CN107721949A - 一种用于治疗脱髓鞘疾病的化合物及其药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种化合物在制备治疗脱髓鞘疾病药物中的应用属于生物医药的技术领域，该化合物是苄噻嗪(Benzthiazide)，其结构式如下：并提供了含有所述的苄噻嗪或其药学上可接受的其他存在形式的化合物作为活性成分和药学上可以接受的载体组成的药物组合物，在治疗脱髓鞘疾病药物制备中的应用。本发明人通过实验发现苄噻嗪可以改善、维持或延缓髓鞘疾病的恶化，能够降低髓鞘脱失的作用。因此苄噻嗪作为治疗脱髓鞘疾病药物具有很重要的临床意义和应用前景。

Description

一种用于治疗脱髓鞘疾病的化合物及其药物组合物

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于治疗脱髓鞘疾病的化合物，特别涉及一种用于治疗脱髓鞘疾病的药物组合物。

背景技术

脱髓鞘疾病(demyelinating disease)是神经系统的疾病，其中神经元的髓鞘受损。该损伤损害受影响神经元中的信号转导。继而，根据受影响的是哪些神经，转导的降低导致感觉、运动、认知或其他功能中的缺陷。

脱髓鞘疾病可以包括影响中枢神经系统和周围神经系统的疾病。中枢神经系统脱髓鞘疾病包括多发性硬化、德维克病(Devic’s disease)、炎性脱髓鞘疾病、中枢神经系统神经病如由维生素B12缺乏所引起的那些；骨髓病如脊髓痨(Tabes dorsalis)，脑白质病(leukoencephalopathies)如进行性多灶性白质脑病(progressive multifocalleukoencephalopathy)，脑白质营养不良(leukodystrophies)或其组合。周围神经系统的脱髓鞘疾病包括格林巴利综合征(GBS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(chronicinflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy)(CIDP)、传导阻滞多灶性运动神经病(multifocal motor neuropathy with conduction block)(MMN)和副蛋白血症脱髓鞘性周围神经病(paraproteinaemic demyelinating peripheral neuropathy)(PDN)。

核转录因子-kappa B(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一种具有多向转录调节作用的蛋白质，NF-κB是作为B细胞核转录因子被发现的。由于NF-κB对多种神经细胞具有生物活性，在多种神经系统疾病中均发现有NF-κB的激活，而NF-κB的持久激活会引起神经元的迟发性死亡，阻断NF-κB活化有可能成为今后治疗神经系统疾病的重要手段，为神经系统疾病的治疗开辟新的途径。

苄噻嗪(Benzthiazide)，又名苄硫醚氯噻嗪；苄硫噻嗪；分子式C15H14ClN3O4S3，分子量431.94，白色结晶性粉末，熔点221-223℃。由3-氟甲基苯胺-4，6-二磺酰氯与氢氧化铵进行胺化后，再与苯乙醛环合制得。为利尿药物，适用于各种水肿，如充血性心力衰竭、肾脏病、肝硬化、妊娠毒血症、经前期症、候群和可的松类药物治疗时所引起的水肿，也可用于治疗高血压症。但在治疗脱髓鞘周围神经病药物制备中的应用经检索未见文献公开报道。本发明人通过实验发现苄噻嗪可以改善、维持或延缓髓鞘疾病的恶化，能够降低髓鞘脱失的作用。因此苄噻嗪作为治疗脱髓鞘疾病药物具有很重要的临床意义和应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于治疗脱髓鞘疾病药物中的化合物。

所述化合物的结构式如下：

所述化合物的中文名称是苄噻嗪；苄硫醚氯噻嗪；苄硫噻嗪，英文名称Benzthiazide。

本发明化合物可以不同形式存在，例如游离酸、游离碱、酯和其它前药、盐和互变异构体，例如，本申请包括所述化合物的所有变体形式。

本发明的目的是提供一种苄噻嗪在脱髓鞘疾病药物制备中的应用。

本发明的另一目的是提供以苄噻嗪化合物作为活性成分，用于制备治疗或预防各种脱髓鞘疾病的药物组合物。

上述的药物组合物，其组成含有治疗有效量的苄噻嗪化合物，所说的苄噻嗪化合物在药物组合物当中可以是单独使用，也可以与其他药物配合使用。其中所述药物组合物的单剂量含活性成分苄噻嗪化合物在药物组合物中的有效含量为1-95％。本发明的药用组合物中的活性成分的实际剂量水平可以进行改变从而获得能够对于具体患者、组合物以及给药模式而言有效达到需要的治疗响应的一定量的活性化合物。选定的剂量水平取决于具体化合物的活性、给药途径、待治疗疾病的严重程度以及待治疗患者的情况和前病史。然而，本领域的技术人员可以从较低的剂量开始给药，该剂量低于达到理想治疗效果所需要的剂量，然后逐渐增加剂量直到获得理想疗效。

上述的药物组合物除了含有治疗有效量的苄噻嗪或其药学可接受的其他存在形式的化合物之外，还含有药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等；填充剂如淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙、碳酸氢钠等；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇等；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、聚乙二醇等，另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

上述药物组合物是药剂学上所说的任何一种剂型，包括片剂、胶囊剂、软胶囊、凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、静脉乳剂、脂质体注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、颗粒剂、口服液和注射剂。

本发明化合物通常可以通过口服、静脉内、皮下、颊内、直肠、皮肤、鼻内、气管、支气管给药，可以通过任何其它胃肠外途径给药，也可以例如通过口服或者鼻腔喷雾或通过吸入给药。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，然后将其制成所需的剂型。

本发明化合物可以用于治疗各种脱髓鞘疾病，包括影响中枢神经系统和周围神经系统的疾病。比如：脱髓鞘疾病包括：多发性硬化症、视神经炎、特发性炎性脱髓鞘疾病、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、横贯性脊髓炎、巴洛同心性硬化、恶性贫血、脑桥中部髓鞘溶解、脊髓痨、视神经脊髓炎、进行性多灶性白质脑病、抗MAG神经病、遗传性运动和感觉神经病、脑腱黄瘤病、以及脑白质营养不良，包括肾上腺脑白质营养不良、肾上腺脊髓神经病、卡纳万病、消失性白质病、亚历山大病、雷夫叙姆病及佩利措伊斯-梅茨巴赫病、异染性脑白质营养不良、球样细胞性脑白质营养不良。

优选地所述脱髓鞘疾病为急性或慢性脱髓鞘神经病或者格林-巴利综合征。

术语“治疗”包括改善脱髓鞘疾病的一或多种症状的治疗，或者延缓此类疾病进程的治疗，例如预防或延缓脱髓鞘；它也包括治愈此类疾病的治疗，使得患者进入正常功能状态和/或将患者维持在正常功能状态或者延长复发时间，减少髓鞘脱失。

化合物的治疗用途可以包括预防用途，预防、控制或减轻患者脱髓鞘疾病发作的严重程度，还包括控制或减轻已存在疾病的严重性的治疗。化合物可以在症状发作之前给药，也可以在症状发作之后给药。可以给药于可能具有脱髓鞘疾病发作风险的患者。

本发明人通过苄噻嗪化合物的NF-κB抑制作用的研究中，发现苄噻嗪具有极强的NF-κB抑制活性，对苄噻嗪进行了动物药效实验，结果发现其表现出了抑制炎症，能够有效保护髓鞘脱失的作用。治疗有效量的苄噻嗪可以减轻炎症、减少脱髓鞘、减少轴突丢失和/或减少神经元丢失。

因此苄噻嗪化合物可开发为预防或治疗脱髓鞘疾病的药物，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是苄噻嗪基于报告基因靶向NF-κB信号通路的抑制作用。

图1中1为空白对照组，2为模型组，3为阳性药物对照组，4、5、6、为苄噻嗪组(浓度分别为0.1、1、10μm/L)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图2是苄噻嗪对大鼠淋巴结MNC的增殖实验的影响。

图2中1为正常对照组，2为EAN组，3为苄噻嗪组，*P<0.05，**P<0.01***。

图3是苄噻嗪对实验性自身免疫性神经炎模型中细胞因子TNF-α、IFN-γ及IL-17水平的影响图。

图3中■为正常对照组，为EAN组，为苄噻嗪组，*P<0.05，**P<0.01。

图4是苄噻嗪对实验性自身免疫性神经炎模型中坐骨神经病理切片的影响。

图4中A为正常对照组，B为EAN组，C为苄噻嗪组。

图5是CPZ介导的急性髓鞘脱失动物模型组MBP髓鞘标志蛋白含量随时间的变化。*P<0.05，**P<0.01。

图6是苄噻嗪对CPZ介导的急性髓鞘脱失动物模型组PLP和CNPase两种髓鞘标志蛋白含量随时间的变化。*P<0.05，**P<0.01。

图7是苄噻嗪对CPZ介导的急性髓鞘脱失动物模型的GST-pi标记和BDNF表达的影响。

图7中1为正常组，2为CPZ模型组，3为25mg/kg苄噻嗪组，4为50mg/kg苄噻嗪组，*P<0.05，**P<0.01。

图8是苄噻嗪对CPZ介导的急性髓鞘脱失动物模型的髓鞘碱性蛋白(MBP)的影响。

图8中1为正常对照组，2为CPZ模型组，3为25mg/kg苄噻嗪组，4为50mg/kg苄噻嗪组，*P<0.05，**P<0.01。

具体实施方式

本发明公开了一种化合物在制备治疗脱髓鞘疾病的药物中的应用，下文将以具体实施方式的形式阐述本发明。应理解，这些具体实施例仅仅是阐述性的，而非限制性的。在不偏离本发明精神和范围的情况下，可对本发明做出适当的修改和变动。这些修改和变动都在本发明的范围之内。实验中使用的各种试剂都可从市场上购得，其用量除非另有说明否则按照常规的量使用。

实施例1：苄噻嗪化合物基于报告基因靶向NF-κB信号通路的抑制作用

将生长于对数期的NF-κB-RE-Luci 293细胞株(北京英茂盛业生物公司)吹打，一个小瓶的细胞调整细胞悬液以1:3的比例接种96孔细胞培养板，每孔200μL。置37℃，5％CO2培养箱培养24h后，每孔弃100μL培养基。空白组不加TNF-α(金斯瑞公司)，加100μL与实验组同DMSO比例的PBS；炎症模型组每孔加50μL与实验组相同DMSO比例的PBS和50μL1000ng/mL的TNF-α刺激；阳性对照组每孔加50μLPDTC溶液(碧云天公司)50μL 200ng/mL的TNF-α刺激；实验组每孔加上不同浓度的药物溶液和50μL200ng/mL的TNF-α溶液(注：TNF-α溶液在加入药物之后1h后加入)。继续培养24h后，吸出各孔培养液，轻轻加入25μL PBS，置-80℃裂解至少30min。取出培养板室温融化，每孔加入底物Steady-Reagent(Promega公司)25μL，避光裂解至少20min。取反应液40μL至384孔白色酶标板，用酶标仪检测化学发光值(RLU)，此值代表各检测样品中荧光素酶的表达水平，从而间接反映NF-κB的活化水平。

药物处理后结果显示，苄噻嗪(上海蓝木化工)在浓度为0.1、1、10μm/L时有明显的NF-κB抑制活性，且成剂量效应关系。

实施例2：苄噻嗪对实验性自身免疫性神经炎(EAN)大鼠模型模型的影响

将健康雄性Lewis大鼠(南方医科大学实验动物中心)雄性，体重220g-280g，随机分为3组，正常对照组、EAN组和苄噻嗪组每组10只，大鼠尾根部皮下注射200μL P257-81多肽与弗氏完全佐剂(MPbio公司)的混合乳液，隔天称重，观察发病情况。苄噻嗪组从免疫0天开始腹腔注射200μL苄噻嗪，5mg/kg，隔日一次，正常对照组给予相同体积的PBS。按发病程度分为0～10级，0级：无异常；1级：尾部张力降低，尾尖上翘；2级：尾瘫，翻正反射部分缺失；3级：翻正反射缺失；4级：步态失调、姿态异常；5级：后肢轻瘫；6级：中度瘫痪；7级：后肢严重瘫痪；8级：四肢瘫痪；9级：濒死；10级：死亡。

CCK8法测定体外淋巴细胞增殖:致敏第16天，实验组每组随机选5只大鼠，进行淋巴结单个核细胞(MNC)分离，将大鼠淋巴细胞悬液(2xl0⁶/ml),接种到96孔培养板中,每孔200μL，每个样本每3孔，分别加入10μLRPMI1640培养液、5μg/mLConA培养72h，向每孔中加入10μLCCK8(购自Sigma)，将培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养4小时后，酶标仪(购自赛默飞世尔公司)测450nm OD值。

致敏第16天淋巴结MNC(2×10⁶/mL)培养56h后，取培养液上清，采用ELISA法，进行TNF-α、IFN-γ及IL-17含量测定。

致敏第16天处死大鼠，取双侧坐骨神经，进行坐骨神经病理切片，苏木素-伊红(HE)染色，用图像分析系统测定切片上神经组织的面积和炎性细胞数目。

实验结果:

正常对照组无大鼠发病；EAN组大鼠第8天开始发病，第16天左右瘫痪达高峰，第18天后逐渐缓解；苄噻嗪组致敏后第9天开始发病，第19天左右瘫痪达高峰，第21天后逐渐缓解。

致敏第16天大鼠淋巴结MNC对不同抗原刺激的增殖实验结果，与EAN组比较，苄噻嗪组能明显抑制ConA诱导的单个核细胞增殖。

致敏第16天淋巴结MNC培养56h后，培养液上清中TNF-α、IFN-γ、IL-17水平，苄噻嗪组显著低于EAN组。

坐骨神经病理检查结果：致敏第16天正常对照组正常，苄噻嗪组大鼠坐骨神经炎性细胞浸润数目显著低于EAN组(P＜0.01)。

实验结果表明，苄噻嗪可减轻坐骨神经的损伤，减少炎性细胞浸润和髓鞘脱失情况，能够减轻EAN周围神经炎症，从而起到神经保护作用。

实施例3苄噻嗪对CPZ诱导的急性髓鞘脱失动物模型的实验

实验方法：

6-8周龄C57Bl/6雄性小鼠(南方医科大学实验动物中心)，体重约18-20g,SPF级，很据实验需要分为以下4组：①正常对照组：饲喂6周常规饲料并正常饮水；②模型组(记为CPZ组)：饲喂6周含0.2％铜离子螯合剂CPZ(Sigma公司)的饲料并正常饮水；③25mg/kg苄噻嗪组：饲喂6周含0.2％CPZ的饲料，正常饮水并在第3周末给予苄噻嗪(25mg/kg/只/天；④50mg/kg苄噻嗪组：饲喂6周含0.2％CPZ的饲料，正常饮水并在第3周末给予苄噻嗪50mg/kg/只/天；受试药物连续给药3周直至实验结束，正常对照组和模型组动物给予等体积溶剂。

实验结果：

1、CPZ介导的急性髓鞘脱失的模型组，每周采用含量半定量统计方法检测MBP、PLP、CNPase三种髓鞘标志蛋白含量随时间的变化。如图5和图6所示，动物饲喂含CPZ的饲料后小鼠脑内MBP、PLP和CNPase三种髓鞘标志蛋白含量随时间的变化显著下降，说明CPZ介导的急性髓鞘脱失动物模型中髓鞘髓鞘逐渐脱失。

2、饲喂6周后，检测各组对CPZ介导的急性髓鞘脱失动物模型的脑源性神经营养因子(BDNF)表达、成熟少突胶质细胞(GST-pi标记)、髓鞘碱性蛋白(MBP)的影响。如图7和图8所示。

MBP为髓鞘碱性蛋白，是髓鞘的主要组成成分，髓鞘碱性蛋白(MBP)平均面积半定量统计结果显示，饲喂含CPZ饲料6周后模型组动物髓鞘脂质脱失严重，苄噻嗪组具有保护髓鞘脱失的作用。

成熟少突胶质细胞(OLs)(GST-pi标记)是中枢神经系统的髓鞘生成细胞,均能降低髓鞘脱失部位少突胶质细胞前体细胞的数量，增加成熟少突胶质细胞数量，模型组与正常对照组相比，GST-pi阳性细胞数显著降低，给予不同剂量的苄噻嗪组皆可增加GST-pi阳性细胞数，**P<0.01。苄噻嗪组与对增加单位面积内GST-pi的阳性细胞数具有剂量依赖性。说明苄噻嗪具有促进少突胶质细胞前体细胞向成熟少突胶质细胞分化的潜能。

BDNF是脑内一种重要的神经营养因子，为髓鞘的形成提供营养支持。增加BDNF的表达可以为脱失的髓鞘提供营养支撑从而对抗或者逆转由CPZ引起的髓鞘脱失，结果显示苄噻嗪组能够显著上调急性期脑内BDNF的表达，**P<0.01。

实验结论：

苄噻嗪在CPZ诱导的急性髓鞘脱失动物模型中，能够促进髓鞘脱失部位OLs(GST-pi标记)的表达、以及上调神经营养因子BDNF的表达，说明苄噻嗪对CPZ介导的急性髓鞘脱失具有显著的对抗和缓解作用。

由上可知，通过以上实施例的实验结果表明，苄噻嗪具有较强的NF-κB抑制作用，能够较轻神经炎症和髓鞘脱失情况，从而起到神经保护作用。因此可以证实，苄噻嗪可用于制备预防或治疗脱髓鞘疾病的药物。

Claims (10)

1.一种用于治疗脱髓鞘疾病的化合物及其药物组合物，其特征在于，所述化合物的结构式如下：

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物为苄噻嗪。

3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物可以以苄噻嗪不同形式存在，包括游离酸或游离碱或酯或其它前药、盐或互变异构体。

4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物为治疗由脱髓鞘、髓鞘形成不足或髓磷脂鞘发育不全引起的脱髓鞘疾病的化合物。

5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中所述脱髓鞘疾病包括：多发性硬化症、视神经炎、特发性炎性脱髓鞘疾病、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、横贯性脊髓炎、巴洛同心性硬化、恶性贫血、脑桥中部髓鞘溶解、脊髓痨、视神经脊髓炎、进行性多灶性白质脑病、抗MAG神经病、遗传性运动和感觉神经病、脑腱黄瘤病、以及脑白质营养不良，包括肾上腺脑白质营养不良、肾上腺脊髓神经病、卡纳万病、消失性白质病、亚历山大病、雷夫叙姆病及佩利措伊斯-梅茨巴赫病、异染性脑白质营养不良、球样细胞性脑白质营养不良。

6.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中所述脱髓鞘疾病优选为急慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病或格林-巴利综合征。

7.一种用于治疗脱髓鞘疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为由苄噻嗪或其药学上可接受的其他存在形式的化合物作为活性成分，以及与药学上可以接受的载体制成的药物组合物。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括一种或多种药学上或食品学上可接受的稀释剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、调节剂以及其他辅料。

9.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物剂型为片剂、包衣片剂、胶囊、颗粒剂、口服液和注射剂。

10.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的单剂量含活性成分苄噻嗪或其药学可接受的其他存在形式的化合物在药物组合物中的有效含量为1-95％。