CN107630085B - 分子标志物在男性骨质疏松中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分子标志物在男性骨质疏松中的应用，所述分子标志物为BTNL3。本发明通过实验证明，BTNL3基因及其编码的蛋白在骨质疏松患者中表达上调，提示通过检测BTNL3的表达水平，可以用于骨质疏松的早期诊断。

Description

分子标志物在男性骨质疏松中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及分子标志物在男性骨质疏松中的应用，具体的该分子标志物为BTNL3。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis)是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。骨质疏松症分为原发性和继发性二大类。原发性骨质疏松症的发生发展与内分泌紊乱、全身营养状态、免疫功能、遗传基因密切相关。

随着经济高速发展和工业化进程的加速，人类健康面临的非传染性疾病威胁证日益增重，骨质疏松与骨质疏松性骨折等更是危害健康的无情杀手，且已被广泛认为是影响人类健康的重大卫生问题之一。

在中老年人中，随着年龄的增长，性激素水平逐渐下降。在男性中，血清睾酮水平与年龄有密切关系，起初随着年龄增长睾酮水平逐渐升高，7-10岁达顶峰，之后随年龄增长逐渐下降。而骨质疏松多发生与绝经后女性和男性中老年人群，并且与年龄有一定的相关性。

虽然目前研究认为骨质疏松的发病与年龄、性别有关，且与遗传因素和环境因素等密切相关，但骨质疏松的发病机制仍不明确，骨质疏松的早期诊断、治疗效果监测和预后评估对于骨质疏松的防治具有重要作用。近年来，随着生物技术的发展，遗传因素的研究成为骨质疏松诊治领域的热门课题，已有研究表明骨质疏松与体内基因的变化相关，如专利201610272604.0、201610271798.2等报道了基因的差异表达与骨质疏松的发生发展相关，可见，利用基因进行骨质疏松的早期诊断成为未来发展的趋势。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于男性骨质疏松早期诊断的分子标志物，以期实现骨质疏松的特异性诊断和预防。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了BTNL3基因的应用，用于制备诊断骨质疏松的产品。

进一步，所述产品包括检测样本中BTNL3表达水平的试剂。

进一步，BTNL3在骨质疏松中表达上调。

进一步，所述试剂通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测BTNL3表达水平的试剂。

进一步，所述通过RT-PCR检测BTNL3表达水平的试剂至少包括一对特异扩增BTNL3基因的引物；所述通过实时定量PCR检测BTNL3表达水平的试剂至少包括一对特异扩增BTNL3基因的引物；所述通过免疫检测BTNL3表达水平的试剂包括与BTNL3蛋白特异性结合的抗体和/或配体；所述通过原位杂交检测BTNL3表达水平的试剂包括与BTNL3基因的核酸序列杂交的探针；所述通过芯片检测BTNL3表达水平的试剂包括与BTNL3基因核酸序列杂交的探针、或与BTNL3蛋白特异性结合的抗体和/或配体。

在本发明中，“样本”是包含细胞或细胞物质的可从中获取核酸、多肽、或其它分析物的样本。生物样本的示例非限定性地包括：尿、血液、血清、血浆、脑脊髓液、胸膜液、支气管灌洗、痰、腹腔液、膀胱冲洗、分泌物(例如，乳腺分泌物)、口腔冲洗、拭子(例如，口腔拭子)、分离细胞、组织样本、触碰准备物、以及细针穿刺物。优选的，所述样本为人外周血。

本发明提供了一种诊断骨质疏松的产品，包括制剂、芯片或试剂盒，其中，所述制剂、芯片或试剂盒包括检测BTNL3表达水平的试剂。

进一步，所述芯片中检测BTNL3表达水平的试剂包括特异性识别BTNL3基因的探针，或特异性结合BTNL3编码的蛋白的抗体或配体。

进一步，所述试剂盒中检测BTNL3表达水平的试剂包括特异性扩增BTNL3基因的引物；或特异性识别BTNL3基因的探针；或特异性结合BTNL3编码的蛋白的抗体或配体。

进一步，所述特异性扩增BTNL3基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

进一步，所述试剂盒包括SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

进一步，所述检测试剂盒还包括使用说明书和标签。

本发明所述的基因芯片或基因检测试剂盒可用于检测包括BTNL3基因在内的多个基因(例如，与骨质疏松相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白芯片或蛋白免疫检测试剂盒可用于检测包括BTNL3蛋白在内的多个蛋白质(例如与骨质疏松相关的多个蛋白质)的表达水平。将骨质疏松的多个标志物同时进行检测，可大大提高骨质疏松诊断的准确率。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了分子标志物BTNL3与男性骨质疏松发生发展相关，通过检测受试者BTNL3的变化，诊断患者是否患有骨质疏松以及换骨质疏松的风险，从而实现骨质疏患者的早发现早治疗，提高患者的生活质量。

附图说明

图1为利用QPCR检测BTNL3基因在骨质疏松患者中的表达情况图；

图2为利用免疫印迹在蛋白水平上检测BTNL3基因的差异表达的图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次发现了在男性骨质疏松患者中BTNL3呈现特异性高表达，为骨质疏松的早期检测寻找更好的途径和方法。

生物标志物

“生物标志物”也称为“分子标志物”，是在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。

本文包含用于检测分子标志物表达的现有技术中任何可用方法。本发明分子标志物的表达可在核酸水平上被检测(如，RNA转录物)或蛋白质水平。通过“检测表达”旨在确定RNA转录物或其分子标志物基因的表达产物的数量或存在。因此，“检测表达”包含一分子标志物被确定不能被表达、不能被检测表达，表达在低水平、表达在正常水平或过表达的实例。为了确定过表达，被检测的所述身体样本能够与相应的来自健康人的身体样本比较。那就是说，所述表达的“正常”水平是分子标志物的表达水平。这个样本可以以标准化形式呈现。在一些实施例中，分子标志物过表达的确定需比较身体样本和相应来自健康人的身体样本。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，一种代表性的人BTNL3的编码序列或氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。BTNL3包括包含SEQ ID NO.2的多肽和其它BTNL3天然序列多肽，诸如天然存在变体和天然序列多肽，其由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

编码BTNL3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码BTNL3蛋白的多核苷酸。

本发明的人BTNL3核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

检测方法

本发明可以使用本领域普通技术人员已知的多种核酸以及蛋白技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。

蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

根据本发明的免疫法可基于，例如，以下方法中的任一种。

免疫沉淀法是最简单的免疫测定方法；这种方法测量沉淀物的量，在试剂抗体已与样本一起孵育并与其中存在的靶抗原反应以形成不溶性团聚体之后形成所述沉淀。免疫沉淀反应可以是定性的或是定量的。

在颗粒免疫测定中，多种抗体与该颗粒连接，且所述颗粒能够同时结合很多抗原分子。这大大地加速了可见反应的速度。这允许生物标志物的快速且灵敏的检测。

在免疫比浊法(immunonephelometry)中，抗体和生物标志物上的靶抗原的相互作用引起免疫复合物的形成，所述免疫复合物太小而不能沉淀。但是，这些复合物将散射入射光，这可使用比浊计来测量。可在反应的几分钟之内测定抗原(即生物标志物)的浓度。

放射免疫测定(RIA)法使用放射性同位素例如I125来标记抗原或抗体。所使用的同位素发射γ射线，通常在除去非结合的(游离的)放射性标记之后测量所述射线。与其它的免疫测定相比较，RIA的主要优势在于更高的灵敏度、容易的信号检测和确认的、快速的测定。主要的劣势在于由放射物的使用引起的健康和安全风险和与维护许可放射物安全和处理程序相关的时间和费用。出于该原因，在常规临床实验室实践中，RIA已很大程度上被酶免疫测定所取代。

酶免疫测定(EIA)发展为放射免疫测定(RIA)的替代物。这些方法使用酶来标记抗体或靶抗原。EIA的灵敏度接近RIA的灵敏度，且不存在由放射性同位素引起的危险。用于检测的最广泛使用的EIA方法之一是酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA方法可使用两种抗体，其一对于靶抗原是特异性的，而另一与酶偶联，酶底物的添加引起化学发光信号或荧光信号的产生。

荧光免疫测定(FIA)指使用荧光标记或酶标记的免疫测定，所述荧光标记或酶标记作用在底物上以形成荧光产物。荧光测量固有地比比色(分光光度法的)测量更加灵敏。因此，FIA方法具有比利用吸收(光密度)测量的EIA方法更高的分析灵敏度。

化学发光免疫测定使用化学发光标记，当其被化学能激发时产生光；使用光检测器测量发射。

因此，可使用熟知的方法进行根据本发明的免疫法。在本发明的生物标志物的检测中可使用任何直接(如使用传感器芯片)或间接的方法。

探针

“探针”是指能够用于测量特定基因的表达情况的分子。示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

本发明中术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

作为探针，可以使用荧光标记、放射标记、生物素标记等对癌检测用多核苷酸进行了标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。可通过如下方法检查试样中是否存在受试核酸：固定受试核酸或者其扩增物，与标记探针进行杂交，洗涤，以及然后测定与固相结合的标记。备选地，还可固定癌检测用多核苷酸，使受试核酸与其杂交，然后应用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。在这种情况下，结合于固相上的癌检测用多核苷酸也称为探针。使用多核苷酸探针测定受试核酸的方法在本领域也是公知的。可以如下进行该方法：在缓冲液中使多核苷酸探针与受试核酸在Tm或者其附近(优选在±4℃以内)接触用于杂交，洗涤，然后测定杂交的标记探针或者与固相探针结合的模板核酸。

在作为探针使用的多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为20个或更多个核苷酸，以及编码区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PN、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。

芯片、试剂盒

术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。

各种探针阵列已经描述在文献中并且可以用于本发明上下文中检测可能与本文所述表型相关的标志物。例如，DNA探针阵列芯片或较大的DNA探针阵列晶片(否则，可以通过打断晶片而获得各个体芯片)用于本发明的一个实施方案。DNA探针阵列晶片一般包含玻璃晶片，其上放置了高密度DNA探针(短DNA片段)阵列。这些晶片各自可以保持例如约6000万个用于识别较长样品DNA序列(例如，来自个体或群体，例如，包含所关注的标志物)的DNA探针。用玻璃晶片上的DNA探针组识别样品DNA通过DNA杂交进行。当DNA样品与DNA探针阵列杂交时，样品结合于样品DNA序列互补的那些探针。通过评价个体样品DNA与那些探针更稳固地杂交，有可能确定已知的核酸序列是否存在于样品中，由此确定核酸中发现的标志物是否存在。还可以使用这一手段通过控制杂交条件以允许区别单一核苷酸，例如，用于SNP鉴定和一种或多种SNP的样品基因分型来进行ASH。阵列提供了一种同时(或串连)检测多个多态性标志物的便利性实施方案。

本发明中，试剂盒可用于检测BTNL3基因或蛋白的表达水平，包含用于BTNL3检测和/或定量的本发明的配体、和/或芯片。任选的与试剂盒的说明书在一起。

试剂盒包括一种或多种无菌容器，这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容器药物的其它材料。

在本发明中，术语“包括”用于指短语“包括但不限于”，并与短语“包括但不限于”可以互换使用。

抗体

在本发明中，术语“抗体”是指选择性结合目标抗原的天然或合成抗体。该术语包括多克隆和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子外，那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物以及选择性结合目标抗原的免疫球蛋白分子的人类或人源化形式也包括在术语“抗体”的范围内，只要它们展现出期望的生物学活性即可。“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。

单克隆抗体还包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性即可。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)²或抗体的其它抗原结合子序列。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)²和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠结构中散发出六个高变环(重链和轻链各3个环)，促成结合抗原的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也可具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

本发明的抗体的“功能性片段”指那些保留与衍生它们的完整全链分子以基本上相同的亲和力结合多肽且在至少一种测定法中有活性(例如抑制TH2诱导的哮喘途径，诸如在小鼠模型中，或在体外抑制抗体片段结合的抗原的生物学活性)的片段。

多克隆抗体包含对产生人抗体的动物(例如，小鼠)免疫BTNL3蛋白质而得的抗体。当制备了嵌合抗体或人源化抗体之后，可以将可变区(例如，FR)和/或恒定区中的氨基酸用其他氨基酸替换等。

统计学方法

在本发明中，实验至少采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 筛选与骨质疏松相关的基因标志物

1、样品收集

各收集6例男性骨质疏松患者和健康人的血液，上述样本均无吸烟史、饮酒史、母系家族史、咖啡或碳酸饮料史、无体力活动缺乏、没有影响骨代谢的疾病或者使用相关药物。上述样本的获取，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备及质量分析

2.1RNA样品的制备

使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：

1)取1ml收集在肝素或EDTA处理过的试管中的全血，放进无菌离心管中；

2)3000rpm(400g)离心5min，小心地从样品顶部吸走上清；

3)加1ml血细胞裂解液，小心吸放4-5次，重悬沉淀物，3000rpm离心5min；

4)重复步骤3两次(共三次)；

5)避开细胞沉淀物，小心吸走几乎所有上清，只保留100μl上清液；确认一下BME已经加到RNA裂解液中，然后加175μl RNA裂解液到细胞中，吸放重悬并裂解细胞；

6)加350μl RNA稀释液，颠倒混合3-4次，室温下13000g离心10min，将清亮裂解物转移到一支无菌离心管中；

7)向澄清裂解液中加入200μl 95％乙醇，用移液枪吸放3-4次以混合；将此混合物转移到离心柱装配体中，13000g离心1min；

8)从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，加600μl RNA洗涤液于离心柱装配体，13000g离心1min；

9)弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，将50μl新鲜制备的DNase孵育混合物直接加到离心柱内的膜上；

10)室温下孵育15min，向离心柱中加入200μl DNA酶终止缓冲液(确认已加入乙醇)，13000g离心1min；

11)加入600μl RNA洗涤液(已加入乙醇)，13000g，离心1min；

12)清空收集管，向离心柱内加入250μl RNA洗涤液(已加入乙醇)，高速离心2min；

13)将离心柱从收集管上转移到洗脱管上，向膜上加100μl无核酸酶水，将离心柱装配体放进离心机并使洗脱管的盖子朝外，13000g离心1min，丢弃离心柱，盖好盛有RNA的洗脱管，存于-70℃。

2.2RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

4、构建cDNA文库

利用利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

5、上机测序

使用Hiseq4000测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

6、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当P<0.05时，认为mRNA显著差异表达。

7、结果

RNA-seq结果显示，BTNL3基因在骨质疏松患者中的表达量显著高于健康人人的表达量。

实施例2 QPCR验证BTNL3基因的差异表达

1、对BTNL3基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择骨质疏松患者和健康人的血液各80例。

2、RNA提取 步骤如实施例1所述。

3、逆转录

采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行mRNA反转录

4、QPCR

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

1)引物设计

根据Genebank中BTNL3基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

BTNL3基因：

正向引物为5’-AGCCTGTATGATGTGGAGAT-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-AGCAAGGTGGATGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)。

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’(SEQ ID NO.6)

2)按照表1配制20μl PCR反应体系：

表1 PCR反应体系

3)PCR反应条件：：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，每个样进行3次重复实验。

5、结果

如图1所示，与对照组相比，BTNL3基因在骨质疏松患者中表达显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3 蛋白水平验证BTNL3的差异表达

1、按照RIPA蛋白裂解液试剂盒说明书提取各组蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品中蛋白浓度。

2、以常规Western-blot方法检测BTNL3蛋白变化，各组实验均重复3次，以β-actin为内参，做BTNL3蛋白条带吸光度定量分析，表达量以BTNL3蛋白/β-actin吸光度的比值代表。

3、结果

结果如图2所示，与健康人相比，男性骨质疏松患者中BTNL3的蛋白水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 王丽 马青 王玉功

<120> 分子标志物在男性骨质疏松中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1401

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atggcttttg tgctcatttt ggttctcagt ttctacgagc tggtgtcagg acagtggcaa 60

gtcactggac cgggcaagtt tgtccaggcc ttggtggggg aggacgccgt gttctcctgc 120

tccctctttc ctgagaccag tgcagaggct atggaagtgc ggttcttcag gaatcagttc 180

catgctgtgg tccacctcta cagagatggg gaagactggg aatctaagca gatgccacag 240

tatcgaggga gaactgagtt tgtgaaggac tccattgcag gggggcgtgt ctctctaagg 300

ctaaaaaaca tcactccctc ggacatcggc ctgtatgggt gctggttcag ttcccagatt 360

tacgatgagg aggccacctg ggagctgcgg gtggcagcac tgggctcact tcctctcatt 420

tccatcgtgg gatatgttga cggaggtatc cagttactct gcctgtcctc aggctggttc 480

ccccagccca cagccaagtg gaaaggtcca caaggacagg atttgtcttc agactccaga 540

gcaaatgcag atgggtacag cctgtatgat gtggagatct ccattatagt ccaggaaaat 600

gctgggagca tattgtgttc catccacctt gctgagcaga gtcatgaggt ggaatccaag 660

gtattgatag gagagacgtt tttccagccc tcaccttggc gcctggcttc tattttactc 720

gggttactct gtggtgccct gtgtggtgtt gtcatgggga tgataattgt tttcttcaaa 780

tccaaaggga aaatccaggc ggaactggac tggagaagaa agcacggaca ggcagaattg 840

agagacgccc ggaaacacgc agtggaggtg actctggatc cagagacggc tcacccgaag 900

ctctgcgttt ctgatctgaa aactgtaacc catagaaaag ctccccagga ggtgcctcac 960

tctgagaaga gatttacaag gaagagtgtg gtggcttctc agggtttcca agcagggaaa 1020

cattactggg aggtggacgt gggacaaaat gtagggtggt atgtgggagt gtgtcgggat 1080

gacgtagaca gggggaagaa caatgtgact ttgtctccca acaatgggta ttgggtcctc 1140

agactgacaa cagaacattt gtatttcaca ttcaatcccc attttatcag cctccccccc 1200

agcacccctc ctacacgagt aggggtcttc ctggactatg agggtgggac catctccttc 1260

ttcaatacaa atgaccagtc ccttatttat accctgctga catgtcagtt tgaaggcttg 1320

ttgagaccct atatccagca tgcgatgtat gacgaggaaa aggggactcc catattcata 1380

tgtccagtgt cctggggatg a 1401

<210> 2

<211> 466

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ala Phe Val Leu Ile Leu Val Leu Ser Phe Tyr Glu Leu Val Ser

1 5 10 15

Gly Gln Trp Gln Val Thr Gly Pro Gly Lys Phe Val Gln Ala Leu Val

20 25 30

Gly Glu Asp Ala Val Phe Ser Cys Ser Leu Phe Pro Glu Thr Ser Ala

35 40 45

Glu Ala Met Glu Val Arg Phe Phe Arg Asn Gln Phe His Ala Val Val

50 55 60

His Leu Tyr Arg Asp Gly Glu Asp Trp Glu Ser Lys Gln Met Pro Gln

65 70 75 80

Tyr Arg Gly Arg Thr Glu Phe Val Lys Asp Ser Ile Ala Gly Gly Arg

85 90 95

Val Ser Leu Arg Leu Lys Asn Ile Thr Pro Ser Asp Ile Gly Leu Tyr

100 105 110

Gly Cys Trp Phe Ser Ser Gln Ile Tyr Asp Glu Glu Ala Thr Trp Glu

115 120 125

Leu Arg Val Ala Ala Leu Gly Ser Leu Pro Leu Ile Ser Ile Val Gly

130 135 140

Tyr Val Asp Gly Gly Ile Gln Leu Leu Cys Leu Ser Ser Gly Trp Phe

145 150 155 160

Pro Gln Pro Thr Ala Lys Trp Lys Gly Pro Gln Gly Gln Asp Leu Ser

165 170 175

Ser Asp Ser Arg Ala Asn Ala Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Asp Val Glu

180 185 190

Ile Ser Ile Ile Val Gln Glu Asn Ala Gly Ser Ile Leu Cys Ser Ile

195 200 205

His Leu Ala Glu Gln Ser His Glu Val Glu Ser Lys Val Leu Ile Gly

210 215 220

Glu Thr Phe Phe Gln Pro Ser Pro Trp Arg Leu Ala Ser Ile Leu Leu

225 230 235 240

Gly Leu Leu Cys Gly Ala Leu Cys Gly Val Val Met Gly Met Ile Ile

245 250 255

Val Phe Phe Lys Ser Lys Gly Lys Ile Gln Ala Glu Leu Asp Trp Arg

260 265 270

Arg Lys His Gly Gln Ala Glu Leu Arg Asp Ala Arg Lys His Ala Val

275 280 285

Glu Val Thr Leu Asp Pro Glu Thr Ala His Pro Lys Leu Cys Val Ser

290 295 300

Asp Leu Lys Thr Val Thr His Arg Lys Ala Pro Gln Glu Val Pro His

305 310 315 320

Ser Glu Lys Arg Phe Thr Arg Lys Ser Val Val Ala Ser Gln Gly Phe

325 330 335

Gln Ala Gly Lys His Tyr Trp Glu Val Asp Val Gly Gln Asn Val Gly

340 345 350

Trp Tyr Val Gly Val Cys Arg Asp Asp Val Asp Arg Gly Lys Asn Asn

355 360 365

Val Thr Leu Ser Pro Asn Asn Gly Tyr Trp Val Leu Arg Leu Thr Thr

370 375 380

Glu His Leu Tyr Phe Thr Phe Asn Pro His Phe Ile Ser Leu Pro Pro

385 390 395 400

Ser Thr Pro Pro Thr Arg Val Gly Val Phe Leu Asp Tyr Glu Gly Gly

405 410 415

Thr Ile Ser Phe Phe Asn Thr Asn Asp Gln Ser Leu Ile Tyr Thr Leu

420 425 430

Leu Thr Cys Gln Phe Glu Gly Leu Leu Arg Pro Tyr Ile Gln His Ala

435 440 445

Met Tyr Asp Glu Glu Lys Gly Thr Pro Ile Phe Ile Cys Pro Val Ser

450 455 460

Trp Gly

465

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcctgtatg atgtggagat 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcaaggtgg atggaaca 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (8)

1.检测血液样本中BTNL3表达水平的试剂在制备诊断男性骨质疏松的产品中的应用，其特征在于，与健康男性相比，BTNL3在男性骨质疏松患者血液样本中表达上调。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测BTNL3表达水平的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述通过RT-PCR检测BTNL3表达水平的试剂至少包括一对特异扩增BTNL3基因的引物；所述通过实时定量PCR检测BTNL3表达水平的试剂至少包括一对特异扩增BTNL3基因的引物；所述通过免疫检测BTNL3表达水平的试剂包括与BTNL3蛋白特异性结合的抗体；所述通过原位杂交检测BTNL3表达水平的试剂包括与BTNL3基因的核酸序列杂交的探针；所述通过芯片检测BTNL3表达水平的试剂包括与BTNL3基因核酸序列杂交的探针、或与BTNL3蛋白特异性结合的抗体。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括制剂、芯片或试剂盒。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，芯片中检测BTNL3表达水平的试剂包括特异性识别BTNL3基因的探针，或特异性结合BTNL3编码的蛋白的抗体。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，试剂盒中检测BTNL3表达水平的试剂包括特异性扩增BTNL3基因的引物；或特异性识别BTNL3基因的探针；或特异性结合BTNL3编码的蛋白的抗体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增BTNL3基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

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