CN107893060A - 一种海洋细菌来源热稳定耐盐sgnh家族水解酶及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海洋细菌来源新型热稳定耐盐耐有机溶剂SGNH家族水解酶AlinE4及其编码基因与应用。本发明涉及水解酶基因aline4来自海洋细菌Altererythrobacter indicus DSM 18604，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的水解酶基因经异源表达后，该水解酶具有酯酶活性，底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4)时催化活性最高，酶活为25.8U/mg。AlinE4催化水解最适pH和温度为7.5和40℃；在40、50和60℃中孵育60min后，仍能保持50％以上活性；在有机溶剂和金属离子存在条件下，酶学活性较高。该水解酶具有热稳定性和碱性特征，可应用于洗涤剂、废水处理、精细化工、制药和环境修复等领域高温、含盐和含有机溶剂条件下的工业生产。

Description

一种海洋细菌来源热稳定耐盐SGNH家族水解酶及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种海洋细菌来源新型热稳定耐盐SGNH家族水解酶、其编码基因及其应用。

背景技术

SGNH家族水解酶是一类在4个保守序列区中含有4个严格保守的催化残基丝氨酸、甘氨酸、天冬酰胺和组氨酸的水解酶。SGNH家族水解酶广泛存在于真核和原核生物中，具有脂肪酶、蛋白酶、硫酯酶、芳香酯酶、溶血磷脂酶、碳水化合物酯酶、酰基转移酶等多种活性，是具有广泛底物谱的一类水解酶,可参与细菌毒力和植物生长发育、形态发生以及防御等多种生理功能。广泛底物谱和功能多样性使该家族水解酶具有广泛的潜在应用价值，成为国内外研究热点。

目前已报道的SGNH家族水解酶多来源于真核生物，细菌来源的该家族水解酶较少，功能也不明确。海洋是一个巨大的微生物资源宝库，海洋来源的水解酶通常具有与海洋环境相关的优良性质，例如温度稳定性、耐盐性、耐碱性、耐低温、以及优异的手性选择性等等，因此，从海洋微生物中筛选出独具特性的水解酶就成了开发新型工业酶制剂的一个重要方向。

本发明从一种海洋细菌中筛选到一种新型SGNH家族水解酶基因，并对该基因进行了重组表达，重组酶具有热稳定、耐盐和耐有机溶剂等特点，可用于精细化工、制药、洗涤、废水处理和环境修复等工业领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的海洋细菌来源水解酶、其编码基因及其制备方法，该水解酶可用于高温高盐条件下酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。

本发明涉及具有水解酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的多肽所示序列一致；

(b)多肽，其为SEQ ID NO:2所示多肽的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO:2所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的酶活性。

本发明所述的具有水解酶活性的多肽，其来源于红树林野生稻根瘤土的细菌Altererythrobacter indicus。

本发明针对分离自红树林野生稻根瘤土的细菌Altererythrobacter indicusDSM 18604，菌株购买自德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)。基于其全基因组序列，筛选获得水解酶基因aline4，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。基因aline4大小为573bp，碱基组成为139A(24.26％)、115T(20.07％)、149C(26.00％)和170G(29.67％)，编码蛋白大小为190个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将该水解酶AlinE4氨基酸序列在GenBank nr数据库中进行同源搜索，与之一致性最高的是宏基因组来源芳基酯酶，一致性为71％(其在GenBank数据库中的注册号为OJW68931.1)。氨基酸序列分析结果表明，活性位点丝氨酸附近序列为具有甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-亮氨酸组成的保守区(氨基酸位置为11至14)，13位丝氨酸与162位天冬氨酸和165位组氨酸共同构成丝氨酸水解酶催化三联体。此外，13位丝氨酸、50位甘氨酸和81位天冬酰胺共同构成氧负离子洞。其氨基酸序列特征符合SGNH水解酶家族特征。综上所述，AlinE4应为SGNH水解酶家族中的一名新成员。

在不影响AlinE4蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO:2所示的远离催化中心氨基酸位置(优选远离11-14、162和165氨基酸位置)的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有AlinE4活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是与其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域(优选11-14、162和165氨基酸位置)的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的水解酶AlinE4突变体具有至少与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。所述的突变体能够基本保留水解酶AlinE4的生物学功能，优选该突变体具有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的水解酶至少90％以上的酶活性，更优选具有至少95％以上的酶活性，最优选至少99％以上的酶活性。

本发明涉及SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的人工变体，突变位置优选小于5个，更优选小于3个，最优选仅为1个位置氨基酸的突变。保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如Η.Neurath和R.L.Hill，1979于TheProteins，Academic Press，NewYork中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly等。

可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science，241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413或者WO 95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等，1991，Biochemistry30:10832-10837；

美国专利号5,223,409；WO92/06204)和区域定向诱变(region-directedmutagenesis)(Derbyshire等，1986，Gene46:145和1988，DNA7:127)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明水解酶AlinE4的核苷酸序列，或由编码本发明具有水解酶AlinE4活性的突变体的核苷酸序列组成。

本发明涉及编码具有水解酶AlinE4活性多肽的分离的多核苷酸，其选自下组：

(a)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸所示序列一致；

(b)多核苷酸，其为编码SEQ ID NO:1所示的远离催化中心氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体的多核苷酸，该多核苷酸具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％以上的同源性。

本发明提供了编码水解酶AlinE4的基因aline4，其与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列一致；基因aline4大小为573bp，碱基组成为139A(24.26％)、115T(20.07％)、149C(26.00％)和170G(29.67％)，编码蛋白大小为190个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。本发明还提供对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除31-42、484-186和493-495位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留AlinE4蛋白生物学活性的突变体基因。优选的水解酶AlinE4突变体基因具有至少与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，可以用许多方式操作编码本发明水解酶的分离的多核苷酸以提供水解酶的表达。所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶AlinE4基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组水解酶AlinE4。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等，优选采用原核表达系统E.coli。

合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)；动物细胞表达载体pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，可有利地用于水解酶AlinE4的重组生产中。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是在本发明的水解酶AlinE4的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶AlinE4基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组水解酶AlinE4。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，可通过如下原生质体转化或或电穿孔法将载体转化到原核细胞中。合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等。本发明优选采用原核表达系统E.coli表达生产水解酶AlinE4。一个优选的例子是将本发明筛选到的水解酶基因aline4连接到大肠杆菌表达载体pET28a上，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经诱导表达出高活性的重组酶。

本发明还涉及用于产生本发明所述水解酶AlinE4的方法，其包括：

(a)在有助于产生水解酶AlinE4的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含SEQ ID NO:1所示核苷酸或其至少一个突变位点的核苷酸；

(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述水解酶AlinE4的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述水解酶AlinE4的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物回收。

所得水解酶AlinE4可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)或差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)等方法。

本发明还提供了水解酶AlinE4或能表达水解酶AlinE4的宿主菌在工业上的应用，例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，水解酶AlinE4具有酯酶活性。AlinE4或上述能表达AlinE4的宿主菌可用于水解短链脂肪酸酯，例如C2-C8短碳链脂肪酸酯，同时对C10-C14的长碳链脂肪酸酯也具有一定降解作用。优选的短链脂肪酸脂为具有C2-C8短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯酚乙酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚己酸酯和对硝基苯酚辛酸酯等，其中底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4)时催化活性最高，酶活为25.8U/mg。

AlinE4催化水解温度范围为15～60℃，优选为40℃；所述水解的pH值为6.0～10.5，优选为7.5。在10～60℃中孵育1h和4h条件下，仍能保持80％以上活性；在90℃中孵育0.5h和1h，AlinE4可保持45％以上活性；0.5mol/L和1mol/L NaCl条件可增强AlinE4活性，2mol/L和1mol/L NaCl条件下可保留95％以上活性；在Ba²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Sr²⁺存在下可保留85％以上活性；乙醇、DMSO、甘油、异丙醇和甲醇可增强其活性。

本发明从红树林野生稻根瘤土细菌Altererythrobacter indicus DSM18604中筛选获得新的热稳定耐盐耐有机溶剂水解酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化解酯和酶法合成酯产品生产过程中。获得的水解酶基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产热稳定耐盐耐有机溶剂水解酶，为后续的工业应用提供成本低廉的热稳定耐盐耐有机溶剂水解酶起始材料。该酶的生产可在洗涤剂、废水处理、精细化工、制药和环境修复等高温、含盐和含有机溶剂生产工艺中显示出重要的经济和社会价值。

附图说明

图1为纯化水解酶AlinE4的聚乙酰胺凝胶电泳分析图。

图2为水解酶AlinE4的底物特异性图。C2：对硝基苯酚乙酸酯；C4：对硝基苯酚丁酸酯、C6：对硝基苯酚己酸酯；C8：对硝基苯酚辛酸酯；C10：对硝基苯酚癸酸酯；C12：对硝基苯酚十二酸酯；C14：对硝基苯酚十四酸酯；C16：对硝基苯酚十六酸酯；定义底物为C4时测定值为100％。

图3为水解酶AlinE4最适反应pH图。

图4为水解酶AlinE4最适反应温度图。

图5为水解酶AlinE4不同温度下热稳定性图。

图6为水解酶AlinE4高温下不同时间热稳定性图。

图7为NaCl对水解酶AlinE4活性影像图。

图8为二价阳离子对水解酶AlinE4活性影响图。

图9为有机溶剂对水解酶AlinE4活性影响图。

具体实施方式

实施例1水解酶基因aline4的获取

基于分离自红树林野生稻根瘤土的细菌Altererythrobacter indicus DSM18604全基因组、开放阅读框预测及基因注释结果，筛选脂类水解酶相关基因。通过Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知水解酶基因序列的同源性。经数据库比对分析获得aline4基因，大小为573bp，碱基组成为139A(24.26％)、115T(20.07％)、149C(26.00％)和170G(29.67％)，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。编码蛋白大小为190个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将该AlinE4蛋白序列在GenBank中进行同源搜索，与之氨基酸序列一致性最高的是非培养来源酯酶，一致性为71％，其在GenBank数据库中的注册号为OJW68931.1。

系统发育分析表明，水解酶AlinE4属于酯酶第II家族，亦属SGNH水解酶家族。氨基酸序列分析结果显示活性位点丝氨酸附近序列为具有甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-亮氨酸组成的保守区(氨基酸位置为11至14)，13位丝氨酸与162位天冬氨酸和165位组氨酸共同构成丝氨酸水解酶催化中心。13位丝氨酸、50位甘氨酸和81位天冬酰胺共同构成氧负离子洞。其氨基酸序列特征符合SGNH水解酶家族特征。

综上所述，AlinE4应为酯酶家族和SGNH水解酶家族中的一名新成员。

实施例2基因aline4的重组表达质粒和重组菌株的构建

将本发明获得的基因aline4克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。基于NCBIORF Finder的ORF分析获得的基因开放阅读框序列，设计扩增全基因的上游引物aline4F(5’-TCGCGGATCCATGGGCGAATCGCGC-3’，BamHI)和下游引物aline4R(5’-TCCGCTCGAGTCACTTCTTCGCAGGCAGCGCC-3’，XhoI)，PCR扩增确认基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用BamHI和XhoI双酶切PCR产物，纯化后的片段与经BamHI和XhoI双酶切的质粒pSMT3连接，采用CaCl₂转化法转化至E.coli DH5α中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(Omega，美国)提取阳性克隆的质粒，经BamHI和XhoI双酶切鉴定，获得600bp左右的DNA片段，经测序鉴定为基因aline4。将重组表达质粒转化到E.coliRosetta(DE3)表达菌株中，构建表达重组菌株。

实施例3利用重组表达菌株表达重组基因aline4

将构建好的3ml重组表达菌株转接到100ml含有20μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，转入20℃以150r/min振荡培养16h。低温离心收集菌体，重悬于NTA-10溶液(500mM氯化钠，10mM咪唑，20mM Tris盐酸，pH 8.0)中，在冰上进行超声波破碎处理。低温离心收集上清，采用NTA-Ni²⁺亲和柱层析纯化表达蛋白。所表达的重组蛋白含有N端的6×His tag，可亲和吸附到层吸柱上，经过不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱，收集洗脱液。经SDS-PAGE检测目的蛋白在洗脱液中的分布情况。利用ULP1酶在透析袋中切除重组蛋白N端的类泛素SUMO，并采用NTA-Ni²⁺亲和柱层析去除SUMO蛋白，收集样品进行SDS-PAGE检测。得到电泳纯的重组蛋白AlinE4，分子量约20kDa(图1)。用Brandford法测定蛋白质浓度。

实施例4重组基因aline4的活性检测

利用对硝基苯酚丁酸酯法测定纯化的重组水解酶AlinE4活性。具体操作：1ml反应体系中包括1mM对硝基苯酚丁酸酯，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和185ng纯酶蛋白，采用紫外可见光分光光度计(Beckman DU800型，美国)于40℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅2min，使用失活的酶液作为对照用于调零。一个酶活力单位定义为每分钟从对硝基苯酚酯催化产生lμmol对硝基苯酚的所需要的酶量。测得的酯酶活性为25.8U/mg。

实施例5水解酶AlinE4底物特异性分析

水解酶AlinE4的底物特异性分析采用体系(1ml)：100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，1mM底物，加入185ng纯酶蛋白，在25℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定采用的底物为：对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚癸酸酯(C10)，对硝基苯酚十二酸酯(C12)，对硝基苯酚十四酸酯(C14)，对硝基苯酚十六酸酯(C16)。经测定表明，AlinE4对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯(C4、C6和C8)具有较高催化活性，其中底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4)时催化活性最高，对酰基碳链较长的对硝基苯酚酯(C10、C12和C14)也具有一定的催化活性(图2)。结果表明，水解酶AlinE4对酰基碳链较短脂类物质具有较好催化活性，对于短链脂类的水解活力优于长链脂类。

实施例6水解酶AlinE4最适反应条件分析

水解酶AlinE4最适反应pH在3.0～10.5范围内测定。具体操作为：在不同pH缓冲液中加入1mM对硝基苯酚丁酸酯和185ng纯酶蛋白，在40℃下连续测定吸光值A₃₄₈ 2min。测定使用的缓冲液为：100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0～6.0)，100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH 6.0～7.5)，100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5～9.0)和100mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0～10.5)。测定结果表明，AlinE4最适反应pH为7.5，在pH 6.0～10.5范围内具有活性(图3)。

水解酶AlinE4最适反应温度在15～60℃范围内测定。具体操作为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚丁酸酯，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和185ng纯酶蛋白，分别在15、20、25、30、35、40、45、50、55和60℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明AlinE4的反应温度范围为15～60℃，最适反应温度为40℃(图3)。

实施例7水解酶AlinE4酶学稳定性分析

水解酶AlinE4的热稳定性分析具体操作为：(1)将酶液分别在10、20、30、40、50、60、70、80、90和100℃条件下孵育1h和4h，测定酶的活性；(2)将酶液分别在90、95和100℃条件下孵育0.5、1、1.5、2和2.5h，测定酶的活性。测活体系为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚丁酸酯，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和185ng纯酶蛋白，于40℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。结果表明，在10～60℃中孵育4h和在10～70℃中孵育1h条件下，AlinE4仍能保持80％以上活性(图5)；在90℃中孵育0.5h和1h，AlinE4可保持50％和45％以上活性(图6)；在100℃中孵育0.5h和1h，AlinE4可保持30％和20％以上活性(图6)，说明AlinE4具有很好的热稳定性。

NaCl对水解酶AlinE4活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入0、0.5、1、2、3、4和5mol/L NaCl，测定酶的活性。测活体系为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚丁酸酯，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和185ng纯酶蛋白，于40℃下连续测定吸光值A₄₀₅2min。结果表明，在0.5～3mol/L NaCl条件下，NaCl对AlinE4活性基本没有影响(保留95％以上活性)，其中0.5mol/L和1mol/L NaCl条件可增强AlinE4活性；NaCl浓度达5mol/L时，AlinE4仍能保留40％以上活性，说明AlinE4具有很好的耐盐特性(图7)。

二价阳离子对水解酶AlinE4活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入10mM Ba²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Sr²⁺、Zn²⁺和乙二胺四乙酸(EDTA)，测定酶活性。测酶活体系为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚丁酸酯，100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)和185ng纯酶蛋白，于40℃下连续测定吸光值A₄₀₅2min。测定结果表明，AlinE4活性会被Cd²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺和Zn²⁺离子明显抑制，在Ba²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Sr²⁺存在下对酶活影响不大(保留85％以上活性)，EDTA可增强其活性(图8)。

有机溶剂对水解酶AlinE4活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入15％(v/v)有机溶剂：丙酮(Acetone)、乙腈(Acetonitrile)、乙醇(Ethanol)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Glycerol)、异丙醇(Isopropanol)和甲醇(Methanol)，测定酶的活性。测活体系为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚丁酸酯，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和185ng纯酶蛋白，于40℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明，AlinE4活性会被乙腈完全抑制，乙醇、DMSO、甘油、异丙醇和甲醇可增强其活性，特别是在乙醇和甘油存在下AlinE4活性增加一倍以上(图9)。

序列表

<110> 国家海洋局第二海洋研究所

<120> 一种海洋细菌来源热稳定耐盐SGNH家族水解酶及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 573

<212> DNA

<213> Altererythrobacter indicus

<400> 1

atgggcgaat cgcgcgtgat tctcgccttc ggagacagcc tgtttgcagg ctatggcctt 60

gataaggggg agagctatcc ggcaaagctg gaaactgcgc tgcgcagcca tggcatcaat 120

gccagaatca ttaatgccgg cgtttcgggt gacaccactg cggcagggct gcagcgaatc 180

aaattcgtgc tggatagcca gccggacaag ccggaattgg ccatagtgga actgggcggg 240

aatgaccttt tacgcggcct ctcaccagcc gaagcgcggc agaacctcag cggaatcctc 300

gaagaattgc agaggcggaa aattccaatc ctgttgatgg gaatgcgagc gccgcccaat 360

ctaggggcaa aatatcagcg cgaatttgat gggatttatc cctatctggc cgaaaaatat 420

gacgccaagc tggtaccttt cttccttgag gccgtggcag atagacctga cctcattcag 480

aaggatcacg ttcaccccac tgcgcgcggt gtggaggaac tcgtgtctgc aacatcgaat 540

gcagttgcca aggcgctgcc tgcgaagaag tga 573

<210> 2

<211> 190

<212> PRT

<213> Altererythrobacter indicus

<400> 2

Met Gly Glu Ser Arg Val Ile Leu Ala Phe Gly Asp Ser Leu Phe Ala

1 5 10 15

Gly Tyr Gly Leu Asp Lys Gly Glu Ser Tyr Pro Ala Lys Leu Glu Thr

20 25 30

Ala Leu Arg Ser His Gly Ile Asn Ala Arg Ile Ile Asn Ala Gly Val

35 40 45

Ser Gly Asp Thr Thr Ala Ala Gly Leu Gln Arg Ile Lys Phe Val Leu

50 55 60

Asp Ser Gln Pro Asp Lys Pro Glu Leu Ala Ile Val Glu Leu Gly Gly

65 70 75 80

Asn Asp Leu Leu Arg Gly Leu Ser Pro Ala Glu Ala Arg Gln Asn Leu

85 90 95

Ser Gly Ile Leu Glu Glu Leu Gln Arg Arg Lys Ile Pro Ile Leu Leu

100 105 110

Met Gly Met Arg Ala Pro Pro Asn Leu Gly Ala Lys Tyr Gln Arg Glu

115 120 125

Phe Asp Gly Ile Tyr Pro Tyr Leu Ala Glu Lys Tyr Asp Ala Lys Leu

130 135 140

Val Pro Phe Phe Leu Glu Ala Val Ala Asp Arg Pro Asp Leu Ile Gln

145 150 155 160

Lys Asp His Val His Pro Thr Ala Arg Gly Val Glu Glu Leu Val Ser

165 170 175

Ala Thr Ser Asn Ala Val Ala Lys Ala Leu Pro Ala Lys Lys

180 185 190

Claims (10)

1.一种具有水解酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的多肽所示序列一致；

(b)多肽，其为SEQ ID NO:2所示多肽的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO:2所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的水解酶活性。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述水解酶的催化中心为SEQ ID NO:2所示的11-14、162和165号氨基酸位置。

3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述的突变体为SEQ ID NO:2所示多肽的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失小于5个氨基酸得到的突变体。

4.一种编码具有权利要求1所述多肽的多核苷酸，其选自下组：

(a)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸所示序列一致；

(b)多核苷酸，其为对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除31-42、484-186和493-495位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸得到的突变体基因，该多核苷酸具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％以上的同源性。

5.一种核酸构建体，其包含与一种或多种调控序列可操作地连接的权利要求4的多核苷酸，所述调控序列在合适的表达宿主中指导所述多肽的产生。

6.一种重组表达载体，其包含权利要求5的核酸构建体。

7.一种宿主，其由权利要求6所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。

8.根据权利要求7所述的宿主，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞。

9.一种产生权利要求1-3任一项所述多肽的方法，其包括：

(a)、在有助于产生水解酶的条件下培养权利要求7所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含SEQ ID N0:1所示核苷酸或其至少一个突变位点的核苷酸；

(b)、回收所述多肽。

10.权利要求1所述的水解酶或权利要求7所述的能表达水解酶的宿主菌在催化酯类水解中的应用。