CN107709341A - 新的脑膜炎奈瑟氏菌血清组y寡聚体及其合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的新的寡聚体(Men‑Y寡聚体)及用于合成新的Men‑Y寡聚体的方法。特别是，本发明涉及Men‑Y荚膜多糖重复单元的四聚体的化学合成，其能够用作开发针对脑膜炎球菌血清组Y细菌感染的半合成和合成的缀合疫苗的候选物。

Description

新的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y寡聚体及其合成方法

技术领域

本发明涉及脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的新的寡聚体(以下称为Men-Y寡聚体)。本发明还涉及用于合成新的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y寡聚体的方法。更特别而言，本发明涉及能够用作开发针对脑膜炎球菌血清组Y细菌感染的半合成和合成的缀合疫苗的候选物的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y的四聚体(以下称为Men-Y四聚体)的化学合成。

背景技术

细菌性脑膜炎每年导致大约17万人的死亡，发达国家至少有5-10％的病例病死率，发展中国家有20％的病例病死率。肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌(Hib)和脑膜炎奈瑟氏菌是世界范围内大部分细菌性脑膜炎病例的原因。然而，尽管有现代抗生素，脑膜炎奈瑟氏菌仍然是细菌性脑膜炎和其他侵入性细菌感染的主要原因。

脑膜炎球菌疾病是需要立即诊断和治疗的医疗急症。

目前已经鉴定出脑膜炎奈瑟氏菌的总共13种不同的血清组，即A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y和Z，但约90％的感染是由血清组A、B、C、Y和W135引起。

以下类型的疫苗可用于脑膜炎球菌感染：

·用于预防该疾病超过30年的多糖疫苗。脑膜炎球菌多糖疫苗可以以控制该疾病的各种组合，例如，二价(组A和C)、三价(组A、C和W)或四价(组A、C、Y和W)形式获得。

·自从1999年以来，已经有针对组C的脑膜炎球菌缀合疫苗。四价的A、C、Y和W缀合疫苗被广泛使用，自2005年以来已被批准用于包括加拿大、美国、欧洲和印度在内的世界各地的儿童和成人。血清组的其他组合也可以以批准的缀合疫苗获得。除单价的组A缀合疫苗外，目前可得的脑膜炎球菌缀合疫苗由于其成本高昂，对资源贫乏国家的贫困人群来说是无法接触的。

目前，可用于Men-Y的疫苗利用从细菌来源分离的多糖，这些多糖与如处理活细菌培养物的危险性等各种风险相关。此外，通常分离的细菌多糖是异质的，以至于不能通过期望的同质性标准。细菌多糖的异质性导致了使用它制备的缀合物的异质性，进而导致差异性大，因此导致缀合物批次的不合格。

在过去的十年中，人们越来越关注包括荚膜寡糖的类似物的细菌抗原的有机合成。鉴于现有技术，含有合成Men-Y寡糖的脑膜炎球菌缀合疫苗比常规疫苗更有优势。合成抗原大小均匀且表征充分，这降低了所产生的缀合物的异质性，并且最终缀合物中批次间变化较小。合成抗原的主要优点之一是可以用所需的接头进行工程化，用于简化缀合以及获得更好的产量。

目前还没有公开Men-Y有机合成的生产和纯化程序的现有技术。国际专利申请PCT/US2013/042428号“Multivalent meningococcal conjugates and methods forprepari ng conjugates”涉及免疫原性缀合物，其包括与奈瑟氏菌表面蛋白缀合的至少一种多糖或蛋白质，其可以引发针对来自组A、C、W-135和Y的脑膜炎球菌多糖(PS)的免疫应答。所述国际专利申请仅公开了Men Y寡聚体制备的一般描述，但是没有能够公开Men-Y寡聚体的制备。此外，可用于脑膜炎奈瑟氏菌的其他血清组的现有技术要么耗时，要么产生不同大小的寡聚体的混合物。

发明目的

本发明的主要目的在于提供脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的新的寡聚体。

本发明的另一个目的在于提供在针对脑膜炎球菌细菌感染的合成和半合成缀合疫苗开发中能够用作候选物的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的新的寡聚体。

本发明的另一个目的在于提供在针对脑膜炎球菌血清组Y细菌感染的半合成或完全合成疫苗的开发中能够用作候选物的新的Men-Y四聚体。

本发明的另一个目的在于提供使用具有特定链长的纯化糖合成Men-Y寡聚体的化学方法。

本发明的另一个目的在于提供能够产生免疫原性缀合疫苗的具有改善抗原性的Men-Y寡聚体的化学合成方法。

本发明的另一个目的在于提供一种制备满足纯度的物理化学品质标准的合成Men-Y荚膜寡聚体的方法。

本发明的另一个目的在于提供与载体蛋白缀合时具有增加的效力和改善的保存期限的具有成本效益的Men-Y寡聚体。

发明内容

因此，本发明公开了脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y寡聚体及获得其的合成方法。所述Men-Y寡聚体能够在缀合至合适的载体蛋白后用作针对脑膜炎球菌血清组Y细菌感染的半合成和合成缀合疫苗开发的候选物。所述疫苗可以通过胃肠外途径施用。

本发明的Men-Y寡聚体具有改善的抗原性和改善的保质期。所述Men-Y寡聚体也符合纯度的物理化学质量标准并且具有成本效益。

本发明的方法公开了Men-Y寡聚体的合成，Men-Y寡聚体包含两种主要构成单元：起始单元和增长单元。起始单元通过另一种适当保护的单糖对适当保护的单糖(更特别是但不限于神经氨酸)的糖苷化来制备。所述另一种适当保护的单糖选自己糖，更特别是但不限于葡萄糖。增长单元通过另一种适当保护的单糖(更特别是己糖，更特别是但不限于葡萄糖)对适当保护的单糖(更特别是但不限于神经氨酸)的糖苷化来制备。

使用催化剂在预定的温度将起始单元和增长单元连接在一起以提供四糖或二聚体单元。所述连接中使用的催化剂是糖化试剂/路易斯酸催化剂，其选自但不限于N-碘代丁二酰亚胺(NIS)、三氟甲磺酸(TfOH)、三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(TMSOTf)、三氟甲磺酸银(CF₃SO₃Ag)。二聚体单元与诸如但不限于甲醇钠等碱性试剂反应以促进开环。如此获得的二聚体单元再次与增长单元反应，以形成三聚体。三聚体在相似条件下进行迭代反应，以得到被保护的高级寡聚体(Y)，其包括四聚体、五聚体、六聚体、七聚体等。

使如此获得的被保护的高级寡聚体依次进行保护基团的脱保护，得到Men-Y高级寡聚体。

如此获得的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y的高级寡聚体具有改善的产率、高功效并且能够用作开发针对由Men-Y感染引起的疾病的缀合疫苗的候选物。

所有用于使用新方法合成Men-Y寡聚体的说明性步骤获得四聚体的更好产率，图8中显示纯度>95％，并且图9中显示抗原性增强。

附图说明

图1描绘了Men-Y四聚体(化合物26)的¹H-NMR；

图2描绘了Men-Y四聚体的¹³C-NMR；

图3描绘了Men-Y四聚体的COSY NMR谱；

图4描绘了Men-Y四聚体的HMBC NMR谱；

图5描绘了Men-Y四聚体的HSQC NMR谱；

图6描绘了Men-Y四聚体的TOCSY NMR谱；

图7描绘了Men-Y四聚体的DEPT NMR谱；

图8描绘了用于Men-Y四聚体纯度的HPSEC分析；

图9描绘了通过针对抗Men-Y多克隆血清的抑制ELISA对Men-Y四聚体和Men-Y四聚体-破伤风类毒素(TT)缀合物的抗原性分析。

特别实施方式

因此，本发明涉及新型Men-Y寡聚体。本发明还涉及合成新型Men-Y寡聚体的方法。更特别而言，本发明涉及能够用作针对脑膜炎球菌细菌感染的半合成和合成疫苗开发的候选物的Men-Y四聚体的化学合成。所述疫苗可以以合适的施用模式施用，更特别而言，通过胃肠外途径施用。所述合成在以下步骤中完成：

步骤1：增长单元(方案I所示的化合物18)的合成；

步骤2：起始单元(方案II所示的化合物20)的合成；

步骤3：高级寡聚体(方案III所示的化合物21、22、23、24、25、d26)的合成。

在描述本发明的优选实施方式之前，应当理解的是，本发明不限于所描述的特别材料，因为它们可以变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅以描述特定实施方式为目的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。

必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。

在所述方法的一个非限制性实例中，作为化合物1的N-乙酰基神经氨酸在诸如Dowex 50W X8(H⁺)树脂等催化剂的存在下发生甲基化，得到化合物2。如此获得的化合物2在吡啶的存在下在诸如乙酸酐等酰化剂的存在下进行酰化，得到化合物3。该方法有助于屏蔽羟基。

如此获得的化合物3在诸如乙酰氯和HCl等卤化剂的存在下进行选择性卤化(更特别是氯化)，得到化合物4。化合物4在也被称为Hunig碱的DIPEA(弱亲核试剂)的存在下与诸如对甲苯基硫醇(TolSH)等硫醇化试剂反应而得到第二位连接有-Stol基团的化合物5。如此获得的化合物5在MeOH、甲磺酸(MsOH)的存在下进行脱酰，得到化合物6。如此获得的化合物6在MeCN/H₂O的存在下与诸如三光气、NaHCO₃等羰基化试剂反应并进行噁唑烷酮环的形成，得到化合物7。如此获得的化合物7在诸如叔丁基二苯基甲硅烷基氯化物TBDPSCl/DMF等保护试剂的存在下对末端存在的羟基进行保护，然后使用2,2-DMP用于丙酮化合物保护，然后使用AcCl进行酰化，得到化合物8。如此获得的化合物8在NIS、TfOH、DCM的存在下与诸如磷酸二丁酯(Bu₂PO₄H)等反应试剂反应，以获得在末端位置的磷酸根离去基团，这提高了作为化合物9的α选择性。

商业购买的化合物10β-D-葡萄糖五乙酸酯与硫代甲酚和(催化剂)DCM(溶剂)中的BF3:OEt₂反应以保护α位，获得化合物11。化合物11MeOH中在MeONa的存在下进行脱乙酰基反应，得到化合物12。如此获得的化合物12与诸如叔丁基二苯基甲硅烷基氯(TBDPS-Cl)等甲硅烷基保护基反应，从而保护化合物12的第6位的-OH基，得到产率为80％的化合物13。如此得到的化合物13进行烷基化并用苄基化保护特定位置，反应在0℃至室温得到产率为76％的化合物14。

上述方法是已知的方法。

然后通过使化合物14与诸如四氢呋喃(THF)中的四正丁基氟化铵(TBAF)等脱保护试剂反应，恢复化合物14的一个被保护的羟基，从而得到产率范围为85％至95％的化合物15。化合物14作为增长单元18的合成中的中间体。

如此获得的剩余量的化合物14与5-叠氮基己醇进行糖苷化，得到化合物16。如此获得的化合物16的产率在65％至75％的范围内，更特别是70％。使化合物16受到如THF溶剂中的TBAF等甲硅烷基脱保护试剂处理，导致除去空间上阻碍的-OTBDPS基团，得到化合物17。上述反应得到化合物17，总体上α:β比率增加(95:5)，且反应产率在55％至65％的范围内，更特别是60％。如此获得的化合物17用作起始单元20合成中的中间体。

然后化合物9的一部分在诸如TMSOTf等催化剂的存在下在低温下，更特别而言在-80℃至-60℃范围内，与化合物15反应以产生增长单元(化合物18)。

然后化合物9的其余部分在诸如TMSOTf等催化剂的存在下在低温下，更特别而言在-80℃至-60℃范围内与化合物17反应，得到化合物19。

如此获得的化合物19在甲醇(MeOH)/二氯甲烷(DCM)的存在下与诸如NaOMe等碱性试剂反应，得到起始单元(化合物20)。

使用催化剂，起始单元(20)和增长单元(18)在低温下，更特别是在-50℃至-30℃范围内连接在一起，以提供四糖或二聚体单元(21)。用于所述连接的催化剂是但不限于，在溶剂存在下的NIS/TfOH/三氟甲烷磺酸三甲基甲硅烷基酯(TMSOTf)/三氟甲磺酸银(CF₃SO₃Ag)。催化剂活化化合物18的甲苯基硫(thiotolyl，Stol)基团。活化后易于去除，然后Stol基团被起始单元(20)的游离羟基取代。

二聚体单元(21)与诸如但不限于甲醇钠等碱性试剂反应，以便于开环而形成受保护的二聚体单元(22)。此后，如此获得的二聚体在所述催化剂和所述碱性试剂的存在下在类似的条件下进行迭代反应，得到包括三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、24、26、28...n)等高级合成寡聚体。

如此获得的二聚体单元(22)再次与增长单元在类似的温度和大气压条件下反应，导致形成三聚体(23、24)。如此获得的三聚体再次在相似条件下与增长单元反应以获得四聚体单元(25)。四聚体在类似的条件下经历迭代反应以获得包括四聚体、五聚体、六聚体、七聚体等的高级寡聚体(Y)。

如此获得的高级寡聚体在诸如BF₃:OEt₂ACN、NaOH、MeOH、H₂/Pd(OH)₂等脱保护试剂的存在下进行保护基团的最终脱保护。在脱保护试剂存在下，保护基团的顺序脱保护产生脱保护的Men-Y高级寡聚物(d22、d24、d26、d28...dn)。

所述方法所需的总时间在330小时至400小时的范围内，更特别为370小时，导致显着较低的生产成本。

如此获得的高级寡聚体通过内置连接物缀合而与载体蛋白连接，获得针对脑膜炎球菌血清组Y细菌感染的半合成缀合物疫苗。这种化学合成方法也可以用于制备合成蛋白质/肽以制备完全合成的缀合物疫苗。应注意到与载体蛋白的这种缀合产生具有良好产率和增强的抗原性的疫苗。

在一个实施方式中，通过进行抑制酶联免疫吸附测定(抑制ELISA)测试Men-Y四聚体的抗原性，发现四聚体及其与破伤风类毒素的缀合物可中和针对Men-Y荚膜多糖的特异性抗体。

MenY四聚体合成的完整方案：

方案I：增长单元18的合成

磷酸唾液酸供体的合成：

葡萄糖受体15&17的合成

方案II：起始单元20的合成

方案III：二聚体、三聚体和四聚体的合成

二聚体、三聚体和四聚体单元的合成

如下通过非限制性实施例来阐释以上方法的详细描述：

实施例：

实施例1：步骤1-化合物2的制备

过程：向N-乙酰基神经氨酸(2.0kg，6.472mol)在甲醇(32L)中的搅拌溶液加入Dowex 50W X8树脂。反应在室温下搅拌24小时。通过TLC(20％甲醇；DCM)监测反应。完成后，过滤反应混合物，用甲醇(2升)洗涤树脂。浓缩滤液，得到作为白色固体的所需产物(2.0kg；95％)。

实施例2：步骤2-化合物3的制备

过程：在0℃向化合物2(1kg，3.095mol)在吡啶(10升)中的机械搅拌溶液加入DMAP(38g，0.0309mol)，然后加入乙酸酐(11.7升)。反应在室温下搅拌24小时。完成后，将反应混合物真空浓缩(10毫巴)。通过硅胶(230目至400目)上的快速柱色谱纯化粗化合物，用30％乙酸乙酯-己烷至100％乙酸乙酯洗脱。获得作为白色泡沫状固体的化合物-3(1.4kg；87％)。

实施例3：步骤3-化合物4的制备

过程：将化合物-3(1.4kg，2.626mol)在乙酰氯(7.5升)中的搅拌溶液冷却至0℃；并加入新鲜制备的HCl在乙酰氯中的溶液(4.5升)。将所得反应混合物温热至室温并搅拌16小时。完成后，将反应混合物减压浓缩。获得的化合物与甲苯(2×2.5升)共蒸馏，并将粗产物送入下一步骤(1.4kg，99％)。

实施例4：步骤4：化合物5的制备

过程：向化合物-4(1.35kg，2.652mol)在DCM(13.5升)中的机械搅拌溶液中加入对甲苯硫酚(324g，2.652mol)。将该溶液冷却至0℃，在氮气气氛下，用滴液漏斗以30分钟缓慢加入二异丙基乙胺(548ml，3.135mol)。将所得反应混合物温热至室温并搅拌18小时。完成后，通过TLC监测反应；将反应混合物冷却至0℃并用DCM(5.0升)稀释，用水(2×5升)洗涤。分离有机层，用盐水溶液洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩。获得的化合物用25％乙酸乙酯/石油醚处理。过滤得到的白色固体并干燥(900g，60％)。

实施例5：步骤5-化合物6的制备

过程：在0℃下向化合物-5(500g，0.8375mol)在甲醇(5.0L)中的搅拌溶液中缓慢加入甲磺酸(322g，3.35mol)。将得到的反应混合物加热回流36小时。将反应混合物冷却至0℃，用三乙胺(790.0ml)淬灭。将混合物浓缩并将残余物不经任何进一步纯化而用于下一步骤。LC MS纯度96％。(粗重：650g)。

实施例6：步骤6-化合物7的制备

过程：在室温下，将化合物-6溶于机械搅拌的乙腈(4.0升)、水(5.0升)和NaHCO₃(2.352kg，46.51mol)的混合物(1.8kg，4.651mol)中。将反应混合物用冰浴冷却至0℃，并在60分钟内滴加三光气(0.895kg，4.651mol)在乙腈(1.0升)中的溶液。将反应物在0℃再搅拌3小时。完成后，用10％HCl(3升)中和反应混合物。用乙酸乙酯(2×4.0升)萃取产物。有机层用水、盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并浓缩。粗化合物通过快速柱色谱纯化，用2-5％甲醇；DCM洗脱。得到作为灰白色固体的化合物-6(700g，2步共56％)。

实施例7：步骤7-化合物7A的制备

过程：向化合物-7(700g，1.694mol)在DMF(6.0升)中的搅拌溶液加入咪唑(288g，4.237mol)。在0℃缓慢加入叔丁基二苯基甲硅烷基氯(557g，2.033mol)10分钟。将反应温度升至室温并搅拌16小时。通过TLC监测反应的进程。完成后，用水稀释(10升)RM。用乙酸乙酯(2×4升)萃取产物。分离有机层，用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥并浓缩。通过硅胶快速柱色谱纯化产物，使用60％乙酸乙酯-己烷作为洗脱剂，得到灰白色固体(1000g，90％)。

实施例8：步骤8-化合物7B的制备

过程：向化合物7A(1050g，1.697mol)在2,2-二甲氧基丙烷(7升)中的搅拌溶液加入樟脑磺酸(470g，2.036mol)。将混合物在室温搅拌3小时。通过TLC监测反应进程。通过TLC完成后；将反应混合物用三乙胺(350mL；2.515mol)淬灭。将反应混合物浓缩。粗化合物通过硅胶快速柱色谱纯化。得到作为灰白色泡沫状固体的化合物-7B(1000g，92％)。

实施例9：步骤9-化合物8的制备

过程：向化合物7B(590g，0.8538mol)在DCM(5.0升)中的搅拌溶液加入二异丙基乙基胺(1500ml，8.538mol)。将溶液冷却至0℃，在氮气气氛下用滴液漏斗缓慢加入乙酰氯(490ml，6.83mol)10分钟。将所得反应混合物温热至室温并搅拌18小时。完成后通过TLC监测反应；将反应混合物冷却至0℃，并用DCM(3升)稀释，用水(3升)洗涤。分离有机层，用盐水溶液洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩。产物在硅胶柱色谱上纯化；10-20％乙酸乙酯；己烷作为洗脱剂(产率：500g，80％)。

实施例10：步骤10-化合物9的制备

过程：在氮气气氛下，向化合物-8(100g，0.1364mol)和磷酸二丁酯(54mL；0.2728mol)在DCM(1升)中的搅拌混合物中加入4A°MS(在140℃的高真空下活化2小时；100g，wt/wt)。将混合物在室温下搅拌2小时，然后冷却至0℃，加入NIS(61.11g，0.2728mol)，接着加入三氟甲磺酸(3.62mL，0.0409mol)。反应温度在0℃保持5小时。通过TLC监测反应进程。完成后，将反应混合物用饱和的海波溶液(250ml)淬灭。经硅藻土过滤，提取。分离有机层，然后用水洗涤，使用Na₂SO₄干燥并浓缩。通过硅胶快速柱色谱纯化粗化合物。获得作为粘性材料的化合物-9(80.0g，70％)。

实施例11：步骤11-化合物11的制备

过程：在火焰干燥的烧瓶中，在氩气气氛下，在二氯甲烷(5升)中加入β-D-葡萄糖五乙酸酯10(500g，1.2816mol)、对甲苯硫酚(255g，2.050mol)和4A°分子筛粉末(500g)。将该溶液冷却至0℃，加入BF₃·Et₂O(49％；1000ml，3.5886mol)。将该混合物搅拌16小时。将反应混合物用二氯甲烷(2升)稀释，用碳酸氢钠(2×2.5L饱和水溶液)洗涤，然后用水(3升)洗涤。有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱纯化残余物，得到作为白色固体的化合物-11(417g，72％)。

实施例12：步骤12-化合物12的制备

过程：在火焰干燥的RB烧瓶中，在氩气气氛下，将化合物11(417g，0.9182mol)溶于甲醇(4.0升)中。加入甲醇钠在甲醇中的溶液(39.6ml的25％溶液)，并将所得混合物搅拌2小时。完成后，分批加入安伯来特IR-120⁺离子交换树脂，直至溶液变成中性。将反应混合物过滤以除去树脂，将滤液真空浓缩，得到作为白色结晶固体的化合物12(254g，95％)。

实施例13：步骤13-化合物13的制备

过程：向化合物-12(200g，0.402mol)在DMF(2.0升)中的搅拌溶液加入咪唑(114g，1.678mol)。在0℃向上述溶液中缓慢加入叔丁基二苯基甲硅烷基氯(269g，0.979mol)10分钟。将反应温度升至室温并搅拌16小时。通过TLC监测反应的进程。完成后，将反应混合物用水(4升)稀释。产物用乙酸乙酯(2×1升)萃取。分离有机层，用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥并浓缩。通过硅胶快速柱色谱纯化产物，使用60％乙酸乙酯-己烷作为洗脱液，得到灰白色固体(260g，72％)。

实施例14：步骤14-化合物14的制备

过程：将化合物13(260g，0.4962mol)和苄基溴(273ml，2.2328mol)在DMF(2.5升)中的搅拌混合物冷却至0℃，在0℃分批加入氢化钠(99g，2.480mol)。将RM在室温下搅拌16小时。TLC显示SM消耗，然后用冰冷的水(4升)淬灭RM，并用乙酸乙酯(2×1升)萃取。分离有机层并减压浓缩。将粗化合物通过快速柱色谱纯化，产物用5％乙酸乙酯-己烷洗脱，得到作为无色液体的化合物14(300g，76％产率)。

实施例15：步骤15-化合物15的制备

过程：将化合物14(145g，0.1826mol)溶于THF(1.4升)中，冷却至0℃，加入1M THF中的TBAF(219mL，0.2191mol)。除去冷却浴并将反应混合物在室温下搅拌16小时。通过TLC监测反应，完成后，用水稀释反应，用乙酸乙酯(2×500ml)萃取。有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗产物通过FCC纯化，用20％EtOAc/己烷洗脱。得到作为粘稠液体的化合物(90g，89％)。

实施例16：步骤16-化合物16的制备

过程：在氮气气氛下，向化合物-14(50g，0.0629mol)和6-叠氮基己醇(18g；0.1259mol)在二乙醚(500ml)中的搅拌混合物中加入4A°MS(在140℃高真空下2小时；50g，wt/wt)。将混合物在室温下搅拌2小时，然后冷却至-40℃。加入NIS(28.2g，0.1259mol)，然后加入三氟甲磺酸(2.8ml，0.0314mol)并继续搅拌2小时。通过TLC完成后，通过加入饱和海波溶液(100ml)淬灭反应混合物。反应混合物通过硅藻土过滤，滤液转移到分液漏斗中。分离有机层，用水洗涤，用Na₂SO₄干燥并浓缩。粗化合物通过快速柱色谱纯化，用10％乙酸乙酯和己烷洗脱。获得作为粘性材料的端基异构体混合物的化合物-16(35g，70％)。

实施例17：步骤17-化合物17的制备

过程：将化合物16(100g，0.123mol)溶于THF(1升)中，冷却至0℃，加入1M的THF中的TBAF(148mL，0.1476mol)。将冷却浴移出并在室温下搅拌16小时。通过TLC监测反应。完成后，用水稀释反应，用乙酸乙酯(2×500ml)萃取。有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗产物通过快速柱色谱纯化，用20％EtOAc/己烷洗脱。得到作为粘稠液体的化合物(55g，78％)。

实施例18：步骤18-化合物18的制备

过程：将化合物-15(43.3g，0.0778mol)和化合物-9(84g；0.1307mol)的混合物溶解于DCM(430ml)中，并加入MS 4A°(45g)。将反应混合物在室温搅拌2小时。然后冷却至-78℃，加入TMSOTf(15.58mL，0.0855mol)。反应保持在-78℃并搅拌1小时。完成后，通过TLC监测反应进程；将反应混合物用三乙胺(1.2当量)淬灭，通过硅藻土过滤。用饱和碳酸氢钠溶液(300mL)洗涤有机层，分离有机层并用水和盐水溶液洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗化合物通过快速柱色谱纯化；用30％乙酸乙酯和己烷洗脱，得到作为白色固体的化合物18(85g，93％)。

实施例19：步骤19-化合物19的制备

过程：向化合物-17(45g，0.0778mol)和化合物-9(85g；0.1037mol)在DCM(450mL)中的混合物中加入MS 4A°(45g)，将反应混合物在室温下搅拌2小时。然后冷却至-78℃，加入TMSOTf(15.66mL，0.0855mol)。在相同的温度下继续搅拌2小时。通过TLC监测反应进程；完成后，将使用三乙胺(1.2当量)淬灭反应混合物，通过硅藻土过滤。用饱和碳酸氢钠溶液(500mL)洗涤有机层，然后用水和盐水溶液洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗化合物通过快速柱色谱纯化；用30％乙酸乙酯和己烷洗脱，以提供作为白色泡沫状固体的化合物-19(80g，86％)。

实施例20：步骤20-化合物20的制备

过程：在氩气气氛下，将化合物-19(80g，0.0676mol)溶于甲醇(533mL)和DCM(267mL)中。加入甲醇钠在甲醇中的溶液(14.6mL，25％甲醇中的NaOMe)，将混合物在室温下搅拌1小时。反应完成后，分批加入离子交换树脂(IR 120+)直至溶液被中和。过滤反应混合物，浓缩滤液，通过快速柱色谱纯化粗产物(乙酸乙酯:石油醚＝2:1作为洗脱剂)，以提供作为白色泡沫状固体的化合物-20(55g，70％)。

实施例21：步骤21-化合物21的制备

过程：向化合物-18(53g，0.0453mol)和化合物-20(35g；0.0302mol)在乙醚(350mL)中的搅拌溶液中加入4A°分子筛(35g)并在室温下搅拌2小时。将该混合物冷却至0℃。向该混合物中一次性加入NIS(13.54g，9.030mmol)，然后加入三氟甲磺酸(1.34mL，0.0151mol)。将反应温度升至室温并保持16小时。通过TLC监测反应进程。完成后，使用饱和硫代硫酸钠溶液(250ml)淬灭反应混合物，用乙酸乙酯(300ml)稀释。经硅藻土过滤，分离有机层。将有机层用水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗化合物通过快速柱色谱纯化，用30％乙酸乙酯和己烷洗脱，获得作为白色固体的化合物-21(32g，48％)。

实施例22：步骤22-化合物22的制备

过程：在火焰干燥的烧瓶中，在氩气气氛下，将化合物-21(10g，4.5454mmol)溶于甲醇(65mL)和DCM(35mL)中。加入甲醇钠在甲醇中的溶液(0.982mL的25％的甲醇中的溶液)，并将混合物在室温下搅拌1小时。反应完成后，使用分批加入的安伯来特IR 120淬灭的反应混合物，直至溶液被中和。过滤反应混合物，浓缩滤液并通过快速柱色谱纯化(乙酸乙酯:石油醚＝2:1-3:1作为洗脱剂)，以提供作为白色泡沫状固体的化合物-22(6.1g，62％)。

实施例23：步骤23-化合物23的制备

过程：向化合物-22(15g，6.899mmol)和化合物-18(12g；10.349mmol)在无水乙醚(150mL)中的搅拌溶液中加入4A°分子筛(15g)，在室温下搅拌混合物2小时。将该混合物冷却至0℃。向该混合物中加入NIS(3.1g，13.790mmol)，然后加入三氟甲磺酸(0.306ml，3.450mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌16小时。通过TLC完成后，加入饱和硫代硫酸钠溶液(150ml)淬灭反应混合物。将反应混合物通过硅藻土过滤，将滤液有机层用水和盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗化合物通过快速柱色谱纯化，用50％乙酸乙酯和己烷洗脱。得到作为白色泡沫状固体的化合物-23(12g，41％)。

实施例24：步骤24-化合物24的制备

过程：在火焰干燥的烧瓶中，在氩气气氛下，将化合物23(12g，3.732mmol)溶于甲醇(80mL)和DCM(40mL)中。加入甲醇钠在甲醇中的溶液(0.806mL，25％)，并将混合物在0℃下搅拌1小时。通过TLC完成后，通过分批加入离子交换树脂(IR 120+)淬灭反应混合物，直至溶液被中和。将反应混合物过滤，浓缩，通过快速柱色谱(乙酸乙酯:石油醚＝2:1作为洗脱液)纯化粗产物，以提供作为白色泡沫状固体的化合物24(7g，60％)。

实施例25：步骤25-化合物25的制备

过程：向化合物-24(4.1g，1.4733mmol)和化合物-18(3.1g；2.6505mmol)在乙醚(40mL)中的搅拌溶液中加入4A°分子筛(4.1g)并在室温下搅拌2小时。立即加入NIS(0.34g，1.5175mmol)，随后在室温下加入三氟甲磺酸(0.13mL，1.4733mmol)。在室温下继续搅拌60小时。通过TLC(35％乙酸乙酯；己烷)监测反应进程。完成后，使用饱和硫代硫酸钠溶液(40mL)淬灭反应混合物。经硅藻土过滤，分离有机层。将有机层用水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将粗化合物通过快速柱色谱纯化，用20-30％乙酸乙酯和己烷洗脱。得到作为白色固体的化合物-25(2.06g，38％)。

实施例26：步骤26-化合物25A的制备

过程：在氩气气氛下，将化合物-25(3g，0.7088mmol)溶于甲醇(624mL)和DCM(12mL)中。加入甲醇钠在甲醇中的溶液(0.184mL，25％)，并将混合物在室温下搅拌1小时。通过TLC完成后，使用离子交换树脂安伯来特IR 120淬灭反应混合物，直至溶液被中和。将混合物过滤并浓缩。通过快速柱色谱(乙酸乙酯:石油醚＝2:1)纯化粗产物，以提供作为白色固体的化合物-25A(1.7g，58％)。

实施例27：步骤27-化合物25B的制备

过程：将化合物25A(1.7g，0.4040mmol)溶于乙腈(45mL)中并冷却至0℃，加入45％BF₃:OEt₂(7.65mL，24.2453mmol)并继续搅拌3小时。将反应混合物用乙酸乙酯(100mL)稀释，用NaHCO₃饱和水溶液(80mL)洗涤，然后用盐水溶液洗涤。然后将有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。

用己烷洗涤残余物，将所得固体产物置于乙醇和水中。加入氢氧化锂(0.17g，4.0408mmol)并将反应在80℃下搅拌过夜。减压除去溶剂；将粗材料溶于水(20mL)中，用乙醚(20mL)洗涤并分离水层。使用1N HCl(0.4mL)溶液将水层的pH调节至5。产物用10％甲醇:DCM(2×60mL)萃取。有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩，得到化合物25B(0.8g；两步共80％)。

实施例28：步骤28-化合物d26的制备

过程：在250mL氢化烧瓶中将化合物-25B(0.8g，0.2638mmol)溶于甲醇(50mL)和水(12mL)的混合物中。在氮气气氛下加入20％Pd(OH)₂/C(0.8g)。用氢气吹扫烧瓶三次，然后将内容物在氢气氛(100psi)下搅拌24小时。完成后，将反应混合物通过硅藻土过滤并在25℃减压浓缩。产物通过Sephadex-G-10柱通过凝胶过滤纯化，用水洗脱。收集化合物级分并冻干以获得作为白色固体的Men-Y四聚体(d26)(350mg；70％)。

实施例29：Men-Y四聚体和Men-Y四聚体-破伤风类毒素(TT)缀合物的抗原性分析

过程：将ELISA板用细菌多糖包被，所述细菌多糖与针对抗-Men-Y细菌荚膜多糖产生的多克隆血清反应，使用不同浓度的Men-Y四聚体或使用硫醚化学制备的Men-Y四聚体-TT缀合物进行抑制或不进行抑制。如图9所示，当使用HRP标记的第二抗体进行显色时，与没有抗原的对照相比，以不同抗原浓度吸附血清稀释物后，Men-Y四聚体及其缀合物均中和Men-Y特异性IgG，这通过光密度的降低(％抑制)显而易见。

Claims (14)

1.一种脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的寡聚体的新型合成方法，所述方法包括以下步骤：

(a)合成增长单元(18)，

(b)合成起始单元(20)，

(c)在至少一种催化剂和至少一种碱性试剂的存在下，将所述起始单元(20)与所述增长单元(18)连接以合成高级寡聚体，

(d)在所述催化剂和所述碱性试剂的存在下进行步骤(c)的迭代反应以获得高级合成寡聚体(22、24、26、28….n)，

(e)使步骤(d)的所述高级合成寡聚体在至少一种脱保护试剂的存在下依次进行保护基团的脱保护，获得脱保护的Men-Y高级寡聚体(d22、d24、d26、d28....dn)，

使得所述方法以更高的产率和高纯度产生所述新的高级合成寡聚体。

2.如权利要求1所述的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的寡聚体的新型合成方法，其中，所述高级合成寡聚体(Y)是新的四聚体(d26)。

3.如权利要求2所述的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的寡聚体的新型合成方法，其中，合成所述四聚体所需的时间在330小时至400小时的范围内，更优选370小时。

4.如权利要求1所述的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的寡聚体的新型合成方法，其中，所述起始单元(20)通过以下步骤合成：

(a)通过已知方法，在催化剂的存在下使单糖化合物1进行甲基化获得化合物2，在酰基化剂的存在下使化合物2酰基化获得化合物3，在卤化剂的存在下使化合物3卤化获得化合物4，使化合物4与硫醇化试剂反应获得化合物5，使化合物5与脱酰基化试剂反应获得化合物6，使化合物6与羰基化试剂反应获得化合物7，使化合物7与保护试剂作用获得化合物8，使化合物8发生磷酸化反应获得化合物9，

(b)通过已知方法，使商业上购得的化合物10与受体和催化剂反应获得化合物11，使化合物11与脱乙酰化试剂作用获得化合物12，使化合物12与保护基团作用获得化合物13，使化合物13进行烷基化获得化合物14，

其中，使所述化合物14进行：

(c)在至少一种催化剂存在下，化合物14与醇发生糖苷化获得化合物16，

(d)使化合物16与至少一种脱保护试剂作用获得化合物17，

(e)在所述至少一种催化剂的存在下，使化合物17和化合物9反应获得化合物19，

(f)使化合物19与至少一种碱性试剂作用获得所述起始单元化合物20。

5.如权利要求1所述的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的寡聚体的新型合成方法，其中，所述增长单元(18)通过以下步骤合成：

(a)使化合物14与至少一种脱保护试剂作用获得化合物15，

(b)在所述至少一种催化剂的存在下，使所述化合物15与所述化合物9反应获得增长单元18。

6.如权利要求1、4和5所述的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的寡聚体的新型合成方法，其中，所述催化剂选自NIS、TfOH、TMSOTf。

7.如权利要求4所述的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的寡聚体的新型合成方法，其中，所述醇是6-叠氮己醇。

8.如权利要求1所述的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的寡聚体的新型合成方法，其中，所述脱保护试剂选自BF3:OEt₂、ACN、NaOH、MeOH、H₂/Pd(OH)₂。

9.如权利要求4所述的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的寡聚体的新型合成方法，其中，所述单糖是神经氨酸，更特别是N-乙酰神经氨酸。

10.如权利要求4和5所述的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的寡聚体的新型合成方法，其中，所述脱保护试剂选自TABF、THF、CSA、HCl、PTSA。

11.如权利要求1和4所述的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的寡聚体的新型合成方法，其中，所述碱性试剂选自NaOMe、NaOEt、KOtBu。

12.一种通过权利要求1所述的方法制备的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的新的高级合成寡聚体，其中，所述新的高级合成寡聚体(Y)是高纯度和抗原性改善的合成寡聚体。

13.通过权利要求1所述的方法制备的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的新的高级合成寡聚体，其中，所述新的高级合成寡聚体(Y)是纯度大于95％且功效改善的具有以下结构式的四聚体(d26)：

14.通过权利要求1所述的方法制备的脑膜炎奈瑟氏菌血清组Y荚膜多糖重复单元的新的高级合成寡聚体，其能够用作开发针对脑膜炎球菌血清组Y细菌感染的半合成或全合成缀合疫苗的候选物。