)。例如，为了保护敏感的机械、电子和光学部件，可以将内部室的湿度保持在比具有储存位置的内部室更低的水平。在一些实施例中，培殖器进一步配备有具有预限定传感器的监测系统。监测装置的实例包括但不限于：氧气监测器、二氧化碳监测器、臭氧气体检测器、过氧化氢监测器、以及多气体监测器。例如，在一些实施例中，培殖器有利地包括响应于与细胞生长有关的不同参数的多个传感器，这些参数可以包括温度、空气纯度、污染物水平、pH值、湿度、N2、CO2、O2和光。借助于此监测系统，可以使用传感器持续培养或过程的持续时间地测量培殖器中的参数。在一些实施例中，由传感器测得的参数被监测系统经由线路传输至计算机控制的监测与控制系统，以进行如本文别处所讨论的进一步处理。
在一些实施例中，可以将环境监测系统与本文描述的培殖器结合使用。在一些实施例中，可以将提供对系统的温度、空气成分(例如，CO2浓度、O2浓度等)和/或湿度的测量的一个或多个传感器与培殖器相关联(例如，装配在培殖器柜内)。在一些实施例中，可以将一个或多个这样的传感器作为培殖器的一部分并入(例如，附接至、集成至、或以其他方式连接至培殖器的内部壁或门上)。在一些情况下，可以将一个或多个传感器定位在培殖器柜外部或内部的任何适合的位置(例如，在转移室和/或内部室内，例如附接至内部壁上、和/或内部上或下表面上)。
在一些实施例中，提供了气体传感器，所述气体传感器可以以百分之几、百万分之几或任何其他标准单位提供与所述传感器接触的气体(例如，柜中的气体、或环境空气)的浓度的实时读数。用于在本文提供的方法和培殖器中使用的气体传感器包括CO2传感器、O2传感器、N2传感器、臭氧气体检测器、过氧化氢监测器、多气体监测器、以及CO传感器。这样的传感器可以从多个商业来源获得。在一些情况下，可以基于由本文描述的传感器提供的信息来调节或控制培殖器的环境。例如，可以基于来自CO2传感器的对于在培殖器中存在低于所希望浓度CO2的指示来增加培殖器中的CO2水平。
在一些实施例中，可以将一个或多个加热或冷却元件并入培殖器中(例如，柜或门的内表面上、和/或整合在其中一个或多个壁中和/ 或柜的底座中)，以用于控制培殖器内的温度的目的。在一些实施例中，可以使用加热元件来解冻液体，例如细胞培养基或其他试剂。
在一些实施例中，将一个或多个空气或氧气源、碳过滤器和/或一个或多个加湿或除湿系统连接至培殖器，并将其配置成用于控制培殖器内的氧气、二氧化碳和/或湿度的水平(例如，响应于来自在培殖器中或附接至培殖器上的一个或多个传感器的信号)。在一些实施例中，一个或多个控制器附接至这些传感器和其他系统上，以控制培殖器的内部环境。
在一些实施例中，培殖器可以包括一个或多个光源(例如，白炽灯泡、LED、UV或其他光源)。这些光源可以被置于培殖器内以照亮该柜内的区域。在一些实施例中，使用可以被放置在培殖器内或外部的相机或其他光敏装置来监测培养系统的运行。在实施例中，光源是灭菌光源。例如，可以将UV灯定位在本文提供的培殖器的转移室和/或内部室内。
在一些实施例中，培殖器包括透明物体(例如，窗口)，该透明物体允许来自培殖器内的可见光或其他光波长被放在培殖器外部的相机或其他光敏装置检测到。在一些实施例中，可以擦拭该透明物体的内表面(例如，从柜的内部)以防止或去除可能积聚在该内表面上的并且干扰系统的监测的凝结液滴(例如，由于培殖器内部的潮湿空气)。在一些实施例中，可以用被控制器自动控制的擦拭件来擦拭该表面。
在一些实施例中，提供传感器或其他特征来检测培殖器的一个或多个门何时被打开(例如，培殖器柜的门、例如外部或内部门何时被打开)。这样的特征是有用的，因为它们允许操作者保持跟踪或被警示可能危害无菌性、破坏生产、损害测定或实验等的任何对培殖器(例如，培殖器柜)的未经计划或未经授权的打开。
在一些实施例中，将射频信标或其他信号源定位在培殖器内(例如，在培殖器柜内)，其可以用于确定培殖器柜内的一个或多个装置的位置(例如，具有传感器的装置，该装置可以检测信号并使用该信号来确定其位置)。在一些实施例中，这些装置可以具有信号源，并且所述传感器可以位于培殖器柜的其中一个或多个室内部(例如，位于内部室的内部表面上)。
在一些实施例中，可以使用光信号或激光(例如，激光信号的网格)来确定培殖器柜内的一个或多个装置或部件的位置和/或身份。这样的信息可以被例如有线或无线地传送至外部计算机或监测站。所述信息可以用于控制转移装置、例如机器人臂在培殖器柜内的操作，以确保转移装置可以在培殖器柜内适当地抓住、操纵、或操控装置或物品。
在一些实施例中，在容器或器皿被放入培殖器柜中之前，使用者可以基于正被插入培殖器柜中的具体容器、器皿、配料或细胞来选择自动化系统方案。与培殖器和/或一个或多个培殖器部件、以及正在生长的细胞有关的相关信息可以被输入数据系统中。例如，可以将一个或多个标识符、例如条形码(例如，1D或2D条形码)放在容器或器皿上，并且可以指明其他重要信息，例如，其他容器类型、容器的内容物、将对容器中的样本执行什么测定或操纵。在一些实施例中，与培殖器系统和/或细胞有关的信息可以被包含在一个或多个条形码中、在单独的数据系统上、或其组合形式上。使用者还可以输入识别器皿或其他容器的维度(例如，高度、直径)的信息，或者所述系统自身确定、测量所述器皿或其他容器的高度。使用此信息，例如当分析模块准备好对在器皿中生长的细胞执行测定或其他操纵时、或已经完成了执行测定或操纵时，可以请求机器人臂输送特定容器。
计算机和控制设备
本文提供的培殖器包括若干部件，包括传感器、环境控制系统、机器人等，这些部件可以在计算机、处理器、微控制器或其他控制器的方向上一起工作。这些部件可以包括例如：转移装置(例如，机器人臂)、液体处置装置、用于将培养器皿或其他部件递送至培殖器柜或从培殖器柜中递送出来的递送系统、用于控制培殖器柜的温度和其他环境方面的环境控制系统、门操作系统、成像或检测系统、以及细胞培养测定系统。
在一些情况下，诸如对细胞培养培殖器和/或本文提供的或与之接口连接的部件的控制操作等的操作可以使用硬件、软件或其组合来实施。当在软件中实施时，可以在任何适合的处理器或处理器集合上执行软件代码，无论其是提供在单一部件中还是分布在多个部件之间。这样的处理器可以被实施为集成电路，其中在集成电路部件中具有一个或多个处理器。可以使用处于任何适当的格式的电路系统来实现处理器。
计算机可以以多种形式中的任一种形式来实现，例如机架式计算机、台式计算机、膝上型计算机、或平板计算机。此外，计算机可以被嵌入通常不被视为计算机但具有适当处理能力的装置中，包括个人数字助理(PDA)、智能电话或任何其他适合的便携式、移动式或固定式电子装置，包括培殖器本身。
在一些情况下，计算机可以具有一个或多个输入装置和输出装置。这些装置可以尤其用于呈现用户界面。可以用于提供用户界面的输出装置的实例包括用于视觉呈现输出的打印机或显示屏、以及用于对输出进行可听呈现的扬声器或其他声音生成装置。可以用于用户界面的输入装置的实例包括键盘和指点装置，诸如鼠标、触摸板、以及数字化写字板。在其他实例中，计算机可以通过语音识别或以其他可听格式、通过可见手势、通过触觉输入(例如，包括振动、触觉和/或其他力)或其任何组合来接收输入信息。
一个或多个计算机可以通过一个或多个网络以任何合适的形式互连，包括作为局域网或广域网，诸如企业网络或因特网。这样的网络可以基于任何合适的技术、并且可以根据任何合适的协议来运行并且可以包括无线网络、有线网络或者光纤网络。
本文概述的这些不同的方法或过程可以被编码为在采用各种各样操作系统或平台中的任何一者的一个或多个处理器上可执行的软件。这样的软件可以使用多种合适的编程语言和/或编程或脚本工具中的任一种来编写、并且可以被编译为在架构或虚拟机上执行的可执行的机器语言代码或中间代码。
用于控制本文提供的方法或过程的一种或多种算法可以被实施为可读存储介质(或多个可读介质)(例如，计算机存储器、一个或多个软盘、光盘(CD)、光盘、数字视频盘(DVD)、磁带、闪存、现场可编程门阵列或其他半导体设备中的电路配置、或其他有形存储介质)，该可读存储介质编码有一个或多个程序，所述程序在一个或多个计算机或其他处理器上执行时执行用于实施本文描述的这些不同方法或过程的方法。
在一些实施例中，计算机可读存储介质可以将信息保留足够的时间以提供非暂态形式的计算机可执行指令。这样的一个或多个计算机可读存储介质可以是可运输的，使得其上存储的一个或多个程序可以被加载到一个或多个不同的计算机或其他处理器上，以实现本文描述的方法或过程的不同方面。如本文使用的，术语“计算机可读储存介质”仅涵盖可以被认为是制造物(例如，制造品)或机器的计算机可读介质。替代或另外地，本文描述的方法或过程可以被实施为除计算机可读存储介质之外的计算机可读介质，诸如传播信号。
术语“程序”或“软件”在本文是以一般意义使用的，是指可以被采用来对计算机或其他处理器编程以实施本文描述的方法或过程的不同方面的任何类型的代码或可执行指令集。此外，应了解的是，根据这个实施例的一个方面，在被执行时实施本文描述的方法或过程的一个或多个程序不需要位于单一计算机或处理器上、而是可以以模块化方式分布在多个不同的计算机或处理器中来执行不同的程序或操作。
可执行指令可以呈由一个或多个计算机或其他装置执行的许多形式，例如程序模块。一般而言，程序模块包括执行具体任务或实现具体抽象数据类型的例程、程序、对象、部件、数据结构等。典型地，程序模块的功能性可以根据需要在不同的实施例中组合或分配。
而且，数据结构可以以任何合适的形式存储在计算机可读介质中。数据存储的非限制性实例包括结构化、非结构化、本地化、分布式、短期和/或长期的存储。可以用于传送数据的协议的非限制性实例包括专有和/或工业标准协议(例如，HTTP、HTML、XML、JSON、SQL、 web服务、文本、电子表格等、或其任何组合)。为了简化说明，可以将数据结构示出为具有通过数据结构中的位置而相关的字段。这样的关系同样可以通过为字段指定在计算机可读介质中的储存位置来实现，这些位置传达字段之间的关系。然而，可以使用任何合适的机制来建立数据结构的字段中的信息之间的关系，包括通过使用指针、标签、或建立数据元素之间的关系的其他机制。
在一些实施例中，可以从与培殖器相关联的一个或多个传感器(例如，位于培殖器柜内、或位于培殖器内但在培殖器柜外部)获得与培殖器的操作有关的信息(例如，温度、湿度、气体成分、图像、细胞培养条件等、或其任何组合)，并且所述信息可以被存储在计算机可读介质中以提供关于细胞培养培殖期间的条件的信息。在一些实施例中，可读介质包括数据库。在一些实施例中，所述数据库包含来自单一培殖器的数据。在一些实施例中，所述数据库包含来自多个培殖器的数据。在一些实施例中，数据以使其防篡改的方式被存储。在一些实施例中，所述器械(例如，培殖器)生成的所有数据都被存储。在一些实施例中，存储数据子集。
在一些实施例中，所述部件(例如，计算机)控制在培殖器内部执行的多个不同过程。例如，计算机可以直接控制设备(例如，操纵器、成像器、流体处置系统等)。在一些实施例中，计算机控制对细胞培养物的成像、细胞拾取、细胞去除(例如，细胞丛去除)、细胞培养条件监测、细胞培养条件的调整、对培殖器内的细胞培养器皿移动的跟踪、和/或对先前过程的规划。
转到附图，图1示出了细胞培养系统的说明性实施例的示意图。在一些实施例中，细胞培养系统包括培殖器柜，所述培殖器柜具有通向内部室(101)的外部门(100)。在内部室内部是多个细胞培养器皿(102)，每个器皿都具有被配置成允许材料无菌地进入或离开器皿的通路；每个细胞培养器皿(P1，P2，P3，P4，P5和P6)可以含有来自不同受试者的细胞样本。
图2A-2B示出了细胞培养系统的说明性实施例的示意图。图2A 描绘了包括培殖器柜的细胞培养系统，所述培殖器柜具有容纳多个细胞培养器皿(102)的内部室(101)，每个器皿都具有被配置成允许材料无菌地进入或离开器皿的通路；通向转移室(104)并在关闭时形成不漏气体的密封的内部门(103)；细胞培养器皿转移装置(105)；以及在打开时将转移室连接至培殖器柜的外部的外部门(100)。图 2B描绘了图2A中实施的细胞培养系统的示意图，所述细胞培养系统还包括臭氧发生器(106)和泵(107)。在一些实施例中，臭氧发生器与泵处于流体连通。在一些实施例中，臭氧发生器与培殖器柜处于流体连通。例如，臭氧发生器可以经由连接至培殖器柜的入口或出口的管道或管件而与培殖器柜的内部室和/或转移室处于流体连通。在一些实施例中，泵与培殖器柜处于流体连通。例如，泵可以经由连接至培殖器柜的入口或出口的管道或管件而与培殖器柜的内部室和/或转移室处于流体连通。在一些实施例中，泵用于从培殖器柜的内部室和/ 或转移室中去除臭氧气体。
图3示出了细胞培养系统的说明性实施例的示意图。在一些实施例中，细胞培养系统包括具有外部门(100)的培殖器柜，所述外部门通入转移室(104)。转移室具有两个内部门(103，108)。第一内部门(103)通入容纳多个细胞培养器皿的第一内部室(101)，每个器皿具有被配置成允许材料无菌地进入或离开所述器皿的通路。第二内部门(108)通入第二内部室(109)。第二内部室包括成像器(110)、操纵器(111)以及操纵位置(112)。在一些实施例中，第二内部室还包括流体储器(113)和/或离心机(114)。在一些实施例中，第二内部室包括FACS机器。
图4示出了细胞培养系统的说明性实施例的示意图。在一些实施例中，培殖器柜包括外部门(100)，所述外部门通入容纳多个细胞培养器皿的第一内部室(101)，每个器皿都被配置成允许材料无菌地进入或离开所述器皿，所述培殖器柜包括转移装置(105)。内部门将第一内部室连接到包括成像器(110)的第二内部室(109)。
以上方面和实施例可以以任何合适的组合来采用，因为本发明在此方面不受限制。
应理解的是，在此参照某些说明性实施例和附图描述了本发明的方面。本文描述的说明性实施例不一定旨在示出本发明的所有方面，而是用于描述几个说明性实施例。因此，本发明的方面不旨在被狭窄地就这些说明性实施例来加以解释。此外，应理解的是，本发明的方面可以单独使用或以与本发明的其他方面的任何合适的组合来使用。
如此描述了本发明的至少一个实施例的若干方面之后，应了解的是，本领域技术人员会容易想到不同的变更、修改以及改进。这样的变更、修改以及改进旨在是本披露的一部分、并且旨在落入本发明的精神和范围之内。因而，先前的描述和附图仅是以举例的方式的。
虽然本文已经描述和展示了本发明的若干实施例，但是本领域普通技术人员会容易设想到多种多样其他的装置和/或结构来执行本文描述的功能、和/或获得结果和/或其中一个或多个优点，并且这样的改变和/或修改中的每一者都被认为落入本发明的范围之内。更广义地，本领域技术人员会容易认识到，本文描述的所有的参数、尺寸、材料、和构型意在是示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料、和/ 或构型将取决于使用本发明的传授内容的这个或这些具体应用。本领域的技术人员仅仅使用常规实验就将认识到或能够确认本文描述的发明的具体实施例的许多等效物。因此，应理解的是，前述实施例仅是通过举例来呈现的，并且在所附权利要求及其等效物的范围内，本发明可以与具体描述和要求保护的方式不同地进行实践。本发明涉及本文描述的每一单独的特征、系统、物品、材料、和/或方法。此外，如果此类特征、系统、物品、材料、和/或方法并不相互矛盾，则两个或更多个此类特征、系统、物品、材料、和/或方法的任何组合被包含在本发明的范围之内。
如本文在说明书中使用的，不定冠词“一种”和“一个”除非明确地作相反指示，否则应当理解为是指“至少一个”。
如本文在说明书和权利要求书中使用的，短语“和/或(and/or)”应当理解为意味着元素中的“任一者或两者(either or both)”如此联合，即，多个元素在一些情况下联合地存在并且在其他情况下分离地存在。除了通过“和/或”项具体指明的要素之外可以任选地存在其他要素，而无论与具体指明的那些要素相关或无关，除非明确地作相反指示。因此，作为非限制性实例，当结合例如“包括”的开放式语言使用时，在一个实施例中提及“A和/或B”可以指有A而没有B(可选地包含除了B之外的要素)、在另一实施例中可以指有B而没有A (可选地包含除了A之外的要素)、在又一实施例中可以指有A和B 两者(可选地包含其他要素)等等。
如本文在说明书中和权利要求中使用的，“或”应理解为具有与上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当在列表中划分多个项时，“或”或“和/或”应解释为包容性的，例如，包含多个要素或要素列表中的至少一个要素，但也包含一个以上的要素，并且可选地包含额外的未列出的项。只有清楚地作出相反指示的术语，例如“仅一个”或“确切一个”或在权利要求中使用时为“由……组成”，是指包含多个要素或要素列表中的确切一个要素。一般来说，当之前有排他性术语、如“任一个”、“之一”、“……中的仅一个”、或“……中的确切一个”时，本文使用的术语“或”应当仅被解释为指示排他性的替代项(例如，“一个或另一个但非两者”)。当在权利要求中使用时，“基本上由……组成”应具有其在专利法领域中使用的普通含义。
如本文在说明书中和权利要求中使用的，参引一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应理解为是指选自该要素列表中的任意一个或多个要素中的至少一个要素，但不一定包含该要素列表内具体列出的各个和所有要素中的至少一个要素，并且不排除要素列表中的要素的任何组合。这个定义还允许可以可选地存在除了短语“至少一个”所指的、在要素列表中明确指明的要素之外的要素，无论是与明确指明的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B 中的至少一者”(或等效地“A或B中的至少一者”，或等效地“A 和/或B中的至少一者”)在一个实施例中可以指代至少一个(可选地包含一个以上的)A，而B不存在(并且可选地包含除了B之外的要素)；在另一实施例中可以指代至少一个(可选地包含一个以上的) B，而A不存在(并且可选地包含除了A之外的要素)；在又一实施例中可以指代至少一个(可选地包含一个以上的)A、以及至少一个 (可选地包含一个以上的)B(并且可选地包含其他要素)等等。
在权利要求以及上面的说明书中，诸如“包括”、“包含”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“具备”等的所有过渡性短语应被理解为是开放式的，即意思是“包括但不限于”。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，只有过渡性短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭式或半封闭式过渡性短语。
在权利要求中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等顺序术语来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一个权利要求要素的任何优先级、在先、或顺序，或方法的动作被执行的时间顺序，而是仅被用作标记，以将具有某个名称的一个权利要求要素与具有相同名称的另一个要素(但是使用了顺序术语)进行区分从而区分这些权利要求要素。
还应理解的是，除非明确地作相反指示，否则在本文所要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于该方法的步骤或动作被叙述的顺序。
权利要求书。

Claims (50)

1.一种用于产生哺乳动物细胞培养物的方法，包括以下步骤：
提供细胞培养器皿，所述细胞培养器皿包括被配置成允许材料无菌地转移进入或离开所述器皿的通路；
通过所述通路将哺乳动物细胞样本引入到所述细胞培养器皿中；
将所述细胞培养器皿放入培殖器的无菌内部室中；并且
使所述细胞样本在所述无菌内部室中扩增，从而产生哺乳动物细胞培养物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述通路是可刺破的自密封膜。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述通路被透气膜覆盖。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述通路是无菌用后可弃式管。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述通路是微流体通道网。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，还包括通过所述器皿中的所述通路来无菌地引入生长培养基。
7.如权利要求1至5中任一项所述的方法，还包括通过所述器皿中的所述通路无菌地引入生物材料。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述生物材料是细胞生长因子。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述生物材料是核酸分子。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述核酸分子是核酸载体。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述核酸载体是转染载体。
12.如权利要求10所述的方法，其中，所述核酸载体是转导载体。
13.如权利要求10所述的方法，其中，所述核酸载体包含转基因材料。
14.如权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括无菌地监测所述生长培养基的状况。
15.如权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括在所述培殖器中保持恒定的温度范围。
16.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述培殖器保持在约37摄氏度。
17.如权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括无菌地监测所述细胞的状况。
18.如权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括对所述细胞培养物进行无菌成像。
19.如权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括对所述细胞培养物进行过滤。
20.如权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括无菌地移除所述细胞培养物的等分部份。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，所述培殖器是如权利要求22至49中任一项所述的细胞培养系统。
22.一种细胞培养培殖器，包括：
转移室；
一个或多个内部室；
从外部环境通向所述转移室的外部门；
从所述转移室通向第一内部室的第一内部门；
从所述转移室通向第二内部室的第二内部门；以及
转移装置，所述转移装置用于使一个或多个物品在所述转移室与所述第一内部室之间和/或在所述转移室与所述第二内部室之间和/或在所述第二内部室与所述第一内部室之间移动。
23.如权利要求22所述的细胞培养培殖器，还包括臭氧发生器，所述臭氧发生器联接至泵，其中，所述臭氧发生器被配置成用于向所述转移室供应臭氧气体。
24.如权利要求23所述的细胞培养培殖器，其中，所述臭氧发生器被配置成用于向内部室供应臭氧气体。
25.如权利要求22至24中任一项所述的细胞培养培殖器，其中，所述外部门在关闭时形成基本上不漏气体的密封。
26.如权利要求22至25中任一项所述的细胞培养培殖器，其中，所述第一内部门和所述第二内部门在关闭时均形成基本上不漏气体的密封。
27.如权利要求23至26中任一项所述的细胞培养培殖器，其中，所述泵被配置成用于从所述转移室和/或一个或多个内部室中去除臭氧气体。
28.如权利要求22至27中任一项所述的细胞培养培殖器，其中，所述内部室包括储存位置。
29.如权利要求28所述的细胞培养培殖器，其中，所述储存位置被配置成用于固持多个细胞培养器皿。
30.如权利要求29所述的细胞培养培殖器，其中，所述多个细胞培养器皿中的每个器皿都标记有唯一的条形码。
31.如权利要求22至30中任一项所述的细胞培养培殖器，其中，所述内部室包括成像器和成像位置。
32.如权利要求22至31中任一项所述的细胞培养培殖器，其中，所述成像器是全息成像器。
33.如权利要求22至31中任一项所述的细胞培养培殖器，其中，所述成像器是显微镜，可选地是明视场显微镜或荧光显微镜。
34.如权利要求31至33中任一项所述的细胞培养培殖器，还包括用于所述成像器的控制器。
35.如权利要求22至34中任一项所述的细胞培养培殖器，其中，所述内部室包括操纵器和操纵位置。
36.如权利要求35所述的细胞培养培殖器，其中，所述操纵器是细胞拾取器。
37.如权利要求35所述的细胞培养培殖器，其中，所述操纵器包括流体处置系统。
38.如权利要求35至37中任一项所述的细胞培养培殖器，还包括用于所述操纵器的控制器。
39.如权利要求22至38中任一项所述的细胞培养培殖器，其中，所述内部室包括流体储存位置。
40.如权利要求22至39中任一项所述的细胞培养培殖器，其中，所述内部室包括细胞分选或细胞分离设备。
41.如权利要求40所述的细胞培养培殖器，其中，所述细胞分选或细胞分离设备是离心机。
42.如权利要求40所述的细胞培养培殖器，其中，所述细胞分选或细胞分离设备是荧光激活细胞分选(FACS)机器。
43.如权利要求22至42中任一项所述的细胞培养培殖器，其中，所述转移装置包括一个或多个机器人元件。
44.如权利要求22至43中任一项所述的细胞培养培殖器，还包括用于所述转移装置的控制器。
45.如权利要求34至44中任一项所述的细胞培养培殖器，其中，用于所述成像器的所述控制器、用于所述操纵器的所述控制器和/或用于所述转移装置的所述控制器在所述培殖器柜的外部。
46.如权利要求45所述的细胞培养培殖器，其中，用于所述成像器的所述控制器、用于所述操纵器的所述控制器和/或用于所述转移装置的所述控制器包括计算机。
47.如权利要求46所述的细胞培养培殖器，其中，单一计算机控制所述成像器、所述操纵器和/或所述转移装置。
48.如权利要求22至47中任一项所述的细胞培养培殖器，还包括条形码扫描仪。
49.如权利要求48所述的细胞培养培殖器，其中，所述条形码扫描仪连接至计算机，其中，所述计算机在所述培殖器柜的外部。
50.一种细胞培养系统，包括2个或更多个细胞培养器皿，其中，每个器皿包括来自一个不同患者的细胞，并且其中，每个器皿包括被配置成允许材料无菌地进入或离开所述器皿的通路。
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