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CN107709291A - 抑制剂及其应用 - Google Patents

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CN107709291A CN201680033508.9A CN201680033508A CN107709291A CN 107709291 A CN107709291 A CN 107709291A CN 201680033508 A CN201680033508 A CN 201680033508A CN 107709291 A CN107709291 A CN 107709291A
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Abstract

本发明涉及PPP1R15A和PPP1R15B的抑制剂以及它们在治疗中的使用，尤其是用于治疗通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B而减轻的疾病状态，例如与错误折叠蛋白的积聚相关联的障碍或蛋白内稳态障碍。本发明的化合物包括具有式IA的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1a、R3a、R5a、Xa和Ya如本文所定义。

Description

抑制剂及其应用
本发明涉及PPP1R15A和PPP1R15B的抑制剂以及它们在治疗中的应用。
发明背景
蛋白的可逆磷酸化事实上控制细胞和生物体功能的所有方面，允许细胞通过激酶和磷酸酶的拮抗作用适应突然的变化。因此，靶向磷酸化提供广泛的治疗切入点，并且激酶已经成为当今对超过3000种已批准的以及实验的药物的药学研究中最常见的药物靶点。然而，虽然靶向磷酸酶原则上应与激酶一样具有吸引力，但磷酸酶的治疗潜力被忽视。大部分蛋白磷酸化发生在丝氨酸和苏氨酸上，并且选择性的丝氨酸/苏氨酸去磷酸化通过几百种不同的二聚体或三聚体全酶来实现，这些全酶由仅仅几种的催化亚基之一和几百种不同的调节亚基之一组合装配而成(Heroes等人，FEBS Journal，280，584-595，2012)。因此，全酶的催化部分(如PP1c)的抑制导致几百种磷酸酶的抑制，并且是毒性的。因为选择性是药物开发的一个重要特性，催化磷酸酶的多功能性已经导致它们被认为是无成药性的。
eIF2α的α亚基的磷酸化是抗多种应激的第一道防线，并且因此是两个部分重叠的信号途径的中心组分：未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response，UPR)和整合应激反应(Integrated Stress Response，ISR)。为了逆转eIF2α磷酸化，哺乳动物细胞具有两种eIF2α磷酸酶。eIF2α磷酸酶是二聚体全酶，其与200种其它磷酸酶共享催化亚基PP1c，并且结合到两种相关的调节亚基之一上：PPP1R15A(Novoa等人，The Journal ofCell Biology，153，1345-1355，2001)——一种应激诱导型蛋白，或者组成型表达的PPP1R15B(Jousse等人，The Journal ofCell Biology，163，767-775，2003)。
近来，已经展示了选择性抑制丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的可行性。发现胍那苄(Guanabenz)(Tsaytler等人，Science，332，91-94，2011；Tsaytler和Bertolotti，FEBSJournal，280，766-770，2012)及其衍生物，其中的一些公开于WO2014108520(MedicalResearch Council)，选择性抑制PPP1R15A/GADD34——一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1的应激诱导型调节亚基，并且提出将其用于治疗与蛋白错误折叠应激相关联的疾病。
PPP1R15A抑制选择性抑制包含PPP1R15A和PP1的应激诱导型eIF2α磷酸酶，而放过高度相关的组成型磷酸酶PPP1R15B-PP1。PPP1R15A抑制延长应激细胞中的eIF2α磷酸化并且这导致应激细胞中翻译衰减的延长。因此，应激细胞中分子伴侣的可用性提高，这是因为通常参与辅助新合成蛋白折叠的分子伴侣当翻译衰减后变得可用。这有利于蛋白折叠并且拯救蛋白内稳态缺陷的细胞。因此，原则上PPP1R15A抑制剂能够治疗涉及蛋白错误折叠应激的哺乳动物细胞疾病。哺乳动物中PPP1R15A的抑制具有吸引人的治疗潜力，这是因为预测PPP1R15A的抑制是安全的，因为PPP1R15A/GADD34敲除小鼠很大程度上与野生型小鼠不可区分(Marciniak等人，Genes&Development，18，3066-3077，2004)。然而，预期可经由PPP1R15A抑制剂治疗的治疗适应症的数目局限于其中表达PPP1R15A的疾病以及PPP1R15A参与疾病作用方式的疾病。因此，PPP1R15A的抑制可为强力的且安全的，但是将局限于涉及PPP1R15A的疾病。
无论与PPP1R15A抑制相关联的限制如何，通过对翻译的精细调节提高分子伴侣的可用性，从而恢复蛋白内稳态的方法理论上是强效的、直接的并且可用于治疗涉及错误折叠蛋白的广范围的疾病。如上所述，PPP1R15A抑制剂的使用将局限于其中表达PPP1R15A的疾病以及PPP1R15A参与疾病作用方式的疾病。这代表严重的局限。因此需要具有广泛治疗潜力的替代方法，并且本发明致力于提供这些方法。
发明内容
与选择性抑制PPP1R15A的化合物相比，抑制PPP1R15A和PPP1R15B的化合物可有利地用于治疗更宽范围的疾病。
在第一方面，本发明提供式IA的化合物：
(IA)
或其药学上可接受的盐，其中：
Xa是N或CR2a；
Ya是N或CR4a；
R1a是H、F、Cl或Br；
R2a、R3a、R4a、R5a各自独立地表示H、F或Cl；
所述前提条件是：
当Xa和Ya分别表示CR2a和CR4a并且R2a和R4a均为H时：
当R3a和R5a均表示H时，R1a不是F、Cl或Br；
当R1a是Cl并且R2a是H时，R5a不是F或Cl；
当R1a是Cl并且R5a是H时，R3a不是F；
当R1a和R5a均为H时或者当R1a是Cl并且R5a是H时，R3a不是Cl；
R1a、R3a和R5a不全是H；
当R3a是H并且R5a是F时，R1a不是Cl；
当Xa表示CH并且Ya表示CR4a时，其中R4a是Cl:
R1a和R5a不全是Cl；
当R1a和R5a是Cl时，R3a不是Cl；
当Xa表示CR2a并且Ya表示CR4a并且R2a和R4a均为Cl时，R1a、R3a和R5a不全是H。
在一个实施方案中，Xa表示CR2a并且Ya表示CR4a，其中R2a和R4a各自独立地表示H、F或Cl。
在一个实施方案中，R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的三个表示Cl或F，并且R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的两个表示H，任选地其中R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的至少一个是F。
在一个实施方案中，R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的三个表示Cl，并且R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的两个表示H。
在一个实施方案中，R3a是Cl或F，并且R1a、R2a、R4a和R5a各自独立地选自H、F和Cl，其中R1a、R2a、R4a和R5a中的两个选自F和Cl，并且R1a、R2a、R4a和R5a中的两个是H。
在一个实施方案中，R5a是H。
在一个实施方案中，式IA的化合物是E-异构体形式。
本发明的第二方面涉及式IB的化合物：
(IB)
或其药学上可接受的盐，其中：
Xb是N或CR2b；
Yb是N或CR4b；
R1b是H、F、Cl或Br；
R2b、R3b、R4b、R5b各自独立地表示H、F或Cl；
所述前提条件是：
当Xb和Yb均表示N时，R1b和R3b不全是Cl；
当Xb是CR2b并且R2b是Cl时，R1b不是Br；
当R3b和R4b均为H时，R1b和R2b不全是Cl；
当Xb是CR2b并且R2b和R3b均为H时，R1b不是Cl，此时Yb是CR4b并且R4b是F；
当Xb是CR2b并且Yb是CR4b时，R1b、R2b、R3b、R4b和R5b不全是H；
当Xb是CR2b并且Yb是CR4b并且R2b、R3b、R4b和R5b是H时，R1b不是Cl；
当Xb是CR2b并且Yb是CR4b并且R2b、R3b和R4b是H时，R1b不是Cl，此时R5b是F；
用于治疗通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B而减轻的疾病状态。
在一个实施方案中，Xb表示CR2b并且Yb表示CR4b，其中R2b和R4b各自独立地表示H、F或Cl。
在一个实施方案中，R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的三个表示Cl并且R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的两个表示H。
在一个实施方案中，R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的三个表示Cl或F并且R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的两个表示H，任选地其中R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的至少一个是F。
在一个实施方案中，R3b是Cl或F并且R1b、R2b，R4b和R5b独立地选自H、F和Cl，其中R1b、R2b，R4b和R5b中的三个选自F和Cl，并且R1b、R2b、R4b和R5b中的一个是H。
在一个实施方案中，R5a是H。
在一个实施方案中，式IB的化合物是E-异构体形式。
本发明的另一方面涉及用于治疗的式IA的化合物。
本发明的另一方面涉及式IA或式IB的化合物，它们用于治疗通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B而减轻的疾病状态。
本发明的另一方面涉及IA或式IB的化合物在制备用于治疗通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B而减轻的疾病状态的药物中的应用。
本发明的另一方面涉及在需要治疗的受试者中治疗通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B而减轻的疾病状态的方法，所述方法包括施用治疗有效量的式IA或IB的化合物。
在一个实施方案中，通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B而减轻的疾病状态是与错误折叠蛋白的积聚相关联的障碍或蛋白内稳态障碍。
在另一个实施方案中，疾病是亨廷顿氏病(Huntington’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、tau蛋白病(tauopathy)、蛋白质运输疾病或髓鞘质障碍(myelindisorder)。
在另一个实施方案中，上述疾病为任何多聚谷氨酰胺障碍。
在另一个实施方案中，上述疾病为远端型遗传性运动神经病，其具有在分子伴侣HSJ1中的突变。
本发明的另一方面涉及如上所述包含式IA或式IB的化合物的药物组合物，其与合适的药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体混合。
附图说明
现在将仅以举例的方式描述本发明的某些实施方案，参照下图，其中：
图1示出实施例1的R15B抑制剂与R15B-PP1的选择性结合超过R15A-PP1。
图2示出实施例1的选择性R15B抑制剂在不存在应激的情况下诱导细胞中elF2α的瞬时磷酸化以及诱导细胞中的R15A表达。
图3示出实施例1的选择性R15B抑制剂保护细胞免于应激。
图4示出应激后选择性R15B抑制剂对elF2α磷酸化的效应。在R15A尚未表达时，实施例1的化合物在应激后延长eIF2磷酸化。
图5示出实施例1的化合物的组织分布，其表现出广泛的组织分布。
图6示出用无毒性的实施例1的化合物(10mg/kg)治疗小鼠。
图7示出用实施例1的化合物(10mg/kg)治疗小鼠不引起胍那苄的副作用。
图8示出在用实施例1的化合物治疗后，在哺乳动物中的R15A诱导。
图9示出实施例1的R15B抑制剂对预防哺乳动物疾病的效果。在图8使用的示例是亨廷顿氏病(Huntington’s disease)，其使用小鼠模型HD82Gln(Schilling等人，Hum.Mol.Genet.，8，387-407，1999)。WT：野生型小鼠。Tg：HD82Gln。
图10以红色(杆状)示出来自培养的背根神经节(dorsal root ganglia，DRG)的髓鞘质节间体并以蓝色(球‘团’状)示出用溶媒或实施例1的化合物治疗的指示基因型的核。PMP22-突变小鼠中的髓鞘质节间体较短。用实施例1的化合物治疗增加突变DRG中髓鞘质节间体的长度，这表明它改善髓鞘形成。
图11示出在用实施例1的化合物治疗后肥胖小鼠db/db动物(每种条件n＝5)中的血糖水平。
图12示出选择性R15A抑制剂(第1柱-胍那苄(GBZ))、选择性R15B抑制剂(第2柱-化合物16(TST3))、GBZ和TST3的组合(第3柱)、和R15A/B抑制剂(第4柱-化合物10)的蛋白合成速率。该图示出选择性R15A抑制剂不抑制非应激细胞的蛋白合成。选择性R15B抑制剂在非应激细胞中暂时抑制蛋白合成。混合R15A和R15B抑制剂导致持续抑制蛋白合成。同样地，R15A/B抑制剂持续抑制蛋白合成。Y轴示出蛋白合成的相对速率。X轴示出在加入化合物(10μM)后的时间，单位为小时(h)。
图13示出免疫印迹，其显示R15A/B抑制剂(化合物10，20μM)诱导ATF4的表达，证实化合物的中靶效应。在将化合物加入培养基中的细胞后的时间在ATF4免疫印迹下方示出(0、2、5、7.5小时)。
发明详细描述
在第一方面，本发明提供式IA的化合物：
(IA)
或其药学上可接受的盐，其中：
Xa是N或CR2a；
Ya是N或CR4a；
R1a是H、F、Cl或Br；
R2a、R3a、R4a、R5a各自独立地表示H、F或Cl；
所述前提条件是：
当Xa和Ya分别表示CR2a和CR4a并且R2a和R4a均为H时：
当R3a和R5a均表示H时，R1a不是F、Cl或Br；
当R1a是Cl并且R2a是H时，R5a不是F或Cl；
当R1a是Cl并且R5a是H时，R3a不是F；
当R1a和R5a均为H时或者当R1a是Cl并且R5a是H时，R3a不是Cl；
R1a、R3a和R5a不全是H；
当R3a是H并且R5a是F时，R1a不是Cl；
当Xa表示CH并且Ya表示CR4a时，其中R4a是Cl:
R1a和R5a不全是Cl；
当R1a和R5a是Cl时，R3a不是Cl；
当Xa表示CR2a并且Ya表示CR4a并且R2a和R4a均为Cl时，R1a、R3a和R5a不全是H。
在一个实施方案中，R1a是F、Cl或Br。
在另一个实施方案中，R3a是F或Cl。
在另一个实施方案中，R5a是H。
在一个实施方案中，当Xa表示CR2a并且Ya表示CR4a时，R1a、R2a、R3a、R4a和R5a表示Cl。
在一个实施方案中，当Xa表示CR2a并且Ya表示CR4a时，R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的一个表示Cl并且R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的一个表示F。
在一个实施方案中，当Xa表示CR2a并且Ya表示CR4a时，R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的一个表示Cl并且R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的一个表示Br。
在一个实施方案中，R1a和R3a均表示Cl。
在一个实施方案中，当Xa表示CR2a并且Ya表示CR4a时，R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的三个表示Cl并且R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的两个表示H。
在一个实施方案中，当Xa表示CR2a并且Ya表示CR4a时，R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的两个表示Cl，R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的一个表示F，并且R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的两个表示H。
在一个实施方案中，当Xa表示CR2a并且Ya表示CR4a时，R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的两个表示F，R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的一个表示Cl，并且R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的两个表示H。
在一个实施方案中，R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的三个表示Cl或F，并且R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的两个表示H，任选地其中R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的至少一个是F。
在一个实施方案中，当Xa表示CR2a并且Ya表示CR4a时，R3a是Cl或F，R1a、R2a、R4a和R5a中的两个选自F和Cl，并且R1a、R2a、R4a和R5a中的两个表示H。
在一个实施方案中，当Xa表示N时，R1a和R3a均表示Cl。
在一个实施方案中，
Xa是CR2a；
Ya是CR4a；
R1a是H、F、Cl或Br；
R2a、R3a和R4a各自独立地表示H、F或Cl；
R5a表示H；
前提条件是：
当Xa和Ya表示CH时：
当R3a和R5a均表示H时，R1a不是F、Cl或Br；
当R1a是Cl并且R2a是H时，R5a不是F或Cl；
当R1a是Cl并且R5a是H时，R3a不是F；
当R1a和R5a均为H时或者当R1a是Cl并且R5a是H时，R3a不是Cl；
R1a、R3a和R5a不全是H；
当R3a是H并且R5a是F时，R1a不是Cl；
当Xa表示CH并且Ya表示CR4a时，其中R4a是Cl:
R1a和R5a不全是Cl；
当R1a和R5a是Cl时，R3a不是Cl；
当Xa表示CR2a并且Ya表示CR4a并且R2a和R4a均为Cl时，R1a、R3a和R5a不全是H。
在一个实施方案中，式IA的化合物是E-异构体形式。
在第二方面，本发明提供式IB的化合物，其用于治疗通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B而减轻的疾病状态：
(IB)
或其药学上可接受的盐，其中：
Xb是N或CR2b；
Yb是N或CR4b；
R1b是H、F、Cl或Br；
R2b、R3b、R4b、R5b各自独立地表示H、F或Cl；
所述前提条件是：
当Xb和Yb均表示N时，R1a和R3b不全是Cl；
当Xb是CR2b并且R2b是Cl时，R1b不是Br；
当R3b和R4b均为H时，R1b和R2b不全是Cl；
当Xb是CR2b并且R2b和R3b均为H时，R1b不是Cl，此时Yb是CR4b并且R4b是F；
当Xb是CR2b并且Yb是CR4b时，R1b、R2b、R3b、R4b和R5b不全是H；
当Xb是CR2b并且Yb是CR4b并且R2b、R3b、R4b和R5b是H时，R1b不是Cl；
当Xb是CR2b并且Yb是CR4b并且R2b、R3b和R4b是H时，R1b不是Cl，此时R5b是F；
当Xb是CR2b(其中R2b是Cl)并且Yb是CR4b(其中R4b是H)时，R1b不是Cl，此时R3b、R4b和R5b是H，或者此时R3b和R4b是H并且R5b是Cl。
在一个实施方案中，Xb表示CR2b并且Yb表示CR4b。在一个另选的实施方案中，Xb和Yb均表示N。在一个另选的实施方案中，Xb表示N并且Yb表示CR4b。
式IB的化合物是R15A和R15B抑制剂。
在一个实施方案中，R1b表示F、Cl或Br。
在另一个实施方案中，R3b表示F或Cl。
在另一个实施方案中，R5b是H。
在一个实施方案中，当Xb表示CR2b并且Yb表示CR4b时，R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的两个表示Cl。
在一个实施方案中，当Xb表示CR2b并且Yb表示CR4b时，R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的一个表示Cl并且R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的一个表示F。
在一个实施方案中，R1b和R3b均表示Cl。
在一个实施方案中，当Xb表示CR2b并且Yb表示CR4b时，R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的三个表示Cl。
在一个实施方案中，当Xb表示CR2b并且Yb表示CR4b时，R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的两个表示Cl并且R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的一个表示F。
在一个实施方案中，当Xb表示CR2b并且Yb表示CR4b时，R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的两个表示F并且R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的一个表示Cl。
在一个实施方案中，R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的三个表示Cl或F，并且R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的两个表示H，任选地其中R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的至少一个是F。
在一个实施方案中，当Xb表示N时，R1b和R3b均表示Cl。
在一个实施方案中，
Xb是CR2b；
Yb是CR4b；
R1b是H、F、Cl或Br；
R2b、R3b、和R4b各自独立地表示H、F或Cl；
R5b是H；
前提条件是：
当Xb和Yb均表示N时，R1a和R3b不全是Cl；
当Xb是CR2b并且R2b是Cl时，R1b不是Br；
当R3b和R4b均为H时，R1b和R2b不全是Cl；
当Xb是CR2b并且R2b和R3b均为H时，R1a不是Cl，此时Yb是CR4b并且R4b是F；
当Xb是CR2b并且Yb是CR4b时，R1b、R2b、R3b、R4b和R5b不全是H；
当Xb是CR2b并且Yb是CR4b并且R2b、R3b、R4b和R5b是H时，R1b不是Cl；
当Xb是CR2b并且Yb是CR4b并且R2b、R3b和R4b是H时，R1b不是Cl，此时R5b是F；
当Xb是CR2b(其中R2b是Cl)并且Yb是CR4b(其中R4b是H)时，R1b不是Cl，此时R3b、R4b和R5b是H，或者此时R3b和R4b是H并且R5b是Cl。
在一个实施方案中，式IA的化合物是E-异构体形式。
术语“PPP1R15A”与术语“R15A”互换使用并且术语“PPP1R15B”与术语“R15B”互换使用。PPP1R15A和PPP1R15B的抑制剂全文可称为“R15A/B”、“R15AB”或“AB”。
本文所述的化合物包括：
上文列出的化合物的E异构体形式是尤其优选的：
式IA的新型化合物包括：
化合物2：2-((2,4-二氯嘧啶-5-基)亚甲基)肼-1-甲脒
化合物3：2-(3,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物4：2-(2,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物5：2-(3,5-二氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物6：2-(2,3,4-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物7：2-(2,4-二氯-5-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物9：2-(2-溴-3-氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物13：2-(2,4-二氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物14：2-(2,3-二氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物18：2-(4,5-二氯-2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物20：2-(2-氯-5-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物22：2-((2,6-二氯吡啶-3-基)亚甲基)肼-1-甲脒
化合物25：2-(2-氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物27：2-(2-氯-3,4-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物29：2-(2-氯-3,5-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物32：2-(2-氯-4,5-二氟亚苄基)肼-1-甲脒。
式IA的新型化合物可选自以下E异构体形式：
化合物2(E)：(E)-2-((2,4-二氯嘧啶-5-基)亚甲基)肼-1-甲脒
化合物3(E)：(E)-2-(3,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物4(E)：(E)-2-(2,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物5(E)：(E)-2-(3,5-二氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物6(E)：(E)-2-(2,3,4-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物7(E)：(E)-2-(2,4-二氯-5-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物8(E)：(E)-2-(4-氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物9(E)：(E)-2-(2-溴-3-氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物10(E)：(E)-2-(2,3,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物11(E)：(E)-2-(3,4-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物13(E)：(E)-2-(2,4-二氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物14(E)：(E)-2-(2,3-二氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物15(E)：(E)-2-(3-氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物16(E)：(E)-2-(2,3-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物18(E)：(E)-2-(4,5-二氯-2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物20(E)：(E)-2-(2-氯-5-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物21(E)：(E)-2-((2-氯吡啶-3-基)亚甲基)肼-1-甲脒
化合物22(E)：(E)-2-((2,6-二氯吡啶-3-基)亚甲基)肼-1-甲脒
化合物23(E)：(E)-2-(3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物24(E)：(E)-2-(3-氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物25(E)：(E)-2-(2-氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物26(E)：(E)-2-(2,5-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物27(E)：(E)-2-(2-氯-3,4-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物29(E)：(E)-2-(2-氯-3,5-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物30(E)：(E)-2-(3-氯-2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物31(E)：(E)-2-(2,3,6-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物32(E)：(E)-2-(2-氯-4,5-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物34(E)：(E)-2-(3,5-二氯亚苄基)肼-1-甲脒。
在一个优选的实施方案中，式IA的化合物选自化合物3，即，2-(3,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒，以及化合物4，即，2-(2,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒，具体地，式IA的化合物选自(E)-2-(3,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒和(E)-2-(2,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒。
在一个实施方案中，式IA的化合物是(E)-2-(3,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒。
在另一个实施方案中，式IA的化合物是(E)-2-(2,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒。
式IB的化合物可选自以下化合物：
化合物1(E)：(E)-2-((4-氯苯基)亚甲基)肼-1-甲脒
化合物3(E)：(E)-2-(3,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物4(E)：(E)-2-(2,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物5(E)：(E)-2-(3,5-二氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物6(E)：(E)-2-(2,3,4-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物7(E)：(E)-2-(2,4-二氯-5-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物8(E)：(E)-2-(4-氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物10(E)：(E)-2-(2,3,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物11(E)：(E)-2-(3,4-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物12(E)：(E)-2-(2,4-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物13(E)：(E)-2-(2,4-二氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物14(E)：(E)-2-(2,3-二氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物15(E)：(E)-2-(3-氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物17(E)：(E)-2-(2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物18(E)：(E)-2-(4,5-二氯-2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物21(E)：(E)-2-((2-氯吡啶-3-基)亚甲基)肼-1-甲脒
化合物22(E)：(E)-2-((2,6-二氯吡啶-3-基)亚甲基)肼-1-甲脒
化合物23(E)：(E)-2-(3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物24(E)：(E)-2-(3-氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物25(E)：(E)-2-(2-氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物26(E)：(E)-2-(2,5-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
化合物27(E)：(E)-2-(2-氯-3,4-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物29(E)：(E)-2-(2-氯-3,5-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物30(E)：(E)-2-(3-氯-2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
化合物32(E)：(E)-2-(2-氯-4,5-二氟亚苄基)肼-1-甲脒。
在一个优选的实施方案中，式IB的化合物选自化合物3，即，(E)-2-(3,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒，以及化合物4，即，(E)-2-(2,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒。
在一个实施方案中，式IB的化合物是(E)-2-(3,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒。
在另一个实施方案中，式IB的化合物是(E)-2-(2,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒。
在一个实施方案中，式IB的化合物抑制PPP1R15A和PPP1R15B。PPP1R15A和PPP1R15B的抑制可通过结合分析确定。例如，可使用SPR(surface plasmon resonance，表面等离振子共振)获得KD值，分析结合。PPP1R15A和PPP1R15B抑制剂可定义为其中R15A和R15B之间的KD值差值不超过约3倍的化合物。具体地，R15A和R15B之间的KD值差值不超过约2倍。例如，对一个靶的亲和力与对另一个靶的亲和力差值小于约3倍，具体地小于约2倍。“选择性抑制剂”可定义为其中R15A和R15B之间的KD值差值大于3倍，或者甚至更优选地大于10或20倍的化合物。
在细胞中，式IB的化合物抑制蛋白合成。不像胍那苄、在非应激细胞中不抑制蛋白合成的R15A抑制剂(Tsaytler等人，Science，332，91-94，2011)、或暂时抑制蛋白合成的R15B抑制剂，R15A和R15B抑制剂的组合导致对蛋白合成的持续抑制(图12)。同样地，R15A和R15B的抑制剂(化合物10)持续抑制蛋白合成(图12)。ATF4由R15A和R15B的抑制剂诱导，证实该化合物是中靶的(图13)。
本文所述的是使用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐作为PPP1R15B选择性抑制剂：
(I)
其中：
X是N或CR2；
Y是N或CR4；
R1、R2、R3和R4独立地选自H、Cl或F；
前提条件是：
当X是CR2并且Y是CR4时，式I的化合物为至少单取代的；
当R3是Cl时，R2不是Cl；
当R1和R4均为Cl时，R2不是Cl；
当式I的化合物为双取代的、X是CR2、Y是CR4并且R1是Cl时，R3不是Cl；
当R4是Cl并且式I的化合物是双取代的时，R2不是Cl；
当R1是F时，R2不是Cl；
当X或Y是N并且式I的化合物是单取代的时，R1不是Cl；
当X是CR2、Y是CR4并且式I的化合物是单取代的时，R1不是F或Cl。
PPP1R15B选择性抑制剂或其药学上可接受的盐可选自：
盐和酯
本文所述的化合物可以盐或酯形式存在，尤其是药学上可接受的盐或酯。
本文所述化合物的药学上可接受的盐包括其合适的酸加成盐或碱盐。合适的药物盐的综述可见于Berge等人，J Pharm Sci，66，1-19(1977)。非药学或兽医学可接受的盐作为中间体仍可为有价值的。
酯用有机酸或醇/氢氧化物形成，这取决于被酯化的官能团。
对映异构体/互变异构体
在本发明之前讨论的所有方面，本发明包括在适用情况下本发明化合物的所有对映异构体、非对映异构体和互变异构体。本领域的技术人员将认识到具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或互变异构特征的化合物。对应的对映异构体和/或互变异构体可通过本领域已知的方法分离/制备。对映异构体的特征在于它们手性中心的绝对构型，并通过Cahn，Ingold和Prelog的R-和S-顺序规则描述。此类规则在本领域中是公知的(例如参见‘Advanced Organic Chemistry’，第3版，March，J.编辑，John Wiley and Sons，New York，1985)。
立体和几何异构体
本发明的一些化合物可存在立体异构和/或几何异构体-例如，它们可具有一个或多个不对称和/或几何中心，并因此可能存在两个或更多个立体异构和/或几何异构形式。本发明考虑使用那些抑制剂的所有单独的立体异构体和几何异构体、以及它们的混合物。在权利要求书中使用的术语包括这些形式，只要所述形式保留适当的功能活性(但不必到相同程度)。
本发明还包括上述药剂或其药学上可接受的盐的所有合适的同位素变体。本发明的药剂或其药学上可接受的盐的同位素变体定义为其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量与通常在自然界中发现的原子质量不同的原子替代。可掺入到上述试剂及其药学上可接受的盐的同位素的示例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，例如分别为2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl的同位素。上述试剂及其药学上可接受的盐的某些同位素变体，例如其中掺入放射性同位素如3H或14C的那些，可用于药物和/或底物组织分布研究。氚化，即，3H，和碳-14,即，14C，同位素是特别优选的，因其易于制备和检测。此外，用同位素如氘(即，2H)进行取代可提供由更大的代谢稳定性所带来的某些治疗优势，例如增加体内半衰期或减少剂量要求，并因此在某些情况下优选。例如，本发明包括其中任意的氢原子已被为氘原子取代的式I的化合物。本发明试剂及其药学上可接受的盐的同位素变体一般可通过使用合适试剂的适当同位素变体，通过常规方法来制备。
前药
本发明还包括前药形式的本发明的化合物，即，共价键合的化合物，其在体内释放根据任何示例性化合物的活性母体药物。此类前药通常是本发明的化合物，其中一个或多个适当基团已被修饰，使得所述修饰可以在施用于人或哺乳动物受试者时逆转。逆转通常由天然存在于这些受试者体内的酶进行，但是此种前药与第二药剂一起施用以在体内进行逆转是可能的。此类修饰的示例包括酯(例如，上述那些中的任一种)，其中逆转可以由酯酶等进行。其它此类系统是那些本领域技术人员将公知的。
溶剂化物
本发明还包括本发明化合物的溶剂化物形式。在权利要求书中使用的术语包括这些形式。
多晶型物
本发明还涉及本发明化合物的各种结晶形式、多晶型形式和水合形式。制药工业中已经确认化合物可通过稍微改变纯化和/或分离方法从合成制备此类化合物的溶剂中以任何此类形式分离出来。
治疗应用
本文所述的化合物对于治疗和预防各种疾病和病症具有潜在的治疗应用。
本发明的一个方面涉及用于治疗的式IA的化合物。
本发明的另一方面涉及治疗患有与错误折叠蛋白的积聚或蛋白质内稳态干扰(perturbation of protein homeostasis)相关联的障碍的受试者，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明化合物。
本发明的另一方面涉及治疗患有通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B而减轻的疾病状态的受试者，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明化合物。
本发明的另一方面涉及预防受试者与错误折叠蛋白的积聚或蛋白质内稳态干扰相关联的障碍，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明化合物。
本发明的另一方面涉及在受试者中预防通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B而减轻的疾病状态的方法，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明化合物。
本发明的另一方面涉及式IA和式IB的化合物，它们用于治疗或预防与错误折叠蛋白的积聚或蛋白质内稳态干扰相关联的疾病。
本发明的另一方面涉及式IA和式IB的化合物，它们用于治疗或预防通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B而减轻的疾病状态。
本发明的另一方面涉及式IA和IB的化合物在制备用于治疗或预防与错误折叠蛋白的积聚或蛋白质内稳态干扰相关联的障碍的药物中的应用。
本发明的另一方面涉及式IA和IB的化合物在制备用于治疗或预防通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B而减轻的疾病状态的药物中的应用。
PPP1R15A和PPP1R15B相关的疾病是可通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B改善的疾病。这些包括与错误折叠蛋白的积聚或蛋白质内稳态(蛋白内稳态)干扰相关联的疾病，例如亨廷顿氏病(Huntington’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、共济失调和其它多聚谷氨酰胺障碍以及视网膜变性、青光眼、肌萎缩性侧索硬化(ALS)与朊病毒病；与微管相关蛋白tau的聚集相关联的疾病并且包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、肌萎缩性侧索硬化和关岛帕金森-痴呆综合征(parkinsonism-dementia complex)、嗜银颗粒病、慢性创伤性脑病、皮质基底节变性、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症(DNTC)、唐氏综合征(Down’s syndrome)、家族性英国型痴呆(FBD)、家族性丹麦型痴呆(FDD)、与17号染色体相关的额颞性痴呆及帕金森综合征(FTDP-17)、额颞叶变性(FTLD)、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克症、Gaudeloupean帕金森病(Gaudeloupeanparkinsonism)、强直性肌营养不良、脑组织铁沉积神经变性病、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)C型、伴神经纤维缠结非关岛运动神经元病、皮克病(Pick’sdisease)、脑炎后帕金森综合征、朊蛋白淀粉样脑血管病、进行性皮质下胶质增生症、进行性核上性麻痹、SLC9A6相关的智力障碍、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结性痴呆(tangle-onlydementia)、和伴球状胶质细胞包涵体的白质tau蛋白病(white mattertauopathywithglobular glial inclusions)；髓鞘质障碍如多发性硬化症、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、白质消失病、急性播散性脑脊髓炎、脑室周围白质软化、脑室周围白质损伤、脊髓痨、德维克病(Devic’s disease)、视神经炎、进行性多灶性白质脑病、横贯性脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、抗MAG外周神经病、肾上腺脑白质营养不良、肾上腺脊髓神经病、弥漫性脑白质损伤、吉兰-巴雷综合征(Guillain-BarreSyndrome)、脑桥中央髓鞘溶解症、遗传性脱髓鞘疾病如脑白质营养不良、和腓骨肌萎缩症牙病(CharcotMarie Tooth disease)；由在内质网(ER)中制备的任何蛋白的错误折叠或运输缺陷引起的疾病，例如囊性纤维化、先天性甲状腺肿、家族性垂体性糖尿病、前胶原生物合成障碍(包括成骨不全)、高胆固醇血症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、溶酶体障碍、色素性视网膜炎(RP)、和炎性肠病；代谢疾病如糖尿病、沃尔科特-拉里森综合症(Wolcott-Rallisonsyndrome)、肥胖症、胰岛素抵抗、血脂过多、脂肪性肝病和动脉粥状硬化；癌症；衰老；炎症；以及其它疾病，包括类风湿性关节炎、1型糖尿病和白癫风。
在一个优选的实施方案中，本文所述的化合物用于治疗与病变UPR或ISR和/或蛋白质内稳态缺陷相关联的障碍。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，所述任务包括但不限于，化学、药理、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的那些方式、手段、技术和程序或者容易由化学、药理、生物学、生物化学和医学领域的从业者从已知的方式、手段、技术和程序开发的方式、手段、技术和程序。
术语“治疗有效量”是指所施用的化合物的量将在某种程度上缓解所治疗疾病或障碍的一个或多个症状。
本文术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转疾病或障碍的进展、基本上改善疾病或障碍的临床症状或基本上预防疾病或障碍的临床症状的出现。
短语“药物制备”包括除了在筛选程序中用于得到进一步的活性剂或用于此类药物制备过程中的任何阶段外，如上所述的化合物直接作为药物。
在它们的作用方式中具有潜在的蛋白或肽错误折叠和/或聚集的疾病
引起疾病的蛋白在整个生命周期内表达，但是退行性疾病多数是迟发的。这表明不同的引起疾病的蛋白随时间推移逐渐变得有害。虽然目前确认错误折叠的蛋白引起独特的退行性疾病，但是它们为何积聚很大程度上仍不清楚。细胞通常力图蛋白正确折叠，并且实际上所有细胞具有强力且精密的蛋白控制系统，在几十年里非常高效地处理可能有害的蛋白。然而，蛋白质量控制机制似乎随着衰老逐渐失效，导致错误折叠的蛋白积聚，引起细胞和生物体的灾难性后果。这些错误折叠/聚集的蛋白或肽可存在于细胞内部或外部，并且可见于任何位置。原则上，促进抗错误折叠蛋白的天然细胞防御应代表一种通用方法，其用于减少各种蛋白错误折叠疾病的病变，其中易发生错误折叠/聚集的蛋白存在于所述病变中。本发明描述此种方法并展示它在哺乳动物中的安全性和功效。
神经退行性疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease，HD)、共济失调和其它多聚谷氨酰胺障碍、tau蛋白病以及、视网膜变性、青光眼、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和朊病毒病是破坏性的并且在老龄人群中影响越来越多的个体。这些疾病临床上各异但共有共同的机理。它们由由于异常形状的特定蛋白的积聚导致的大脑选择性区域中的特定神经细胞的进行性功能障碍以及死亡引起。易发生错误折叠并聚集的蛋白包括但不限于：Aβ42、α-突触核蛋白、TAU、TDP-43、TLS/FUS、SOD1、亨廷顿蛋白(Huntingtin)和其它具有多聚谷氨酰胺扩增的蛋白、朊病毒以及C9ORF72的翻译产物。
申请人已经证明实施例1的化合物选择性抑制PPP1R15B-PP1，矫正小鼠的蛋白错误折叠疾病。本文所述的PPP1R15B抑制剂因此具有在涉及错误折叠蛋白、尤其是错误折叠蛋白积聚的多种疾病的治疗中的治疗应用。也期望诸如式IB化合物的PPP1R15A和PPP1R15B的抑制剂具有在涉及错误折叠蛋白的疾病的治疗中的应用。
本发明提供多聚谷氨酰胺障碍的疗法。亨廷顿氏病(Huntington’s disease)属于一种较广泛的疾病种类，“多聚谷氨酰胺障碍”，其特征在于在不相关的蛋白中以谷氨酰胺翻译的CAG密码子的扩增。亨廷顿氏病(Huntington’s disease)由编码亨廷顿蛋白(Huntingtin)的基因扩增引起；脊髓延髓肌萎缩症、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(Dentalorubral-pallidoluysian atrophy)、和脊髓小脑共济失调由分别编码雄激素受体、Atrophin 1、Ataxin 1、Ataxin2、Ataxin3、α-电压依赖性钙通道亚基和TBP的基因扩增引起。CAG扩增以多聚谷氨酰胺翻译并引起受影响蛋白的聚集。因此，预防和/或治疗诸如这些的多聚谷氨酰胺障碍也在本发明的范围内。
例如，申请人已经示出实施例1的化合物改善哺乳动物的亨廷顿氏病(Huntington’s disease)。因此，不受理论的束缚，据信PPP1R15B的抑制剂具有对由错误折叠/聚集的蛋白引起的多种疾病的保护效应，所述疾病例如但不限于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease，HD)、共济失调和其它多聚谷氨酰胺障碍、以及视网膜变性、青光眼、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、tau蛋白病和朊病毒病。期望诸如式IB化合物的PPP1R15A和PPP1R15B的抑制剂具有相同效应。
上述疾病包括错误折叠/聚集涉及目前已知蛋白和上文所述蛋白的任何疾病，但是也将应用于未来的新蛋白和可能的新疾病。
在一个优选的实施方案中，本发明提供蛋白内稳态疾病的疗法。
在另一个实施方案中，本文所述的化合物用于治疗错误折叠蛋白的积聚参与到作用方式中的疾病。
在另一个实施方案中，疾病或障碍为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease，HD)、共济失调或其它多聚谷氨酰胺障碍、视网膜变性、青光眼、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、tau蛋白病或朊病毒病。
在一个具体实施方案中，本文所述的化合物用于治疗亨廷顿氏病(Huntington’sdisease)。
在另一个具体实施方案中，本文所述的化合物用于治疗帕金森氏病(Parkinson’sdisease)。
在一个实施方案中，疾病或障碍与微管相关蛋白tau的聚集相关联。
申请人已经证明实施例1的化合物选择性抑制PPP1R15B-PP1，矫正小鼠的蛋白错误折叠疾病。PPP1R15B抑制剂也可用于预防或终止由相同机理(错误折叠蛋白的积聚)引起的疾病进展。也期望诸如式IB化合物的PPP1R15A和PPP1R15B的抑制剂具有这种应用。
此类疾病的示例包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、肌萎缩性侧索硬化和帕金森病与痴呆、嗜银颗粒病、慢性创伤性脑病、皮质基底节变性、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症(DNTC)、唐氏综合征(Down’s syndrome)、家族性英国型痴呆(FBD)、家族性丹麦型痴呆(FDD)、与17号染色体相关的额颞性痴呆及帕金森综合征(FTDP-17)(由MAPT突变引起)、额颞叶变性(FTLD)(一些病例由C9ORF72突变引起)、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克症、Gaudeloupean帕金森病、强直性肌营养不良、脑组织铁沉积神经变性病、尼曼-皮克病C型(Niemann-Pickdisease)、伴神经纤维缠结非关岛运动神经元病、皮克病(Pick’s disease)、脑炎后帕金森综合征、朊蛋白淀粉样脑血管病、进行性皮质下胶质增生症、进行性核上性麻痹、SLC9A6相关的智力障碍、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结性痴呆、伴球状胶质细胞包涵体的白质tau蛋白病。
在一个实施方案中，疾病是髓鞘质障碍。
髓鞘质是中枢和外周神经系统的富含蛋白。它由两种细胞类型产生：中枢神经系统中的少突胶质细胞和外周神经系统中的神经膜细胞。髓鞘质形成围绕轴突的鞘以确保电脉冲沿轴突的传导速度，并且用于防止电流从轴突上消散。髓鞘质功能对于神经系统来说是必需的。
髓鞘质障碍在世界范围内影响超过2.5百万人并且定义为与髓鞘质的损伤相关联的任何疾病。髓鞘质障碍表现为各种不同的症状，包括但不限于运动障碍、感官障碍、认知障碍、情绪困扰、和协调障碍。
存在多种脱髓鞘疾病，其中最常见的是多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)。多发性硬化症是一种自身免疫性疾病，影响大脑和脊髓，导致大脑脱髓鞘。除MS之外，其它脱髓鞘疾病包括但不限于佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)和白质消失病、急性播散性脑脊髓炎、脑室周围白质软化、脑室周围白质损伤、脊髓痨、德维克病(Devic’s disease)、视神经炎、进行性多灶性白质脑病、横贯性脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、抗MAG外周神经病、肾上腺脑白质营养不良、肾上腺脊髓神经病、弥漫性脑白质损伤、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre Syndrome)、脑桥中央髓鞘溶解症、诸如脑白质营养不良的遗传性脱髓鞘疾病、以及腓骨肌萎缩症牙病(Charcot Marie Toothdisease，CMT)。
CMT疾病是一类髓鞘神经病变，其由多个基因的突变引起。在外周髓鞘蛋白PMP22中的突变是CMT最常见的起因。PMP22(Trembler-J)中的突变引起PMP22的错误折叠并导致小鼠中的疾病，其类似于人的CMT，这是由于外周神经系统中的髓鞘质缺陷引起。申请人已经证明实施例1的化合物能够改善来自神经病变小鼠的外植体的髓鞘形成。申请人已经证明改善来自神经病变小鼠的外植体的髓鞘形成预示在哺乳动物中的功效(Das等人，Science，2015)。因此实施例1的化合物将用于治疗哺乳动物的CMT和其它髓鞘质障碍，其中已知机理是相似的并且涉及eIF2α途径(Lin和Popko，Nat.Neurosci.，12，379-385，2009)，并且预期诸如式(I)化合物的PPP1R15A和PPP1R15B的抑制剂也在治疗CMT中有用。
在一个实施方案中，本文所述的化合物用于治疗髓鞘质障碍。
在另一个实施方案中，本文所述的化合物用于治疗腓骨肌萎缩症牙病(CharcotMarie Tooth disease)。
在另一个实施方案中，本文所述的化合物用于治疗中枢神经系统的髓鞘质障碍，例如多发性硬化症。已知CMT和MS的机理相似之处在于髓鞘质产生细胞的耗竭(CMT中的神经膜细胞和MS中的少突胶质细胞)并且涉及eIF2α-RRR1R15A途径的病理信号转导(Lin和Popko，Nat.Neurosci.，12，379-385，2009)。因为申请人已经展示实施例1对髓鞘质病有效并且也已经展示了实施例1的化合物在中枢神经系统和外周神经系统中的生物利用率(图5)，预期PPP1R15B抑制剂以及PPP1R15A和PPP1R15B的抑制剂如式IB的化合物，将可用于治疗多发性硬化症。
在一个实施方案中，上述疾病是起因于蛋白突变，导致其错误折叠和错误定位或运输缺陷的疾病。
申请人已经展示实施例1的化合物能够治疗由一种在内质网(ER)中合成的错误折叠蛋白PMP22引起的缺陷。由于作用机制(减少翻译以增加折叠)，PPP1R15B的抑制剂以及PPP1R15A和PPP1R15B的抑制剂也将可用于治疗由于在ER中制备的任何蛋白(包括跨膜蛋白或分泌蛋白)的错误折叠或运输缺陷引起的疾病。
此类疾病的示例包括：由破坏跨膜蛋白折叠的突变引起的囊性纤维化(CFTR)；由于激素甲状腺球蛋白的错误折叠和/或运输缺陷引起的先天性甲状腺肿伴甲状腺球蛋白缺乏症；由错误折叠和缺乏循环精氨酸加压素引起的遗传垂体性尿崩症(familialneurohypophyseal diabetes)(这也可包括某些形式的基因遗传的肾性尿崩症)；前胶原生物合成障碍，其中所述疾病由无法折叠、装配并合成胶原引起，例如但不限于成骨不全；更一般地，其中蛋白的错误折叠/无法合成或错误定位参与作用方式中的结缔组织的任何遗传疾病，例如与来自细胞外基质的蛋白缺陷相关联的生长板发育不良；高胆固醇血症，其具有由LDL受体中的突变导致无法合成、改变细胞内运输、或功能异常引起的分子缺陷；由于α1抗胰蛋白酶的错误折叠引起的α-1抗胰蛋白酶缺乏症；由于与溶酶体功能相关联的蛋白错误折叠引起的溶酶体障碍，如戈谢病(Gaucher disease)和尼曼-皮克病(Niemann-Pickdisease)以及安德森-法布里病(Anderson-Fabry disease)；色素性视网膜炎(RP)，它是由视紫质蛋白的错误折叠、它们的ER驻留以及导致的ER应激和细胞凋亡引起的遗传性视网膜变性最常见的形式；和与ER应激相关联的炎性肠病。
出于相同原因，PPP1R15B的抑制剂或PPP1R15A和PPP1R15B的抑制剂，如式IB的化合物，可用于治疗与病变UPR和/或跨膜蛋白缺陷相关联的以下障碍(Lin和Popko，Nat.Neurosci.，12，379-385，2009)。这些疾病包括但不限于与膜蛋白脂质蛋白(PLP)基因中的突变相关联的佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、和白质消失(VWM)病、以及多发性硬化症(一种常见的髓鞘质障碍)。
在一个实施方案中，本文所述的化合物用于治疗由导致蛋白错误折叠和错误定位或运输缺陷的蛋白突变引起的疾病。
在另一个实施方案中，由导致蛋白错误折叠和错误定位或运输缺陷的蛋白突变引起的疾病选自囊性纤维化、先天性甲状腺肿、遗传垂体性尿崩症、前胶原生物合成障碍(诸如成骨不全)、高胆固醇血症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、溶酶体疾病(诸如戈谢病(Gaucherdisease)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)和安德森-法布里病(Anderson-Fabrydisease))、色素性视网膜炎和炎性肠病。
在一个实施方案中，上述疾病是代谢疾病。
已知诸如糖尿病、肥胖症、胰岛素抵抗、血脂过多、脂肪性肝病、和动脉粥样硬化的代谢疾病与病理ER应激相关联，并且据信UPR的药理调节剂可具有治疗有益效果(Cao和Kaufman，2012，Curr Biol，卷22(16))。然而，因为之前无PPP1R15B抑制剂可用并且曾预测PPP1R15B抑制是有毒性的，以及此外因为抑制磷酸酶具有挑战性，不清楚是否PPP1R15B可为代谢疾病的治疗靶点。
发明人已经证明实施例1的化合物能够改善哺乳动物的代谢障碍(图11)。因此，PPP1R15B抑制剂将可用于治疗代谢障碍，例如但不限于糖尿病、肥胖症、脂肪性肝病、和动脉粥样硬化。也期望诸如式(I)化合物的PPP1R15A和PPP1R15B的抑制剂也在治疗代谢障碍中有用。
在一个实施方案中，本文所述的化合物用于治疗代谢障碍。
在一个优选的实施方案中，代谢障碍选自糖尿病、肥胖症、脂肪性肝病、和动脉粥样硬化。
PPP1R15B选择性抑制剂在治疗其它障碍中有用，包括类风湿性关节炎、糖尿病、沃尔科特-拉里森综合征(Wolkott Rallison syndrome)、炎性肠病和白癜风，它们的作用机理涉及UPR(Cao和Kaufman，2012，CurrBiol，vol.22(16))。诸如式(I)化合物的PPP1R15A和PPP1R15B抑制剂也期望在治疗这些疾病中有用。
癌症
在一个实施方案中，本文所述的化合物用于治疗癌症。
癌细胞具有高代谢要求，并且它们的增殖依赖于高效的蛋白质合成。翻译起始在调控蛋白稳态、分化、增殖和恶性转化中起着至关重要的作用。增加翻译起始有助于肿瘤的发生，并且相反地，减少翻译起始可减少肿瘤的生长(Donze等人，1995，EMBO J，14，3828-34；Pervin等人，2008，Cancer Res，68，4862-74；Chen等人，2011，Nat Chem Biol，7，610-6)。不受理论的束缚，据信抑制PPP1R15A和PPP1R15B可降低在肿瘤细胞中的翻译，从而减少肿瘤的生长。
衰老
有大量文献表明减少蛋白合成增加寿命(Tavernarakis，2008，Trends CellBiol，18(5)，228-235。因此，预测通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B减少蛋白合成将增加寿命是合理的。
炎症
Salubrinal是eIF2a磷酸化的诱导物并且被认为通过未知的机理抑制R15A和R15B磷酸酶。发现Salubrinal抑制炎症(Hamamura等人，2015，Cellular Signalling，27(4)，828–835)。然而，由于毒性问题，Salubrinal不能用于人类。预期本文公开的R15A/B抑制剂将是用于涉及炎症的疾病的潜在疗法是合理的。
与炎症相关联的一组非穷举性疾病示例为：关节炎、溃疡性结肠炎和炎性肠病、与炎症相关联的感染、纤维症、与炎症相关联的神经退行性疾病或者广义上与炎症相关联的任何人类疾病。
具体地，与炎症相关联的疾病包括：类风湿性关节炎；多发性硬化症；炎性肠病(IBD)，它是一个主要用于描述两种病症：溃疡性结肠炎和克罗恩病(Crohn's disease)的术语；糖尿病；狼疮性肾炎；自身免疫性内耳病(AIED)；囊性纤维化；格雷夫斯病(Gravesdisease)；心肌炎；自身免疫性肝炎；阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)；帕金森氏病(Parkinson’s disease)；硬皮病；胆囊疾病；桥本氏甲状腺炎(Hashimoto'sThyroiditis)；起源于肠，由抗甲状腺酶和蛋白的抗体诱发的自身免疫反应；常由对诸如疫苗的外部应激物的自身免疫响应诱发的神经系统的吉兰-巴雷(Guillain-Barre)自身免疫攻击；风湿性多肌痛；白血病；和哮喘。
抗病毒剂
本文所述的化合物可用作抗病毒剂。蛋白合成是病毒复制所需的。已经显示AB抑制剂抑制蛋白合成，有理由预期它们将阻止病毒复制并对预防人类感染性疾病有用。实际上，以举例的方式，先前已经显示一种eIF2a磷酸化的诱导剂salubrinal阻止单纯疱疹病毒的复制(Boyce，M.等人，(2005)Science 307(5711)，935–939)。然而，由于毒性问题，Salubrinal不能用于人类。因此，本文公开的R15A/B抑制剂与其它翻译抑制剂相比可具有治疗优势。
申请人已经证明PPP1R15B抑制剂能够预防亨廷顿氏病(Huntington’s disease)。PPP1R15B是组成型表达的，并且因此可较广泛地应用于目标疾病。有理由预期以使靶点仅受到短脉冲抑制的剂量施用的AB抑制剂将预防大多数(如果不是所有的话)蛋白错误折叠疾病。
药物组合物
根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的化合物，用于与任何药学上可接受的载体、助剂或溶媒(vehicle)组合的疗法。
术语“药物组合物”在本发明的上下文中是指包含活性剂以及附加的一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物。
合适的药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员已知的，并且一般包括可接受的组合物、材料、载体、稀释剂或溶媒，它们适于施用本发明的组合物于动物。
在一个实施方案中，上述动物是哺乳动物。在另一个实施方案中，上述哺乳动物是人。
药物制剂包括那些适于口服的、局部的(包括皮肤的、口腔的、眼的和舌下的)、直肠的或肠胃外的(包括皮下的、真皮内的、肌肉内的和静脉内的)、经鼻的、眼内的和肺部给药(例如通过吸入)的药物制剂。在合适情况下，制剂可以独立的剂量单位便利地存在，并且可通过制药领域中任何熟知的方法制备。
剂量可根据患者需求、待治疗病症的严重度和待使用活性成分的特性而变化。确定有效剂量是在技术人员的知识范围内，无过度的负担。施用于包括人的哺乳动物的合适剂型通常在至多100mg/kg体重的范围内，或者可为例如0.1mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg。
根据本发明的另一方面，提供了用于制备如上所述的药物组合物的方法，该方法包括使活性化合物与载体结合，例如通过掺合剂结合。
一般来讲，通过均匀并紧密地使活性剂与液体载体或细粉碎的固体载体或以上二者结合，并且随后根据需要成形产品来制备所述制剂。本发明扩展至制备药物组合物的方法，该方法包括使本文所公开的化合物与药学上可接受的载体或溶媒接合或结合。所有方法包括使活性化合物与液体载体或细粉碎的固体载体或以上二者结合的步骤，并且随后根据需要将产品成形成所需的制剂。
组合
在一个尤其优选的实施方案中，本发明的一种或多种化合物与一种或多种其它活性剂，例如市售的现有药物组合施用。在这种情况下，本发明的抑制剂可以连续、同时或贯序与一种或多种其它活性剂共同施用。
组合R15A抑制剂化合物与R15B抑制剂化合物产生与抑制R15A和R15B这二者的化合物相同的有利特性。因此，本发明的一个方面提供R15A抑制剂化合物和R15B抑制剂化合物的组合。该组合可用于治疗通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B而减轻的疾病状态，例如与错误折叠蛋白的积聚相关联的障碍或蛋白内稳态障碍。该组合可为已知R15A抑制剂胍那苄与R15B抑制剂(E)-2-(2,3-二氯亚苄基)肼-1-甲脒(化合物16)。
当组合使用时，药物一般是更有效的。具体地，组合疗法是可取的，以避免主要毒性、作用机制和耐药机制的重叠。此外，期望将大部分药物以其最大耐受剂量通过这些剂量之间的最短时间间隔施用。组合药物的主要优点是，它可以通过生物化学相互作用促进额外的或可能的协同效应，并且还可以减少耐药性的出现。
有利的组合可以通过以已知的或推测在特定障碍的治疗中有价值的药剂来研究测试抑制剂抑制活性而提出。此过程也可用于确定药剂的施用顺序，即，在递送前、与递送同时、或在递送后的顺序。这样的时序安排可为所有本文中所鉴定的活性剂的特征。
实施例
制备根据本发明的化合物
根据本发明的化合物可根据以下过程制备，它们以E异构体形式示出。根据这些方法，技术人员将已知如何能够获得其它异构体形式或外消旋体。
化合物1-(E)-2-((4-氯苯基)亚甲基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
1 4-氯苯甲醛 0.060g 140.57 0.00042 1.00
2 氨基胍盐酸盐 0.047g 110.55 0.00042 1.00
3 乙酸钠 0.034g 82.03 0.00042 1.00
4 乙醇 1ml
程序：
在25℃下向4-氯苯甲醛(0.060g，0.00042mol)在乙醇(1ml)中的溶液依次加入氨基胍盐酸盐(0.047g，0.00042mol)和乙酸钠(0.034g，0.00042mol)。随后将所得反应混合物在80℃下加热6小时。在使用二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，使反应混合物冷却至25℃并倾倒在NaHCO3饱和溶液(10ml)中。真空滤除所得沉淀物并用水(5ml)洗涤。所得固体材料与二乙醚(2x 2ml)一起研磨并真空干燥以得到标题化合物(0.040g，47.8％产率)。
化合物2-(E)-2-((2,4-二氯嘧啶-5-基)亚甲基)肼-1-甲脒
反应方案：
实验细节：
向化合物-14(0.1g，0.56mmol)在甲醇(2mL)中的溶液加入氨基胍盐酸盐(0.50g，0.45mmol)。反应混合物在65-70℃下搅拌2小时。反应在TLC上显示80％的转化率。减压浓缩反应混合物以提供粗产物，其与乙酸乙酯(30mL)一起搅拌以得到固体材料，将其滤出并随后真空干燥。获得的固体材料通过Prep HPLC纯化进行进一步纯化，得到作为黄色固体的标题化合物(0.028g，27.12％)。
化合物3-(E)-2-(3,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
1 3,4,5-三氯苯甲醛 0.040g 207.92 0.00019 1.00
2 氨基胍盐酸盐 0.021g 110.55 0.00019 1.00
3 乙酸钠 0.015g 82.03 0.00019 1.00
4 乙醇 1ml
程序：
在25℃下向3,4,5-三氯苯甲醛(0.040g，0.00019mol)在乙醇(1ml)中的溶液依次加入氨基胍盐酸盐(0.021g，0.00019mol)和乙酸钠(0.015g，0.00019mol)。随后将所得反应混合物在80℃下加热6小时。在使用二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，使反应混合物冷却至25℃并倾倒在NaHCO3饱和溶液(10ml)中。真空滤除所得沉淀物并用水(5ml)洗涤。所得固体材料与二乙醚(2x 2ml)一起研磨并真空干燥以得到标题化合物(0.036g，70.88％产率)。1H-NMR(DMSO-d6):δ(ppm)7.96(s，2H)；7.89(s，1H)；6.20(brs，2H)；5.69(brs，2H)；MS(ESI+):m/z＝265.1[M+H]+。
化合物4-(E)-2-(2,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
合成1,2,4-三氯-5-碘苯[中间体-1]
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
1 2,4,5-三氯苯胺 4.00g 194.94 0.02051 1.00
2 NaNO2 1.41g 69 0.02051 1.00
3 KI 3.74g 166 0.02251 1.10
4 Na2S2O3.5H2O 1.50g 248.1 0.00610 0.30
5 乙酸 80ml
6 浓度HCl 4ml
7 D.M.水 4.8ml
程序：
将2,4,5-三氯苯胺(4.00g，0.02051mol)在乙酸(80ml)中悬浮液在35℃下加热，直至混合物变得澄清。随后所得反应混合物冷却至25℃。在25℃下将浓HCl(4ml)加入反应混合物，并且随后在相同温度下搅拌反应混合物30分钟。随后在25℃下将NaNO2(1.41g，0.02051mol)在D.M.水(4.8ml)中的溶液加入反应混合物，并且在相同温度下搅拌所得反应混合物30分钟。滤除不溶解物质并用乙酸(3x 15ml)洗涤。在25℃下将KI(3.74g，0.02251mol)加入合并的澄清滤液。在25℃下搅拌所得混合物30分钟，随后将Na2S2O3·5H2O(1.50g，0.00610)加入反应混合物，其在25℃下再搅拌30分钟。滤除反应混合物中最终的不溶解固体并用乙酸(3x 10ml)洗涤。将合并的澄清滤液蒸发至干燥以得到中间体-1(5g，79.6％产率)，其用于下一步骤，无需任何进一步加工。
合成叔丁基(E)-3-(2,4,5-三氯苯基)丙烯酸酯[中间体-2]
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
1 中间体-1 5.00g 305.82 0.01634 1.00
2 叔丁基丙烯酸酯 8.30g 128.1 0.06539 4.00
3 三丁胺 9.00g 185.3 0.04904 3.00
4 三苯膦 0.42g 262.2 0.00162 0.10
5 乙酸钯(II) 0.73g 224.0 0.00325 0.20
6 DMF 30ml
程序：
在25℃下向中间体-1(5.00g，0.01634mol)在DMF(30ml)中的溶液依次加入叔丁基丙烯酸酯(8.30g，0.06539mol)，三丁胺(9.00g，0.04904mol)，三苯膦(0.42g，0.00162mol)和乙酸钯(II)(0.73g，0.00325mol)。随后将所得反应混合物在80℃下加热3小时。在使用正己烷/乙酸乙酯(9/1)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，使反应混合物冷却至25℃。将所得反应混合物蒸发至干燥。将所得残余物悬浮在D.M.水(200ml)中并用乙酸乙酯(3x 250ml)提取。所得合并有机层用盐水(100ml)洗涤，在Na2SO4上干燥并真空浓缩以得到期望的中间体-2(3.3g，65.96％产率)，其用于下一步骤，无需任何进一步加工。
合成2,4,5-三氯苯甲醛[中间体-3]
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
1 中间体-2 0.25g 306 0.00081 1.00
2 二甲基硫醚 0.32ml
3 DCM 30ml
4 甲醇 20ml
程序：
中间体-2(0.25g，0.00081mol)吸收在甲醇:二氯甲烷(2:3)的混合物(50ml)中，并且在干冰/丙酮浴的帮助下将反应混合物冷却至-78℃。在-78℃下将臭氧气体充入反应混合物中，直至反应变为蓝色。在-78℃下将臭氧气体充入反应混合物10分钟后，在-78℃下加入二甲基硫醚(0.32ml)。随后使所得反应混合物升温至室温并搅拌10分钟。在使用正己烷/乙酸乙酯(9/1)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，将反应混合物蒸发至干燥。将所得残余物悬浮在D.M.水(50ml)中并用二乙醚(3x 20ml)提取。所得合并有机层在Na2SO4上干燥并真空浓缩以得到期望的中间体-3(0.25g，定量)，其用于下一步骤，无需任何进一步加工。
合成(E)-2-(2,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
1 中间体-3 0.040g 207.92 0.00019 1.00
2 氨基胍盐酸盐 0.021g 110.55 0.00019 1.00
3 乙酸钠 0.015g 82.03 0.00019 1.00
4 乙醇 1ml
程序：
在25℃下向中间体-3(0.040g，0.00019mol)在乙醇(1ml)中的溶液依次加入氨基胍盐酸盐(0.021g，0.00019mol)和乙酸钠(0.015g，0.00019mol)。随后将所得反应混合物在80℃下加热6小时。在使用二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，使反应混合物冷却至25℃并倾倒在NaHCO3饱和溶液(10ml)中。真空滤除所得沉淀物并用水(5ml)洗涤。所得固体材料与二乙醚(2x2ml)一起研磨并真空干燥以得到标题化合物(0.04g，78.76％产率)。1H-NMR(DMSO-d6):δ(ppm)8.43(s，1H)；8.12(s，1H)；7.77(s，1H)；6.33(brs，2H)；5.83(brs，2H)；MS(ESI+):m/z＝265.17[M+H]+。
化合物5-(E)-2-(3,5-二氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
向3,5-氯-4-氟苯甲醛(0.1g，0.52mmol)在甲醇(2mL)中的溶液加入氨基胍盐酸盐(0.048g，0.43mmol)。反应在65-70℃下搅拌2小时。反应在TLC上显示80％的转化率。冷却并减压浓缩反应混合物以提供粗产物，其与乙酸乙酯(30mL)一起搅拌以得到固体材料，将其过滤并真空干燥。获得的固体材料通过Prep HPLC纯化进行进一步纯化，得到作为白色固体的标题化合物(0.056g，54.24％)。
化合物6-(E)-2-(2,3,4-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
中间体1 0.1g 209.5 0.00047 1
中间体2 0.052g 110.5 0.00047 1
NaOAc 0.039g 82.03 0.00047 1
乙醇 1mL - - 10V
程序
向中间体1(0.1g，0.00047mol)和中间体2(0.052g，0.00047mol)在乙醇(1mL)中的溶液加入NaOAc(0.039g，0.00047mol)并加热至80℃，持续4小时。通过使用DCM中的20％MeOH作为流动相的TLC监控反应进程。将NaHCO3(5mL)的冷溶液加入反应混合物并搅拌10分钟。过滤沉淀物，用水(2X 10mL)充分洗涤并减压干燥以获得纯产物(0.097g，76.98％产率)，对其进行分析。
化合物7-(E)-2-(2,4-二氯-5-氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
向2,4-二氯-5-氟苯甲醛(0.1g，0.52mmol)在甲醇(2mL)中的溶液加入氨基胍盐酸盐(0.046g，0.42mmol)。在65-70℃下搅拌反应混合物2小时。冷却反应混合物并减压去除甲醇从而得到粗产物，其用乙酸乙酯(30mL)结晶以得到固体材料。获得的固体材料通过PrepHPLC纯化进行进一步纯化，得到作为本白色固体的标题化合物(0.1g，96.86％)。
化合物8-(E)-2-(4-氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
向4-氯-3-氟苯甲醛(0.1g，0.63mmol)在甲醇(2mL)中的溶液加入氨基胍盐酸盐(0.056g，0.51mmol)。反应在65-70℃下搅拌2小时。反应在TLC上显示90％的转化率。减压浓缩反应混合物以提供粗产物，其与乙酸乙酯(30mL)一起搅拌以得到固体材料，将其过滤并真空干燥。用柱层析将获得的固体材料进一步纯化，所述柱层析使用硅胶(100-200)和8％MeOH/DCM作为洗脱液以得到作为本白色固体的标题化合物(0.059g，54.48％)。
化合物9–(E)-2-(2-溴-3-氯亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
向2-溴-3-氯苯甲醛(0.63mmol)在甲醇(2mL)中的溶液加入氨基胍盐酸盐(0.79mmol)。反应在65-70℃下搅拌2小时。反应在TLC上显示90％的转化率。减压浓缩反应混合物以提供粗产物，其与乙酸乙酯(30mL)一起搅拌以得到固体材料，将其过滤并真空干燥。用柱层析将获得的固体材料纯化，所述柱层析使用硅胶(100-200)和8.5％MeOH/DCM作为洗脱液以得到标题化合物。
化合物10-(E)-2-(2,3,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
1 2,3,5-三氯苯甲醛 0.040g 207.92 0.00019 1.00
2 氨基胍盐酸盐 0.021g 110.55 0.00019 1.00
3 乙酸钠 0.015g 82.03 0.00019 1.00
4 乙醇 1ml
程序：
在25℃下向2,3,5-三氯苯甲醛(0.040g，0.00019mol)在乙醇(1ml)中的溶液依次加入氨基胍盐酸盐(0.021g，0.00019mol)和乙酸钠(0.015g，0.00019mol)。随后将所得反应混合物在80℃下加热6小时。在使用二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，使反应混合物冷却至25℃并倾倒在NaHCO3饱和溶液(10ml)中。真空滤除所得沉淀物并用水(5ml)洗涤。所得固体材料与二乙醚(2x 2ml)一起研磨并真空干燥以得到标题化合物(0.036g，70.88％产率)。
化合物11-(E)-2-(3,4-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
1 3,4-二氯苯甲醛 0.030g 173.96 0.00017 1.00
2 氨基胍盐酸盐 0.019g 110.55 0.00017 1.00
3 乙酸钠 0.014g 82.03 0.00017 1.00
4 乙醇 1ml
程序：
在25℃下向3,4-二氯苯甲醛(0.030g，0.00017mol)在乙醇(1ml)中的溶液依次加入氨基胍盐酸盐(0.019g，0.00017mol)和乙酸钠(0.014g，0.00017mol)。随后将所得反应混合物在80℃下加热6小时。在使用二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，使反应混合物冷却至25℃并倾倒在NaHCO3饱和溶液(10ml)中。真空滤除所得沉淀物并用水(5ml)洗涤。所得固体材料与二乙醚(2x 2ml)一起研磨并真空干燥以得到标题化合物(0.035g，88.2％产率)。
化合物12-(E)-2-(2,4-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
以下化合物12的合成描述于Nguyen等人，2014，5(10)，1075-1082中
合成方案：
方案：
3,5-二氯苯甲醛(1.0mmol，175mg)和氨基胍盐酸盐(1.0mmol，110mg)在EtOH(2ml)中的溶液回流振荡12小时。在室温下冷却后，在过滤后回收沉淀的最终化合物。回收作为白色粉末的标题化合物(210mg，79％)。
化合物13-(E)-2-(2,4-二氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
中间体1 0.1g 193.03 0.00051 1
中间体2 0.057g 110.5 0.00051 1
NaOAc 0.042g 82.03 0.00051 1
乙醇 1mL - - 10V
程序：
向中间体1(0.1g，0.00051mol)和中间体2(0.057g，0.00051mol)在乙醇(1mL)中的溶液加入NaOAc(0.042g，0.00051mol)并加热至80℃，持续4小时。通过使用DCM中的20％MeOH作为流动相的TLC监控反应进程。将NaHCO3(5mL)的冷溶液加入反应混合物并搅拌10分钟。过滤沉淀物，用水(2X 10mL)充分洗涤并减压干燥以获得纯产物(0.05g；38.75％产率)，对其进行分析。
化合物14-(E)-2-(2,3-二氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
中间体1 0.05g 193 0.00025 1
中间体2 0.028g 110.5 0.00025 1
NaOAc 0.021g 82.03 0.00025 1
乙醇 0.5mL - - 10V
程序：
向中间体1(0.05g，0.00025mol)和中间体2(0.028g，0.00025mol)在乙醇(0.5mL)中的溶液加入NaOAc(0.021g，0.00025mol)并加热至80℃，持续4小时。通过使用DCM中的20％MeOH作为流动相的TLC监控反应进程。将NaHCO3(2.5mL)的冷溶液加入反应混合物并搅拌10分钟。过滤沉淀物，用水(2X 5mL)充分洗涤并减压干燥以获得进行分析的纯产物(0.043g，67.18％产率)，对其进行分析。
化合物15-(E)-2-(3-氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
向3-氯-4-氟苯甲醛(0.1g，0.63mmol)在甲醇(2mL)中的溶液加入氨基胍盐酸盐(0.087g，0.79mmol)。反应在65-70℃下搅拌2小时。反应在TLC上显示80％的转化率。减压浓缩反应混合物以提供粗产物，其与乙酸乙酯(30mL)一起搅拌以得到固体材料，将其过滤并真空干燥。用柱层析将获得的固体材料进一步纯化，所述柱层析使用硅胶(100-200)和8％MeOH/DCM作为洗脱液以得到作为白色固体的标题化合物(0.053g，39.15％)。
化合物16-(E)-2-(2,3-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
程序：
在25℃下向2,3-二氯苯甲醛(1e.)在乙醇(300ml)中的溶液依次加入氨基胍盐酸盐(1eq.)和乙酸钠(1eq.)。随后将所得反应混合物在80℃下加热紧接其后的～6小时。在使用二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，使反应混合物冷却至25℃并倾倒在NaHCO3饱和溶液(700ml)中。真空滤除所得沉淀物并用水(100ml)洗涤。所得固体材料与二乙醚(2x 2ml)一起研磨并真空干燥以得到标题化合物(85％产率)，考虑单乙酸盐)LC-MS:m/z＝231.23(M+H)。1H-NMR(DMSO-d6):δ(ppm)11.85(brs，1H)；8.35(s，1H)；8.19-8.21(dd，1H)；7.56-7.59(dd，1H)；7.32-7.36(t，1H)；7.04(brs，4H)；1.84(s，3H)；MS(ESI+):m/z＝231.23[M+H]+。
化合物17-(E)-2-(2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
程序：
在25℃下向2-氟苯甲醛(1eq.)在乙醇(300ml)中的溶液依次加入氨基胍盐酸盐(1eq.)和乙酸钠(1eq.)。随后将所得反应混合物在80℃下加热紧接其后的～6小时。在使用二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，使反应混合物冷却至25℃并倾倒在NaHCO3饱和溶液(700ml)中。真空滤除所得沉淀物并用水(100ml)洗涤。所得固体材料与二乙醚(2x 25ml)一起研磨并真空干燥以得到标题化合物。
化合物18-(E)-2-(4,5-二氯-2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
步骤-1：
步骤-2：
步骤-3：
步骤-4：
化合物20–(E)-2-(2-氯-5-氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
中间体1 0.1g 158.6 0.00063 1
中间体2 0.069g 110.5 0.00063 1
NaOAc 0.051g 82.03 0.00063 1
乙醇 1mL - - 10V
程序：
向中间体1(0.1g，0.00063mol)和中间体2(0.069g，0.00063mol)在乙醇(1mL)中的溶液加入NaOAc(0.051g，0.00063mol)并加热至80℃，持续4小时。通过使用DCM中的20％MeOH作为流动相的TLC监控反应进程。将NaHCO3(5mL)的冷溶液加入反应混合物并搅拌10分钟。过滤沉淀物，用水(2X 10mL)充分洗涤并减压干燥以获得纯产物(0.086g；63.07％产率)。
化合物22-(E)-2-((2,6-二氯吡啶-3-基)亚甲基)肼-1-甲脒
反应方案：
实验细节：
向2,6-二氯烟醛(0.1g，0.57mmol)在甲醇(2mL)中的溶液加入氨基胍盐酸盐(0.079g，0.71mmol)。反应混合物在65-70℃下搅拌2小时。反应在TLC上显示80％的转化率。减压浓缩反应混合物以提供粗残余物，其与乙酸乙酯(30mL)一起搅拌以得到固体材料，将其过滤并真空干燥。用柱层析将固体材料进一步纯化，所述柱层析使用硅胶(100-200)和5％MeOH/DCM作为洗脱液以得到作为黄色固体的期望化合物(0.040g，30.99％)。
化合物23-(E)-2-(3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
向3-氟苯甲醛(0.1g，0.81mmol)在甲醇(2mL)中的溶液加入氨基胍盐酸盐(0.047g，0.43mmol)。反应混合物在65-70℃下搅拌2小时。反应在TLC上显示90％的转化率。减压浓缩反应混合物以提供粗残余物，其与乙酸乙酯(30mL)一起搅拌以得到固体材料，将其过滤并真空干燥。用柱层析将固体材料进一步纯化，所述柱层析使用硅胶(100-200)和6.5％MeOH/DCM作为洗脱液以得到作为白色固体的期望化合物(0.069g，66.83％)。
化合物24-(E)-2-(3-氯亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
1 3-氯苯甲醛 0.050g 140.57 0.00035 1.00
2 氨基胍盐酸盐 0.039g 110.55 0.00035 1.00
3 乙酸钠 0.028g 82.03 0.00035 1.00
4 乙醇 1ml
程序：
在25℃下向3-氯苯甲醛(0.050g，0.00035mol)在乙醇(1ml)中的溶液依次加入氨基胍盐酸盐(0.039g，0.00035mol)和乙酸钠(0.028g，0.00035mol)。随后将所得反应混合物在80℃下加热6小时。在使用二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，使反应混合物冷却至25℃并倾倒在NaHCO3饱和溶液(10ml)中。真空滤除所得沉淀物并用水(5ml)洗涤。所得固体材料与二乙醚(2x 2ml)一起研磨并真空干燥以得到标题化合物(0.035g，50.19％产率)。
化合物25-(E)-2-(3-氯-2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
向2-氯-3-氟苯甲醛(0.1g，0.63mmol)在甲醇(2mL)中的溶液加入氨基胍盐酸盐(0.087g，0.79mmol)。反应在65-70℃下搅拌2小时。反应在TLC上显示90％的转化率。减压浓缩反应混合物以提供粗产物，其与乙酸乙酯(30mL)一起搅拌以得到固体材料，将其过滤并真空干燥。用柱层析将固体材料纯化，所述柱层析使用硅胶(100-200)和8.5％MeOH/DCM作为洗脱液以得到作为白色固体的标题化合物(0.088g，68.19％)。
化合物26-(E)-2-(2,5-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
1 2,5-二氯苯甲醛 0.045g 173.96 0.00025 1.00
2 氨基胍盐酸盐 0.028g 110.55 0.00025 1.00
3 乙酸钠 0.020g 82.03 0.00025 1.00
4 乙醇 1ml
程序：
在25℃下向2,5-二氯苯甲醛(0.045g，0.00025mol)在乙醇(1ml)中的溶液依次加入氨基胍盐酸盐(0.028g，0.00025mol)和乙酸钠(0.020g，0.00025mol)。随后将所得反应混合物在80℃下加热6小时。在使用二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，使反应混合物冷却至25℃并倾倒在NaHCO3饱和溶液(10ml)中。真空滤除所得沉淀物并用水(5ml)洗涤。所得固体材料与二乙醚(2x 2ml)一起研磨并真空干燥以得到标题化合物(0.039g，65.55％产率)。
化合物27-(E)-2-(2-氯-3,4-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
中间体1 0.04g 176.55 0.00022 1
中间体2 0.025g 110.5 0.00022 1
NaOAc 0.018g 82.03 0.00022 1
乙醇 0.4mL - - 10V
程序：
向中间体1(0.04g，0.00022mol)和中间体2(0.025g，0.00022mol)在乙醇(0.4mL)中的溶液加入NaOAc(0.018g，0.00022mol)并加热至80℃，持续4小时。通过使用DCM中的20％MeOH作为流动相的TLC监控反应进程。将NaHCO3(2.5mL)的冷溶液加入反应混合物并搅拌10分钟。过滤沉淀物，用水(2X 5mL)充分洗涤并减压干燥以获得纯产物(0.063g，95.43％产率)，对其进行分析。
化合物29-(E)-2-(2-氯-3,5-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
中间体1 0.06g 176.55 0.00033 1
中间体2 0.037g 110.5 0.00033 1
NaOAc 0.027g 82.03 0.00033 1
乙醇 0.6mL - - 10V
程序：
向中间体1(0.06g，0.00033mol)和中间体2(0.037g，0.00033mol)在乙醇(0.6mL)中的溶液加入NaOAc(0.027g，0.00033mol)并加热至80℃，持续4小时。通过使用DCM中的20％MeOH作为流动相的TLC监控反应进程。将NaHCO3(2.7mL)的冷溶液加入反应混合物并搅拌10分钟。过滤沉淀物，用水(2X 2.7mL)充分洗涤并减压干燥以获得进行分析的纯产物(0.04g，50.63％产率)。
化合物30-(E)-2-(3-氯-2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
向3-氯-2-氟苯甲醛(0.1g，0.63mmol)在甲醇(2mL)中的溶液加入氨基胍盐酸盐(0.087g，0.79mmol)。反应在65-70℃下搅拌2小时。反应在TLC上显示90％的转化率。减压浓缩反应混合物以提供粗产物，其与乙酸乙酯(30mL)一起搅拌以得到固体材料，将其过滤并真空干燥。用柱层析将获得的固体材料纯化，所述柱层析使用硅胶(100-200)和8.5％MeOH/DCM作为洗脱液以得到标题化合物。
化合物31-(E)-2-(2,3,6-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
在25℃下向2,3,6-三氯苯甲醛(0.040g，0.00019mol)在乙醇(1ml)中的溶液依次加入氨基胍盐酸盐(0.021g，0.00019mol)和乙酸钠(0.015g，0.00019mol)。随后将所得反应混合物在80℃下加热紧接其后的6小时。在使用二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，使反应混合物冷却至25℃并倾倒在NaHCO3饱和溶液(10ml)中。真空滤除所得沉淀物并用水(5ml)洗涤。所得固体材料与二乙醚(2x 2ml)一起研磨并真空干燥以得到标题化合物。
化合物32-(E)-2-(2-氯-4,5-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
中间体1 0.1g 176.55 0.00056 1
中间体2 0.062g 110.5 0.00056 1
NaOAc 0.046g 82.03 0.00056 1
乙醇 1mL - - 10V
程序：
向中间体1(0.1g，0.00056mol)和中间体2(0.062g，0.00056mol)在乙醇(1mL)中的溶液加入NaOAc(0.046g，0.00056mol)并加热至80℃，持续4小时。通过使用DCM中的20％MeOH作为流动相的TLC监控反应进程。将NaHCO3(5mL)的冷溶液加入反应混合物并搅拌10分钟。过滤沉淀物，用水(2X 10mL)充分洗涤并减压干燥以获得进行分析的纯产物(0.117g，89.31％产率)。
化合物34-(E)-2-(3,5-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
合成方案：
实验细节：
计算：
化学品 数量 分子量 摩尔 摩尔比
1 3,5-二氯苯甲醛 0.030g 173.96 0.00017 1.00
2 氨基胍盐酸盐 0.019g 110.55 0.00017 1.00
3 乙酸钠 0.013g 82.03 0.00017 1.00
4 乙醇 1ml
程序：
在25℃下向3,5-二氯苯甲醛(0.030g，0.00017mol)在乙醇(1ml)中的溶液依次加入氨基胍盐酸盐(0.019g，0.00017mol)和乙酸钠(0.013g，0.00017mol)。随后将所得反应混合物在80℃下加热紧接其后的6小时。在使用二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，使反应混合物冷却至25℃并倾倒在NaHCO3饱和溶液(10ml)中。真空滤除所得沉淀物并用水(5ml)洗涤。所得固体材料与二乙醚(2x 2ml)一起研磨并真空干燥以得到标题化合物(0.038g，95.8％产率)。
通用方法A：
在25℃下向苯甲醛(1eq.)在乙醇(300ml)中的溶液依次加入氨基胍盐酸盐(1eq.)和乙酸钠(1eq.)。随后将所得反应混合物在80℃下加热紧随其后的～6小时。在使用二氯甲烷/甲醇(8/2)作为流动相的TLC上监控反应完全。在反应完全后，使反应混合物冷却至25℃并倾倒在NaHCO3饱和溶液(700ml)中。真空滤除所得沉淀物并用水(100ml)洗涤。所得固体材料与二乙醚(2x 25ml)一起研磨并真空干燥以得到期望的取代氨基胍衍生物。
根据通用方法A制备以下化合物：
实施例1(化合物16(E)):(E)-2-(2,3-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
按照通用方法A从2,3-二氯苯甲醛制备，85％产率(考虑单乙酸盐)LC-MS:m/z＝231.23(M+H)。1H-NMR(DMSO-d6):δ(ppm)11.85(brs，1H)；8.35(s，1H)；8.19-8.21(dd，1H)；7.56-7.59(dd，1H)；7.32-7.36(t，1H)；7.04(brs，4H)；1.84(s，3H)；MS(ESI+):m/z＝231.23[M+H]+。
实施例2:(E)-2-(2-氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
按照通用方法A从2-氯-4-氟苯甲醛制备，67％产率。1H-NMR(DMSO-d6):δ(ppm)5.80(brs，2H)；5.84(brs，2H)；7.19-7.34(m，4H)；8.16(s，1H)；MS(ESI+):m/z＝215.1[M+H]+。
对PPP1R15B抑制执行实施例A的方案和测定。然而，应当理解，本文所述方法同样适用于鉴定/分析PPP1R15A和PPP1R15B抑制剂。
实例A
通过表面等离子共振的蛋白表达、纯化和分析
蛋白表达和纯化
如下表达并纯化PPP1R15A325-636和PPP1R15B340-698：将编码PPP1R15A的氨基酸325-636和PPP1R15B的氨基酸340-698的cDNA加组氨酸标记并克隆进pMAL-c5x。重组PPP1R15A/B在BL21-Gold细胞中表达并通过在HisTrap HP柱(GEHealthcare)以及随后的MBPTrap HP柱(GEHealthcare)上的亲和色谱纯化。蛋白质在用SimplyBlue SafeStain(LifeTechnologies)染色的BOLT SDS-PAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(Life Technologies)上分析。将编码人PP1γ的cDNA克隆进杆状病毒转移载体pDW464以添加生物素受体肽(BAP)。该载体也编码大肠杆菌生物素全酶合成酶(BirA)，以使BAP-标记的蛋白可在秋粘虫(Spodopterefrugiperda)(Sf9)昆虫细胞中进行体内生物素酰化(Duffy等人，Anal.Biochem.，262，122-128，1998)。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Life Technologies)用于产生重组杆状病毒质粒DNA，并且Sf9昆虫细胞用于扩增病毒原液。培养物通过在1,200g下离心15分钟收集，细胞沉淀物重悬在裂解缓冲液(50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，0.2％Triton，5％甘油，1PiC片剂(Roche)/50ml以及0.2mM PMSF)中并随后进行轻柔超声处理。蛋白质首先在5ml HiTrapQ HP柱(GE Healthcare)上纯化，随后通过HiLoad 16/600Superdex 200柱(GEHealthcare)纯化。收集通过SDS-PAGE和蛋白质印迹确认的阳性级分，浓缩至～1μM并存储在-80℃。
在SA传感器芯片上捕集生物素–PP1
使用Biacore T200(GE Healthcare)系统用于所有实验，并且生物素酰化的PP1使用传感器芯片SA(GEHealthcare，目录号BR-1005-31)捕集。链亲和素涂覆的表面通过用50mMNaOH和1MNaCl的溶液注射1分钟来活化。生物素–PP1在运行缓冲液(50mM Tris pH7.5，100mMNaCl，0.1mM EGTA，1mM MnCl2，0.05％Tween 20)中稀释并以大约300nM的浓度直接注射到链亲和素涂覆的表面上，持续100秒，或者达到对应于～7000RU的生物素–PP1固定水平。对其中一个SA传感器芯片表面进行空白固定，用作参考。
使用生物素-PP1表面测定小分子与eIF2α全磷酸酶复合物的稳态结合常数
在所有结合实验中使用仅有微小偏差的相同程序和条件。小分子以在100％DMSO中的50mM原液形式储存。在测定结合常数前，在96-孔板的运行缓冲液中制备12个或8个浓度的化合物的系列稀释。在每个化合物稀释系列之前，在运行缓冲液中将调节亚基R15A或R15B稀释至15μM，并在生物素-PP1表面上捕集，从而在传感器芯片表面上形成全磷酸酶复合物。随后，不再生表面，将化合物稀释系列注射到芯片表面上。使用Biacore T200评估软件和基于稳态模型测定的结合常数分析传感图。使用不同浓度的化合物及其测定的相应平衡结合水平进行动力学实验。这些平衡响应水平(Req)对浓度作图并使用全局拟合进行拟合，其能够测定稳态亲和常数，即，在50％饱和度的浓度为KD(Frostell-Karlsson等人，J.Med.Chem.，43，1986-1992，2000)。
哺乳动物细胞培养物
在分别含有5％和10％胎牛血清(FBS)并补充有青霉素、链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Media，DMEM)中培养海拉细胞。MEF细胞在补充有青霉素、链霉素、谷氨酰胺、55μMβ-巯基乙醇、1X非必需氨基酸(Sigma-Adrich)和10％FBS的DMEM中培养。根据指示，细胞用2.5μg/ml衣霉素，1mMDTT(Sigma-Adrich)和/或指示浓度的指示化合物进行处理。
通过免疫印迹进行蛋白质分析
对于免疫印迹，在每个实验前24小时将海拉细胞(80,000个细胞/ml)铺于12-孔板中。紧接着上述指示的处理之后，细胞在75μlLaemmli Buffer中裂解，在95℃下煮沸5分钟并用超声波处理。分离蛋白并如下所述用以下抗体分析(Tsaytler等人，Science，332，91-94，2011)：phospho-eIf2α[pS52]和PPP1R15A/GADD34(10449-1-AP；ProteinTech Group，1/1000稀释)以及ATF4(Sc-200Santa Cruz)。
评估细胞活力
在处理前24小时将细胞铺于24-孔板中，密度为15,000(海拉)或12,000个细胞/ml(MEFs)。通过加入包含2.5μg/ml衣霉素(Sigma-Aldrich)的新鲜培养基引发ER应激。实施例1的化合物溶解在DMSO中并如所指出的那样加入。DMSO用作模拟处理。利用细胞活力计数试剂盒(Cell Viability Counting Kit-8)(Dojindo)，根据供应商的推荐，在衣霉素处理48小时后通过测量WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑鎓]还原成甲臜的情况，评估细胞活力。
利用细胞活力计数试剂盒(Cell Viability Counting Kit-8)(Dojindo)或在使用相差显微镜和IncuCyteTM Cytotox Green Reagent的Incucyte(Essenbioscience)中评估化合物毒性。
动物研究
所有动物护理和程序符合对于使用动物进行研究的规定(英国动物科学程序法案，UKAnimals Scientific Procedures Act of 1986)，获得当地伦理委员会的批准。
为了研究实施例1的化合物对体重的效应，C3H/B6小鼠每日一次口服实施例1的化合物并且每日记录小鼠体重，持续2周。
为了评估实施例1的化合物对减轻疾病表型的功效，28-日龄的转基因小鼠或同窝对照小鼠每日口服实施例1的化合物(2mg/kg)或溶媒，持续4周。通过在处理期间通过给小鼠称重并且在处理4周后评估它们的运动能力，评估疾病进展。
为了评估是否实施例1的化合物具有胍那苄的副作用，小鼠(n>3)口服10mg/kg的化合物或胍那苄。在给药后监控它们的活动30分钟。胍那苄处理过的小鼠在给药后30分钟不运动，这是由于胍那苄的降血压活性，相比之下，用实施例1的化合物处理过的小鼠与未处理小鼠一样活跃。
八周龄的HD-N171-82Q小鼠和它们的野生型同窝小鼠首先在静止转子上适应1分钟并在恒定速度(4rpm)下适应1分钟。重复适应过程。测试阶段由四个试验组成，每个试验之间有15分钟的间隔。对于每个试验，将5只小鼠置于加速转子(4至40rpm)上并记录跌落的延迟时间，个体动物的最大时间限设为300秒。
为了治疗代谢疾病，Db/db动物(每种条件n＝5)用1mg/kg的实施例1的化合物每日治疗一次，持续三周。在9和10am间用血糖仪(DSI)测量血糖水平。数据为平均值+/-标准误。
定量RT-PCR
将在trizol(Life Technologies)中从大脑提取RNA。使用NANODROP1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量RNA浓度，并且使用SuperScript逆转录酶(LifeTechnologies)将1μg逆转录成cDNA。定量PCR利用引物
GAPDH(f):ACCACAGTCCATGCCATCAC，
GAPDH(r):TCCACCACCCTGTTGCTGTA，
PPP1R15A(f):CCTCCTGAAACTTGGGGACT；和
PPP1R15A(r):GCTGTGATGTGGGATAAGCG，使用 Select Master Mix(Ref4472908，applied biosystems)在Corbett Rotor-Gene 6000型上进行。每个基因的表达对居家基因GAPDH进行归一化并表达为使用Paffl公式计算出的倍数改变。
DRG培养物
从在13.5或发育(E13.5)的野生型或Pmp22Tr-J(PMP22突变体)(Henry等人，Neuropathol.Exp.Neurol.，42，688-706，1983)胚胎中切出的背根神经节(DRG)在胶原涂敷的盖玻片上的neurobasal培养基中培养7天，所述培养基补充有4g/l葡萄糖，2mM L-谷氨酰胺，2％B27补充剂和50ng/ml神经生长因子(NGF)。为了分化神经膜细胞并诱导髓鞘形成，随后将培养的DRG保持在C-培养基(MEM培养基，补充有4g/l葡萄糖，2mM L-谷氨酰胺，10％FCS，50ng/ml NGF)中。为了通过神经膜细胞的髓鞘形成，每隔一天更换C-培养基，其新添加50μg/ml抗坏血酸±5nM实施例I的化合物，并且培养14天。培养的DRG随后在4％多聚甲醛中固定并用MBP免疫染色(大鼠髓鞘碱性蛋白，1/250稀释，ab73498)。
小鼠的参考文献是PubmedID:631386。
生物化学测定
测定1:选择性结合PPP1R15B-PP1的选择性PPP1R15B抑制剂(图1)
表面等离子共振(SPR)用于测量化合物与PPP1R15A/B-PP1磷酸酶复合物的结合亲和力。生物素受体肽(BAP)融合在PP1γ的N-末端上，这使BAP-标记的蛋白能够在Sf9昆虫细胞中进行生物素酰化。在纯化后，BAP-PP1γ蛋白在链亲和素传感器芯片(SA-芯片，GEhealthcare)上捕集至～5.000RU的响应水平。使用受控生物素酰化能够定向并均匀的固定传感器芯片表面。随后使用PP1γ以在链亲和素芯片表面上捕集PPP1R15A/B并形成全磷酸酶复合物。这种复合物随后能够用于测试化合物的结合。10μM PPP1R15A/B蛋白浓度用于在80秒注射期间形成全磷酸酶复合物。在已经捕集了PPP1R15A/B后，将一系列浓度的化合物注射在芯片表面，测量化合物与全磷酸酶的结合。在完成浓度系列(8或12个浓度)后，用3M NaCl再生表面，并且能够再次捕集R15A/B以形成新的全磷酸酶复合物，用于测量另一个化合物浓度系列的结合。分析作为浓度函数的平衡结合水平得到相互作用亲和力或稳态结合亲和力(KD)。
图1示出实施例1的化合物的KD值。0.035μM PPP1R15B-PP1和1μM PPP1R15A-PP1的KD表明实施例1的化合物选择性结合至PP1R15B-PP1复合物，但是该结合显著小于PPP1R15A-PP1复合物。
测定2:在无应激的情况下选择性PPP1R15B抑制剂诱导细胞中eIF2α的瞬时磷酸化(图2A和B)
利用与重组蛋白的体外结合测定揭示实施例1的化合物的选择性。然而，虽然结合测定可用于筛选结合PPP1R15B的选择性化合物，但是通过结合测定未必预测出化合物的特性。因此，需要其它测定以评估是否化合物抑制PPP1R15B的功能。
人类细胞用PPP1R15B抑制剂处理，并且监控随时间推移的eIF2α磷酸化。发明人发现在无应激的情况下(在其中细胞不表达PPP1R15A的情况下)，用实施例1的化合物处理细胞诱导eIF2α磷酸化。这在加入实施例1的化合物1小时和7.5小时之间出现。然而，在加入实施例1的化合物后10小时，eIF2α磷酸化恢复至基线水平。这表明在这个时间点存在活性eIF2α磷酸酶。实际上，发明人注意到在加入实施例1的化合物后的后期时间点时，PPP1R15A被诱导(参见测定3)。eIF2α磷酸化的瞬时诱导表明该化合物是细胞中的PPP1R15B的选择性抑制剂。此外，这证实实施例1的化合物激发PPP1R15A。这一测定可用于鉴定其它选择性PPP1R15B抑制剂。
测定3:选择性PPP1R15B抑制剂诱导细胞中PPP1R15A的表达(图2A和B)
细胞和生物体通常具有缺陷补偿机制。因此发明人考虑是否细胞可通过诱导PPP1R15A来补偿PPP1R15B抑制。以前已经报道了PPP1R15B敲除小鼠的肝脏中的PPP1R15A水平提高(Harding等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，106，1832-1837，2009)。尚不清楚是否这种补偿响应是肝脏特异性的，或者是否它可发生在细胞或其它组织中。此外，在这一研究之前，不知道是否PPP1R15A诱导可在PPP1R15B的药理抑制时观察到，因为在这一研究之前它们不是PPP1R15B的选择性抑制剂。
图2B展示发现用实施例1的化合物处理的细胞诱导PPP1R15A。诱导PPP1R15A的这一特性可用作筛选PPP1R15B抑制剂的方法，因为诱导细胞中的PPP1R15A表达的化合物将具有PPP1R15B抑制特性。例如，可设计PPP1R15A基因或融合到报告基因上的启动子的测定并将其开发利用到HTS筛选中，用于鉴定诱导PPP1R15A的化合物。
测定4:保护细胞免于应激的选择性PPP1R15B抑制剂(图3)
图3展示保护细胞免于应激的选择性PPP1R15B抑制剂。在存在0.2-5M实施例1的化合物的情况下，使用衣霉素(2.5ug/ml)应激细胞。在处理后3天测量细胞活力。
实施例1的抑制剂保护细胞免于衣霉素引起的细胞毒性应激。抗ER应激的细胞保护作用可通过合适的测定进行测量。在此情况下，测量海拉细胞中的细胞保护作用，其中通过加入包含衣霉素(一种阻断N-糖基化的药物)的培养基引起ER应激，从而阻止蛋白质折叠并诱导未折叠蛋白反应。随后在一组时间段后，利用来自Dojindo的标准细胞活力试剂盒(Cell Viability Counting Kit-8)，通过测量WST-8向甲臜的还原，在存在和不存在实施例1的化合物的情况下检测细胞活力。ER应激的细胞保护作用根据在ER应激后存活细胞的百分比增加(相对于对照)进行测量。
测定5:选择性PPP1R15B抑制剂在应激恢复期间延长eIF2a磷酸化(图4)
发明人推断PPP1R15B抑制剂将在应激后延长eIF2α磷酸化。为了揭示这种活性，寻找其中不表达PPP1R15A的情况以避免混杂效应是至关重要的。发明人利用通过DTT的应激诱导的快速动力学和可逆性(Bertolotti等人，Nat.Cell.Biol.，2，326-332，2000；Jousse等人，2003)并且在用1mM DTT处理30分钟并洗脱后监控细胞中的eIF2α磷酸化。发明人发现通常发生在DTT洗脱后的eIF2α磷酸化的下降延迟了，并且这发生在任何显著的PPP1R15A诱导之前。因此，在应激-恢复范例(如本文所述的应激恢复)的早期阶段对eIF2α去磷酸化动力学的仔细监控可用于鉴定其它PPP1R15B抑制剂。
小鼠中实施例1的化合物(图5)具有良好的组织分布
在口服实施例1的化合物后的不同时间分析小鼠组织(血浆、脑、脊髓、胰腺、肝脏)揭示PPP1R15B抑制剂具有广泛的组织分布，并且因此展示在治疗各种疾病和影响不同器官的疾病中的应用。
用实施例1的化合物处理小鼠对小鼠无毒性(图6)
用实施例1处理小鼠并密切监控以检测任何临床征象。发现持续2周用多达10mg/mg实施例1的化合物每天处理一次的小鼠与用安慰剂处理的小鼠无法区分，并且小鼠体重正常增加(图6)。这确定PPP1R15B抑制无毒性。这是令人惊讶的且未预料到的，因为在这一研究之前本来推测PPP1R15B抑制剂将是有毒性的，使得它们将不具有治疗潜力。
用实施例1的化合物处理小鼠不引起由胍那苄引起的副作用(图7)
在人体中，胍那苄的肾上腺素激动剂活性具有副作用，包括在高剂量下的嗜睡和昏迷(A.H.Hall，Ann Intern Med 102；787–788；1985)。由于这些副作用，胍那苄不再用于人类。预测胍那苄衍生物具有胍那苄的副作用，其与α-2肾上腺素活性相关联。虽然胍那苄与α-2肾上腺素受体的结构活性关系不可用，发明人令人惊讶地发现本文实施例1无胍那苄的副作用，尽管结构上非常相似。
测定6:在用实施例1的化合物处理后，在哺乳动物中诱导PPP1R15A(图8)
通过对从用指示剂量的实施例1的化合物处理过的小鼠大脑中提取的总mRNA的qPCR评估PPP1R15A诱导。
类似于已在细胞中观察到的，发现在用实施例1的化合物处理后，小鼠诱导PPP1R15A，并且这种诱导是剂量依赖性的。这解释了为什么小鼠耐受选择性PPP1R15B抑制剂：PPP1R15A诱导将eIF2α去磷酸化，确保由实施例1的化合物引起的PPP1R15B抑制导致的eIF2α磷酸化仅仅是瞬时的。这是重要的，因为eIF2α的持续磷酸化是有害的。PPP1R15B抑制剂的体内PPP1R15A诱导是一种药效动力学参数，其可用于在临床前研究或临床研究中评估哺乳动物中的PPP1R15B抑制剂的功效和效能。
实施例1的化合物预防哺乳动物中的疾病(图9)
通过抑制PPP1R15B增加折叠具有有益于非常广泛的人类病理的潜力。为了测试这个观点，发明人研究了亨廷顿氏病(Huntington’s disease，HD)，一种蛋白内稳态疾病，其由错误折叠蛋白(突变亨廷顿蛋白)的积聚引起。有一些报道指出突变亨廷顿蛋白诱导UPR(Duennwald和Lindquist，Gene&Development，22，3308-3319，2008；Nishitoh等人，Genes&Development，16，1345-1355，2002)。然而，发明人未能在亨廷顿氏病(Huntington’sdisease)模型中检测到PPP1R15A，表明PPP1R15A不是HD的治疗靶点。因为HD迄今无治疗方法，发明人测试是否HD可通过PPP1R15B抑制进行预防。发明人发现用2mg/kg实施例1的化合物处理HD小鼠预防运动能力障碍(图9)。这证明PPP1R15B是有效的治疗靶点，并且因此PPP1R15B抑制将在治疗并预防疾病中有用。
如本文所示，为了测定是否一种疾病能够通过PPP1R15B抑制进行预防或改善，小鼠模型或人类可用耐受剂量的抑制剂进行处理。为了证明体内的靶点抑制，可监控PPP1R15B途径的标记物并将其用作药效动力学标记物。此类标记物可为如本文所示的PPP1R15A(图8)或任何其它途径上的靶点，例如UPR或ISR标记物(包括但不限于eIF2α磷酸化、CHOP、ATF4)。如本文用实施例1的化合物所示，只要它是安全的，PPP1R15B抑制剂将可用于治疗，并且这通过化合物对PPP1R15B的选择性进行测定。
在神经病变小鼠的外植体中的髓鞘形成(图10).
CMT是一类髓鞘神经病变，其由多个基因的突变引起。在外周髓鞘蛋白PMP22中的突变是CMT最常见的起因。PMP22(Trembler-J)中的突变引起PMP22的错误折叠以及小鼠中的疾病，其类似于人的CMT，这是由于外周神经系统中的髓鞘质缺陷引起。来自PMP22突变小鼠的外植体重现了人类疾病中观察到的严重的髓鞘形成减少。发明人发现处理来自PMP22突变小鼠的背根神经节培养物(DRG)改善髓鞘形成。以前已经发现来自突变小鼠的DRG培养物是预测化合物的治疗功效的有用的模型。因此，此处提供的数据表明实施例1的化合物在治疗由PMP22的突变或过度产生引起的疾病(例如CMT疾病)中是有用的。实施例1的化合物在治疗其它髓鞘质障碍中也是有用的。
评估对代谢疾病的PPP1R15B功效(图11)
已知代谢疾病如糖尿病、肥胖症、脂肪性肝病、和动脉粥样硬化与病理ER应激相关联，并且据信UPR的药理调节剂可具有治疗有益效果。因为在这一研究之前不存在可用的PPP1R15B抑制剂，不清楚是否PPP1R15B可为代谢疾病中的治疗靶点。发明人测试了这种可能性并且发现用实施例1的化合物处理肥胖小鼠减少了这些哺乳动物中的病理高血糖(图11)。这表明用实施例1的化合物进行治疗能够改善代谢疾病。
在一个疾病模型中已经示出用实施例1的化合物进行治疗是有益的，明显的是本发明的化合物将有益于其它哺乳动物代谢障碍，如糖尿病、肥胖症、脂肪性肝病、和动脉粥样硬化。
实施例B
蛋白表达和纯化
如前文所述表达并纯化MBP-R15A325-636-His和MBP-R15B340-698-His(Das等人，Science，2015)。将编码人PP1γ的cDNA克隆进杆状病毒转移载体pDW464以添加N-末端生物素受体肽(BAP)。该载体也编码大肠杆菌生物素全酶合成酶(BirA)，以使BAP-标记的蛋白可在秋粘虫(Spodoptere frugiperda)(Sf9)昆虫细胞中，进行体内生物素酰化(bio-PP1c)(Duffy等人，Anal.Biochem.，262，122-128，1998)。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(ThermoFisher Scientific)用于产生重组杆状病毒质粒DNA，并且Sf9昆虫细胞用于扩充病毒原液。使用Sf9昆虫细胞在Insect-Xpress培养基(Lonza)中产生蛋白。bio-PP1c通过在HiTrapQ HP柱(GE Healthcare)上的阴离子交换色谱进行纯化，随后通过凝胶过滤(HiLoad 16/600Superdex 200柱，GE Healthcare)纯化。所述蛋白在用InstantBlue(Expedeon)染色的BOLT SDS-PAGE4-12％Bis-Tris凝胶(Thermo Fisher Scientific)上分析，并且生物素酰化的PP1的存在通过利用Pierc高敏感链亲和素-HRP抗体(Thermo Fisher Scientific)的蛋白质印迹进行确认。这产生部分纯化的蛋白，而由于生物素对链亲和素的高亲和力和特异性，完全纯化在后期实现(在SPR芯片上)。
表面等离子共振(SPR)
在SA传感器芯片上捕集bio-GBZ或bio–PP1c
使用Biacore T200(GE Healthcare)系统用于所有实验，并且生物素酰化的GBZ(bio-GBZ){Tsaytler:2011ji}或bio-PP1在传感器芯片SA(GE Healthcare)上捕集。链亲和素涂覆的表面通过用50mM NaOH和1M NaCl的溶液以10μl/min的流速进行1分钟的注射三次，进行活化。bio-GBZ或bio–PP1c在运行缓冲液(50mM Tris pH7.5，100mM NaCl，0.1mMEGTA，0.05％Tween 20，0.1％DMSO)中稀释并以大约300nM的浓度、10μl/min的流速直接注射到链亲和素涂覆的表面达到分别对应于～200和6000RU的bio-GBZ或bio–PP1c固定水平。对其中一个SA传感器芯片表面进行空白固定，用作参考。
使用bio-PP1c表面测定小分子与R15全磷酸酶复合物的稳态结合常数
小分子以在100％DMSO中的50mM原液形式储存。在测定结合常数前，在96-孔板的运行缓冲液中制备12个或8个浓度的化合物的系列稀释。在每个化合物稀释系列之前，在运行缓冲液中将调节亚基MBP-R15A325-636-His或MBP-R15B340-698-His稀释至10μM，并以30μl/min的流速在bio-PP1c表面上捕集1分钟，从而在传感器芯片表面上形成全磷酸酶复合物。此后通过1分钟的稳定期间，以洗脱任何非特异性的结合。随后，不再生表面，以30μl/min的流速将化合物稀释系列注射到芯片表面上，持续1分钟，随后是2分钟的解离时间。在每个稀释系列后，使用3M NaCl再生表面90秒。在再生后，SPR响应一般恢复至基线水平，并且bio-PP1c表面为下一个化合物稀释系列准备就绪。为了能修正样品间DMSO浓度的微小差异，每隔50个循环注入范围为0.06至8％的DMSO的八个溶剂样品。流式细胞温度为10℃。
数据分析
使用Biacore T200评估软件和基于稳态模型测定的结合常数分析传感图。使用不同浓度的化合物及其测定的相应平衡结合水平进行动力学实验。这些平衡响应水平(Req)对浓度作图并使用全局拟合进行拟合，其能够测定稳态亲和常数，即，在50％饱和度的浓度为KD。KD值在表1中示出。
测量抗ER应激的细胞保护作用
将海拉细胞(40,000个细胞/ml)铺于96-孔板中并用不同浓度(0–20μM)的化合物处理，根据指示在存在250ng/ml衣霉素的情况下处理72小时。为了监控细胞凋亡，将1/2000稀释的CellTox绿色染料(Promega)加到培养基中。监控随时间推移的细胞生长，并且每隔2小时用IncuCyte ZOOM系统拍照并通过IncuCyte ZOOM软件(Essen BioScience)进行分析。表1示出化合物保护细胞免于由衣霉素引起的细胞毒性应激的能力。抗ER应激的细胞保护作用可通过合适的测定进行测量。在此情况下，测量海拉细胞中的细胞保护作用，其中通过加入包含衣霉素(一种阻断N-糖基化的药物)的培养基引起ER应激，从而阻止蛋白质折叠并诱导未折叠蛋白反应。随后在一组时间段后，通过监控随时间推移的细胞生长，在存在和不存在表1列出的化合物的情况下检测细胞活力。ER应激的细胞保护作用根据在ER应激后存活细胞的百分比增加(相对于对照)进行测量。
EC50
从细胞凋亡的剂量响应实验外推得到EC50。来自IncuCyte的数据在Prism中作图并分析。“％细胞凋亡”用于每个数据点。对于每个浓度存在％细胞凋亡对(vs)时间，取在该曲线下的面积并对浓度对数＝>EC50作图(在Prism中分析)。
评估翻译速率
将细胞(90,000个细胞/ml)铺于12-孔板中，根据指示处理，用100μCi/ml 35S-甲硫氨酸(Hartmann Analytic)在37℃下标记10分钟，用冰冷的PBS洗涤并在120μl Laemmli缓冲液中裂解。溶胞产物在95℃下煮沸5分钟，用超声波处理并在4-12％BoltBis-TrisPlus Gels(Thermo Fisher Scientific)上分离。凝胶随后用InstantBlue(Expedeon)染色并通过磷光成像进行分析，并且使用ImageJ定量。
通过如上所述监控翻译速率，R15A、R15B和R15A/B抑制剂的活性可如下确定(也在图12中示出)。R15A抑制剂对非应激细胞中的翻译无效，但是延长应激后的翻译衰减。选择性R15B抑制剂瞬时衰减蛋白合成，因为R15A补偿R15B的抑制。R15A/B抑制剂持续抑制蛋白合成。
翻译可在多个水平上受到抑制。为了确保R15A和B抑制剂中靶，监控用化合物处理过的细胞中的ATF4水平。R15A/B抑制剂持续诱导eIF2α磷酸化和eIF2α磷酸化，导致ATF4翻译。本文示出A/B抑制剂实际上诱导ATF4，证实细胞中的靶结合。
表1：

Claims (25)

1.式IA的化合物：
(IA)
或其药学上可接受的盐，其中：
Xa是N或CR2a；
Ya是N或CR4a；
R1a是H、F、Cl或Br；
R2a、R3a、R4a、R5a各自独立地表示H、F或Cl；
前提条件是：
当Xa和Ya表示CH时：
当R3a和R5a均表示H时，R1a不是F、Cl或Br；
当R1a是Cl并且R2a是H时，R5a不是F或Cl；
当R1a是Cl并且R5a是H时，R3a不是F；
当R1a和R5a均为H时或者当R1a是Cl并且R5a是H时，R3a不是Cl；
R1a、R3a和R5a不全是H；或者
当R3a是H并且R5a是F时，R1a不是Cl；
当Xa表示CH并且Ya表示CR4a时，其中R4a是Cl:
R1a和R5a不全是Cl；
当R1a和R5a是Cl时，R3a不是Cl；
当Xa表示CR2a并且Ya表示CR4a并且R2a和R4a均为Cl时，R1a、R3a和R5a不全是H。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中Xa表示CR2a并且Ya表示CR4a，其中R2a和R4a各自独立地表示H、F或Cl。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的三个表示Cl或F，并且R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的两个表示H，任选地其中R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的至少一个是F。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的三个表示Cl，并且R1a、R2a、R3a、R4a和R5a中的两个表示H。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中R3a是Cl或F，并且R1a、R2a、R4a和R5a各自独立地选自H、F和Cl，其中R1a、R2a、R4a和R5a中的两个选自F和Cl，并且R1a、R2a、R4a和R5a中的两个表示H。
6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R5a表示H。
7.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物为E-异构体形式。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自
(E)-2-((2,4-二氯嘧啶-5-基)亚甲基)肼-1-甲脒
(E)-2-(3,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(3,5-二氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,3,4-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,4-二氯-5-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(4-氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2-溴-3-氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,3,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(3,4-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,4-二氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,3-二氯-4-氟亚苄基)肼-1- 甲脒
(E)-2-(3-氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,3-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(4,5-二氯-2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2-氯-5-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-((2-氯吡啶-3-基)亚甲基)肼-1-甲脒
(E)-2-((2,6-二氯吡啶-3-基)亚甲基)肼-1-甲脒
(E)-2-(3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(3-氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2-氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,5-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2-氯-3,4-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2-氯-3,5-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(3-氯-2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,3,6-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2-氯-4,5-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(3,5-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
或它们药学上可接受的盐。
9.一种式IB的化合物，其用于在通过抑制PPP1R15A和PPP1R15B而减轻的疾病状态的治疗中的应用，
(IB)
或其药学上可接受的盐，其中：
Xb是N或CR2b；
Yb是N或CR4b；
R1b是H、F、Cl或Br；
R2b、R3b、R4b、R5b各自独立地表示H、F或Cl；
所述前提条件是：
当Xb和Yb均表示N时，R1b和R3b不全是Cl；
当Xb是CR2b并且R2b是Cl时，R1b不是Br；
当R3b和R4b均为H时，R1b和R2b不全是Cl；
当Xb是CR2b并且R2b和R3b均为H时，R1b不是Cl，此时Yb是CR4b并且R4b是F；
当Xb是CR2b并且Yb是CR4b时，R1b、R2b、R3b、R4b和R5b不全是H；
当Xb是CR2b并且Yb是CR4b并且R2b、R3b、R4b和R5b是H时，R1b不是Cl；
当Xb是CR2b并且Yb是CR4b并且R2b、R3b和R4b是H时，R1b不是Cl，此时R5b是F；
当Xb是其中R2b是Cl的CR2b并且Yb是其中R4b是H的CR4b时，R1b不是Cl，此时R3b、R4b和R5b是H，或者此时R3b和R4b是H并且R5b是Cl。
10.用于根据权利要求9所述的应用的化合物，其中Xb表示CR2b并且Yb表示CR4b，其中R2b和R4b各自独立地表示H、F或Cl。
11.用于根据权利要求9或权利要求10所述的应用的化合物，其中R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的三个表示Cl或F并且R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的两个表示H，任选地其中R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的至少一个表示F。
12.用于根据权利要求9或权利要求10所述的应用的化合物，其中R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的三个表示Cl并且R1b、R2b、R3b、R4b和R5b中的两个表示H。
13.用于根据权利要求9或权利要求10所述的应用的化合物，其中R3b是Cl或F并且R1b、R2b，R4b和R5b独立地选自H、F和Cl，其中R1b、R2b，R4b和R5b中的两个选自F和Cl，并且R1b、R2b、R4b和R5b中的两个是H。
14.用于根据权利要求9至权利要求13中任一项所述的应用的化合物，其中R5b是H。
15.用于根据权利要求9至权利要求14中任一项所述的应用的化合物，其中所述化合物为E-异构体形式。
16.用于根据权利要求9所述的应用的化合物，其中所述化合物选自：
(E)-2-​((4-​氯苯基)​亚甲基)肼-1-甲脒
(E)-2-(3,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(3,5-二氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,3,4-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,4-二氯-5-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(4-氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,3,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(3,4-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,4-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,4-二氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,3-二氯-4-氟亚苄基)肼-1- 甲脒
(E)-2-(3-氯-4-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(4,5-二氯-2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-((2-氯吡啶-3-基)亚甲基)肼-1-甲脒
(E)-2-((2,6-二氯吡啶-3-基)亚甲基)肼-1-甲脒
(E)-2-(3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(3-氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2-氯-3-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2,5-二氯亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2-氯-3,4-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2-氯-3,5-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(3-氯-2-氟亚苄基)肼-1-甲脒
(E)-2-(2-氯-4,5-二氟亚苄基)肼-1-甲脒
或它们药学上可接受的盐。
17.根据权利要求1所述的化合物或用于根据权利要求9所述的应用的化合物，所述化合物是(E)-2-(3,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒或其药学上可接受的盐。
18.根据权利要求1所述的化合物或用于根据权利要求9所述的应用的化合物，所述化合物是(E)-2-(2,4,5-三氯亚苄基)肼-1-甲脒或其药学上可接受的盐。
19.根据权利要求1至8、17或18中任一项所述的化合物，所述化合物用于在与错误折叠蛋白的积聚相关联的障碍或蛋白内稳态障碍的治疗中的应用。
20.用于根据权利要求19所述的应用的化合物，其中所述障碍与PPP1R15A和PPP1R15B相关联。
21.用于根据权利要求9至18中任一项所述的应用的化合物，其中所述障碍是与错误折叠蛋白的积聚相关联的障碍或蛋白内稳态障碍。
22.用于根据权利要求19至21中任一项所述的应用的化合物，其中所述障碍选自阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、其它多聚谷氨酰胺障碍和tau蛋白病。
23.一种药物组合物，所述药物组合物包含与药学上可接受的赋形剂组合的根据权利要求1至9、17或18中任一项所述的化合物。
24.根据权利要求1至8、17或18中任一项所述的式IA的化合物在制备用于治疗与错误折叠蛋白的积聚相关联的障碍或蛋白内稳态障碍的药物中的应用。
25.一种治疗在有需要的受试者中的与错误折叠蛋白的积聚相关联的障碍或蛋白内稳态障碍的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求1至8、17或18中任一项所述的式IA的化合物。
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