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CN107903210B - 一种小分子抑制剂sld4650及其在制药中的应用 - Google Patents

一种小分子抑制剂sld4650及其在制药中的应用 Download PDF

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CN107903210B
CN107903210B CN201711420932.1A CN201711420932A CN107903210B CN 107903210 B CN107903210 B CN 107903210B CN 201711420932 A CN201711420932 A CN 201711420932A CN 107903210 B CN107903210 B CN 107903210B
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王艳林
曹春雨
孙丽丹
秦宇
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Abstract

本发明提供一种小分子抑制剂SLD4650，该小分子抑制剂的结构式为：
Figure DDA0001523029430000011
本发明将所述的小分子抑制剂SLD4650在制备抑制精胺氧化酶的药物上的应用。结果显示SLD4650改变人小细胞肺癌A549细胞生长周期，以及改变A549细胞周期蛋白表达含量，同时可诱导A549细胞发生凋亡。

Description

一种小分子抑制剂SLD4650及其在制药中的应用
技术领域
本发明提供一种抑制精胺氧化酶的小分子抑制剂，同时将该小分子抑制剂用于制备治疗肿瘤疾病的药物上的应用。
背景技术
多胺(腐胺、精脒和精胺)是广泛存在于真核细胞内的小分子有机化合物，参与细胞分化、增殖和基因调控等重要生理功能。研究发现，细胞内高多胺含量为肿瘤细胞快速生长所必需，由此多胺代谢途径逐渐成为抗肿瘤治疗和药物设计的新靶点。精胺氧化酶(spermine oxidase,SMO)是一种参与多胺降解代谢的关键酶，该酶是一个FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)依赖型的氧化酶，此酶把对精胺(Spm)的氧化作为其首选底物分解途径。该酶的产物是精脒，氨基丙醛和H2O2。新近研究发现，在多种慢性炎症环境中，受累组织细胞中SMO表达持续上调，由此导致细胞内活性氧含量升高和DNA损伤，且这一过程与多种肿瘤的发生密切相关，由此SMO是潜在的抗肿瘤治疗新的分子靶点。
随着对多胺类似物抗肿瘤分子机制的不断深入了解，越来越多的精胺类似物被合成，某些类似物已进入临床试验阶段。在所有精胺类似物中，对BENSpm研究是最为深入的，其主要对肺癌和乳腺癌等具有细胞毒性作用。但在二期临床研究中发现，BENSpm作为单一药物对于治疗晚期乳腺癌的效果并不显著，而针对此研究的扩展实验则表明BENSpm与其他常规化疗药物在联合使用时具有协同作用。第二代精胺类似物CPENSpm与第一代相比其毒性效应更低、效果更显著，但是CPENSpm与BENSpm面临同样的问题，必需与其他化疗药物联合使用。虽然从临床前实验结果上看BENSpm和CPENSpm具有很好的临床应用前景，但是在一期二期临床试验中却收效甚微。因此，亟需寻找新的精胺氧化酶小分子抑制剂，以满足抗肿瘤药物开发的需要。
发明内容
基于上述研究背景，我们首先运用计算机辅助药物设计技术，基于Spm和SMO复合物构建具有抑制SMO活性作用的药效团模型，以得到的药效团模型为提问结构，在化学数据库中进行虚拟筛选，从而获得理论上能够抑制SMO活性的候选分子，并利用分子对接技术，分析和评价筛选结果。得到小分子化合物，并在体外蛋白水平对其活性进行评价，从而获得抑制SMO活性的小分子抑制剂。接下来，又在细胞水平进行进一步验证，并对这些小分子抑制剂的抗肿瘤作用机制进行探索研究。
基于Spd和SMO的复合物结构，分析小分子抑制剂与蛋白之间形成的关键相互作用。在软件构建过程中，使用药效团模块建立SMO与Spd之间相互作用的药效团模型。将上面经过药效团模型搜索得到的化合物使用对接软件进行分子对接。在对接打分的基础上，结合化合物结构的多样性，得到抑制剂。
该小分子抑制剂SLD4650的具体结构式为：
Figure BDA0001523029410000021
所述的小分子抑制剂SLD4650在制备抑制精胺氧化酶的药物上的应用。
所述的小分子抑制剂SLD4650在制备抑制人小细胞肺癌的药物上的应用。
所述的制备抑制人小细胞肺癌的药物上的应用，具体是在制备抑制人小细胞肺癌A549细胞生长繁殖的药物上的应用。
所述的制备抑制人小细胞肺癌的药物上的应用，具体是在制备抑制人小细胞肺癌A549细胞发生迁移的药物上的应用。
附图说明
图1筛选SMO小分子抑制剂的药效团模型。
图2 SLD4650与Spd的结合模式对比图。
图3化学放光法检测小分子SLD4650对精胺氧化酶活性的抑制作用，**：与0mM相比较，p<0.01。
图4 HPLC检测A549细胞中多胺的含量，**：p<0.01，*：p<0.05。
图5 MTT法检测小分子药物SLD4650对A549细胞生长抑制作用。
图6 Transwell法体外检测A549细胞迁移的能力，
A:正常培养的A549细胞；
B:细胞培养液中添加终浓度为80μM的SLD4650小分子药物，作用48h后的A549细胞。
图7流式细胞术法检测小分子药物SLD4650对A549细胞生长周期的影响，
A:正常培养的A549细胞；
B:细胞培养液中添加终浓度为40μM的SLD4650小分子药物，作用48h后的A549细胞；
C:细胞培养液中添加终浓度为40μM的SLD4650小分子药物，作用72h后的A549细胞。
图8流式细胞术法检测小分子药物SLD4650对A549细胞生长周期的影响，
A:正常培养的A549细胞；
B:细胞培养液中添加终浓度为80μM的SLD4650小分子药物，作用48h后的A549细胞；
C:细胞培养液中添加终浓度为80μM的SLD4650小分子药物，作用72h后的A549细胞。
图9免疫印迹法检测A549细胞中周期蛋白的含量变化，
1.正常培养的A549细胞；
2.细胞培养液中添加终浓度为80μM的SLD4650小分子药物，作用48h后的A549细胞。
图10AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测小分子药物SLD4650诱导A549细胞凋亡
A:正常培养的A549细胞，
B:细胞培养液中添加终浓度为80μM的SLD4650小分子药物，作用48h后的A549细胞。
具体实施方式
一种小分子抑制剂SLD4650，的具体结构式为：
Figure BDA0001523029410000031
药效团结果如下：
在复合物结构中，Spd与SMO之间共形成很多的氢键相互作用。为了确保药效团模型的合理性，我们只保留了两对关键的氢键特征元素。另外，为了保证结构的多样性，我们在对活性口袋的特征进行分析后，增加了一组基于受体氨基酸的氢键特征元素P1-Ser O。具体如下(图1)：二个供体中心-P1-Ser O和P3-Glu O。
分子对接结果
将上面经过药效团模型得到的化合物进行分子对接，并按照对接能量打分得到化合物结合在对接定义的活性口袋中。图2为其中定义为SLD4650的结合模式图。
小分子抑制剂对精胺氧化酶活性的影响
体外实验检测SLD4650有效抑制精胺氧化酶的活性
构建原核表达载体，诱导细菌表达精胺氧化酶蛋白，获取蛋白并纯化。将不同浓度的SLD4650小分子药物与精胺混合后，加入精胺氧化酶，利用化学发光法检测酶活性大小。结果显示，随着SLD4650药物浓度的增加，酶活性逐渐减少，因此SLD4650能有效抑制精胺氧化酶的活性，如图3所示。
用终浓度为80μM的SLD4650处理A549细胞48h后，收集细胞并裂解，提取细胞中的多胺成分，通过高效液相分析检测细胞中多胺的含量，结果显示，与对照细胞相比，SLD4650处理后细胞中精胺含量增加，而精脒含量减少，得出SLD4650抑制了细胞中精胺氧化酶的活性，导致精胺不能被有效转化为精脒，从而干扰细胞多胺代谢，如图4所示。
小分子抑制剂抗肿瘤活性研究
1.SLD4650有效抑制人小细胞肺癌A549细胞的生长繁殖
MTT法检测SLD4650对A549细胞的抑制作用，结果显示SLD4650有效抑制细胞增殖，且具有时间和剂量依赖性，其中160μM的作用浓度处理72h对细胞的抑制率高达63.79％，如图5所示。
2.SLD4650能有效抑制A549细胞发生迁移
用终浓度为80μM的SLD4650处理A549细胞48h后，使用Transwell法体外检测A549细胞迁移的能力，结果显示，SLD4650能有效抑制细胞发生迁移，如图6所示。
小分子抑制剂抗肿瘤作用机制研究
1.SLD4650改变人小细胞肺癌A549细胞生长周期
分别用终浓度为40μM和80μM的SLD4650作用细胞48h和72h后，收集细胞，PI对基因组染色，流式细胞术检测不同生长周期的细胞占全部细胞的百分比，结果显示，SLD4650使得G0/G1期细胞数目减少，S期细胞数量增加，改变了细胞的生长周期，如图7、8所示。
2.SLD4650改变A549细胞周期蛋白表达含量
用终浓度为80μM的SLD4650处理A549细胞48h后，收集细胞并裂解，获得细胞蛋白，利用免疫印迹法检测细胞蛋白中的周期蛋白表达量，结果显示，与对照细胞相比较，周期蛋白Cyclin B1和p21蛋白显著增多，与细胞生长周期变化相符合，如图9所示。
3.SLD4650诱导A549细胞发生凋亡
用终浓度为80μM的SLD4650处理A549细胞48h后，收集细胞，使用AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒对细胞染色，上流式细胞仪检测，与对照细胞相比，AnnexinV-FITC/PI双染细胞数量从1.61％增加到12.45％。得到SLD4650有效诱导A549细胞发生凋亡，如图10所示。

Claims (4)

1.一种小分子抑制剂SLD4650在制备抑制精胺氧化酶的药物上的应用，该小分子抑制剂的结构式为：
Figure FDA0002567001060000011
2.一种小分子抑制剂SLD4650在制备抑制人非小细胞肺癌的药物上的应用，该小分子抑制剂的结构式为：
Figure FDA0002567001060000012
3.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的小分子抑制剂在制备抑制人非小细胞肺癌A549细胞生长繁殖的药物上的应用。
4.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的小分子抑制剂在制备抑制人非小细胞肺癌A549细胞发生迁移的药物上的应用。
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