CN107641602B - 一株产朊假丝酵母及其在发酵产蛋白中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产朊假丝酵母及其在发酵产蛋白中的应用，所述菌株分类命名为产朊假丝酵母（Candida utilis）YHC‑007，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2017403。所述菌株可大幅度提高发酵产物中蛋白的产量，并且遗传稳定性好，连续传代5次后效价并无明显改变。在500L发酵罐中，发酵产量几乎没有下降。本发明菌株完全符合工业化发酵生产蛋白的技术指标，可用于工业化发酵生产，有重大的社会科研意义和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株产朊假丝酵母及其在发酵产蛋白中的应用，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
酵母是一类繁殖较快的微生物，往往在1~3h就可以扩繁一倍，同时酵母的发酵底物也比较广，包括如糖蜜等各种低成本原料。在发酵的终产物中，每克活性酵母可达200亿以上 , 其蛋白质质量含量一般低于50%。因此，利用酵母的快速繁殖能力和高蛋白特性,生产廉价的蛋白饲料受到人们的关注。
我国开发研究生物饲料蛋白已有多年历史,利用秸秆、鼓皮、酒糟等废弃物生产生物酵母蛋白，近年来研究者们也采用氨基酸废液来生产酵母蛋白; 国外(日本、俄罗斯等)虽然有研究报道, 但也尚未见工业化生产。
本发明菌株采用的离子束诱变育种是一种交叉物理学和生物学的新型诱变方式，和经典诱变方法相比，在遗传稳定性，诱变频率性上有巨大优势。同时采用糖蜜、玉米浆等工业废弃原材料进行发酵，最终获得的假丝状酵母蛋白质质量含量可达75%，发酵时间缩短到24h以内，大大优于国内外相关生产标准。
经过相关文献、专利的检索，国内外利用这一思路筛选低产朊假丝酵母发酵产高蛋白的相关技术和方法尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株产朊假丝酵母及其在发酵产蛋白中的应用，诱变方法简单、高效、安全，相较于出发菌种，发酵周期短，蛋白质质量含量大大提高，达到75%以上，同时减少生产成本，简化生产工艺。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一株产朊假丝酵母，其分类命名为产朊假丝酵母（Candida utilis）YHC-007，已于2017年 6月 30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2017403。
本发明所述的产朊假丝酵母的筛选方法是：将土壤中筛选的的产朊假丝酵母细胞悬浮液经低能氮离子注入诱变后，通过平板筛选出生长状况良好的菌株，再通过摇瓶发酵复筛获取作为下一轮诱变的出发菌株，重复上述诱变过程，最后筛选出符合工业应用的目标菌株产朊假丝酵母YHC-007。
本发明菌株的形态学及生理化学特征如下：
菌落颜色：乳白色；
需氧方式：兼性好氧；
菌落大小：3~8μm；
适宜生长温度：28~35℃；
适宜生长pH：6.0~7.0；
菌落形态：椭圆形；
革兰氏染色：阴性。
本发明所提供的产朊假丝酵母筛选诱变方法，具体步骤如下
（a)、细胞悬浮液制备：将平板上培养的产朊假丝酵母制成细胞悬液，调整浓度为106/毫升。
（b)、低能氮离子注入诱变：取0.1 mL的步骤(a)中细胞悬浮液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在20~30 KeV，注入剂量为5.0×1014~25.0×1014 ions/cm3下对其进行氮离子注入。
(c)、初筛：将步骤（b）诱变得到的菌种在无菌条件下用1 mL无菌水洗脱，涂布到平板上，在30~35 ℃下倒置培养培养时间为5~7d，筛选平板上长势较好的产朊假丝酵母单菌落。
（d）、复筛：将步骤（c）筛选出的菌种接种至斜面培养基上培养后，在30~35℃下倒置培养培养时间为5~7d；再接种至种子培养基培养，培养温度为30~35℃，摇瓶装液量10%~30%（v/v），培养时间18~24h.，将种子培养基中的种液接种至发酵培养基培养，接种量5%~15%（V/V)，250 mL摇瓶装液量30~50 mL，发酵温度30~35 ℃，发酵时间18~24h。
测定蛋白含量，挑选含量高的菌株进行下一次诱变，重复步骤a)~c)。
步骤（b）中低能氮离子注入，优选诱变能量为25KeV。
在上述筛选方法中：步骤（c）中所采用的平板培养基包含如下质量百分数成分：氮源1%~2%，碳源1%~2%，无机盐0.01%~0.1%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
步骤（d）所采用的斜面培养基包含如下质量分数成分：氮源1%~2%，碳源1%~2%，无机盐0.05%~0.1%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
步骤（d)所采用的种子培养基包含如下质量分数成分：氮源1%~2%，碳源1%~2%，无机盐0.05%~0.1%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
步骤（d）所采用的发酵培养基包含如下质量分数成分：氮源2%~5%，碳源2%~5%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
上述筛选出的产朊假丝酵母在发酵生产蛋白中的应用。具体步骤如下：
（1）平板培养：将产朊假丝酵母接种到平板培养基，培养温度为30~35℃，培养时间5~7d；
（2）、斜面培养：将步骤(1)平板培养的产朊假丝酵母接种到斜面培养基上，培养温度为30~35℃，培养时间为5~7d；
（3）、种子培养：将步骤（2）斜面培养的产朊假丝酵母接种到种子培养基中，培养温度为30~35℃，摇瓶装液量10%~30%（v/v），培养时间为18~24h；
（4）、发酵培养：将步骤（3）中的种子培养液接种至发酵培养基，以5%~15%（V/V）接种量接种于发酵培养基中，培养温度为30~35℃，培养时间为18~24h。
其中，所述平板培养基包含如下质量百分数的组分：氮源1%~2%，碳源1%~2%，无机盐0.01%~0.1%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
所述斜面培养基包含如下质量分数的组分：氮源1%~2%，碳源1%~2%，无机盐0.01%~0.1%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
所述种子培养基包含如下质量分数组分：氮源1%~2%，碳源1%~2%，无机盐0.01%~0.1%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
所述发酵培养基包含如下质量分数组分：氮源2%~5%，碳源2%~5%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
有益效果：
本发明筛选得到的产朊假丝酵母，大幅度提高发酵产物中蛋白的产量，并且遗传稳定性好，连续传代5次后效价并无明显改变。在500L发酵罐中，发酵产量几乎没有下降。本发明菌株完全符合工业化发酵生产蛋白的技术指标，可用于工业化发酵生产，有重大的社会科研意义和经济价值。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体物料比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应该也不会限制本发明。
实施例1
本实施例说明将产朊假丝酵母原始菌株进行低能氮离子注入诱变筛选的方法。
进行第一步低能氮离子注入诱变筛选的具体步骤如下：
（a）、单细胞悬浮液制备：取30~35℃恒温培养5~7d的产朊假丝酵母YHC新鲜斜面加无菌水10mL，制成菌悬液，用血球计数板计数，调整细胞浓度106个/毫升。
(b)、低能氮离子注入诱变：取0.1mL步骤（a）中的菌悬液均匀涂布于无菌平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为离子束生物工程装置。在25KeV,注入剂量为10.0×1014ions/cm3下对其进行氮离子注入，靶室真空度为10-3Pa，以15S脉冲式注入，间隔10S。离子注入完毕后，取出平皿。
(c)、诱变菌株的筛选：
初筛：取步骤（b）中诱变得到的菌种在无菌条件下用1 mL无菌水洗脱，涂布到平板培养基上，在30~35 ℃下倒置培养培养时间为1~2d，筛选长势好的产朊假丝酵母单菌落。
复筛：将筛选出的菌种接种至斜面培养基上培养后，在30~35℃下倒置培养，培养时间为5~7d；再接种至种子培养基培养，培养温度为30~35℃，摇瓶装液量10%~30%（v/v），培养时间18~24h.，将种子培养基中的种液接种至发酵培养基培养，接种量5%~15%（V/V)，250mL摇瓶装液量30~50 mL，发酵温度30~35 ℃，发酵时间18~24h。测定蛋白含量，挑选含量高的菌株进行下一次诱变，重复步骤a)~c)。
其中步骤（b）中的平板培养基为：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
所述斜面培养基包含如下质量分数的组分：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
所述种子液培养基包含如下质量分数组分：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.02%，pH调至6，培养温度为30℃；
所述发酵培养基包含如下质量分数组分：酵母膏2%，玉米浆2%，葡萄糖5%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.05%，氯化钠0.05%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
发酵结束后检测各菌株产量如表1所示。
表1
| 菌号 | 出发菌种 | 诱变后菌种 |
| 蛋白含量（%) | 45 | 75 |
实施例2 本实施例说明菌株的鉴定及遗传稳定性
菌株的鉴定：细胞呈椭圆状，较长较细，兼性好氧的革兰氏阴性菌，无鞭毛，在平板培养基上菌落颜色为乳白色，圆柱形菌落，菌落较薄，湿润，边缘整齐，表面光滑，质地均匀，菌落大小3~8μm，生长最适温度：28~35℃，生长温度范围为25-35℃，生长最适pH：6.0~7.0，生长pH范围为5.5~7.5。
传代发酵实验：将筛选得到的产朊假丝酵母接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养120h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间120h。将斜面培养物后接种到种子培养基后，培养温度30℃，100mL摇瓶装液量45mL，在180rpm摇床转速下培养24h；将种子液接种到发酵培养基中，接种量10%（v/v），培养温度29℃，在200rpm转速下培养24h。发酵培养结束后检测发酵产物中蛋白含量结果如表2所示：
表2诱变后菌种的遗传稳定性
| 传代次数 | 蛋白含量wt/(%) |
| 1 | 75 |
| 2 | 73 |
| 3 | 73 |
| 4 | 71 |
| 5 | 72 |
从实验结果可知，经过5次连续传代，突变株较稳定，有较好的传代稳定性。可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例3
本实施例说明产朊假丝酵母在发酵生产蛋白中的应用
本实施例营养基配方（%为质量百分比）：
平板培养基为：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
斜面培养基：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
种子培养基：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
发酵培养基：酵母膏2%，玉米浆2%，糖蜜5%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.05%，氯化钠0.05%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
将筛选得到的产朊假丝酵母接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养120h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间120h。在超净工作台内，用5ml移液管吸取无菌水于斜面中，再用大口5ml移液管吸取斜面上均匀涂抹的菌悬液接种到种子培养基，培养温度30℃，100mL摇瓶瓶装液量45mL，在180rpm摇床转速下培养20h；将摇床上种子液合并后接种到5L种子罐中进行发酵，种子罐中种子培养基的装液量为3.5L，接种量10%（v/v），通气量0.5（V／V·min），培养温度30℃，在180rpm转速下培养20h。发酵培养结束后检测发酵产物中蛋白质量含量为75%。
实施例4
本实施例说明产朊假丝酵母在发酵生产蛋白中的应用
本实施例营养基配方（%为质量百分比）：
平板培养基为：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
斜面培养基：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
种子培养基：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
发酵培养基：酵母膏2%，玉米浆2%，糖蜜5%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.05%，氯化钠0.05%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
将筛选得到的产朊假丝酵母接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养120h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间120h。在超净工作台内，用5ml移液管吸取无菌水于斜面中，再用大口5ml移液管吸取斜面上均匀涂抹的菌悬液接种到种子培养基，培养温度30℃，100mL摇瓶瓶装液量45mL，在180rpm摇床转速下培养50h；将摇床上种子液合并后接种到5L种子罐中进行培养，种子罐中种子培养基的装液量为3.5L，接种量10%（v/v），通气量0.5（V／V·min），培养温度30℃，在180rpm转速下培养22h。再将种子罐压入到50 L发酵罐中进行发酵，发酵罐中发酵培养基的装液量为35 L，接种量10%（v/v），通气量0.5（V／V·min），培养温度30℃，在200rpm转速下培养24h。发酵培养结束后检测发酵产物蛋白质量含量为73%。
实施例5
本实施例说明产朊假丝酵母在发酵生产蛋白中的应用
本实施例营养基配方（%为质量百分比）：
平板培养基为：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
斜面培养基：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
种子培养基：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
发酵培养基：酵母膏2%，玉米浆2%，糖蜜5%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.05%，氯化钠0.05%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
将筛选得到的产朊假丝酵母接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养120h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间120h。在超净工作台内，用5ml移液管吸取无菌水于斜面中，再用大口5ml移液管吸取斜面上均匀涂抹的菌悬液接种到种子培养基，培养温度30℃，100mL摇瓶瓶装液量45mL，在180rpm摇床转速下培养50h；将摇床上种子液合并后接种到50L种子罐中进行培养，种子罐中种子培养基的装液量为35L，接种量10%（v/v），通气量0.5（V／V·min），培养温度30℃，在180rpm转速下培养24h。再将种子罐压入到500L发酵罐中进行发酵，发酵罐中发酵培养基的装液量为350 L，接种量10%（v/v），通气量0.5（V／V·min），培养温度30℃，在200rpm转速下培养18h。发酵培养结束后检测发酵产物中蛋白质量含量为74%。
实施例6
本实施例说明产朊假丝酵母在发酵生产蛋白中的应用
本实施例营养基配方（%为质量百分比）：
平板培养基为：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
斜面培养基：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
种子培养基：酵母膏1%，玉米浆1%，葡萄糖1%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
发酵培养基：酵母膏2%，玉米浆2%，糖蜜5%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.05%，氯化钠0.05%，其余为水，pH调至6，培养温度为30℃；
将筛选得到的产朊假丝酵母接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养120h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间120h。在超净工作台内，用5ml移液管吸取无菌水于斜面中，再用大口5ml移液管吸取斜面上均匀涂抹的菌悬液接种到种子培养基，培养温度30℃，100mL摇瓶瓶装液量45mL，在180rpm摇床转速下培养50h；将摇床上种子液合并后接种到50L种子罐中进行培养，种子罐中种子培养基的装液量为35L，接种量10%（v/v），通气量0.5（V／V·min），培养温度30℃，在180rpm转速下培养20h。再将种子罐压入到500L发酵罐中进行发酵，发酵罐中发酵培养基的装液量为350 L，接种量10%（v/v），通气量0.5（V／V·min），培养温度30℃，在200rpm转速下培养21h。发酵培养结束后检测发酵产物中蛋白质量含量为72%。
实施例7 本实施例说明发酵液中蛋白含量的检测方法
采用 BCA法测定蛋白质量含量。
（1）标准液的制备：
A液：BCANa2 1 g、Na2CO3·H2O 2 g、酒石酸钠0.16 g、NaOH 0.4 g、 NaHCO3 0.95g溶于80 mL水中，用1 mol/L NaOH调pH至11.25，定容至100 mL。
B液：CuSO4·5H2O 4 g，加水定容至100mL。测定时取A液100体积与B液2体积混合，配制成工作液。
（2）样品的制备：
取离心后的样品溶液沉淀0.1mg与工作液2.0 mL混合溶解，37 ℃保温30 min，于562 nm处测定吸光度A。
（3）含量计算方法：
根据标准曲线计算样品中蛋白的浓度。
标准曲线方程为y= 0.788X+0.020（R2=0.997）。
Claims (7)
1.一株产朊假丝酵母（Candida utilis）YHC-007，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2017403。
2.权利要求1所述的产朊假丝酵母在发酵产蛋白中的应用。
3.根据权利要求2所述的产朊假丝酵母在发酵产蛋白中的应用，其特征在于包括如下步骤：
1）平板培养：将产朊假丝酵母接种至平板培养基上培养，培养温度为30~35℃，培养时间为5~7d；
2）斜面培养：将步骤1）平板培养基培养的产朊假丝酵母接种至斜面培养基培养，培养温度为30~35℃，培养时间为5~7d；
3）种子培养：将步骤2）中产朊假丝酵母的斜面培养物接种至种子培养基培养，培养温度为30~35℃，培养时间24~30h；
4） 发酵培养：将步骤3)中种子培养基中的产朊假丝酵母接种至发酵培养基培养，接种量5%~15%（V/V)，发酵温度30~35℃，发酵时间24~30h。
4.根据权利要求3所述的产朊假丝酵母在发酵产蛋白中的应用，其特征在于：所述步骤1）中平板培养基由如下质量百分数的组分组成：氮源1%~2%，碳源1%~2%，无机盐0.01%~0.1%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的产朊假丝酵母在发酵产蛋白中的应用，其特征在于所述步骤2）中的斜面培养基由如下质量百分数的组分组成：氮源1%~2%，碳源1%~2%，无机盐0.01%~0.1%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的产朊假丝酵母菌在发酵产蛋白的应用，其特征在于所述步骤3）中的种子培养基由如下质量百分数的组分组成：氮源1%~2%，碳源1%~2%，无机盐0.01%~0.1%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
7.根据权利要求3所述的产朊假丝酵母菌在发酵产蛋白的应用，其特征在于所述步骤4）中的发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：氮源2%~5%，碳源2%~5%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为尿素、玉米浆或者酵母膏中的至少一种；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的至少一种；所述无机盐为铁盐、钠盐、钙盐或者镁盐中的至少一种。
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