CN107893020A - 分子诊断微流控芯片和分子诊断微流控芯片体系以及它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微流控芯片分子诊断领域，特别涉及分子诊断微流控芯片和分子诊断微流控芯片体系以及它们的应用。芯片包括：接收待检样本的进样单元(1)、储存反应试剂的储液单元(2)、对细胞进行裂解的细胞裂解单元(3)、对核酸进行扩增的核酸扩增单元(4)；细胞裂解单元包括狭缝(31)、由狭缝隔开的第一腔室(32)和第二腔室(33)，至少一个腔室配置有研磨微珠；第一腔室与进样单元相通，第二腔室与至少一个储液单元相通，接收细胞裂解液。芯片体系由上中下三层组成；中层为所述芯片；上下层用于覆盖封闭中层；上层有与进样单元连接的进样孔，对应储液单元的让位孔。该芯片检测过程简单，可对反应样本进行定量，灵敏度高、重复性强。

Description

分子诊断微流控芯片和分子诊断微流控芯片体系以及它们的 应用

技术领域

本发明涉及微流控芯片分子诊断领域，特别涉及一种用于分子诊断的微流控芯片和一种用于分子诊断的流控芯片体系，以及它们在核酸扩增中的应用。

背景技术

微流控芯片技术(microfluidics)又被称为微流控芯片实验室或芯片实验室(lab-on-a-chip)，指的是在一块几平方厘米的芯片上构建的化学或生物实验室，它把化学和生物学等领域中所涉及的样品制备，反应，分离，检测，细胞培养，分选，裂解等基本操作单元集成到一块很小的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以实现生物，化学，医学诊断等领域中的各种功能。

微流控芯片技术的基本特征和最大优势是：多种单元结构在微小的芯片平台上可以灵活组合使得芯片设计上灵活多变且功能齐全；微小的芯片内部结构单元所需要的检测样本量非常少，且微结构单元的大比表面积允许内部试剂快速扩散以实现快速反应和检测；微流控芯片一般是由配套仪器自动完成内部反应，故而在实际测试过程中，微流控芯片技术可以减少对医学检测人员的技术要求，降低检测的人为失误，进而降低患者的医学检测成本；微流控芯片技术由于采用仪器自动化完成，故而内部反应过程完全可控，如此可以得到更加准确，更加灵敏的检测数据。

在医学检测领域中，体外诊断(In-Vitro-Diagnostics，IVD)是一个非常重要的分支，是指在人体体外，对来源于人体的样本(如血液，尿液，唾液等体液)进行检测从而获取临床诊断信息，根据该信息来判断受检者是否患有某种疾病或经受某种病菌感染的诊断方法。目前，随着生物技术，特别是生物化学，免疫学，分子生物学的快速发展，体外诊断根据检测原理和检测方法主要有生化诊断，免疫诊断，分子诊断，微生物诊断，凝血类诊断，流式细胞诊断等方面，其中生化，免疫，分子诊断是目前我国体外诊断的主要细分领域。

分子诊断是利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物分子和分子体系的存在、结构或表达调控变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。分子诊断技术以其具有的灵敏度高、特异性强、简便快速、可进行定性、定量检测等优势，已经被广泛应用于疾病预测，预防，预后，个体化药物治疗，产前筛查，肿瘤、遗传病、血液病、感染性疾病(包括细菌性感染、病毒性感染、寄生虫、真菌、人畜共患疾病等)、神经精神性疾病、器官移植、出生缺陷等多个领域，其检查结果对机体易感性评估、疾病诊断、预后、治疗监测、个体化药物治疗、遗传咨询、健康管理以及家庭生育计划制定等均具有重要的参考价值甚至决定性价值。

目前我国常规开展的分子诊断技术平台主要有流式细胞术，分子杂交技术，DNA/RNA测序技术和核酸扩增技术。但流式细胞术的应用领域狭窄，目前只是应用于对循环肿瘤细胞进行分选的液体活检领域，对于传染病的检测方面则无能为力。分子杂交技术只能在专门的检测科室中进行，操作复杂，容易被环境污染，需要专业技能人员来操作。DNA/RNA测序技术需要昂贵的配套测序仪器，且测序成本高，耗时长。核酸扩增技术在分子诊断领域中应用范围最广，且操作简单，只需要PCR扩增仪即可完成检测，需要的人为操作较少。

尽管如此，使用微流控芯片技术进行核酸扩增分子诊断的专利特别少，国内外将这两种技术结合进而开发出成熟的芯片产品的公司更少。经过专利调研发现，国内外近年来有少量使用微流控技术进行分子诊断的相关专利，比如中国专利201510265559公开了一种高集成度等距等分核酸扩增微流控芯片，但该芯片只具有核酸扩增功能，而不具有试剂存储，试剂混合，样品定量等功能；再比如中国专利201610242532中公开了一种离心式圆盘阵列化核酸检测微流控芯片，但该芯片只是针对核酸提取液进行检测，需要用户在使用前先将待检样本进行手工处理提取样本中的核酸，然后再将核酸注入该芯片中进行检测，该芯片在使用上提高了用户要求，需要预先将核酸提取出来。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的如上问题，提供一种兼核酸提取和样品定量的用于核酸扩增分子诊断的微流控芯片，该微流控芯片具有检测过程简单，能够对反应样本进行定量，以及对反应样本进行核酸提取，且本发明提供的微流控芯片各结构单元相互连通，检测灵敏度高、重复性强。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种分子诊断微流控芯片，该微流控芯片包括：用于接收待检样本的进样单元、用于储存反应试剂的储液单元、用于对待检样本中的细胞进行裂解的细胞裂解单元、用于对核酸进行扩增的核酸扩增单元；

其中，所述细胞裂解单元包括狭缝以及由狭缝隔开的第一腔室和第二腔室，所述第一腔室和所述第二腔室中的至少一个腔室配置有研磨微珠；所述第一腔室与所述进样单元相通，所述第二腔室与至少一个储液单元相通，用于接收细胞裂解液。

优选的，所述细胞裂解单元还包括挡板，所述挡板与所述狭缝相对但不相接，所述第一腔室和第二腔室通过所述挡板与所述狭缝界定的空间相通。

优选地，所述微流控芯片还包括设置在所述细胞裂解单元和核酸扩增单元之间的核酸纯化单元，以在核酸进入所述核酸扩增单元之前对所述细胞裂解单元的裂解产物进行纯化，所述核酸纯化单元中配置有能够特异性吸附核酸的磁珠。

优选地，所述核酸扩增单元包括由多个微井组成的阵列，所述微井中固定有至少一种引物对。

优选的，所述微流控芯片还包括用于收集各步反应所产生的废液的废液单元。

优选的，所述细胞裂解单元的第二腔室和核酸扩增单元与所述废液单元连通的微通道上还设置有微阀门。

优选的，所述核酸纯化单元与所述废液单元连通的微通道上还设置有微阀门。

优选地，该微流控芯片还包括与所述废液单元连接的通气单元，用于为微流控芯片体系提供所需的外部气压。

优选地，该微流控芯片还包括与所述通气单元连接的仪器接口，所述仪器接口用于连接微流控芯片体系外的配套仪器，所述配套仪器提供的气压通过所述通气单元提供至所述微流控芯片体系。

优选地，所述配套仪器包括用于提供气压的推动气压泵、导气管以及与所述通气单元连接的气密性接口；所述气密性接口优选为喇叭形。

优选地，所述通气单元中还填充有透气但不透水的物质；优选的，所述透气但不透水的物质为气溶胶。

优选地，所述反应试剂通过试剂囊袋装填到所述储液单元中；所述试剂囊袋包括用于将其固定到所述储液单元上的定位孔，密封口以及用于将所述密封口打开并释放所述反应试剂的挤压区域或针刺结构。

本发明的第二方面还提供一种分子诊断微流控芯片体系，该微流控芯片体系由上层、中层和下层组成；

其中，中层结构为如上所述的分子诊断微流控芯片；

其中，上层结构和下层结构用于覆盖封闭所述中层；上层结构中设置有与进样单元连接的进样孔，以及与对应于储液单元的让位孔，用于提供外部动力以释放储液单元中的反应试剂。

本发明的第三方面还提供如上所述的分子诊断微流控芯片和/或如上所述的分子诊断微流控芯片体系在核酸扩增中的应用。

本发明可以取得如下的有益效果：

1、本发明采用微流控芯片技术结合核酸扩增法检测待检样本，具有检测灵敏度高，检出限低，检测可重复等优点，同时配合特定检测仪器，可以实现全自动芯片检测，无需人为干扰即可快速得到准确的检测结果。

2、本发明采用微流控芯片技术，对待检样本首先进行体积定量，使得只有特定体积的样本发生反应，保证检测结果的准确性，同时由于芯片结构固定，故而对于同一样本其检测可重复性强，保证检测结果的稳定性和可靠性。

3、本发明采用微流控芯片技术，将需要参与分子诊断反应的所有液体试剂都预存在储液单元中，完全避免了常规开放式分子诊断平台中的污染问题，同时全封闭式液体试剂保存形式可以延长芯片的保质期，确保在相当长一段时间内芯片仍然能够得到稳定而准确的检测结果。

4、本发明采用微流控芯片技术，对于每一个检测样本只进行一次检测，检测完成之后芯片立即废弃，完全避免了医院中不同样本之间的检测干扰，同时完全避免患者之间的交叉感染。

5、本发明采用微流控芯片技术，将反应完成之后的废液和多余样本都完全密封在芯片内部，不会导致废液或样本的泄露，对检测环境无公害，对医院检测人员安全性高，不会导致院内感染的发生。

6、本发明提供的微流控芯片通过上述各结构单元的相互配合，可以对用户注入的待检样本进行精确定量，充分混合，使得样本中含有的细菌，病毒，或其他病原菌细胞进行快速裂解而释放出内部的核酸物质，再优选通过硅胶磁珠的分离纯化获取高质量的DNA/RNA分子，使用特定核酸扩增方法如PCR等可以对特定病原菌的DNA/RNA分子进行检测，从而检测出待检样本中是否包含有某种病原菌，得出准确的“阳性”或“阴性”结果。

附图说明

图1是本发明提供的一种具体的分子诊断微流控芯片示意图。

图2显示了一种具体的配套仪器及其与分子诊断微流控芯片的连接方式。

图3是本发明提供的细胞裂解单元的结构及其运作机理图。

图4（A）是本发明提供的一种试剂囊袋的示意图；图4（B）示出了通过外部压力破裂试剂囊袋的方式；图4（C）显示了通过针刺破裂试剂囊袋的方式。

图5为本发明的分子诊断微流控芯片体系的层结构示意图。

图6为本发明提供的一种上层结构的示意图。

附图标记说明

1 进样单元 2 储液单元 3 细胞裂解单元

4 核酸扩增单元 5 核酸纯化单元 6 废液单元

7 通气单元 8 仪器接口 9 配套仪器

21 试剂囊袋 31 狭缝 32 第一腔室

33 第二腔室 34 挡板 41 微井

91 气压泵 92 导气管 93 气密性接口

211 定位孔 212 密封口 213 挤压区域

214 针刺结构

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

如图1和图3所示，本发明第一方面提供一种分子诊断微流控芯片，该微流控芯片包括：用于接收待检样本的进样单元1、用于储存反应试剂的储液单元2、用于对待检样本中的细胞进行裂解的细胞裂解单元3、用于对核酸进行扩增的核酸扩增单元4；

其中，所述细胞裂解单元3包括狭缝31以及由狭缝31隔开的第一腔室 32和第二腔室33，所述第一腔室32和所述第二腔室33中的至少一个腔室配置有研磨微珠；所述第一腔室32与所述进样单元1相通，所述第二腔室 33与至少一个储液单元2相通，用于接收细胞裂解液。

根据本发明，所述研磨微珠优选在微流控芯片封装的过程中放置于细胞裂解单元3的第一腔室32和/或第二腔室33中，其作用主要是对待提取核酸的细胞进行研磨，并且在研磨过程中提供剪切力破坏待检样本中的细胞(例如，病毒或其他病原菌)的细胞膜或细胞壁，使其释放出内部核酸物质。其材质可以是玻璃，石榴石，碳化硅，钢珠，陶瓷等，其直径大小为 0.05mm-10mm。

根据本发明，所述狭缝31的作用是提供一定量的空间体积，对过多的待检样本进行定量，只截留特定体积的样本，且能够加速研磨时液体通过速度，促进待检样本中病原菌的快速裂解。其狭缝宽度可以为0.001mm-10mm。由此可以看出，本发明提供的细胞裂解单元3不但可以对待检样本细胞进行裂解，还具有定量的功能。

根据本发明，所述细胞裂解单元3还优选与配套仪器9相连，所述配套仪器9包括有推拉杆，因此，当配套仪器9的推拉杆推动第一腔室32时，液体会快速通过狭缝31到达第二腔室33，当配套仪器中的推拉杆推动第二腔室33时，液体会快速通过狭缝31到达第一腔室32，如此待检样本会在两个研磨腔室中来回震荡运动，同时配合研磨珠的反复研磨，可以加速病原菌的裂解。

根据本发明一种优选的实施方式，所述细胞裂解单元3还包括挡板34，所述挡板34与所述狭缝31界定的通路使得所述第一腔室32和第二腔室33 相通。在该优选的情况下，在细胞裂解的过程中，会进一步加剧待检样本在第一腔室32和第二腔室33之间的流速以及震荡程度，从而进一步加快待检样本细胞的裂解。

现结合图3对本发明提供的细胞裂解单元3的结构和工作原理进行详细说明，如图3(A)中示出的，细胞裂解单元3包括有多个研磨微珠，狭缝 31，第一腔室32(第一腔室32通过样品入口连通进样单元1)，第二腔室33 (第二腔室33通过裂解液入口连通装有裂解液的储液单元2)，微阀门。其中研磨微珠在芯片封装过程中加入到第一腔室32中，并存储在该腔室结构中。在进行检测时，如图3(B)中示出的，微阀门打开，待检样本通过样品入口进入到第一腔室32中，多余的样本会通过狭缝31进入到第二腔室33，并通过微阀门流出，优选流入下文提及的废液单元6中，故而此处的结构还可以起到对待检样本进行体积定量的作用。如图3(C)中示出的，在细胞裂解操作之前，先将微阀门关闭，然后通过裂解液入口将裂解液释放到第二腔室33中。如图3(D)中示出的，在配套仪器9中对应位置的推拉杆推动的作用下，两个研磨腔室会相继受到挤压，从而促使裂解液和待检样本发生混合，通过两个挤压杆的交替运作，可以挤压混合液从一个腔室快速通过狭缝31进入另一个腔室，同时在研磨微珠的作用下，待检样本中的细胞膜或细胞壁发生快速裂解，以此实现细胞裂解的功能。

其中，所述裂解液可以为本领域公知的用于对细胞进行裂解的液体，本领域技术人员可以根据实际情况对裂解液进行选择。所述裂解液的一个实例为：55mmol/L的十二烷基环酸钠(SDS)，25mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)， 100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，500mmol/L的氯化钠(NaCl)，最后用NaOH溶液调节上述溶液的pH值至8.0。

根据本发明，为了进一步提高所述微流控芯片的检测效果，所述微流控芯片还包括设置在所述细胞裂解单元3和核酸扩增单元4之间的核酸纯化单元5，以在核酸进入所述核酸扩增单元4之前对所述细胞裂解单元3的裂解产物进行纯化。其中，在所述核酸纯化单元5中配置有能够特异性吸附核酸 (RNA或DNA)的磁珠。

根据本发明一种优选的实施方式，所述磁珠为硅胶磁珠，所述硅胶磁珠可以为任何可商购(例如，购自于ThermoFisher公司的Dynabeads磁珠)的硅胶磁珠。其中，硅胶磁珠可以在芯片封装时预先放置在核酸纯化单元5中，其表面的硅胶层能够特异性吸附核酸分子，然后通过磁铁的吸引作用将硅胶磁珠固定住，再通过清洗液的冲洗可以将未吸附的蛋白、细胞膜等杂质清洗掉，从而起到纯化核酸的目的。核酸纯化单元5是硅胶磁珠和细胞裂解产物发生混合的场所，也是清洗液冲洗未吸附杂质的场所，也是洗脱液将核酸分子从硅胶磁珠上洗脱下来的场所。

其中，所述清洗液可以根据本领域的公知常识进行适当的选择。所述清洗液的一个实例为：25mmol/L的聚乙二醇(PEG)，3mol/L的氯化钠(NaCl)， 2mmol/L乙醇。

其中，所述洗脱液可以为本领域公知的用于对核酸进行洗脱的液体，本领域技术人员可以根据实际情况对洗脱液进行选择。所述洗脱液的一个实例为：10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，13.7mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)。

因此，根据本发明一种优选的实施方式，所述核酸纯化单元5还包括设置在芯片体系之外的磁铁，所述磁铁可以在任意时间容易的引入或切出，从而使得磁珠可以根据需求进行固定以及解固定。例如，当裂解产物进入到所述核酸纯化单元5后，需要将裂解产物与磁珠进行充分混合，以使得裂解产物中的核酸充分吸附到磁珠上，此时，磁珠需要处于解固定的状态。而当对吸附有核酸的磁珠进行清洗以除杂时，需要将磁珠进行固定，使得磁珠不会因为清洗液的冲洗而随着清洗液进入到下一个结构单元。

根据本发明，所述核酸扩增单元4为纯化后的核酸(DNA或RNA)分子进行核酸扩增的场所，该扩增方式可以是比如PCR的循环温控扩增法，也可以是比如LAMP的恒温核酸扩增法。而当所述核酸为RNA分子时，此处先对RNA进行反转录PCR以获得DNA分子。

其中，所述核酸扩增单元4中发生的核酸扩增可以为反转录PCR，也可以普通的PCR以进行定性检测，还可以是荧光定量PCR以进行定量检查。故而该区域优选采用透光性比较好的材料来制备，比如聚甲基丙烯酸甲酯 PMMA，聚碳酸酯PC，或聚二甲基硅氧烷PDMS等。

其中，对扩增后的产物进行光学检测的模块可以由外部配套仪器9来提供。

其中，所述核酸扩增单元4内设置有由多个微井41组成的阵列，微井 41内部可以在芯片封装前通过点样仪点样可选择的固定有反转录引物以及多种不同的扩增引物，该引物通过特定设计后固定在微井底部，微井阵列中的每个微井41中的引物类型可以相同，也可以不同，在相同时，只检测一种类型的病原菌，在不同时，即可同时检测多种不同类型的病原菌。其中，该微井41的尺寸可以为0.001-1mm，其形状可以是矩形，圆形，三角形，菱形等各种形状。阵列方式可以是矩形阵列，蜂窝型阵列，圆形阵列等。

其中，在进行核酸扩增时，所需要的温度可以由外部的配套仪器9提供。因此，所述配套仪器9还包括温控模块。

根据本发明，所述微流控芯片还包括用于收集各步反应所产生的废液的废液单元6，例如，对细胞裂解单元3中多余待检样本的收集，以对待检样本进行定量，核酸扩增单元4中多余纯化产物进行收集，对核酸纯化单元5 中吸附核酸后的裂解液的收集、对清洗液以及洗脱液的收集等等。优选的，所述细胞裂解单元3、核酸扩增单元4和核酸纯化单元5与所述废液单元6 连通的微通路上分别设置有微阀门，以控制相应液体进入废液单元6的情况。

优选的，各结构单元与废液单元6相通的微通道与废液单元6之间的连接口设在废液单元6的上部，其主要作用是将反应完成后的废液或多余的待检样本输送到废液单元6中，同时由于位置上的结构关系使得进入废液单元 6内部的废液不会通过微通道而回流到芯片前部分。

其中，所述微通道的横截面的形状可以是矩形，圆形，三角形，梯形，或其他各种形状。微通道215的宽度可以是0.001mm-10mm，其深度可以是 0.001mm-10mm。

根据本发明，所述废液单元6优选位于芯片内液体流路系统的末端，以收集各步生化反应的废液，防止废液流出芯片而污染外部环境。其中，该废液单元6在结构上并不局限于图1中所示的矩形，其他形状，比如圆柱形，圆锥形，或其他各种不规则形状的也同样适用。其中，所述废液单元6的体积应该要大于所有储液单元2内部试剂体积与待检样本的体积之和，从而可保证废液单元6可以对反应过程中可能产生的废液进行有效的收集。

其中，所述微阀门优选设置有活塞结构，其打开或关闭可以完全由仪器根据预定程序来完成。平时没有仪器的介入下，微阀门均处于打开状态或部分微阀门处于打开状态，而需要将其关闭时，由仪器中步进电机的转轴带动微阀门处的活塞，将活塞旋转一定角度，从而使得活塞内部的液体通路关闭，使得微阀门转变为关闭状态。因此，优选的，配套仪器9还包括步进电机。

作为一种备选的实施方式，所述活塞可以是竖直推拉式而非旋转式，在一般状态下微阀门的活塞处于打开状态，在需要关闭时，通过仪器的推拉杆推动微阀门处的活塞，将活塞推入到微通道内部从而阻塞微通道，使得该微阀门处于关闭状态。

作为另一种备选的实施方式，该微阀门还可以通过铁片和电磁场的配合来进行打开和关闭操作，例如，可以在微阀门上方粘贴一个小铁片，在微阀门下方放置电磁铁，在一般状态下，电磁铁不通电，铁片位于微阀门上方，微阀门处于打开状态，在需要关闭时，通过仪器来对电磁铁通电，磁铁产生的电磁场会吸引微阀门上方的铁片，从而将铁片拉到微阀门下方，使得微阀门处于关闭状态。

根据本发明，所述进样单元1用于接收用户注入的待检样本。所述待检样本可以为任何需要进行PCR扩增的样本，例如，可以为但不限于，全血，血清，血浆，尿液，唾液，汗液等各种机体体液，也可以是经过机体的各种组织器官的分泌物，可以将所述分泌物进行稀释后的液体状物质、还可以是各种机体组织、细菌、病毒或其他病原菌等细胞。

其中，所述进样单元1的结构可以是圆柱形、圆锥形(例如，图1中所示的结构)、梯形，或其他各种不规则形状。其主要功能是接收用户注入的待检样本，使得待检样本在被注入到芯片后不会发生待检样本的泄漏，样本只能按照特定的微通道结构进行运转。

作为一种可选的实施方式，所述进样单元1还可以做成毛细作用进样结构，此时注入的待检样本会通过毛细作用进入到下游的结构单元，并且毛细作用会将待检样本吸附在芯片中，防止待检样本的泄漏而污染环境。

根据本发明，所述储液单元2至少为一个，图1显示了5个储液单元2，该储液单元2的主要作用是将要参与待检样本的裂解、纯化、核酸扩增的各种反应试剂，比如细胞裂解液、核酸清洗液、DNA/RNA洗脱液、DNA扩增或反转录PCR所需试剂等预先装填到本发明的芯片内部，在本发明芯片进行待检样本的测试时，再通过外力将该储液单元2内部的反应试剂按照顺序释放出来。此处需要说明的是，芯片内部的各个储液单元2的大小和形状可以相同，也可以不同，其形状也并不局限于图中所示的圆形，其他形状比如矩形，菱形，多边形或不规则形状也同样适用。同时各储液单元2的大小会根据所要预装的反应试剂的体积大小而发生改变，此时储液单元2的体积并不相同。

如图4（A）所示的，本发明提供了一种储液单元2的基本结构，预装反应试剂被预先装填到试剂囊袋21中，该试剂囊袋21优选为柔性材质，该材质包括但不限于：硝酸纤维素薄膜、塑料薄膜或金属铝箔，所述塑料薄膜可以为但不限于聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯 (PP)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中的至少一种。其共同特点是可以通过挤压或针刺的方式释放内部的预装反应试剂。在预装反应试剂装填到试剂囊袋21中后，通过热塑封的方式将出口进行密封形成密封口211。此处的密封口211的密封程度要比较浅，使得在外力加压试剂囊袋21时，密封口211 会破裂。定位孔212用于辅助将试剂囊袋21安装固定在芯片中的储液单元2 处。在需要将储液单元2内部反应试剂释放时，可以通过图4（B）中的方式，通过挤压试剂囊袋21上的挤压区域213，从而使得密封口211破裂而释放液体，也可以采用图4（C）中的方式，通过刺针来刺破试剂囊袋21的底部区域如针刺结构214处，使得内部预装反应试剂释放出来。

根据本发明一种优选的实施方式，本发明通过对芯片体系的微通路之间进行加压或减压从而控制各液体的流动，以便从一个结构单元进入到另一个结构单元。因此，所述微流控芯片还包括与所述废液单元6连接的通气单元 7，用于为微流控芯片体系提供所需的外部气压，在外部气压的辅助下使得内部液体正常运转。同时通气单元7还可以防止废液单元6中的废液流出到芯片外部而污染外部环境。虽然如图1所示的通气单元7采用W型微通道设计，但其他设计，比如圆形，弧形，Z型等其他各种结构也同样能够起到通气并防止废液外流的作用，这些设计也均应视同在本发明的保护范围之内。

优选的，所述通气单元7内部还可以填充特定物质，起到通气但防止废液外流的作用，比如该物质可以是气溶胶，或透气但不透水的疏松孔状结构物质。

根据本发明一种优选的实施方式，本发明的微流控芯片优选通过外部的配套仪器9提供系统所需的气压。因此，优选的，该微流控芯片还包括与所述通气单元7连接的仪器接口8，所述仪器接口8用于连接流控芯片体系外的配套仪器9，所述配套仪器9提供的气压通过所述通气单元7提供至所述微流控芯片体系。其中，所述外部气压的大小可以比大气压大，也可以比大气压小，根据具体的使用情况不同可以方便的调节该气压的大小。同时，所述仪器接口8优选为气密性的，即芯片在和配套仪器9的气压调节装置进行对接时，该部位不漏气。该功能可以通过塑料密封环或其他组件来实现。配套仪器9的气压调节装置可以是气动泵，储气囊泡，气压泵，挤压泵等。

根据本发明一种优选的实施方式，如图2所示的，所述配套仪器9包括用于提供气压的推动气压泵91、导气管92以及与所述通气单元7连接的气密性接口93。当待测芯片被放入到配套仪器9中后，仪器内部的步进电机(图中未显示)会推动气压泵91，使得气密性接口93紧贴到待测芯片的仪器接口8处，该紧贴方式是气密性的，可以通过在所述气密性接口93上设置密封环或O型圈来完成。优选的，所述气密性接口93是喇叭形，在该优选的情况下，不需要将气密性接口93与仪器接口8精确对准，只需要仪器接口8 位于该气密性接口93内部即可。待紧贴完成后，与气压泵91连接的步进电机处于锁定状态，此时气压泵91的位置固定。通过与气压泵91内部活塞相连的另外一个步进电机(图中未显示)的转动，可以推动或抽提活塞，从而调节气压泵91内部的气压，进而操控芯片内部的气压。在需要给芯片内部加压时，通过步进电机来推动活塞来完成，相反，在需要给芯片内部减压时，通过步进电机来抽提活塞来实现。芯片内部液路网络会由于气压的增大或减少而驱动流体发生转移。在待测芯片的整个测试流程完成之后，通过与气压泵91连接的步进电机的转动来使得该气密性接口脱离芯片。

如图5所示的，根据本发明的第二方面，提供一种分子诊断微流控芯片体系，该微流控芯片体系由上层、中层和下层组成；

其中，中层结构为如上所述的分子诊断微流控芯片；

其中，上层结构和下层结构用于覆盖封闭所述中间层；上层结构中设置有与进样单元1连接的进样孔，以及与对应于储液单元2的让位孔，用于提供外部动力以释放储液单元2中的反应试剂。

如图6所示的，上层结构上面设置有进样孔(小孔)，用于待检样本的加样。所述进样孔与中层结构中的进样单元1相通，以保证待检样本通过进样孔能够进入到所述进样单元1中。此外，上层结构上还设置有至少一个让位孔(大孔)，所述让位孔对应于中层结构的储液单元2，用于配套仪器9 的推杆的进入，从而为储液单元2提供外部压力，以将储液单元2内部预先封闭存储的试剂释放出来，因此，本发明的配套仪器9还包括至少一个推拉杆。所述让位孔大小和形状由中层结构中储液单元的储液囊袋21的结构大小和形状来决定，优选的，该让位孔的直径大小可以是0.5mm-50mm，其形状可以是圆形，矩形，多边形，菱形，甚至不规则形状等各种形状。

优选的，上层、中层和下层的材质各自独立地选自如聚二甲基硅氧烷 (PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、塑料薄膜、弹性乳胶、天然橡胶、塑料和硅胶。

优选的，上层结构的厚度为0.5-20mm，更优选为0.5-10mm，进一步优选为0.5mm-5mm；中层结构的厚度为0.5-50mm；更优选为2mm-20mm，进一步优选为3mm-15mm；下层结构的厚度为0.5-20mm，更优选为0.5-10mm，进一步优选为0.5mm-5mm。

本发明提供的一种优选的分子诊断微流控芯片的制备方法优选包括如下步骤：

步骤1)将待检样本裂解、纯化和核酸扩增所需反应试剂预装到所述试剂囊袋21中，并通过热塑封的方式将所述试剂囊袋21的密封口212进行密封；并通过定位孔211放置在芯片体系中层结构的特定储液结构处，进一步通过热塑封的方式将各储液的试剂囊袋21固定在芯片体系中层结构上。

步骤2)在芯片的第一腔室32中放置一定量的研磨微珠，并在所述芯片的核酸纯化单元5中放置一定量的硅胶磁珠。

步骤3)将下层结构贴合到如上中层结构的下面，其贴合方式包括但不仅限于超声热熔、胶粘、紫外光固化、热塑封等方式。

步骤4)将上层结构贴合到如上中层结构的上面，其贴合方式包括但不仅限于超声热熔、胶粘、紫外光固化、热塑封等方式。

采用本发明提供的一种优选的分子诊断微流控芯片体系进行分子诊断的流程如下：

步骤1)通过移液器吸取一定量的待检样本，将待检样本通过本发明芯片体系上层结构的加样孔加入到本芯片体系中，并进入进样单元1中，再将本发明芯片体系放置在配套仪器9内开始测试。

步骤2)在芯片内部，配套仪器9通过内部步进电机将气压泵91，气密性接口93移动到芯片上的仪器接口8处后固定，然后通过步进电机对活塞进行抽提，此时待检样本被吸入到细胞裂解单元3中的第一腔室32中，多余的样本进入第二腔室33，并在外力的抽提外用下进入废液单元6，从而对待检样本进行定量。

步骤3)通过配套仪器9关闭细胞裂解单元3的微阀门，并通过配套仪器9的推拉杆挤压储液单元2中的裂解液囊袋使其破裂释放内部预装液体，通过配套仪器9的推拉杆连续挤压细胞裂解单元3，促使内部待检样本发生细胞破裂。打开细胞裂解单元3的微阀门，并关闭核酸纯化单元5的微阀门，以同样的方式释放储液单元2的清洗液囊袋中的清洗液，使其冲洗细胞裂解产物并进入核酸纯化单元5中，充分清洗后，在核酸纯化单元5下部位引入磁铁吸引固定住硅胶磁珠，打开核酸纯化单元5的微阀门，通过配套仪器9 的抽提作用将清洗液抽取到废液单元6中，同样的方式再次释放清洗液，最后释放储液单元2中的洗脱液，使的硅胶磁珠上吸附的DNA或RNA洗脱下来。

步骤4)关闭细胞裂解单元3以及核酸纯化单元5的微阀门，挤压核酸纯化单元5使其内部被洗脱下来的DNA溶液进入核酸扩增单元5中，释放储液单元2中的核酸扩增试剂，通过配套仪器9的温度控制进行可选的反转录PCR，以及实时定量PCR反应(或恒温LAMP扩增反应)。

步骤5)在扩增过程中，通过配套仪器9中的光检测模块来探测荧光强度变化，从而获取特定的扩增曲线，从扩增曲线中解析出待检样本是否发生某种病原菌的感染。

本发明提供的分子诊断微流控芯片体系检测的样本体积为10-200μL。

本发明中，配套仪器9为小型便携式设备，配套仪器9除了包括气压泵 91、导气管92以及气密性接口93之外，还优选包括有推拉杆单元，步进电机模块，光检测模块，温控模块、电磁铁模块等。

本发明的第三方面还提供了如上所述的分子诊断微流控芯片和/或所述的分子诊断微流控芯片体系在核酸扩增中的应用。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1

本实施例用于说明通过使用本发明微流控芯片体系来检测大肠杆菌的存在

本实施例采用大肠杆菌作为实验材料的主要原因是大肠杆菌基因结构清楚，且细菌培养简单，菌体容易获取，菌体价格低廉等。当然采用本实施例中公开的实验方法同样可以用于其他病原菌的检测，如败血症中致病菌的检测，呼吸道感染病菌的检测等。

本实施例所使用的细胞裂解液的配制方法为：使用无菌水配制溶液，使其各成分的最终浓度为：55mmol/L的十二烷基环酸钠(SDS)，25mmol/L 的乙二胺四乙酸(EDTA)，100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，500mmol/L 的氯化钠(NaCl)，最后用NaOH溶液调节上述溶液的pH值至8.0，高压灭菌10分钟。细胞裂解液灭菌完成后冷却至室温，然后在无菌环境中封装到储液囊袋中。

核酸清洗液的配制方法为：使用无菌水配制溶液，使其各成分的最终浓度为：25mmol/L的聚乙二醇(PEG)，3mol/L的氯化钠(NaCl)，2mmol/L 乙醇。核酸清洗液在混合均匀后在无菌环境中封装到储液囊袋中。

核酸洗脱液的配制方法为：使用无菌水配制溶液，使其各成分的最终浓度为：10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，13.7mmol/L的乙二胺四乙酸 (EDTA)。核酸洗脱液在混合均匀后在无菌环境中封装到储液囊袋中。

荧光定量PCR试剂购自于SYBR Green Mix公司，其主要成分为：SYBR Green1染料，dNTP，Taq DNA聚合酶，双蒸水。PCR试剂准备完成后在无菌环境下封装在储液囊袋21中。

本实施例的检测对象为大肠杆菌，其菌液制备过程为：称取胰蛋白胨 10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加水定容至1L，高压蒸汽灭菌10分钟，在生物安全柜内接种对数生长期的大肠杆菌，接种后摇床培养16小时(摇床温度37℃)。

本实施例所使用的研磨微珠为直径1mm的玻璃微珠，其圆球外形坚硬，球形较好，加入2g该玻璃微珠到本发明芯片中的第一腔室32中。本实施例所使用的硅胶磁珠的直径为10μm左右，其内核磁性为超顺磁性，其外壳覆盖有高分子惰性材料苯乙烯，在使用时先将该硅胶磁珠溶解于水溶液中，再取200μL点样到所述芯片中的核酸纯化单元5处。

步骤一：芯片的组装方法

1)将上述各反应试剂预装在试剂囊袋21中，并通过热塑封的方式将所述试剂囊袋21的密封口212进行密封(加热时间30s)；并通过定位孔211 放置在芯片体系中层结构的特定储液结构处，进一步通过热塑封的方式将各储液的试剂囊袋21固定在芯片体系中层结构上。

2)本发明芯片的上层1、中间层2和下层3均通过注塑成型的方式制备。首先将步骤1)获得的各试剂囊袋21装填到中间层2的相应的储液单元2 结构处，再将研磨微珠加入到所述芯片的第一腔室32中，再将硅胶磁珠取 200μL注入到芯片的核酸纯化单元5内，通过将高温烘干(70℃，2小时) 的方式将硅胶磁珠固定在核酸纯化单元5内。荧光定量PCR所需引物通过点样仪点样到核酸扩增单元4中的微井41中，并固化2小时使其固定。

再通过光敏胶固化的方式(紫外光固化时间10min)将下层3贴合到中间层结构上，通过同样的光敏胶固化方式(紫外光固化时间10min)将上层 1贴合到中间层2上，如此制备出完整可用的芯片体系。

步骤二：样本检测

本发明芯片的样本检测过程主要分为五个步骤。

步骤1)通过移液器吸取50μL的大肠杆菌菌液，将大肠杆菌菌液通过本发明芯片的加样孔加入到本芯片体系中，从而进入进样单元1中，再将本发明芯片放置在配套仪器9内开始测试。

步骤2)在配套仪器9内部，仪器通过内部的气压泵91来调节芯片内部的气压，将芯片内部的待测样本吸入到细胞裂解单元3中的第一腔室32内，多余的样本流入到第二腔室33中，在此处进行样本体积的定量，多余的待测样本被气压泵抽取到废液单元6。

步骤3)通过配套仪器9关闭细胞裂解单元3的微阀门，并挤压裂解液囊袋使其破裂释放内部预装液体，通过推拉杆连续挤压细胞裂解单元3，促使内部待检样本发生细胞破裂。打开细胞裂解单元3的微阀门，并关闭核酸纯化腔室5的微阀门，通过同样的方式释放清洗液囊袋中清洗液，使其冲洗细胞裂解产物并进入核酸纯化腔室5中，充分清洗后，在核酸纯化腔室5下部位引入磁铁吸引固定住硅胶磁珠，打开核酸纯化腔室5的微阀门，通过仪器的抽提作用将清洗液抽取到废液单元6中，同样的方式释放再次释放清洗液，最后释放储液单元2中的洗脱液到纯化腔室中，使的硅胶磁珠上吸附的 DNA洗脱下来。

步骤4)关闭细胞裂解单元3和核酸纯化单元5的微阀门，挤压核酸纯化单元5使其内部被洗脱下来的DNA溶液进入核酸扩增单元4中，释放储液单元2中的核酸扩增试剂，通过配套仪器9的温度控制进行荧光实时定量 PCR反应(其温度和时间分别为94℃，1分钟，然后55℃，1分钟，然后 72℃，1分钟，进行至少20个循环)。

步骤5)在扩增过程中，该体系所用的SYBR Green荧光染料可以特异性结合到双链DNA上，随着PCR扩增的进行，试剂中双链DNA越来越多，与双链DNA特异性结合的SYBR染料也越来越多，所得到的荧光信号越来越强，通过配套仪器中的光检测模块来探测荧光强度的变化，可以获取特定的扩增曲线，从扩增曲线中解析出待检样本是否存在大肠杆菌的感染。

采用同样的检测流程，取50μL不含有大肠杆菌的无菌水作为对照样本加入到另外一个检测芯片体系中，重复上述步骤进行检测，获取其检测结果。

结果表明，本微流控芯片对大肠杆菌溶液的检测结果为阳性，而对不含大肠杆菌的无菌水其检测结果为阴性，表明该微流控芯片体系可以用于对样本中细菌存在与否进行检测，阴性对照和阳性测试均表明本检测芯片具有结果准确，检测速度快(约50分钟)，可以进一步作为核酸扩增的分子诊断医学参考。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种分子诊断微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片包括：用于接收待检样本的进样单元(1)、用于储存反应试剂的储液单元(2)、用于对待检样本中的细胞进行裂解的细胞裂解单元(3)、用于对核酸进行扩增的核酸扩增单元(4)；

其中，所述细胞裂解单元(3)包括狭缝(31)、以及由所述狭缝(31)隔开的第一腔室(32)和第二腔室(33)，所述第一腔室(32)和所述第二腔室(33)中的至少一个腔室配置有研磨微珠；所述第一腔室(32)与所述进样单元(1)相通，所述第二腔室(33)与至少一个储液单元(2)相通，用于接收细胞裂解液。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其中，所述细胞裂解单元(3)还包括挡板(34)，所述挡板(34)与所述狭缝(31)相对但不相接，所述第一腔室(32)和第二腔室(33)通过所述挡板(34)与所述狭缝(31)界定的空间相通。

3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其中，所述微流控芯片还包括设置在所述细胞裂解单元(3)和核酸扩增单元(4)之间的核酸纯化单元(5)，以在核酸进入所述核酸扩增单元(4)之前对所述细胞裂解单元(3)的裂解产物进行纯化，所述核酸纯化单元(5)中配置有能够特异性吸附核酸的磁珠；

优选的，所述磁珠为硅胶磁珠。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的微流控芯片，其中，所述核酸扩增单元(4)包括由多个微井(41)组成的阵列，所述微井(41)中固定有至少一种引物对；

优选的，所述核酸扩增单元(4)的材质选自聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯和聚二甲基硅氧烷。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的微流控芯片，其中，所述微流控芯片还包括用于收集各步反应所产生的废液的废液单元(6)；

优选的，所述细胞裂解单元(3)的第二腔室(33)和核酸扩增单元(4)与所述废液单元(6)连通的微通道上还设置有微阀门；

优选的，所述核酸纯化单元(5)与所述废液单元(6)连通的微通道上还设置有微阀门。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的微流控芯片，其中，该微流控芯片还包括与所述废液单元(6)连接的通气单元(7)，用于为微流控芯片体系提供所需的外部气压；

优选的，该微流控芯片还包括与所述通气单元(7)连接的仪器接口(8)，所述仪器接口(8)用于连接流控芯片体系外的配套仪器(9)，所述配套仪器(9)提供的气压通过所述通气单元(7)提供至所述微流控芯片体系；

优选的，所述配套仪器(9)包括用于提供气压的气压泵(91)、导气管(92)以及与所述通气单元(7)连接的气密性接口(93)；所述气密性接口(93)优选为喇叭形；

优选的，所述通气单元(7)中还填充有透气但不透水的物质；优选的，所述透气但不透水的物质为气溶胶。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的微流控芯片，其中，所述反应试剂通过试剂囊袋(21)装填到所述储液单元(2)中；所述试剂囊袋(21)包括用于将其固定到所述储液单元(2)上的定位孔(211)，密封口(212)以及用于将所述密封口(212)打开并释放所述反应试剂的挤压区域(213)或针刺结构(214)；

优选的，所述试剂囊袋(21)的材质选自硝酸纤维素薄膜、塑料薄膜和金属铝箔中的至少一种；

优选的，所述塑料薄膜的材质选自聚酯，聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚丙烯和聚甲基丙烯酸甲酯中的至少一种；

优选的，所述反应试剂选自细胞裂解液、核酸清洗液、核酸洗脱液、扩增反应试剂。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的微流控芯片，其中，所述待检样本为机体体液、机体分泌物、机体组织或细胞；

优选地，所述机体体液选自全血、血清、血浆、尿液、唾液和汗液。

9.一种分子诊断微流控芯片体系，其特征在于，该微流控芯片体系由上层、中层和下层组成；

其中，中层结构为权利要求1-8中任意一项所述的分子诊断微流控芯片；

其中，上层结构和下层结构用于覆盖封闭所述中层；上层结构中设置有与进样单元(1)连接的进样孔，以及与对应于储液单元(2)的让位孔，用于提供外部动力以释放储液单元(2)中的反应试剂；

优选的，上层、中层和下层的材质各自独立地选自如聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、塑料薄膜、弹性乳胶、天然橡胶、塑料和硅胶；

优选的，上层结构的厚度为0.5-20mm；中层结构的厚度为0.5-50mm；下层结构的厚度为0.5-20mm。

10.权利要求1-8中任意一项所述的分子诊断微流控芯片和/或权利要求9所述的分子诊断微流控芯片体系在核酸扩增中的应用。