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CN107858328A - 一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质细胞及其诱导分化方法 - Google Patents

一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质细胞及其诱导分化方法 Download PDF

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CN107858328A
CN107858328A CN201711129757.0A CN201711129757A CN107858328A CN 107858328 A CN107858328 A CN 107858328A CN 201711129757 A CN201711129757 A CN 201711129757A CN 107858328 A CN107858328 A CN 107858328A
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stem cell
neural crest
nutrient solution
pedigree
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CN201711129757.0A
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项鹏
李伟强
翟志臣
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Guangzhou Sai Jun Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Sai Jun Biological Technology Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞及其诱导分化方法，其是解离多能干细胞制备成细胞团块，悬浮培养，使多能干细胞形成拟胚体，将培养液更换为神经嵴细胞培养液，悬浮培养拟胚体，每天收集胚体更换培养液；培养一定时间后使拟胚体贴壁生长一定时间；再消化收集细胞；贴壁培养收集的细胞，并将培养液更换为间充质干细胞培养液，传代培养后检测间充质的细胞表型，即得。本发明解决成人来源间充质干细胞及其他非限定诱导途径多能干细胞来源的间充质干细胞异质性与混杂的缺点，获得的神经嵴谱系间充质干细胞具有更强的免疫调节与成骨分化能力；标准化诱导分化程序可保证不同批次间获得的细胞群具有良好的一致性。

Description

一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质细胞及其诱导分化 方法
技术领域
本发明属于生物与医学领域，更具体地，本发明涉及一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞及其制备方法，包括使用特殊的培养条件和选择技术。本发明还涉及利用这群神经嵴谱系间充质干细胞的治疗方法或其临床应用。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)属于成体干细胞的一种，是在成人体内许多组织如骨髓、脐带血、脂肪和外周血等中都存在的一大类多能细胞，在正常时处于静止状态，当所在的组织或器官受到损伤时，他们可以迅速进入增殖状态并保持极大的增殖潜力，并分化为不同的细胞类型以修复受损组织。最先发现的一类 MSCs是骨髓间充质干细胞(Friedenstein AJ,J Embryol Exp Morphol,1966,16(3): 381-90)，其能在不同的诱导条件下向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经细胞、造血支持细胞等方向分化，具有典型的干细胞特点。
由于MSCs具有易于分离扩增及具有多向分化潜能等优点，最早被认为是组织工程理想的种子细胞而成为研究热点。随后发现MSCs具有强大的免疫调节能力，更进一步推动了MSCs相关的研究，使其成为最有希望实现临床化的明星细胞之一。但MSCs难以规模化扩增及异质性是目前限制MSCs临床化应用的两大障碍。
鉴于MSCs广泛的来源及异质性，为了规范MSCs相关的实验与临床治疗研究，国际间充质干细胞治疗委员会ISCT于2006年提出鉴定MSCs的三个标准：(1)细胞可以粘附于塑料培养器皿；(2)细胞表达特定的表面抗原，其中CD44，CD73，CD90，STRO-1和CD105/SH2阳性率>95％，CD11,CD14,CD34 和CD45阳性率<2％；(3)细胞的多向分化潜能，即可以分化为软骨细胞、骨细胞及脂肪细胞等。
但即使培养中的细胞完全符合ISCT所提出的三个标准，MSCs功能上的差异也相当明显，直接导致MSCs表现出增殖能力、分化能力等各方面的差异。在ClinicalTrials上登记的MSC临床研究中很大比例都因结果不稳定而不得不中止研究宣告失败，导致这种差异性结果及临床效果不佳的主要原因是MSCs为异质性细胞群体，不同个体、不同组织来源、甚至同一组织提取到的MSCs都为包含多种亚型的异质性群体，不同亚型的MSCs功能各异。Anokhina通过将 MSCs体外扩增50代，比较MSCs的异质性，发现随着传代次数的增加，MSCs的异质性有所下降，不同个体MSCs表达相同的表面标志，说明体外扩增可以选择性地筛选MSCs亚群，但是MSCs的分化功能则产生了较大的差异。这些研究结果表明长期或大量体外扩增加于MSCs群体上的选择压力将极大地影响 MSCs种群的构成、分化性能及治疗功效，导致不同甚至相反的结果。即使MSCs 的表面表型没有可检测到的变化，MSCs在持续传代过程中也会丢失其多能性，或特异性地筛选出性能不佳的亚型。因此，区分不同亚群MSCs，进而筛选出在相关应用中起关键作用的MSCs亚群，消除其异质性的影响是目前将MSCs临床应用的关键技术之一。
为解决MSCs的来源与扩增的问题，不少研究致力于将ES及iPS诱导分化为MSCs。据文献报道，2004年Chunhui Xu最早通过转染human telomerase reverse transcriptase(hTERT)基因至分化中的hESCs诱导ESC向HEF方向分化，得到的细胞有成骨分化的能力。但其未进行MSC的详细鉴定。随后Tiziano Barberi通过与mouse OP9cell line共培养40d，在添加了20％FBS的alpha MEM 培养液中诱导ESC向MSC分化，流式分选CD73+细胞，被视为是第一个诱导多能干细胞向MSC分化的报道。
05年通过OP9细胞共培养得到MSC的课题组，08年报道了非共培养的诱导：人ESCs(H1、H7、及H9细胞株)培养于包被了Matrigel的孔板中，为了诱导其向MSC分化，增加换液周期为3-5d。9-10d后，40％-50％的细胞表现出成纤维样形态，机械去除ESC细胞，胶原酶消化分化的细胞并接入Matrigel包被的新皿中。成纤维细胞进一步增加，第二次刮去未分化细胞，胰酶消化并接入明胶包被的皿中，在加了10％FBS的aMEM中培养，约4-6周的时间可以完成诱导。
Lian 2007年报道了一种临床级的ES来源MSC，其通过胰酶消化ESC，以含bFGF及PDGF的KSR培养基在明胶包被的培养皿中培养，长满后胰酶消化传代，一周后以CD105+与CD24-分选得到MSC细胞。
已有专利也记载了从iPS分化为间质细胞的方法，如美国杰龙公司(专利申请公布号CN101696397A)、国内付清玲(专利申请公布号CN105754936A)等都描述了一种从多能干细胞分化为间质细胞的方法。
但是，这些文献或专利报道的方法得到的细胞未控制分化路径，只着重于解决MSCs的来源问题，未针对细胞的异质性提供相应的解决方案，因此诱导所得的细胞可能比骨髓来源的间充质更为异质；同时，这些方案未将细胞的功能作为重点考察对象，而治疗效果不佳的产品必定会极大地限制其应用。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞及其诱导方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，包括以下步骤：
(1)体外贴壁培养多能干细胞，保持其未分化状态；
(2)当(1)中细胞扩增到所需数量后，将细胞制备成细胞团块，悬浮培养，使多能干细胞形成拟胚体；
(3)将培养液更换为神经嵴细胞培养液，悬浮培养拟胚体；每天或2～4天更换一次培养液；
(4)悬浮培养4～10天后，贴壁培养拟胚体，每天或2～4天更换一次培养液；
(5)生长2～10天后，以EDTA或胰酶消化收集细胞；
(6)贴壁培养收集的细胞，并将培养液更换为间充质干细胞培养液，传代培养2～6次后检测间充质的细胞表型，即得；
在其中一些实施例中，步骤(1)中每个拟胚体所含有的细胞数目为 2×102～2×106。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述细胞团块可使用解离试剂如Dispase、Accutase或EDTA制备；解离试剂的作用温度为30～37℃。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述细胞团块也可使用机械划刮的方法制备。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述神经嵴细胞培养液包括以下组分： DMEM/F12:20-80％、Neuralbasal:20-80％。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述神经嵴细胞培养液还包括以下组分的一种或几种：N2:0.1-2％、B27:0.1-2％、L-Glu:0.1-5％、2-Mercaptoethanol: 0.01mM-1mM、SB431542:0.01mM-1mM、BIO:0.1-10ng/ml、bFGF:2-50ng/ml、 EGF:2-50ng/ml、Penicillin-Streptomycin:50-200U/ml。
在其中一些实施例中，步骤(4)所述贴壁培养为：将拟胚体转移至包被了Matrigel或层粘连蛋白等基质胶的表面以促进拟胚体的贴壁。
在其中一些实施例中，步骤(5)还包括使用P75与HNK1抗体标记收集的细胞，再通过流式分选P75与HNK1双阳的细胞。
在其中一些实施例中，步骤(6)所述间充质干细胞培养液为添加了5％至 20％血清的DMEM完全培养液，或商业化的无血清完全培养液。
本发明还提供了上述诱导分化方法诱导分化而得的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞。
本发明针对现有技术诱导得到的间充质干细胞的缺陷，提供了一种优化的间充质干细胞亚群，用以增强细胞的细胞学或治疗功能。本发明同时提供间充质干细胞亚群细胞的获取方法。与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明通过先将多能干细胞诱导为神经嵴细胞，再进一步诱导为间充质干细胞，可解决成人来源间充质干细胞及其他非限定诱导途径多能干细胞来源的间充质干细胞异质性与混杂的缺点，可解决间充质干细胞来源受限的问题，获得的神经嵴谱系间充质干细胞具有更强的免疫调节与成骨分化能力；
(2)本发明通过标准化诱导分化程序，可保证不同批次间获得的细胞群具有良好的一致性。
附图说明
图1为实施例1培养的iPS细胞的多能性标记免疫荧光照片；
图2为实施例1中悬浮培养与贴壁培养的拟胚体；
图3为实施例1中神经嵴细胞的分选图与分选后的细胞形态图；
图4为实施例1中神经嵴细胞在间充质培养液中传代4次后的细胞形态图及细胞表面标记流式分析图；
图5是本发明试验例1中获得的神经嵴谱系间充质干细胞成骨、成脂成软骨分化图；
图6是本发明试验例2中神经嵴谱系间充质干细胞对T细胞炎症因子TNFα分泌的抑制作用流式分析图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。以下实施例中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的细胞生物学、生物化学、分子生物学等各个领域的常规技术。
实施例1来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法
本实施例的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，包括以下步骤：
一、体外贴壁培养多能干细胞，保持其未分化状态；
多能干细胞，包括胚胎干细胞及诱导多能干细胞可以方便地通过商业化或本实验室构建获得。本实施例着重阐述在稳定建立的多能干细胞系基础上的进一步培养与分化操作。
多能干细胞可在无饲养层的条件下大规模扩增且保持未分化状态。培养液可选用STEMCELL公司的mTeSR系列产品、E8等，与上述几种培养液相适应的，需要在培养液质上包被基质胶，如Matrigel或层粘连蛋白。保证高质量的多能干细胞是进行下一步诱导的关键。
基于mTeSR1与Matrigel培养体系，具体的培养操作如下：
1、培养皿的包被：冰上融解Matrigel，DMEM/F12稀释Matrigel至1:20 至1:200，加入孔板中室温包被1h以上备用。
2、从液氮中取出冻存管，于37摄氏度水浴中快速解冻细胞株，转移入已加有5mlmTeSR1完全培养液的15ml离心管中，300g离心5min收集细胞。
3、吸去包被的Matrigel，以2ml mTeSR1重悬细胞，均匀地将细胞接种入包被好的孔板中，放入37摄氏度、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置贴壁培养。
4、每天更换培养液，彻底吸去旧的培养液，加入新鲜的预热好的培养液，继续培养，直至细胞克隆长至适合传代的大小。
5、细胞传代前，使用PBS洗涤细胞两次，加入0.5mM的EDTA于37摄氏度孵育1至10min，镜下观察，使细胞解离成小的细胞团块，吸去EDTA，以 PBS轻轻软打细胞，保证细胞维持小团块状；
6、转移细胞团块入15ml离心管中，300g离心5min收集细胞。
7、以mTeSR1重悬细胞，以1：6或其他合适的比例均匀地将细胞接种入包被好的孔板中，放入37摄氏度、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置贴壁培养。
8持续传代以获取足够的细胞量进行下一步的分化诱导。
培养的iPS细胞的多能性标记免疫荧光照片如图1所示。
二、拟胚体的制备与培养
当(一)中细胞扩增到所需数量后，解离细胞制备成细胞团块，悬浮培养，使多能干细胞形成拟胚体，其中，每个拟胚体所含有的细胞数目为2×102～2×106；
1、使用PBS洗涤细胞两次，加入0.5mM的EDTA于37摄氏度孵育1至 10min，镜下观察，使细胞解离成小的细胞团块，吸去EDTA，以PBS轻轻软打细胞，保证细胞维持小团块状。
2、转移细胞团块入15ml离心管中，50g离心1min收集细胞团块。
3、以神经嵴细胞培养液(49％DMEM/F12、49％Neuralbasal、0.5％N2、 0.5％B27、1％L-Glu、0.1mM 2-Mercaptoethanol、0.1mM SB 431542、2ng/ml BIO、 5ng/ml bFGF、5ng/ml EGF)重悬细胞团，以1：1至1：3的比例均匀地将细胞接种入低吸附孔板或培养皿中。放入37摄氏度、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置悬浮培养。
4、悬浮培养第二天，细胞团块将自发形成拟胚体，使用吸管将拟胚体转移入15ml离心管中，50g离心1min收集拟胚体。
5、以神经嵴细胞培养液重悬拟胚体，接种入低吸附孔板或培养皿中37摄氏度、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置悬浮培养。
6、静置悬浮培养拟胚体5d，期间每天或2至3d换液一次，换液时重复步骤4～5。
7、拟胚体悬浮培养第6d时，使用吸管将拟胚体转移入15ml离心管中，50g 离心1min收集拟胚体，以神经嵴细胞培养液重悬拟胚体，接种入已包被好 Matrigel的培养皿中，于37摄氏度、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养，使拟胚体贴壁。
8、贴壁培养的拟胚体每天或2～3d换液一次。
三、将培养液更换为神经嵴细胞培养液，培养皿不再包被基质胶，或更换为超低吸附培养皿，悬浮培养拟胚体，每天收集胚体更换培养液；
1、拟胚体贴壁培养5d后，使用PBS洗涤细胞两次，加入0.05％的胰酶，于37摄氏度孵育0.5至3min，镜下观察，细胞开始收缩时加入与胰酶等量的神经嵴细胞培养液中止消化，以PBS轻轻软打细胞，转移细胞入15ml离心管中， 250g离心5min收集细胞。
2、以0.1至1ml含1％BSA的PBS重悬细胞，分成两份，一份依据抗体说明书加入适量P75与HNK1抗体，另一份加入IgG抗体，在4摄氏度孵育30min。
3、加入PBS洗涤孵育完抗体的细胞，于250g离心5min弃上清。
4、含1％BSA的PBS重悬细胞，以标记了IgG的细胞作为阳性对照，流式分选P75与HNK1双阳细胞，从而分离出神经嵴细胞。
悬浮培养与贴壁培养的拟胚体如图2所示。神经嵴细胞的分选图与分选后的细胞形态如图3所示。
四、神经嵴细胞向间充质干细胞的诱导分化
1、神经嵴细胞培养液重悬浮神经嵴细胞，以5～10×104/cm2的密度接种于包被了基质胶的孔板中，于37摄氏度、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置贴壁培养。
2、第二天，更换神经嵴细胞培养液为间充质干细胞培养液(如LDMEM+10％胎牛血清)，于37摄氏度、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养，每2～3d 换液。
3、细胞生长至80～90％融合后，以胰酶消化传代，接种入普通的组织培养处理过的细胞培养皿，静置贴壁培养；同时取一部分细胞检测CD44、CD73、 CD90、CD34、CD45等抗体表达情况。
4、重复步骤3，直至表达CD44、CD73、CD90的细胞达到95％以上；表达CD34、CD45的细胞少于5％，即得神经嵴谱系间充质干细胞。
神经嵴细胞在间充质培养液中传代4次后的细胞形态及细胞表面标记流式分析如图4所示。
试验例1神经嵴谱系间充质干细胞的成骨成脂成软骨诱导分化
1、成骨分化：神经嵴谱系间充质干细胞生长至80～90％融合后，将培养液换为成骨诱导分化培养液(L-DMEM+10％FBS+10mMβ-glycerophosphate+ 50μg/ml维生素C及100nM的地塞米松)。每3d换液一次，诱导培养14d后进行茜素红染色分析，如图5所示，染色可见明显的钙结节。
2、成脂分化：神经嵴谱系间充质干细胞生长至80～90％融合后，将培养液换为成脂诱导分化培养液(H-DMEM+10％FBS+100nM Indo+0.5mM IBMX 及1mM的地塞米松)。每3d换液一次，诱导培养21d后进行油红O染色分析，如图5所示，染色可见明显的脂滴。
3、成软骨分化：消化收集神经嵴谱系间充质干细胞，以2.5×105/15ml离心管的细胞量分接入15ml离心管中，200×g离心5min，弃上清，加入1ml软骨分化诱导培养液(H-DMEM+10ng/ml重组人转化生长因子(recombinant human transforming growth factor-β3,TGF-β3)，100nM地塞米松,50μg/ml维生素C， 1mM丙酮酸钠，40μg/ml脯氨酸及ITS+premix)。每3d换液一次，诱导培养 21d后进行阿利新蓝染色分析，如图5所示，染色可见明显的糖胺聚糖着色。
试验例2神经嵴谱系间充质干细胞对T细胞炎症因子TNFα分泌的抑制作用检测
包括以下步骤：
1、MSCs培养液重悬MSCs，以4×104/cm2的密度接种入孔板中。
2、以1640+10％FBS培养液重悬CD3+T细胞。
3、以1：5的比例将T细胞接种入培养了MSCs的孔中，于37摄氏度、5％ CO2和95％湿度的培养箱中静置培养3d。
4、3d后，加入刺激剂处理6h。
5、6h后，转移悬浮的T细胞入15ml离心管，500g离心10min收集细胞。
6、以100μl PBS重悬细胞，再加入100μl 4％的PFA室温固定细胞20min。
7、PBS洗涤固定好的细胞后加入皂苷穿透，同时加入TNFα抗体室温孵育 15min。
8、PBS洗涤标记好的抗体，最后以PBS重悬细胞进行流式检测。
结果如图6所示，结果显示神经嵴谱系间充质干细胞较骨髓来源的间充质细具有更强的炎症因子抑制作用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)体外贴壁培养多能干细胞，保持其未分化状态；
(2)当(1)中细胞扩增到所需数量后，将细胞制备成细胞团块，悬浮培养细胞团块，使多能干细胞形成拟胚体；
(3)将培养液更换为神经嵴细胞培养液，悬浮培养拟胚体；每天或2～4天更换一次培养液；
(4)悬浮培养4～10天后，贴壁培养拟胚体，每天或2～4天更换一次培养液；
(5)贴壁培养2～10天后，以EDTA或胰酶消化收集细胞；
(6)贴壁培养收集的细胞，并将培养液更换为间充质干细胞培养液，传代培养2～6次后检测间充质的细胞表型，即得。
2.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(2)中每个拟胚体所含有的细胞数目为2×102～2×106。
3.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(2)所述细胞团块是使用解离试剂制备而得的；所述解离试剂为Dispase、Accutase或EDTA；所述解离试剂的作用温度为30～37℃。
4.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(2)所述细胞团块是使用机械划刮的方法制备而得的。
5.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(3)所述神经嵴细胞培养液包括以下组分：DMEM/F12:20-80％、Neuralbasal:20-80％。
6.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(3)所述神经嵴细胞培养液还包括以下组分的一种或几种：N2:0.1-2％、B27:0.1-2％、L-Glu:0.1-5％、2-Mercaptoethanol:0.01mM-1mM、SB 431542:0.01mM-1mM、BIO:0.1-10ng/ml、bFGF:2-50ng/ml、EGF:2-50ng/ml、Penicillin-Streptomycin:50-200U/ml。
7.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(4)中所述贴壁培养为：将拟胚体转移至包被了Matrigel或层粘连蛋白的基质胶的表面，促进拟胚体的贴壁。
8.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(5)还包括使用P75与HNK1抗体标记收集的细胞，再通过流式分选P75与HNK1双阳的细胞。
9.根据权利要求1所述的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞的诱导分化方法，其特征在于，步骤(6)所述间充质干细胞培养液为添加了5％至20％血清的DMEM完全培养液或商业化的无血清完全培养液。
10.由权利要求1～9任一项所述的诱导分化方法诱导分化而得的来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质干细胞。
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