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CN107636149A - 上皮细胞的离体增殖 - Google Patents

上皮细胞的离体增殖 Download PDF

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CN107636149A
CN107636149A CN201680029217.2A CN201680029217A CN107636149A CN 107636149 A CN107636149 A CN 107636149A CN 201680029217 A CN201680029217 A CN 201680029217A CN 107636149 A CN107636149 A CN 107636149A
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Abstract

本技术部分地涉及用于上皮细胞的离体增殖和扩增的方法和组合物。

Description

上皮细胞的离体增殖
相关专利申请
本专利申请要求于2015年4月3日提交的、标题为“EX VIVO PROLIFERATION OFEPITHELIAL CELLS”、发明人名为Chengkang Zhang且由代理人案号PPG-2001-PV指定的美国临时专利申请号62/142,851的权益。本专利申请还要求于2015年9月11日提交的、标题为“EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLS”、发明人名为Chengkang Zhang且由代理人案号PPG-2001-PV2指定的美国临时专利申请号62/217,406的权益。本专利申请还要求于2016年2月12日提交的、标题为“EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLS”、发明人名为Chengkang Zhang且由代理人案号PPG-2001-PV3指定的美国临时专利申请号62/294,896的权益。上述申请的全部内容出于所有目的以援引方式并入本文，包括所有文本、表和附图。
技术领域
本技术部分涉及用于上皮细胞的离体增殖和扩增的方法和组合物。
背景技术
例如肺、肾、肝、胰腺和皮肤的器官可尤其通过器官特异性上皮细胞的存在来表征。上皮细胞可由每种此类器官的一种或多种特定功能来限定。具体的功能可包括例如肺中的气体交换、肾脏中的过滤、肝脏中的解毒和缀合、胰岛细胞中的胰岛素产生或通过皮肤对环境中有害条件的抵抗。此类器官的疾病或变性经常是使人衰弱或危及生命的，因为变性或丢失的器官结构不容易被替代，并且因为一种器官的特化细胞通常不能接替另一器官的功能。
某些类型的上皮细胞可能难以在体内恢复和/或再生，并且一旦从它们从所在身体中的背景中被取出，则可能维持起来具有挑战性。某些类型的上皮细胞(例如，从受试者收获的器官特异性上皮细胞、来源于多能干细胞的谱系定型的上皮细胞和/或分化的上皮细胞)在体外增殖和扩增可能具有挑战性，并且通常在培养中具有非常有限的寿命。为了在体外或离体研究上皮细胞，经常需要一种形式的遗传操作，例如插入病毒或细胞癌基因，以允许所述细胞存活超过几次传代。然而，这些遗传操作改变了细胞的遗传背景和生理学，使得这些细胞可能不类似于正常的上皮细胞或不像正常的上皮细胞一样起作用。此外，这些遗传修饰的细胞不会成为用于植入动物中的候选物。
培养和扩增上皮细胞(例如，从受试者收获的细胞、来源于干细胞的细胞)延长的时段而不遗传地改变所述细胞的方法将可用于各种目的，包括研究应用、个性化药物应用和移植。
发明内容
本文在某些方面提供了用于离体增殖分化的上皮细胞的方法，所述方法包括：a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养分化的上皮细胞；以及b)在(a)中的所述培养期间抑制所述分化的上皮细胞中的TGF-β信号传导。
本文还在某些方面提供了用于离体增殖原来静止的上皮细胞的方法，所述方法包括：a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养原来静止的上皮细胞；以及b)在(a)中的所述培养期间抑制所述原来静止的上皮细胞中的TGF-β信号传导。
本文还在某些方面提供了用于离体增殖谱系定型的上皮细胞的方法，所述方法包括：a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养谱系定型的上皮细胞；以及b)在(a)中的所述培养期间抑制所述谱系定型的上皮细胞中的TGF-β信号传导。
本文还在某些方面提供了用于离体增殖上皮细胞的方法，所述方法包括：a)在无饲养层细胞条件下培养上皮细胞；b)在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中的TGF-β信号传导；以及c)在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中p21活化的激酶(PAK)的活性。在一些实施方案中，上皮细胞是分化的上皮细胞、原来静止的上皮细胞和/或谱系定型的上皮细胞。
本文还在某些方面提供了用于离体增殖上皮细胞的方法，所述方法包括：a)在无血清且无饲养层细胞条件下培养上皮细胞；b)在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中的TGF-β信号传导；以及c)在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中肌球蛋白II的活性。在一些实施方案中，上皮细胞是分化的上皮细胞、原来静止的上皮细胞和/或谱系定型的上皮细胞。
本文还在某些方面提供了用于离体增殖分化的上皮细胞的方法，所述方法包括：a)在无饲养层细胞条件下培养分化的上皮细胞；b)活化所述分化的上皮细胞中的端粒酶逆转录酶；以及c)调节所述分化的上皮细胞中的细胞骨架结构。
本文还在某些方面提供了用于离体增殖原来静止的上皮细胞的方法，所述方法包括：a)在无饲养层细胞条件下培养原来静止的上皮细胞；b)活化所述原来静止的上皮细胞中的端粒酶逆转录酶；以及c)调节所述原来静止的上皮细胞中的细胞骨架结构。
本文还在某些方面提供了用于离体增殖谱系定型的上皮细胞的方法，所述方法包括：a)在无饲养层细胞条件下培养谱系定型的上皮细胞；b)活化所述谱系定型的上皮细胞中的端粒酶逆转录酶；以及c)调节所述谱系定型的上皮细胞中的细胞骨架结构。
本文在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖分化的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含一种或多种TGF-β抑制剂(例如一种或多种TGF-β信号传导抑制剂)。本文还在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖分化的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含由TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)组成的小分子抑制剂。
本文在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖原来静止的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含一种或多种TGF-β抑制剂(例如一种或多种TGF-β信号传导抑制剂)。本文还在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖原来静止的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含由TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)组成的小分子抑制剂。
本文在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖谱系定型的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含一种或多种TGF-β抑制剂(例如一种或多种TGF-β信号传导抑制剂)。本文还在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖谱系定型的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含由TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)组成的小分子抑制剂。
本文在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖分化的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含一种或多种端粒酶逆转录酶活化剂和一种或多种细胞骨架结构调节剂。本文还在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖分化的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含由端粒酶逆转录酶活化剂和细胞骨架结构调节剂组成的小分子。
本文在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖原来静止的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含一种或多种端粒酶逆转录酶活化剂和一种或多种细胞骨架结构调节剂。本文还在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖原来静止的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含由端粒酶逆转录酶活化剂和细胞骨架结构调节剂组成的小分子。
本文在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖谱系定型的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含一种或多种端粒酶逆转录酶活化剂和一种或多种细胞骨架结构调节剂。本文还在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖谱系定型的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含由端粒酶逆转录酶活化剂和细胞骨架结构调节剂组成的小分子。
本文还在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖上皮细胞的细胞培养基，所述培养基包含一种或多种TGF-β抑制剂(例如，一种或多种TGF-β信号传导抑制剂)以及一种或多种PAK1抑制剂。本文还在某些方面提供了用于本文还在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖上皮细胞的细胞培养基，所述培养基包含由TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)和PAK1抑制剂组成的小分子(例如，小分子抑制剂)。在一些实施方案中，上皮细胞是分化的上皮细胞、原来静止的上皮细胞和/或谱系定型的上皮细胞。
本文还在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖上皮细胞的细胞培养基，所述培养基包含一种或多种TGF-β抑制剂(例如，一种或多种TGF-β信号传导抑制剂)以及一种或多种肌球蛋白II抑制剂。本文还在某些方面提供了用于本文还在某些方面提供了用于在无饲养层细胞条件下离体增殖上皮细胞的细胞培养基，所述培养基包含由TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)和肌球蛋白II抑制剂组成的小分子(例如，小分子抑制剂)。在一些实施方案中，上皮细胞是分化的上皮细胞、原来静止的上皮细胞和/或谱系定型的上皮细胞。
本文在某些方面提供了通过包括以下的方法产生的离体增殖的(例如，扩增的)上皮细胞的群体：a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养和增殖分化的上皮细胞；以及b)在(a)中的所述培养和增殖期间抑制所述分化的上皮细胞中的TGF-β信号传导。
本文在某些方面提供了通过包括以下的方法产生的离体增殖的(例如，扩增的)上皮细胞的群体：a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养和增殖原来静止的上皮细胞；以及b)在(a)中的所述培养和增殖期间抑制所述原来静止的上皮细胞中的TGF-β信号传导。
本文在某些方面提供了通过包括以下的方法产生的离体增殖的(例如，扩增的)上皮细胞的群体：a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养和增殖谱系定型的分化的上皮细胞；以及b)在(a)中的所述培养和增殖期间抑制所述谱系定型的上皮细胞中的TGF-β信号传导。
本文还在某些方面提供了通过包括以下的方法产生的离体增殖的(例如，扩增的)上皮细胞的群体：a)在无饲养层细胞的条件下培养和增殖上皮细胞；b)在(a)中的所述培养和增殖期间抑制所述上皮细胞中的TGF-β信号传导；以及c)在(a)中的所述培养和增殖期间抑制所述上皮细胞中p21活化的激酶(PAK)的活性。在一些实施方案中，上皮细胞是分化的上皮细胞、原来静止的上皮细胞和/或谱系定型的上皮细胞。
本文还在某些方面提供了通过包括以下的方法产生的离体增殖的(例如，扩增的)上皮细胞的群体：a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养和增殖上皮细胞；b)在(a)中的所述培养和增殖期间抑制所述上皮细胞中的TGF-β信号传导；以及c)在(a)中的所述培养和增殖期间抑制所述上皮细胞中肌球蛋白II的活性。在一些实施方案中，上皮细胞是分化的上皮细胞、原来静止的上皮细胞和/或谱系定型的上皮细胞。
本文在某些方面提供了通过包括以下的方法产生的离体增殖的(例如，扩增的)上皮细胞的群体：a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养和增殖分化的上皮细胞；b)在(a)中的所述培养和增殖期间活化所述分化的上皮细胞中的端粒酶逆转录酶；以及c)在(a)中的所述培养和增殖期间调节所述分化的上皮细胞中的细胞骨架结构。
本文在某些方面提供了通过包括以下的方法产生的离体增殖的(例如，扩增的)上皮细胞的群体：a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养和增殖原来静止的上皮细胞；b)在(a)中的所述培养和增殖期间活化所述原来静止的上皮细胞中的端粒酶逆转录酶；以及c)在(a)中的所述培养和增殖期间调节所述原来静止的上皮细胞中的细胞骨架结构。
本文在某些方面提供了通过包括以下的方法产生的离体增殖的(例如，扩增的)上皮细胞的群体：a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养和增殖谱系定型的上皮细胞；b)在(a)中的所述培养和增殖期间活化所述谱系定型的上皮细胞中的端粒酶逆转录酶；以及c)在(a)中的所述培养和增殖期间调节所述谱系定型的上皮细胞中的细胞骨架结构。
本文还在某些方面提供了细胞培养组合物，其包含成分确定的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂(例如TGF-β信号传导抑制剂)和Rho激酶抑制剂(例如Rho相关蛋白质激酶抑制剂)。
本文还在某些方面提供了细胞培养组合物，其由成分确定的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂(例如TGF-β信号传导抑制剂)和Rho激酶抑制剂(例如Rho相关蛋白质激酶抑制剂)组成。
本文还在某些方面提供了细胞培养组合物，其包含成分确定的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂(例如TGF-β信号传导抑制剂)、Rho激酶抑制剂(例如Rho相关蛋白质激酶抑制剂)和β-肾上腺素能激动剂(例如β-肾上腺素能受体激动剂)。
本文还在某些方面提供了细胞培养组合物，其由成分确定的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂(例如TGF-β信号传导抑制剂)、Rho激酶抑制剂(例如Rho相关蛋白质激酶抑制剂)和β-肾上腺素能激动剂(例如β-肾上腺素能受体激动剂)组成。
本文还在某些方面也提供了用于离体增殖上皮细胞的方法，其包括在无饲养层细胞的扩增培养条件下扩增来源于分化组织的原始上皮细胞群体中的细胞数，由此产生扩增的上皮细胞群体，其中所述扩增培养条件包含活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂；当在所述扩增培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行25次或更多次群体倍增；并且当在不包含所述试剂的对照培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行不超过20次群体倍增。
本文还在某些方面提供了用于离体增殖上皮细胞的方法，其包括在无血清且无饲养层细胞的条件下扩增来源于分化组织的原始上皮细胞群体中的细胞数，由此产生扩增的上皮细胞群体，其中所述扩增培养条件包含活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂；并且所述原始上皮细胞群体包含静止和/或原来静止的上皮细胞。在某些实施方案中，扩增培养条件包括调节群体中细胞骨架结构的第二试剂，并且对照培养条件不包括第二试剂。
本文还在某些方面也提供了用于离体增殖上皮细胞的方法，其包括在无饲养层细胞的扩增培养条件下扩增来源于分化组织、胚胎干(ES)细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)的原始上皮细胞群体中的细胞数，由此产生扩增的上皮细胞群体，其中所述扩增培养条件包含活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂；当在所述扩增培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行25次或更多次群体倍增；并且当在不包含所述试剂的对照培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行不超过20次群体倍增。
本文还在某些方面提供了用于离体增殖上皮细胞的方法，其包括在无血清且无饲养层细胞的条件下扩增原始上皮细胞群体中的细胞数，由此产生扩增的上皮细胞群体，其中所述扩增培养条件包含活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂；并且所述原始上皮细胞群体包含分化上皮细胞。
本文还在某些方面提供了用于离体增殖上皮细胞的方法，其包括在无血清且无饲养层细胞的条件下扩增原始上皮细胞群体中的细胞数，由此产生扩增的上皮细胞群体，其中所述扩增培养条件包含活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂；并且所述原始上皮细胞群体包含静止和/或原来静止的上皮细胞。
本文还在某些方面提供了用于离体增殖上皮细胞的方法，其包括在无血清且无饲养层细胞的条件下扩增原始上皮细胞群体中的细胞数，由此产生扩增的上皮细胞群体，其中所述扩增培养条件包含活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂；并且所述原始上皮细胞群体包含谱系定型的上皮细胞。
在以下描述、实施例、权利要求和附图中进一步描述了某些实施方案。
附图简述
附图示出了本技术的某些实施方案，且不具有限制性。为了清楚和易于说明，附图不是按比率绘制的，并且在一些情况下，各个方面可被夸大或放大显示，以便于理解特定实施方案。
图1显示常规培养基(即对照培养条件)中前列腺上皮细胞的生长。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。PrEGM，前列腺上皮细胞生长培养基(Lonza)。PD，群体倍增。
图2显示常规培养基(即对照培养条件)中支气管上皮细胞的生长。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。PrEGM，前列腺上皮细胞生长培养基(Lonza)。PD，群体倍增。
图3A和图3B显示上皮细胞中的hTERT表达。HBEC，人支气管上皮细胞。hTERT，人端粒酶逆转录酶基因。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。LNCaP，人前列腺癌细胞系LNCaP克隆FGC(Sigma-Aldrich)。PrEC，前列腺上皮细胞。PrEGM，前列腺上皮细胞生长培养基(Lonza)。n.d.，未检测到。p，传代。
图4显示上皮细胞中上皮干细胞标志物LGR5表达的缺乏。以1:50稀释度使用多克隆Lgr5抗体(LifeSpan,LS-A1235)。以1:50稀释度使用单克隆TP63抗体(Santa Cruz,sc-25268)。DAPI，DNA荧光染色剂4',6-二脒基-2-苯基吲哚。
图5A和图5B显示支气管上皮细胞中的hTERT表达。HBEC，人支气管上皮细胞。hTERT，人端粒酶逆转录酶基因。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。LNCaP，人前列腺癌细胞系LNCaP克隆FGC(Sigma-Aldrich)。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。n.d.，未检测到。p，传代。
图6A和图6B显示前列腺上皮细胞中的hTERT表达。PrEC，前列腺上皮细胞。hTERT，人端粒酶逆转录酶基因。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。PrEGM，前列腺上皮细胞生长培养基(Lonza)。LNCaP，人前列腺癌细胞系LNCaP克隆FGC(Sigma-Aldrich)。J2，3T3-J2饲养层细胞。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。n.d.，未检测到。p，传代。
图7显示在存在ALK5抑制剂A83-01的KSFM中在常规组织培养表面上前列腺上皮细胞的涂铺效率。PrEC，前列腺上皮细胞。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。A，ALK5抑制剂A83-01。
图8显示在ALK5抑制剂A83-01存在下的KSFM中在常规组织培养表面上支气管上皮细胞的涂铺效率。HBEC，人支气管上皮细胞。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/ThermoFisher)。A，ALK5抑制剂A83-01。
图9显示在存在ALK5抑制剂A83-01和Rho激酶抑制剂(即，Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632的KSFM中在常规组织培养表面上前列腺上皮细胞的涂铺效率。PrEC，前列腺上皮细胞。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。
图10显示在存在ALK5抑制剂A83-01和Rho激酶抑制剂(即，Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632的KSFM中在常规组织培养表面上支气管上皮细胞的涂铺效率。HBEC，人支气管上皮细胞。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。
图11显示在存在ALK5抑制剂A83-01和Rho激酶抑制剂(即，Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632的KSFM中在经胶原I涂覆的组织培养表面上前列腺上皮细胞的涂铺效率。PrEC，前列腺上皮细胞。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。
图12显示在存在ALK5抑制剂A83-01和Rho激酶抑制剂(即，Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632的KSFM中在经胶原I涂覆的组织培养表面上支气管上皮细胞的涂铺效率。HBEC，人支气管上皮细胞。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。
图13显示在存在Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632的KSFM中晚期传代的前列腺上皮细胞和支气管上皮细胞的细胞衰老。PrEC，前列腺上皮细胞。HBEC，人支气管上皮细胞。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。
图14显示前列腺上皮细胞的生长。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/ThermoFisher)。PrEGM，前列腺上皮细胞生长培养基(Lonza)。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。
图15显示支气管上皮细胞的生长。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/ThermoFisher)。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。
图16显示在各种化合物(5μM，实心条；1μM，方格条和0.2μM，空心条)存在下前列腺上皮细胞的生长。对照是没有化合物的KSFM(角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher))。
图17显示在各种化合物(5μM，实心条；1μM，方格条和0.2μM，空心条)存在下前列腺上皮细胞的生长。对照是没有化合物的KSFM(角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher))。
图18显示在KSFM和KSFM+A+Y存在下人包皮角质形成细胞的生长。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。
图19显示在KSFM和KSFM+A+Y存在下前列腺上皮细胞的生长。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。
图20显示在KSFM和KSFM+A+Y存在下支气管上皮细胞的生长。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。
图21显示在KSFM加A83-01和Y-27632中培养的各种上皮细胞的早期和晚期传代时的核型分析结果。左下图显示早期传代的HFK细胞的代表性中期染色体分散(p3)。右下图显示晚期传代的HFK细胞的代表性中期染色体分散(p19)。HFK，人包皮角质形成细胞。HBEC，人支气管上皮细胞。PrEC，前列腺上皮细胞。
图22显示在KSFM加A83-01和Y-27632中培养的不同群体倍增的包皮角质形成细胞中端粒的平均相对长度。使用定量PCR将端粒的相对长度表示为端粒重复(T)与单拷贝基因(S)的比率(T/S比)。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。
图23显示具有A83-01和Y-27632的KSFM中表达转基因核定位的红色荧光蛋白质(nRFP)的上皮细胞系的生长。HFK，人包皮角质形成细胞。HBEC，人支气管上皮细胞。PrEC，前列腺上皮细胞。nRFP，核定位的红色荧光蛋白质。
图24显示具有A83-01和Y-27632的KSFM中生长的表达转基因核定位的红色荧光蛋白质(nRFP)的上皮细胞系的图像。HFK，人包皮角质形成细胞。HBEC，人支气管上皮细胞。PrEC，前列腺上皮细胞。nRFP，核定位的红色荧光蛋白质。
图25显示在各种化合物和条件存在下人包皮角质形成细胞的生长。HFK，人包皮角质形成细胞。M*，改良的MCDB-153培养基(具有90μM CaCl2)加EGF、aFGF、A83-01和Y-27632。EGF，上皮生长因子。aFGF，酸性成纤维细胞生长因子。BSA，无脂肪酸的BSA(Sigma，A8806)。rHA，在水稻(Rice)中表达的重组人血清白蛋白(Sigma，A9731)。脂质混合物，化学成分确定的脂质浓缩物(Gibco,11905-031)。AlbuMAX，I富含脂质的BSA(Gibco，11020-039)。
图26显示在各种化合物和条件存在下人支气管上皮细胞的生长。HBEC，人支气管上皮细胞。M*，改良的MCDB-153培养基(具有90μM CaCl2)加EGF、aFGF、A83-01和Y-27632。EGF，上皮生长因子。aFGF，酸性成纤维细胞生长因子。BSA，无脂肪酸的BSA(Sigma，A8806)。rHA，在水稻(Rice)中表达的重组人血清白蛋白(Sigma，A9731)。脂质混合物，化学成分确定的脂质浓缩物(Gibco,11905-031)。AlbuMAX，I富含脂质的BSA(Gibco，11020-039)。
图27显示与在KSFM中生长的不同传代的上皮细胞相比，表达水平在KSFM加A83-01和Y-27632中生长的不同传代的上皮细胞中被下调或上调的代表性基因列表。处于p2的KSFM中的基因表达水平被设定为1。正数指示上调的倍数，负数指示下调的倍数。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。p2，第2次传代。p6，第6次传代。p13，第13次传代。p23，第23次传代。
图28显示在添加1mM CaCl2(右侧图)后，在具有A83-01和Y-27632(左侧图)的KSFM中培养的上皮细胞的行为的变化。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。
图29显示在具有A83-01和Y-27632以及不同钙浓度的KSFM中培养的支气管上皮细胞的跨TRANSWELL膜的电阻。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。RA，全反式-视黄酸(Sigma)。
图30显示在补充有增加浓度的异丙肾上腺素的KSFM(角质形成细胞-SFM)加A83-01和Y-27632中培养的人包皮角质形成细胞(HFK)和人支气管上皮细胞(HBEC)的生长。
图31显示人支气管上皮细胞(HBEC)分化为支气管球(bronchosphere)。上图显示在较低(4X)放大倍数下观察到的细胞，并且下图显示在较高(20X)放大倍数下观察到的细胞。具有可见腔的大支气管球示于下图中。
图32A到图32D显示在高浓度的CaCl2存在下，在人支气管上皮细胞(HBEC)培养物(图32A、图32B)和人包皮角质形成细胞(HFK)培养物(图32C、图32D)中形成的圆顶样结构。图32A和图32C是整个孔的宏观图像。图32B和图32D是显示微型圆顶的3D样结构的微观图像。
图33显示在高浓度CaCl2存在下诱导分化后的人包皮角质形成细胞(HFK)之间形成的紧密连接。通过使用与Alexa488(ThermoFisher,339188)缀合的单克隆抗体对紧密连接蛋白质ZO-1的免疫荧光染色，揭示细胞间紧密连接的存在。
图34显示在KSFM加A 83-01和Y-27632中在高浓度的CaCl2存在下，在空气-液体界面分化中跨膜电阻(TEER)随时间而增加的人包皮角质形成细胞(HFK)。浸没相由灰色框指示。
图35显示在KSFM加A 83-01和Y-27632中在高浓度的CaCl2存在下，人包皮角质形成细胞(HFK)在空气-液体界面分化中随时间而形成表皮样结构。显示了多层结构，其中各层类似于角质层、颗粒层、棘层和基底层。
图36显示在KSFM加A 83-01、Y-27632和异丙肾上腺素中人包皮角质形成细胞(HFK)的单细胞克隆。
图37显示来源于单细胞的人包皮角质形成细胞(HFK)后代的细胞形态的异质性。
图38显示在KSFM加A 83-01、Y-27632和异丙肾上腺素中培养的人包皮角质形成细胞(HFK)和人支气管上皮细胞(HBEC)的单细胞集落形成效率。
具体实施方式
本文提供了用于离体增殖上皮细胞的方法和培养基组合物。经常将上皮细胞(例如，离体增殖的上皮细胞)与饲养层细胞群体共培养和/或在来源于饲养层细胞的条件培养基中培养。然而，对饲养层细胞的依赖可限制培养上皮细胞的位置和方式，并且可显著增加培养上皮细胞的成本。由于来源于饲养层细胞的成分未确定的生物因子引起的细胞培养可变性，因此饲养层细胞的使用也可能是有问题的。可变性可导致不一致的结果，这使得数据解释由于缺乏可再现性而具有挑战性。饲养层细胞还具有向培养的上皮细胞中引入不想要的病原物(例如，逆转录病毒、其他病原体和免疫原性非人唾液酸例如Neu5Gc)的潜力。对于某些应用，例如移植，此类培养条件可能是不期望的。
通常在补充有血清(例如，胎牛血清(FBS))的培养基中培养上皮细胞。然而，在某些情况下，血清可以是成分未确定的促有丝分裂原的来源，且经常观察到批次间变化。此外，血清可能被感染原(例如支原体和病毒)污染。因此，血清可以是培养基的成分未确定且可变的组分，并且血清的使用可阻止对某些培养细胞的限定的营养和激素要求。
上皮细胞可在无饲养层细胞条件下用无血清培养基培养，所述培养基经常补充有一种或多种生长因子以及一种或多种成分未确定的动物器官提取物。然而，在这些条件下培养的上皮细胞通常在几次传代后停止增殖，具有非常有限的寿命，并且通常不能离体大规模扩增。
本文提供了用于离体增殖和扩增上皮细胞的方法和培养基组合物，而不使用饲养层细胞或饲养层细胞来源的条件培养基，并且在某些实施方案中，不使用血清。本文还在某些实施方案中提供了用于在限定的细胞培养条件下离体增殖和扩增上皮细胞的方法和培养基组合物。本文还在某些实施方案中提供了使用本文所提供的方法和组合物增殖和扩增的上皮细胞群体。
上皮细胞
本文提供了用于离体增殖和扩增上皮细胞的方法和组合物。上皮细胞或上皮通常是指衬于中空器官中的一种或多种细胞以及构成腺体和机体外表面的那些。上皮细胞可包括鳞状上皮细胞、柱状上皮细胞、腺瘤性上皮细胞或移行上皮细胞。上皮细胞可布置成单层，或可布置成多层，这取决于器官和位置。
本文所述的上皮细胞可包括角质形成细胞(KE)上皮细胞或非角质形成细胞(NKE)上皮细胞。角质形成细胞形成在解剖部位(例如皮肤、眼表面、口腔粘膜、食道和子宫颈)处发现的鳞状上皮。角质形成细胞终末分化为平坦、高度角化、无活性的细胞，所述细胞通过形成保护屏障有助于抵抗环境和感染。角质形成细胞上皮细胞的示例包括但不限于真皮角质形成细胞、眼上皮细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、食道上皮细胞和子宫颈上皮细胞。
NKE细胞形成例如在乳腺、前列腺、肝脏、呼吸道、视网膜和胃肠道中发现的机体的上皮。NKE细胞通常分化为例如在吸收和/或分泌中起作用的功能性活细胞。这些细胞通常不形成鳞状上皮细胞特有的高度角质化结构。
用于本文所述方法中的NKE细胞可以是任何类型或组织来源。NKE细胞的示例包括但不限于前列腺细胞、乳腺细胞、肝细胞、肝上皮细胞、胆道上皮细胞、胆囊细胞、胰岛细胞、胰腺β细胞、胰腺导管上皮细胞、肺上皮细胞、气道上皮细胞、鼻上皮细胞、肾细胞、膀胱细胞、尿道上皮细胞、胃上皮细胞、大肠上皮细胞、小肠上皮细胞、睾丸上皮细胞、卵巢上皮细胞、输卵管上皮细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞、垂体细胞、腺细胞、羊膜上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、汗腺上皮细胞、皮脂上皮细胞和毛囊细胞。在一些实施方案中，NKE细胞不包括肠上皮细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞包括基底上皮细胞。基底上皮细胞通常是复层上皮和多层上皮的最深层中的细胞。基底上皮细胞可以是其核在假复层上皮中靠近基底层定位的细胞。在一些情况下，基底上皮细胞可分裂(例如，通过不对称细胞分裂或对称细胞分裂)，产生其他基底细胞和/或其他上皮细胞类型(例如，复层上皮细胞、多层上皮细胞或假复层上皮细胞中的其他细胞类型)。一些上皮中一定比例的基底上皮细胞可具有终生的自我更新能力，并且可产生其他上皮细胞类型和基底细胞，且有时被认为是上皮干细胞。具有终生自我更新能力并且被认为是上皮干细胞的基底上皮细胞的比例在不同组织中不同。
上皮细胞可从受试者和/或细胞来源获得。从受试者和/或细胞来源获得的细胞可被称为原始上皮细胞群体。原始上皮细胞群体是用于通过本文所述培养条件(例如，扩增培养条件、无饲养层细胞的扩增条件)扩增的上皮细胞的输入群体。细胞来源可包括胚胎干(ES)细胞群体、诱导性多能干细胞(iPSC)群体等。在一些实施方案中，从胚胎或来源于胚胎的干细胞培养物中分离原始上皮细胞群体。在一些实施方案中，从诱导性多能干细胞(iPSC)培养物中分离原始上皮细胞群体。可以多种方式从受试者获得原始上皮细胞群体(例如，从活组织获得，例如活检标本、拔出的毛囊、体液如尿液或体腔液体，或从循环中分离)。受试者可包括任何动物，包括但不限于任何哺乳动物，例如小鼠、大鼠、犬、猫、牛、马、猪、非人灵长类动物和人。在某些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是在子宫环境中比胚胎孕育时间更长的动物或人，并且通常是出生后的人或出生后的动物(例如，新生人、新生动物、成年人或成年动物)。通常，受试者不是胚胎。受试者有时是幼年动物、幼年人、成年动物或成年人。
在一些实施方案中，从来自受试者的样品中分离原始上皮细胞群体。样品可包括从受试者或其部分分离或获得的任何样本。样本的非限制性示例包括来自受试者的流体或组织，包括但不限于血液或血液产品(例如血清、血浆等)、脐带血、骨髓、绒膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、灌洗液(例如支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳、关节镜)、活检样品或组织活检样本、颊拭子、膜间液抽取(celocentesis)样品、女性生殖道洗涤物、尿液、排泄物、痰、唾液、鼻粘液、前列腺液、灌洗物、精液、淋巴液、胆汁、眼泪、汗液、母乳、乳汁(breast fluid)、硬组织(例如肝、脾、肾、肺或卵巢)等或其组合。术语血液包括全血、血液产品或任何血液级分，例如血清、血浆、血沉棕黄层等，如常规所定义的。血浆是指由用抗凝血剂处理的血液的离心产生的全血的级分。血清是指在血液样品凝固后残留的水样流体部分。在一些实施方案中，从母体样品(例如，母体血液、羊水)分离胎儿细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞可包括正常的健康细胞(例如，未患病的细胞)。在一些实施方案中，上皮细胞可包括未经遗传改变的细胞。在一些实施方案中，上皮细胞可包括患病和/或遗传改变的细胞。患病的上皮细胞可包括来自携带致病突变的受试者的细胞(例如，CFTR基因中具有遗传突变的上皮细胞)。患病的上皮细胞可包括来自异常组织的细胞，例如来自瘤形成、增生、恶性肿瘤或良性肿瘤的细胞。在某些实施方案中，患病的上皮细胞可包括不是肿瘤细胞的细胞。在某些实施方案中，患病的上皮细胞可包括从受试者的循环中分离的细胞(例如，循环的肿瘤细胞(CTC))。在某些实施方案中，患病的上皮细胞可包括从身体样品例如尿液、精液、粪便(排泄物)等中分离的细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞包括原代细胞。在一些实施方案中，原始上皮细胞群体包括原代细胞。原代上皮细胞直接取自活组织(例如活检标本)、拔出的毛囊、身体样品(例如粪便样品、体液如尿液、精液或体腔液体)，或从循环中分离。在某些情况下，原始细胞尚未被传代。在某些情况下，原代细胞已被传代一次。可从分化组织中分离(例如，从各种器官的上皮中分离)原代细胞。通常，原代细胞已例如通过组织消化被刚刚分离，并涂铺。原代细胞可被冷冻或可不被冷冻，然后稍后被解冻。另外，从中分离原始细胞的组织可在或可不在处理之前立即以某种其他方式被冷冻保存。通常，在细胞被传代超过一次后，所述细胞不再是原代细胞。传代一次或多次且在传代后立即冷冻的细胞在解冻时也不被视为原代细胞。在某些实施方案中，上皮细胞最初是原代细胞，并且通过使用本文所述的方法，在传代后变成非原代细胞。在一些实施方案中，在从分化组织分离原始上皮细胞群体的细胞之后并且在使原始上皮细胞群体与本文所述的培养条件(例如，本文所述的扩增培养条件)接触之前，在细胞培养中维持或增殖所述细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞包括非原代细胞，例如来自建立的细胞系的细胞、转化的细胞、来自先前冷冻收集物的解冻细胞等。在某些实施方案中，上皮细胞包括次代细胞。在一些实施方案中，上皮细胞不包括来自已建立的细胞系的细胞。
在一些实施方案中，培养组合物包含来源于相同组织或相同组织隔室的上皮细胞的异源群体(例如，包含细胞类型和/或分化状态的混合物，例如上皮干细胞、上皮祖细胞、上皮前体细胞、谱系定型的上皮细胞、短期扩增(transit-amplifying)的上皮细胞、分化中的上皮细胞、分化的上皮细胞和终末分化的上皮细胞)。在一些实施方案中，培养组合物包含来源于相同组织或相同组织隔室的上皮细胞的同源群体(例如，不包括细胞类型和/或分化状态的混合物)。在一些实施方案中，上皮细胞的同源群体包含至少约90％具有相同细胞类型和/或以相同分化状态存在的上皮细胞。例如，上皮细胞的同源群体可包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％具有相同细胞类型和/或以相同的分化状态存在的上皮细胞。在一些实施方案中，上皮细胞的同源群体包含约100％具有相同细胞类型和/或以相同分化状态存在的上皮细胞。在一些实施方案中，上皮细胞是基底上皮细胞的同源群体。在一些实施方案中，原始上皮细胞群体可能是异源的或可能是同源的。在一些实施方案中，扩增的上皮细胞群体可能是异源的或可能是同源的。
在一些实施方案中，上皮细胞的特征在于包含在上皮细胞群体中或不存在于上皮细胞群体中的细胞类型和/或分化状态。在一些实施方案中，此类细胞表征可适用于原始上皮细胞群体。在一些实施方案中，此类细胞表征可适用于扩增的上皮细胞群体。在一些实施方案中，此类细胞表征可适用于原始上皮细胞群体和扩增的上皮细胞群体。在一些实施方案中，包含特定细胞类型和/或分化状态的上皮细胞包括至少约50％具有特定细胞类型和/或分化状态的上皮细胞。在一些实施方案中，包含特定细胞类型和/或分化状态的上皮细胞包括至少约90％具有特定细胞类型和/或分化状态的上皮细胞。例如，包含特定细胞类型和/或分化状态的上皮细胞可包括至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％具有特定类型和/或分化状态的上皮细胞。通常，不包含特定细胞类型和/或分化状态的上皮细胞包括小于约10％具有特定细胞类型和/或分化状态的细胞。例如，不包含特定细胞类型和/或分化状态的上皮细胞可包括小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％具有特定细胞类型和/或分化状态的细胞。
在某些实施方案中，培养组合物或群体基本上由特定类型的上皮细胞组成，下文被称为“多数细胞”。此类培养组合物可包含少量的一种或多种其他类型的上皮细胞，下文被称为“少数细胞”。少数细胞通常来自或来源于与多数细胞相同的组织，并且通常来自或来源于与多数细胞相同的组织隔室。多数细胞可以是所述组合物中总细胞的大于50％、大于60％、大于70％或大于80％，并且经常是所述组合物中总细胞的约90％或更高，并且有时是所述组合物或群体中总细胞的约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。
在一些实施方案中，培养组合物包含处于不同细胞周期阶段的上皮细胞的异源群体，例如M期、G1期、S期、G2期以及包括衰老和静止的G0期。在一些实施方案中，原始上皮细胞群体包括处于不同细胞周期阶段的上皮细胞的异源群体，例如M期、G1期、S期、G2期以及包括衰老和静止的G0期。在一些实施方案中，扩增的上皮细胞群体包括处于不同细胞周期阶段的上皮细胞的异源群体，例如M期、G1期、S期、G2期以及包括衰老和静止的G0期。处于特定细胞周期阶段的上皮细胞可占群体的1％到100％。
在一些实施方案中，上皮细胞包括处于一个或多个分化阶段的细胞。在一些实施方案中，可描述原始上皮细胞群体的此类分化阶段。在一些实施方案中，可描述扩增的上皮细胞群体的此类分化阶段。在一些实施方案中，可描述原始上皮细胞群体和扩增的上皮细胞群体的此类分化阶段。例如，上皮细胞(或上皮细胞群体)可包括上皮干细胞、上皮祖细胞、谱系限制性上皮祖细胞、上皮前体细胞、谱系定型的上皮细胞、短期扩增的上皮细胞、增殖的上皮细胞、分化中的上皮细胞、分化的上皮细胞、静止上皮细胞、原来静止的上皮细胞、非增殖的上皮细胞和终末分化的上皮细胞(例如，在组织和器官中发现的细胞)。上皮细胞还可包括从多能干细胞(胚胎干(ES)细胞或诱导性多能干细胞(iPSC))分化和/或来源的谱系定型的上皮细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞包括分化的上皮细胞。分化的上皮细胞可分裂，但通常不具有无限自我更新的能力。在一些实施方案中，分化的上皮细胞未获得分化为多种组织类型的能力。在本文所述的条件下培养的分化上皮细胞通常比未分化细胞(例如，干细胞(胚胎或成体)、祖细胞、前体细胞)分化程度高，并且比终末分化的细胞分化程度低。分化的上皮细胞通常不包括干细胞(胚胎或成体)、祖细胞或前体细胞。在某些情况下，分化的上皮细胞可被称为“组织特异性”和/或“谱系定型的”上皮细胞。在某些情况下，分化的上皮细胞可包括组织特异性和/或谱系定型的上皮细胞。在一些实施方案中，分化的上皮细胞包括静止上皮细胞。在一些实施方案中，分化的上皮细胞包括基底上皮细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞包括静止或原来静止的细胞。静止细胞通常是非增殖性细胞(即，非循环细胞、已从细胞周期退出的细胞、静息细胞)，并且可被表征为可逆停滞的生长。在某些条件下，可诱导静止细胞增殖。静止细胞可被表征为存在于细胞周期的G0期中。已被诱导增殖的静止细胞可被称为原来静止的细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞包括器官特异性上皮细胞。器官特异性上皮细胞有时被称为组织特异性上皮细胞。在一些实施方案中，器官特异性上皮细胞可分化为给定器官内的更特异性的细胞类型，但通常不具有或未获得分化为其他类型器官的细胞的能力。器官特异性上皮细胞通常比未分化细胞(例如，干细胞(胚胎或成体))分化程度高，并且比终末分化的细胞的分化程度低。器官特异性上皮细胞通常不包括胚胎干细胞。器官特异性上皮细胞可包括或可不包括成体干细胞(例如成体上皮干细胞)，并且器官特异性上皮细胞可包括或可不包括祖细胞或前体细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞包括谱系定型的上皮细胞。在一些实施方案中，上皮细胞可包括从多能干细胞(例如胚胎干(ES)细胞和诱导性多能干细胞(iPSC))分化的谱系定型的上皮细胞。谱系定型的上皮细胞可分裂，但通常不具有无限自我更新的能力。在一些实施方案中，谱系定型的上皮细胞可分化为给定细胞谱系(例如，呼吸谱系、消化谱系或皮肤谱系)内的各种细胞类型，但通常不具有或未获得分化为不同细胞谱系的细胞的能力(例如，皮肤谱系定型的上皮细胞通常不分化为血细胞)。谱系定型的上皮细胞通常比未分化的多能干细胞分化程度高，并且比终末分化的细胞分化程度低。谱系定型的的上皮细胞通常不包括多能干细胞(胚胎干细胞或诱导的多能干细胞)。在一些实施方案中，谱系定型的上皮细胞包括祖细胞或前体细胞。在一些实施方案中，谱系定型的上皮细胞包括基底上皮细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞不包括终末分化的上皮细胞。终末分化的上皮细胞通常不分裂并且定型为特定的功能。终末分化的上皮细胞的特征通常在于从细胞周期中确定性地退出，并且通常不可被诱导以增殖。在一些实施方案中，上皮细胞不包括终末分化的胃上皮细胞、肠上皮细胞和/或胰腺上皮细胞。在一些实施方案中，上皮细胞不包括有丝分裂后细胞。有丝分裂后细胞通常不能或不再能够细胞分裂。在一些实施方案中，上皮细胞不包括衰老细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞不包括胚胎干细胞。在一些实施方案中，上皮细胞分化自和/或来源于胚胎干细胞。在一些实施方案中，上皮细胞不是来源于胚胎干细胞。通常，胚胎干细胞是具有无限再生或自我更新能力的未分化细胞。胚胎干细胞有时被认为是多能的(即，可分化为成体生物体的许多或所有细胞类型)，且有时被认为是全能的(即，可分化为所有细胞类型，包括胎盘组织)。在一些实施方案中，上皮细胞不包括诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，上皮细胞分化自和/或来源于诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，上皮细胞不是来源于诱导性多能干细胞(iPSC)。通常，诱导性多能干细胞(iPSC)是一种可直接从成体细胞产生的多能干细胞。在一些实施方案中，上皮细胞不包括多能细胞。在一些实施方案中，上皮细胞不包括全能细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞包括成体干细胞。成体干细胞通常比分化的细胞、器官特异性细胞或谱系定型的细胞的分化程度低，并且比胚胎干细胞的分化程度高。成体干细胞可被称为干细胞、未分化的干细胞、前体细胞和/或祖细胞，并且不被认为是胚胎干细胞，因为成体干细胞不是从胚胎中分离出来的。成体上皮干细胞可被称为上皮干细胞、未分化的上皮干细胞、上皮前体细胞和/或上皮祖细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞不包括成体干细胞或来源于成体干细胞的细胞。在一些实施方案中，上皮细胞不包括上皮干细胞或来源于上皮干细胞的细胞。在一些实施方案中，上皮细胞不包括多能干细胞或来源于多能干细胞的细胞。在一些实施方案中，上皮细胞不包括祖细胞或来源于祖细胞的细胞。在一些实施方案中，上皮细胞不包括前体细胞或来源于前体细胞的细胞。在一些实施方案中，上皮细胞不包括连续增殖的(例如，在体内连续增殖的)上皮干细胞(例如，肠隐窝细胞；Lgr5+细胞)或来源于连续增殖的上皮干细胞的细胞。在一些实施方案中，原始细胞或从中收获原始细胞的组织不包括连续增殖的上皮干细胞(例如，肠隐窝细胞；Lgr5+细胞)并且本文中的方法可不包括对此类细胞类型的选择。例如，在一些实施方案中，方法不包括选择连续增殖的上皮干细胞和/或选择连续增殖的上皮干细胞的体内群体(即，在收获前在受试者中连续增殖的上皮干细胞群体)。在一些实施方案中，上皮细胞未获得形成类器官的能力。在一些实施方案中，上皮细胞在初始分离并涂铺后不是完全未分化的细胞。
在一些实施方案中，上皮细胞的特征可能在于所述细胞是否具有一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征(epigenetic signature))和/或不具有可测量水平的某些标志物或具有低水平的某些标志物。在一些实施方案中，此类标志物表征可适用于原始上皮细胞群体。在一些实施方案中，此类标志物表征可适用于扩增的上皮细胞群体。在一些实施方案中，此类标志物表征可适用于原始上皮细胞群体和扩增的上皮细胞群体。
在某些情况下，确定标志物的表达(例如，mRNA表达)的水平。可使用用于检测和测量mRNA表达的任何适合的方法来确定mRNA表达水平。例如，可通过根据Ct基因值的定量逆转录PCR来确定表达水平，其中Ct基因是定量PCR反应的荧光信号跨越限定的(例如可检测的)阈值所需的循环数。通常，如果Ct基因高于35，则认为不存在标志物的表达。如果Ct基因小于35并且大于或等于30，则认为标志物的表达水平较低。如果Ct基因小于29并且大于或等于22，则认为标志物的表达水平是中等或适中的。如果Ct基因小于22，则认为标志物的表达水平是高的。
在一些实施方案中，上皮细胞具有通常与特定细胞类型和/或分化状态相关的标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)。在一些实施方案中，上皮细胞不具有通常与特定细胞类型和/或分化状态相关的标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)。在一些实施方案中，上皮细胞具有通常不与特定细胞类型和/或分化状态相关的标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)。在一些实施方案中，上皮细胞具有通常不与未分化的干细胞相关的标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)。在一些实施方案中，上皮细胞具有通常与基底上皮细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)。在一些实施方案中，上皮细胞具有通常与分化的上皮细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)。在一些实施方案中，上皮细胞具有通常与气道上皮细胞和/或角质形成细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)。在一些情况下，可能存在适度水平到高水平的标志物。在一些实施方案中，上皮细胞不具有可测量水平的或具有低水平的通常与某些细胞类型(例如多能性干细胞、终末分化的上皮细胞、衰老细胞、胃上皮细胞、肠上皮细胞、胰腺上皮细胞、成纤维细胞和/或肠杯状细胞)相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)。在一些实施方案中，上皮细胞不具有可测量水平的或具有低水平的通常与细胞粘附和/或应激反应相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)。
在一些实施方案中，器官特异性上皮细胞不具有可测量水平的或具有低水平的通常与来自其他器官的细胞类型相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)。例如，气道上皮细胞可不具有可测量水平的或可具有低水平的通常与胃上皮细胞、肠上皮细胞、胰腺上皮细胞、成纤维细胞和/或肠杯状细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)。
在一些实施方案中，上皮细胞具有通常与基底上皮细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如，ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5和TP63。在一些实施方案中，上皮细胞具有通常与分化的上皮细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如，KRT4、KRT6和KRT8。在一些实施方案中，上皮细胞具有通常与气道上皮细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如，HEY2、NGFR和BMP7。在一些实施方案中，上皮细胞具有通常与角质形成细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如，ZFP42。在一些实施方案中，上皮细胞具有一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如CDKN2B、CITED2、CREG1、ID1、MAP2K6、IGFBP3和IGFBP5。在一些情况下，可能存在适度水平到高水平的此类标志物。
在一些实施方案中，上皮细胞不具有可测量水平的或具有低水平的通常与上皮干细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如，LGR5。在一些实施方案中，上皮细胞不具有可测量水平的或具有低水平的通常与多能干细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如，LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4和SOX2。在一些实施方案中，上皮细胞不具有可测量水平的或具有低水平的通常与终末分化的上皮细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如，CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPB和SFTPD。在一些实施方案中，上皮细胞不具有可测量水平的或具有低水平的通常与细胞衰老相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如，AKT1、ATM、CDKN2A、GADD45A、GLB1、PLAU、SERPINE1和SOD2。在一些实施方案中，上皮细胞不具有可测量水平的或具有低水平的通常与细胞粘附相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如，粘附分子FN1和THBS1。在一些实施方案中，上皮细胞不具有可测量水平的或具有低水平的通常与细胞丝相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如，中间丝蛋白质波形蛋白(VIM)。在一些实施方案中，上皮细胞不具有可测量水平的或具有低水平的通常与胃上皮细胞、肠上皮细胞或胰腺上皮细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如，CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1和PROM1/CD133。在一些实施方案中，上皮细胞不具有可测量水平的或具有低水平的通常与成纤维细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如，ZEB1和ZEB2。在一些实施方案中，上皮细胞不具有可测量水平的或具有低水平的通常与肠杯状细胞相关的一种或多种标志物(例如，细胞表面标志物、mRNA、蛋白质、表观遗传学特征)，例如，KRT20。
细胞培养
本文提供了用于细胞培养的方法和组合物。特别地，本文提供了扩增培养条件。细胞培养或培养通常是指细胞在人工、体外环境中的维持，或细胞在外部、离体环境(即，生物体外部)中的维持，并且可包括单个细胞和组织的培育。本文所述的某些细胞培养系统可以是离体环境和/或体外环境。在一些实施方案中，分离原代细胞。在一些实施方案中，可使用单针活检分离原代细胞。在一些实施方案中，可使用组织活检分离原代细胞。在一些实施方案中，可从拔出的毛发中分离原代细胞。在一些实施方案中，可从体液如尿液或体腔液中分离原代细胞。在一些实施方案中，可从受试者的循环中分离原代细胞。
分离后，可洗涤(例如，用盐水和/或PBS溶液)细胞材料。可用例如胶原酶、分散酶和/或胰蛋白酶的酶溶液处理细胞材料，以促进细胞从组织基质的解离。例如，分散酶可用于从下层组织解离上皮。然后可用例如胰蛋白酶或胶原酶处理完整的上皮。此类消化步骤经常产生含有解离的细胞和组织基质的浆液。然后可用足够的力将浆液离心以从浆液的剩余物中分离细胞。然后可移除细胞沉淀并用缓冲液和/或盐水和/或细胞培养基洗涤。离心和洗涤可重复任意次数。在最后洗涤后，可用任何适合的细胞培养基洗涤细胞。在某些情况下，如果在分离(例如，对于从循环中或使用针活检分离的细胞)时从下层组织充分分离细胞，则可不进行消化和洗涤步骤。在一些实施方案中，可从受试者的循环中分离细胞，例如肿瘤细胞。在某些实施方案中，肿瘤细胞可根据在某些类型的肿瘤细胞上特异性表达的细胞标志物来分离(参见例如Lu.J.等，Int’l.J.Cancer,126(3):669-683(2010)和Yu,M.等，J.Cell Biol.,192(3):373-382(2011)，其通过引用并入)。可使用或可不使用电子细胞计数器(例如库尔特计数器(Coulter Counter))对细胞进行计数，或者可使用血细胞计数器对它们进行手动计数。
细胞接种密度可根据某些期望的培养条件进行调节。例如，可使用约1×103到约1-10×105个细胞/cm2的初始接种密度。在一些实施方案中，可使用约1-10到约1-10×105个细胞/cm2的初始接种密度。在某些情况下，可在75cm2培养瓶中培养1×106个细胞。可根据需要在任何传代改变细胞密度。
可在细胞培育箱中在约37℃在正常大气压下培养细胞。培育箱气氛可被加湿，并且可在空气中含有约3-10％的二氧化碳。在一些情况下，培育箱气氛可含有约0.1-30％的氧气。温度、压力以及二氧化碳和氧气的浓度可根据需要而改变。培养基pH可在约7.1到约7.6、或约7.1到约7.4、或约7.1到约7.3范围。
可根据需要每1-2天或更频繁地或更不频繁地更换细胞培养基。随着细胞在培养皿中接近铺满，它们可被传代。细胞传代是细胞的裂解(splitting)或分裂，以及将一部分细胞转移到新的培养皿或培养环境中。粘附到细胞培养表面的细胞可能需要分离。从培养皿的表面分离粘附细胞的方法是众所周知的，并且可包括使用酶，例如胰蛋白酶。
单个传代是指细胞一次裂解或手动分裂，以及将较少数目的细胞转移到新的容器或环境中。当传代时，细胞可裂解成允许细胞附着并生长的任何比率。例如，在单次传代时，细胞可以1:2的比率、1:3的比率、1:4的比率、1:5的比率等分裂。在一些实施方案中，将细胞传代至少约1次到至少约300次。例如，可将细胞传代至少约2次、5次、10次、20次、30次、40次、50次、60次、70次、80次、90次、100次、200次或300次。在一些实施方案中，将细胞传代至少约15次。在一些实施方案中，将细胞传代至少约25次。
细胞生长通常是指细胞分裂，使得一个母细胞分成两个子细胞。细胞生长可被称为细胞扩增。在本文中，细胞生长通常不是指细胞的实际大小(例如，直径、体积)的增加。细胞生长的刺激可通过将细胞群体(例如，细胞群体倍增)相对于时间绘图来评估。具有更陡的生长曲线的细胞群体通常被认为比具有较不陡的曲线的细胞群体生长得更快。例如，可比较相同细胞类型之间的各种处理的生长曲线，或者可比较具有相同条件的不同细胞类型的生长曲线。
扩增细胞群体可被表示为群体倍增。当培养中的细胞分裂使得细胞的数目倍增时，发生细胞群体倍增。在一些情况下，对细胞计数以确定细胞群体是否已倍增，增至三倍或乘以某其他因数。群体倍增数可能不等同于细胞培养物传代的次数。例如，将细胞传代并将其它们以1:3的比率裂解以进一步培养可能不等同于增至三倍的细胞群体。可用于计算群体倍增(PD)的公式呈现于等式A中：
n＝3.32*(log Y-log l)+X 等式A
其中n＝细胞培养物在其被收获或传代时的最终PD数，Y＝收获或传代时的细胞产量，l＝用作开始该细胞培养的接种物的细胞数，并且X＝用于起始传代培养的原始细胞培养物的PD数。
细胞群体可在一定时间段内倍增一定次数。在一些实施方案中，细胞群在一定时间段内能够倍增或倍增至少约1次到至少约500次。例如，细胞群体可能能够倍增或倍增至少约2次、5次、10次、20次、30次、40次、50次、60次、70次、80次、90次、100次、110次、120次、130次、140次、150次、160次、170次、180次、190次、200次、250次、300次、350次、400次、450次或500次。在一些实施方案中，细胞能够倍增或倍增至少20次。在一些实施方案中，细胞能够倍增或倍增至少50次。在一些实施方案中，细胞能够倍增或倍增至少60次。在一些实施方案中，细胞能够倍增或倍增至少70次。在一些实施方案中，细胞能够倍增或倍增至少80次。在一些实施方案中，细胞能够倍增或倍增至少90次。在一些实施方案中，细胞能够倍增或倍增至少100次。在一些实施方案中，细胞能够倍增或倍增至少120次。在一些实施方案中，细胞能够倍增或倍增至少150次。在一些实施方案中，细胞能够倍增或倍增至少200次。在一些实施方案中，细胞群体在约1天到约500天的时期内倍增或能够倍增一定次数。例如，细胞群体可在约2天、5天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、200天、250天、300天、350天、400天、450天或500天的时期内倍增或能够倍增一定次数。在一些实施方案中，细胞群体在约50天的时期内倍增或能够倍增一定次数。在一些实施方案中，细胞群体在约100天的时期内倍增或能够倍增一定次数。在一些实施方案中，细胞群体在约150天的时期内倍增或能够倍增一定次数。在一些实施方案中，细胞群体在约200天的时期内倍增或能够倍增一定次数。
在一些实施方案中，本文的方法包括扩增细胞群体。扩增细胞群体可被称为增殖细胞群体。扩增细胞群体可被表示为细胞数目的倍数增加。可用于计算随群体倍增而变化的倍数增加的公式呈现于等式B中：
F＝2n 等式B
其中F＝n次群体倍增后的细胞数目的倍数增加。例如，在一(1)次群体倍增后，细胞数增加到2倍，并且在两(2)次倍增后，细胞数增加到4(22＝4)倍，并且在三(3)次群体倍增后，细胞数增加到8(23＝8)倍，等等。因此，在二十(20)次群体倍增后，细胞数增加到一百万倍(220＝1,048,576)，并且在三十(30)次群体倍增后，细胞数增加到超过十亿倍(230＝1,073,741,824)，并且在四十(40)次群体倍增后，细胞数增加到超过1兆倍(240＝1,099,511,627,776)，等等。在一些实施方案中，细胞群体被扩增或能够被扩增至少约2倍到至少约10兆倍。例如，细胞群体可被扩增至少约5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍、100,000倍、1百万倍、10亿倍或1兆倍。特定的倍数扩增可在培养中在一定的时间段(例如2天、3天、4天、5天、10天、20天、30天、40天、50天、100天或更长)内发生。
细胞可被连续增殖或连续培养。连续增殖或连续培养是指连续分裂细胞，在细胞培养容器中达到或接近铺满，使得细胞需要传代和添加新鲜培养基以维持它们的健康。连续增殖的细胞或连续培养的细胞可具有与永生化细胞相似或相同的特征。在一些实施方案中，细胞继续生长并分裂至少约5次传代到至少约300次传代。例如，细胞可继续生长并分裂至少约10次传代、20次传代、30次传代、40次传代、50次传代、60次传代、70次传代、80次传代、90次传代、100次传代、200次传代或300次传代。
在一些实施方案中，上皮细胞在初始收集和涂铺时是上皮细胞的异源群体，并且在一次或多次传代后成为上皮细胞的同源群体。例如，在2次传代后，在3次传代后，在4次传代后，在5次传代后，在10次传代后，在20次传代后，在30次传代后，在40次传代后，在50次传代后或在100次或更多次传代后，上皮细胞的异源群体可成为上皮细胞的同源群体。
在一些实施方案中，上皮细胞的特征在于在初始收集和涂铺时包含在上皮细胞群体中或不存在于上皮细胞群体中的细胞类型和/或分化状态。在一些实施方案中，上皮细胞的特征在于在一次或多次传代后包含在上皮细胞群体中或不存在于上皮细胞群体中的细胞类型和/或分化状态。例如，上皮细胞的特征可能在于在2次传代后，在3次传代后，在4次传代后，在5次传代后，在10次传代后，在20次传代后，在30次传代后，在40次传代后，在50次传代后或在100次或更多次传代后，包含在上皮细胞群体中或不存在于上皮细胞群体中的细胞类型和/或分化状态。在一些实施方案中，上皮细胞的特征在于包含在原始上皮细胞群体中的细胞类型和/或分化状态。在一些实施方案中，上皮细胞的特征在于包含在扩增的上皮细胞群体中的细胞类型和/或分化状态。
在一些实施方案中，细胞在扩增、连续增殖或连续培养期间不经历分化。例如，细胞在扩增、连续增殖或连续培养期间可不分化为终末分化细胞或其他细胞类型。在一些实施方案中，特定器官或谱系的细胞不分化为不同器官或谱系的细胞。例如，气道上皮细胞在扩增、连续增殖或连续培养期间可不分化为成纤维细胞、肠上皮细胞、肠杯状细胞、胃上皮细胞或胰腺上皮细胞。在一些实施方案中，细胞在扩增、连续增殖或连续培养期间经历一定程度的分化。例如，谱系定型的上皮细胞可分化为给定谱系内的细胞类型，和/或器官特异性上皮细胞可在扩增、连续增殖或连续培养期间分化为给定器官内的其他细胞类型。
在一些实施方案中，一定比例的上皮细胞可处于G0静息期，其中细胞已退出细胞周期并且已停止分裂，该G0静息期包括静止状态和衰老状态。一定比例的上皮细胞可处于G1期，其中细胞的大小增加并准备好DNA合成。一定比例的上皮细胞可处于S期，其中发生DNA复制。一定比例的上皮细胞可处于G2期，其中细胞继续生长并且准备好进入M(有丝分裂)期并分裂。一定比例的上皮细胞可处于M(有丝分裂)期和完全细胞分裂。
在一些实施方案中，细胞的特征在于端粒长度。在一些实施方案中，原始上皮细胞群体中的细胞的特征在于端粒长度。在一些实施方案中，扩增的上皮细胞群体中的细胞的特征在于端粒长度。通常，随着细胞分裂，端粒长度缩短。当端粒的平均长度减小到一定长度，例如4kb时，细胞通常可能停止分裂。在一些实施方案中，在本文所述的培养基和/或培养条件下培养的细胞的平均端粒长度可减小到小于约10kb的长度，并且所述细胞可继续分裂。例如，在本文所述的培养基和/或培养条件下培养的细胞的平均端粒长度可减小到小于约9kb、8kb、7kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb或1kb、并且所述细胞可继续分裂。平均端粒长度有时被表示为平均端粒长度或中值端粒长度。平均端粒长度可使用用于确定端粒长度的任何适合的方法来确定，并且可根据细胞类型而变化。在一些实施方案中，平均端粒长度被确定为端粒重复相对于单拷贝基因的重复的丰度。
在一些实施方案中，将细胞扩增、连续增殖或连续培养用于一定次数的传代而不改变细胞核型。例如，细胞核型的改变可包括染色体或其部分的重复或缺失和/或一个染色体的一部分转位到另一染色体。可测定细胞群体在一定次数的传代后的核型，可将其与传代之前的同一来源的细胞群体进行比较。在一些实施方案中，在至少约5次传代到至少约300次传代后，细胞具有未改变的核型。例如，在至少约10次传代、20次传代、30次传代、40次传代、50次传代、60次传代、70次传代、80次传代、90次传代、100次传代、200次传代或300次传代后，细胞可具有未改变的核型。在某些情况下，在一定次数的传代后具有未改变的核型的细胞可被称为条件永生化细胞。
在一些实施方案中，本文的方法包括使用细胞外基质(ECM)。在一些实施方案中，本文的方法不包括使用细胞外基质。ECM可含有某些多糖、水、弹性蛋白和某些糖蛋白，例如胶原、巢蛋白(neidogen)、纤连蛋白和层粘连蛋白。可通过在涂铺上皮细胞之前培养产生ECM的细胞，并任选地移除这些细胞来产生ECM。产生ECM的细胞的示例包括软骨细胞，其产生胶原和蛋白聚糖；成纤维细胞，其产生IV型胶原、层粘连蛋白、间质前胶原和纤连蛋白；以及结肠肌成纤维细胞，其产生胶原(I型、III型和V型)、硫酸软骨素蛋白聚糖、透明质酸、纤连蛋白和腱糖蛋白C。ECM还可商业提供。市售的细胞外基质的示例包括细胞外基质蛋白质(Invitrogen)、来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的基底膜制剂(例如MatrigelTM(BD Biosciences))和合成的细胞外基质材料，例如ProNectin(SigmaZ378666)。在某些情况下可使用细胞外基质材料的混合物。细胞外基质可以是均质的(基本上包含单一组分)或异质的(包含多种组分)。异质细胞外基质通常包含ECM组分的混合物，包括例如多种糖蛋白和生长因子。示例性异质细胞外基质包括来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的基底膜制剂(例如MatrigelTM)。在一些实施方案中，本文的方法不包括使用异质细胞外基质。细胞外基质可以是成分确定的(所有或基本上所有的组分和其量都是已知的)或成分未确定的(所有或基本上所有的组分和其量都是未知的)。示例性成分未确定的细胞外基质包含Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的基底膜制剂(例如MatrigelTM)。在一些实施方案中，本文的方法不包括使用成分未确定的细胞外基质。
在一些实施方案中，在包含涂层的容器中培养细胞。例如，可将细胞涂铺到含有一种或多种附着因子的培养皿的表面上。在一些实施方案中，将细胞涂铺到无附着因子的培养皿的表面上。在使用附着因子的实施方案中，培养容器可用一种或多种天然、重组或合成的附着因子或其肽片段(例如但不限于胶原、纤连蛋白和其天然或合成片段)预涂覆。在一些实施方案中，用胶原预涂覆培养皿。在一些实施方案中，用基底膜基质预涂覆培养皿。在一些实施方案中，用均质和/或成分确定的细胞外基质预涂覆培养皿。
细胞可在整个培养过程中维持一个或多个功能特征。在一些实施方案中，功能特征可以是天然功能特性。天然功能特征通常包括同时处于其天然环境的给定细胞类型(例如，受试者身体内被提取用于细胞培养之前的细胞)所具有的特征。天然功能特征的示例包括气道上皮细胞中的气体交换能力、肝上皮细胞中的解毒能力、肾上皮细胞中的过滤能力以及胰岛细胞中的胰岛素产生和/或葡萄糖反应性。在一些实施方案中，细胞在整个培养过程中不维持一种或多种功能特征。
培养中的细胞的特征有时是针对培养中的整个细胞群体来确定的。例如，对培养中的细胞群体确定例如平均端粒长度、倍增时间、生长速率、分裂率、基因水平或标志物水平的特征。特征通常代表群体中的细胞，并且所述特征可能因培养物中的特定细胞而变化。例如，当培养中的细胞群体展现出4kb的平均端粒长度时，群体中的一部分细胞可具有4kb的端粒长度，一部分细胞可具有大于4kb的端粒长度，并且一部分细胞可具有小于4kb的端粒长度。在另一示例中，当细胞群体被表征为表达高水平的特定基因或标志物时，在一些实施方案中，所述群体中的所有细胞均以高水平表达所述特定基因或标志物，并且在某些实施方案中，所述群体中的一部分细胞(例如，至少75％的细胞)以高水平表达所述特定基因或标志物，并且较小部分的所述细胞以中等水平、低水平或不可检测的水平表达所述特定基因或标志物。在另一示例中，当细胞群体被表征为不表达或表达低水平的特定基因或标志物时，在一些实施方案中，所述群体中的细胞均不以可检测的水平表达所述特定基因或标志物，并且在某些实施方案中，所述群体中的一部分细胞(例如，小于10％的细胞)以可检测的水平表达所述特定基因或标志物。
有时将培养中的细胞的特征(例如群体倍增、标志物表达)与在对照培养条件下培养的细胞观察到的相同特征进行比较。通常，当比较在对照培养条件下培养的细胞观察到的特征时，将相等或基本上相等量的来自相同来源的细胞添加到某些培养条件和对照培养条件。对照培养条件可包括相同的基础培养基(例如，无血清的基础培养基)和另外的组分减去一种或多种试剂(例如，一种或多种TGF-β抑制剂(例如，一种或多种TGF-β信号传导抑制剂)、ROCK抑制剂、肌球蛋白II抑制剂、PAK抑制剂)。在一些实施方案中，细胞培养条件基本上由与在对照培养条件下培养的细胞观察到的相同特征相比，实现培养中细胞的一个或多个特征(例如群体倍增、标志物表达)所必需的某些组分组成。当细胞培养条件基本上由某些组分组成时，可包含与对照培养条件相比时，对培养中的细胞的一个或多个特征(例如群体倍增、标志物表达)没有显著影响的另外组分或特征。此类另外的组分或特征可被称为非必需组分，并且可包括典型的细胞培养组分，例如盐、维生素、氨基酸、某些生长因子、脂肪酸等。
饲养层细胞
可在有或无饲养层细胞的情况下培养细胞。通常，饲养层细胞是与用于某些细胞培养系统的其他细胞类型共培养的细胞。饲养层细胞通常是非增殖细胞，且有时被处理以抑制增殖，并且经常被维持在活的代谢活性状态。例如，饲养层细胞可用γ辐照来辐照和/或用丝裂霉素C处理，这可以阻滞细胞分裂，同时维持饲养层细胞处于代谢活性状态。
饲养层细胞可来自任何哺乳动物，并且饲养层细胞的动物来源不必是与被培养的细胞相同的动物来源。例如，饲养层细胞可以是但不限于小鼠、大鼠、犬、猫、牛、马、猪、非人灵长类和人的饲养层细胞。饲养层细胞的类型可包括脾细胞、巨噬细胞、胸腺细胞和/或成纤维细胞。饲养层细胞的类型可以与它们所支持的细胞类型相同。饲养层细胞的类型可以与它们所支持的细胞类型不相同。J2细胞被用作用于某些细胞培养系统的饲养层细胞，并且是来源于建立的Swiss 3T3细胞系的小鼠成纤维细胞的亚克隆。
在一些实施方案中，在不存在饲养层细胞的情况下培养细胞。在一些实施方案中，不在由饲养层细胞调节的培养基中培养(即，不在条件培养基中培养)细胞。在一些实施方案中，不在分级的饲养层细胞、或饲养层细胞的微粒和/或可溶性级分的存在下培养细胞。任一种或所有上述培养条件(即，在不存在饲养层细胞的情况下培养；不在条件培养基中培养；不在分级的饲养层细胞、或饲养层细胞的微粒和/或可溶性级分存在下培养)可被称为无饲养层细胞的条件或无饲养层的条件。本文所提供的扩增培养条件通常是无饲养层细胞的培养条件。
培养基和细胞培养组合物
通常在细胞培养基存在下培养细胞。本文所提供的扩增培养条件通常包含细胞培养基。细胞培养基可包括任何类型的培养基，例如无血清培养基；含血清培养基；减少血清的培养基；无蛋白质的培养基；化学成分确定的培养基；无蛋白质的化学成分确定的培养基；无肽、无蛋白质的化学成分确定的培养基；无动物蛋白质的培养基；无异源物的培养基。细胞培养基通常是水基培养基，并且可包括任何市售和/或经典的培养基，例如达尔伯克氏改良必需培养基(Dulbecco's Modified Essential Medium)(DMEM)、剔除-DMEM(KODMEM)、Ham's F12培养基、DMEM/Ham's F12、高级DMEM/Ham's F12、Ham's F-10培养基、RPMI1640、伊格尔氏基础培养基(Eagle's Basal Medium)(EBM)、伊格尔氏最低必需培养基(Eagle'sMinimum Essential Medium)(MEM)、格拉斯哥最低必需培养基(Glasgow MinimalEssential Medium)(G-MEM)、培养基199、角质形成细胞-SFM(KSFM；Gibco/Thermo-Fisher)、前列腺上皮生长培养基(PrEGM；Lonza)、CHO细胞培养基、PER.C6培养基、293培养基、杂交瘤培养基等和其组合。
在一些实施方案中，细胞培养基是含血清培养基。血清可包括例如胎牛血清(FBS)、牛犊血清、山羊血清或人血清。通常，血清以按培养基的体积计约1％到约30％存在。在一些情况下，血清以按培养基的体积计约0.1％到约30％存在。在一些实施方案中，培养基含有血清替代物。
在一些实施方案中，细胞培养基是无血清培养基。无血清培养基通常不含任何动物血清(例如胎牛血清(FBS)、牛犊血清、山羊血清或人血清)，但可含有某些动物来源的产品，例如血清白蛋白(例如，从血液中纯化)、生长因子、激素、载体蛋白质、水解产物和/或附着因子。在一些实施方案中，无血清细胞培养基包含角质形成细胞SFM(KSFM；Gibco/Thermo-Fisher)。KSFM可包含胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松(hydrocortisone)、三碘甲腺原氨酸(T3)。KSFM基础培养基的代表性制剂描述于例如美国专利号6692961中。
在一些实施方案中，细胞培养基是成分确定的无血清培养基。成分确定的无血清培养基(有时被称为化学成分确定的无血清培养基)通常包含以已知浓度存在的已鉴别组分，且通常不包含成分未确定的组分，例如动物器官提取物(例如垂体提取物)或其他成分未确定的动物来源产品(例如，未定量的量的血清白蛋白(例如，从血液中纯化)、生长因子、激素、载体蛋白质、水解产物和/或附着因子)。成分确定的培养基可包括基础培养基，例如DMEM、F12或RPMI 1640，其含有以下中的一种或多种：氨基酸、维生素、无机酸、无机盐、碱硅酸盐、嘌呤、嘧啶、聚胺、α-酮酸、有机硫化合物、缓冲液(例如HEPES)、抗氧化剂和能源(例如葡萄糖)；并且可补充有一种或多种重组白蛋白、重组生长因子、化学成分确定的脂质、重组胰岛素和/或锌、重组转铁蛋白或铁、硒和抗氧化剂硫醇(例如2-巯基乙醇或1-硫代甘油)。重组白蛋白和/或生长因子可来源于例如非动物来源，例如水稻或大肠杆菌(E.coli)，并且在某些情况下，将合成的化学品添加到成分确定的培养基中，例如聚合物聚乙烯醇，其可再现牛血清白蛋白(BSA)/人血清白蛋白(HSA)的一些功能。在一些实施方案中，成分确定的无血清培养基可选自MCDB 153培养基(Sigma-Aldrich M7403)、改良的MCDB 153培养基(Biological Industries，目录编号01-059-1)、MCDB 105培养基(Sigma-Aldrich M6395)、MCDB 110培养基(Sigma-Aldrich M6520)、MCDB 131培养基(Sigma-Aldrich M8537)、MCDB201培养基(Sigma-Aldrich M6670)和其改良形式。在一些实施方案中，成分确定的无血清培养基是MCDB 153培养基(Sigma-Aldrich M7403)。在一些实施方案中，成分确定的无血清培养基是改良的MCDB 153培养基(Biological Industries，目录编号01-059-1)。
在一些实施方案中，细胞培养基是无异源物的无血清培养基。无异源物通常意味着不具有来源于除被培养细胞所来源的动物以外的动物的组分。例如，当培养人细胞时，无异源物的培养物不具有非人动物来源的组分。在一些实施方案中，细胞培养基是成分确定的无异源物的无血清培养基。成分确定的无异源物的无血清培养基(有时被称为化学成分确定的无异源物的无血清培养基)通常包含以已知浓度存在的已鉴别组分，且通常不包含成分未确定的组分，例如动物器官提取物(例如垂体提取物)或其他成分未确定的动物来源产品(例如，血清白蛋白(例如，从血液中纯化)、生长因子、激素、载体蛋白质、水解产物和/或附着因子)。成分确定的无异源物的无血清培养基可包含或可不包含来自动物来源(例如非人来源)的脂质和/或重组蛋白质，例如重组白蛋白，重组生长因子、重组胰岛素和/或重组转铁蛋白。重组蛋白质可来源于例如非动物来源，例如植物(例如水稻)或细菌(例如大肠杆菌)，并且在某些情况下，将合成的化学品添加到成分确定的培养基中(例如，聚合物(例如聚乙烯醇))，其可再现牛血清白蛋白(BSA)/人血清白蛋白(HSA)的一些功能。在一些实施方案中，成分确定的无血清培养基可包括市售的无异源物的血清代用品，例如XF-KOSRTM(Invitrogen)。在一些实施方案中，成分确定的无血清培养基可包括市售的无异源物的基础培养基，例如mTeSR2TM(Stem Cell Technologies)、NutriStemTM(StemGent)、X-Vivo 10TM或X-Vivo 15TM(Lonza Biosciences)或HEScGROTM(Millipore)。
另外的成分可被添加到本文的细胞培养基中。例如，此类另外的成分可包括氨基酸、维生素、无机盐、无机酸、腺嘌呤、乙醇胺、D-葡萄糖、肝素、N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸](HEPES)、氢化可的松、胰岛素、硫辛酸、酚红、磷酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸钠、丙酮酸、偏钒酸铵、钼酸、硅酸盐、碱硅酸盐(例如偏硅酸钠)、嘌呤、嘧啶、聚胺、α-酮酸、有机硫化合物、缓冲液(例如HEPES)、抗氧化剂、硫辛酸、三碘甲腺原氨酸(T3)、胸苷和转铁蛋白。在某些情况下，胰岛素和/或转铁蛋白可被柠檬酸铁或硫酸亚铁螯合物替代。氨基酸可包括例如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。维生素可包括例如生物素、D-生物素、氯化胆碱、D-Ca+2-泛酸盐、D-泛酸、叶酸、内消旋肌醇、肌-肌醇、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺和维生素B12。无机盐可包括例如钙盐(例如CaCl2)、CuSO4、FeSO4、KCl、镁盐(例如MgCl2、MgSO4)、锰盐(例如MnCl2)、乙酸钠、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4、Na2SO4以及某些痕量元素(包括硒、硅、钼、钒、镍、锡和锌)的离子。这些痕量元素可以各种形式提供，包括盐的形式，例如Na2SeO3、Na2SiO3、(NH4)6Mo7O24、NH4VO3、NiSO4、SnCl和ZnSO。另外的成分可包括例如肝素、表皮生长因子(EGF)、至少一种增加细胞内环腺苷单磷酸(cAMP)水平的试剂、至少一种成纤维细胞生长因子(FGF)、酸性FGF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(uniprot保藏号P04141)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(uniprot保藏号P09919)、肝细胞生长因子(HGF)(uniprot保藏号P14210)、神经调节蛋白1(NRG1)(uniprot保藏号Q61CV5)、神经调节蛋白2(NRG2)(uniprot保藏号Q3MI86)、神经调节蛋白3(NRG3)(uniprot保藏号B9EGV5)、神经调节蛋白4(NRG4)(uniprot保藏号QOP6N6)、表皮调节素(epiregulin)(ERG)(uniprot保藏号014944)、β细胞素(betacellulin)(BC)(uniprot保藏号Q86UF5)、白介素-11(IL11)(uniprot保藏号P20809)、胶原和肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)(uniprot保藏号Q14487)。
在一些实施方案中，细胞培养基包含钙。在一些实施方案中，钙以约2mM的浓度存在。在一些实施方案中，钙以低于2mM的浓度存在。在一些实施方案中，钙以约1mM的浓度存在。在一些实施方案中，钙以低于1mM的浓度存在。例如，钙可以低于2mM、低于1mM、低于900μM、低于800μM、低于700μM、低于600μM、低于500μM、低于400μM、低于300μM、低于200μM、低于100μM、低于90μM、低于80μM、低于70μM、低于60μM、低于50μM、低于40μM、低于30μM、低于20μM或低于10μM的浓度存在。在一些实施方案中，钙以低于500μM的浓度存在。在一些实施方案中，钙以低于300μM的浓度存在。在一些实施方案中，钙以低于100μM的浓度存在。在一些实施方案中，钙以低于20μM的浓度存在。在一些实施方案中，钙以约90μM的浓度存在。
在一些实施方案中，细胞培养基包含白蛋白(例如血清白蛋白)。白蛋白是脊椎动物血液中通常丰富的蛋白质。在一些实施方案中，细胞培养基包含牛血清白蛋白(BSA)。在一些实施方案中，细胞培养基包含人血清白蛋白(HSA)。白蛋白可被纯化(例如，从人血清或牛血清)，或可例如在植物(例如，水稻)、细菌(例如大肠杆菌)或酵母(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中重组产生。在一些实施方案中，细胞培养基包含重组人血清白蛋白(rHSA)。在一些实施方案中，细胞培养基包含在水稻中产生的重组人血清白蛋白(rHSA)。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种或多种脂质。脂质通常是指油、脂肪、蜡、固醇、脂溶性维生素(例如维生素A、D、E和K)、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮化合物(polyketide)、异戊烯醇脂(prenol lipid)等，并且可包括脂质的混合物(例如，化学成分确定的脂质混合物)。在一些实施方案中，脂质可选自花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸、普流尼克F-68(pluronic F-68)、硬脂酸、聚山梨糖醇酯80(吐温80(TWEEN 80))、吐温20、鳕鱼肝油脂肪酸(甲酯)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、D-α-生育酚乙酸酯。在一些实施方案中，脂质可包括亚油酸、亚麻酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸中的一种或多种。在一些实施方案中，脂质混合物可以是市售的脂质混合物(例如，化学成分确定的脂质浓缩物(Gibco1,11905-031)；脂质混合物(Sigma-Aldrich L5146)；化学成分确定的脂质混合物1(Sigma-Aldrich L0288))。在一些实施方案中，脂质混合物可包括提供有市售白蛋白的脂质的混合物(例如，I富含脂质的BSA(Gibco,11020-039))。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种或多种促有丝分裂生长因子。例如，促有丝分裂生长因子可包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因子I(IGF-I)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)和/或角质形成细胞生长因子(KGF)。在一些实施方案中，培养基不包含促有丝分裂生长因子。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种或多种促有丝分裂的补充剂。例如，促有丝分裂的补充剂可包括牛垂体提取物(BPE；Gibco/Thermo-Fisher)、B27(Gibco/Thermo-Fisher)、N-乙酰半胱氨酸(Sigma)、GEM21NEUROPLEX(Gemini Bio-Products)和N2NEUROPLEX(Gemini Bio-Products)。在一些实施方案中，细胞培养基不包含促有丝分裂的补充剂。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种或多种增加细胞内环腺苷单磷酸(cAMP)水平的试剂。例如，细胞培养基可包含一种或多种β-肾上腺素能激动剂(例如，一种或多种β-肾上腺素能受体激动剂)。β-肾上腺素能激动剂(例如β-肾上腺素能受体激动剂)通常是活化β肾上腺素受体(例如，β-1肾上腺素能受体、β-2肾上腺素能受体、β-3肾上腺素能受体)的一类拟交感神经剂。β-肾上腺素受体的活化会活化腺苷酸环化酶，导致环腺苷单磷酸(cAMP)的活化。β-肾上腺素能激动剂(例如β-肾上腺素能受体激动剂)可包括例如肾上腺素、异丙肾上腺素、多巴酚丁胺(dobutamine)、扎莫特罗(xamoterol)、沙丁胺醇(ALBUTEROL)、左沙丁胺醇(LEVALBUTEROL)、非诺特罗(fenoterol)、福莫特罗(formoterol)、异丙喘宁(metaproterenol)、沙美特罗(salmeterol)、特布他林(terbutaline)、克仑特罗(clenbuterol)、异他林(isoetarine)、吡布特罗(pirbuterol)、丙卡特罗(procaterol)、利托君(ritodrine)、阿布他明(arbutamine)、苯呋洛尔(befunolol)、溴乙酰基阿普洛尔薄荷烷(bromoacetylalprenololmenthane)、溴沙特罗(broxaterol)、西马特罗(cimaterol)、西拉唑啉(cirazoline)、地诺帕明(denopamine)、多培沙明(dopexamine)、依替福林(etilefrine)、海索那林(hexoprenaline)、去甲乌药碱(higenamine)、异克舒令(isoxsuprine)、马布特罗(mabuterol)、甲氧那明(methoxyphenamine)、布酚宁(nylidrin)、奥昔非君(oxyfedrine)、普瑞特罗(prenalterol)、雷托巴胺(ractopamine)、瑞普特罗(reproterol)、利米特罗(rimiterol)、曲托喹酚(tretoquinol)、妥洛特罗(tulobuterol)、齐帕特罗(zilpaterol)和净特罗(zinterol)。在一些实施方案中，细胞培养基包含异丙肾上腺素。在一些实施方案中，细胞培养基包含浓度为约0.5μM到约20μM的异丙肾上腺素。例如，异丙肾上腺素可以约0.5μM、约0.6μM、约0.7μM、约0.8μM、约0.9μM、约1μM、约1.25μM、约1.5μM、约1.75μM、约2μM、约2.5μM、约3μM、约3.5μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM、约11μM、约12μM、约13μM、约14μM或约15μM的浓度存在。
增加细胞内cAMP水平的其他试剂可包括诱导细胞内cAMP水平直接增加的试剂(例如，二丁酰基cAMP)、通过与细胞G蛋白质相互作用而引起细胞内cAMP水平增加的试剂(例如，霍乱毒素和福司柯林(forskolin))和通过抑制cAMP磷酸二酯酶的活性而引起细胞内cAMP水平增加的试剂(例如，异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)和茶碱)。
在一些实施方案中，细胞培养基不包含以下一种或多种：Wnt激动剂、β-连环蛋白激动剂、头蛋白(Noggin)、DAN、Cerberus、Gremlin、R-脊椎蛋白(R-spondin)、Wnt-3a、EGF、烟酰胺、FGF10、胃泌素、p38抑制剂、SB202190、DHT、notch抑制剂、γ分泌酶抑制剂、DBZ、DAPT、白介素-6(IL6)或肝配蛋白(ephrin)A5(EfnA5))。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种或多种抑制剂。抑制剂可包括例如一种或多种TGF-β抑制剂(例如一种或多种TGF-β信号传导抑制剂)、一种或多种p21活化的激酶(PAK)抑制剂、一种或多种肌球蛋白II抑制剂(例如非-肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂)和一种或多种Rho激酶抑制剂(例如，一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂)。以下将进一步详细讨论此类抑制剂。抑制剂可以呈以下形式：小分子抑制剂(例如小有机分子)、抗体、RNAi分子、反义寡核苷酸、重组蛋白质、天然或修饰的基质、酶、受体、肽模拟物、无机分子、肽、多肽、适体等以及这些的结构或功能模拟物。抑制剂可竞争性地、非竞争性地、无竞争性地或通过混合抑制来起作用。例如，在某些实施方案中，抑制剂可以是靶激酶(例如蛋白质激酶)的ATP结合袋(pocket)的竞争性抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂破坏一种或多种受体的活性。在一些实施方案中，抑制剂破坏一种或多种受体-配体相互作用。在一些实施方案中，抑制剂可结合到其靶标并降低其活性。在一些实施方案中，抑制剂可结合到其标靶并且与对照相比，将其活性降低约10％或更高。例如，抑制剂可结合到其靶标并且与对照相比，将其活性降低约20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、或99％或更高。例如，可使用细胞测定法来评估抑制。
在一些实施方案中，抑制剂是激酶抑制剂(例如蛋白质激酶抑制剂)。抑制其靶标的生物或生物化学功能的激酶抑制剂的有效性可被表示为IC50值。IC50通常指示将激酶抑制50％所需的特定抑制剂的量。在一些实施方案中，抑制剂具有等于或小于1000nM、等于或小于500nM、等于或小于400nM、等于或小于300nM、等于或小于200nM、等于或小于100nM、等于或小于50nM、等于或小于20nM、或等于或小于10nM的IC50值。
在一些实施方案中，抑制剂可直接或间接影响一种或多种细胞活性、功能或特征。例如，抑制剂可在培养的细胞中诱导端粒酶逆转录酶表达，例如通过抑制TGF-β信号传导途径。在某些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如TGF-β信号传导抑制剂)活化培养细胞中的端粒酶逆转录酶表达。在某些实施方案中，ALK5抑制剂活化培养细胞中的端粒酶逆转录酶表达。在某些实施方案中，A83-01活化培养细胞中的端粒酶逆转录酶表达。在另一示例中，抑制剂可调节培养细胞内的细胞骨架结构，例如通过抑制Rho激酶(例如Rho相关蛋白质激酶)、p21活化的激酶(PAK)和/或肌球蛋白II(例如，非-肌球蛋白II(NM II))。细胞骨架结构的调节可包括例如对包括肌动蛋白微丝、微管蛋白微管和中间丝的细胞骨架结构的任何方面的修饰、破坏或改变；或与任何相关蛋白质(例如分子马达、交联剂、加帽蛋白质和成核促进因子)的相互作用。在某些实施方案中，ROCK抑制剂调节培养细胞内的细胞骨架结构。在某些实施方案中，Y-27632调节培养细胞内的细胞骨架结构。在某些实施方案中，PAK1抑制剂调节培养细胞内的细胞骨架结构。在某些实施方案中，IPA3调节培养细胞内的细胞骨架结构。在某些实施方案中，肌球蛋白II抑制剂(例如，非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂))调节培养细胞内的细胞骨架结构。在某些实施方案中，布雷他汀(blebbistatin)调节培养细胞内的细胞骨架结构。
TGF-β抑制剂
在一些实施方案中，本文的方法包括抑制培养的上皮细胞中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导。TGF-β信号传导控制多种细胞类型中的增殖、细胞分化和其他功能，并且可在某些细胞类型中在细胞周期控制、免疫系统的调控和发育中起作用。TGF-β信号传导的抑制可包括抑制任何TGF-β信号传导途径和/或TGF-β超家族成员，包括配体，例如TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、抑制素、活化素、抗苗勒氏管激素(anti-müllerian hormone)、骨形态发生蛋白质、decapentaplegic和Vg-1；受体，例如TGF-βI型受体、TGF-β2型受体、ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、ALK7和ALK8；以及下游效应物，例如R-SMAD和其他SMAD蛋白质(例如SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5)。
在一些实施方案中，抑制一种或多种TGF-β受体的活性。在一些实施方案中，抑制一种或多种TGF-β受体-配体相互作用。在一些实施方案中，抑制TGF-βI型受体。TGF-βI型受体可包括ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、ALK7和ALK8中的一种或多种。在一些实施方案中，TGF-β受体是ALK5。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种或多种TGF-β抑制剂(例如，一种或多种TGF-β信号传导抑制剂)。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)结合到一种或多种TGF-β受体。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)结合到一种或多种TGF-β配体。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)结合到一种或多种SMAD蛋白质。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)结合到一种或多种TGF-β受体和一种或多种TGF-β配体。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)结合到一种或多种TGF-β受体和一种或多种SMAD蛋白质。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)破坏一种或多种TGF-β受体-配体相互作用。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)破坏一种或多种TGF-β受体-SMAD相互作用。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)阻断TGF-β受体的磷酸化或自磷酸化。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)促进一种或多种TGF-β受体的去磷酸化。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)阻断一种或多种SMAD蛋白质的磷酸化。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)促进一种或多种SMAD蛋白质的去磷酸化。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)促进泛素介导的一种或多种TGF-β受体的降解。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如TGF-β信号传导抑制剂)促进泛素介导的一种或多种SMAD蛋白质的降解。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)影响SMAD的核转位、SMAD的核混编(nuclear shuffling)、SMAD与共活化剂的相互作用等。在某些情况下，TGF-β信号传导可通过SMAD报告子测定来测量。
在一些实施方案中，TGF-β抑制剂(例如TGF-β信号传导抑制剂)可以是ALK5抑制剂。ALK5抑制剂可结合到ALK5或一种或多种ALK5配体或这两者。ALK5抑制剂可结合到ALK5或一种或多种下游SMAD蛋白质或这两者。ALK5抑制剂可破坏一种或多种ALK5-配体相互作用或可破坏一种或多种ALK5-SMAD相互作用。在一些实施方案中，ALK5抑制剂阻断SMAD2的磷酸化。
ALK5抑制剂可包括一种或多种小分子ALK5抑制剂。在一些实施方案中，ALK5抑制剂是ATP类似物。在一些实施方案中，ALK5抑制剂包含式A的结构：
其中：
X、Y和Z独立地选自N、C和O；
R1、R2和R3独立地选自氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C10环芳基、取代的C5-C10环芳基、C5-C9杂环基、取代的C5-C9杂环基、C5-C9杂环芳基、取代的C5-C9杂环芳基、-接头-(C3-C9环烷基)、-接头-(取代的C3-C9环烷基)、-接头-(C5-C10芳基)、-接头-(取代的C5-C10芳基)、-接头-(C5-C10环芳基)、-接头-(取代的C5-C10环芳基)、-接头-(C5-C9杂环基)、-接头-(取代的C5-C9杂环基)、-接头-(C5-C9杂环芳基)、-接头-(取代的C5-C9杂环芳基)；
n为0或1；
R4、R5和R6独立选自氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、取代的C1-C10烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6烷氧基羰基、取代的C1-C6烷酰基、取代的C1-C6烷氧基羰基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C10环芳基、取代的C5-C10环芳基、C5-C9杂环基、取代的C5-C9杂环基、C5-C9杂环芳基、取代的C5-C9杂环芳基、-接头-(C3-C9环烷基)、-接头-(取代的C3-C9环烷基)、-接头-(C5-C10芳基)、-接头-(取代的C5-C10芳基)、-接头-(C5-C10环芳基)、-接头-(取代的C5-C10环芳基)、-接头-(C5-C9杂环基)、-接头-(取代的C5-C9杂环基)、-接头-(C5-C9杂环芳基)、接头-(取代的C5-C9杂环芳基)；并且
所述取代的烷基、烷氧基、烷酰基、烷氧基羰基环烷基、芳基、环芳基、杂环基或杂环芳基上的取代基是羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C9环烷基、C5-C9杂环基、C1-6烷氧基C1-6烯基、氨基、氰基、卤素或芳基。
ALK5抑制剂可包括例如A83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺)、GW788388(4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺)、RepSox(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-二氮杂萘)和SB 431542(4-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)。在一些实施方案中，ALK5抑制剂是A83-01。
p21活化的激酶(PAK)抑制剂
在一些实施方案中，本文的方法包括抑制培养的上皮细胞中p21活化的激酶(PAK)的活性。PAK蛋白质(丝氨酸/苏氨酸p21活化激酶家族)包括PAK1、PAK2、PAK3和PAK4，并且通常起到联系Rho家族的GTP酶与细胞骨架再组织和核信号传导的作用。这些蛋白质是Cdc42和Rac的靶标，并且可在各种生物活性中起作用。例如，PAK1可调控细胞运动性和形态。在一些实施方案中，本文的方法包括抑制培养的上皮细胞中PAK1的活性。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种或多种PAK1抑制剂。在一些实施方案中，PAK1抑制剂结合到PAK1蛋白质。在一些实施方案中，PAK1抑制剂结合到一种或多种PAK1活化剂(例如，Cdc42、Rac)。在一些实施方案中，PAK1抑制剂结合到PAK1的一种或多种下游效应物。在一些实施方案中，PAK1抑制剂结合到PAK1蛋白质和一种或多种PAK1活化剂(例如，Cdc42、Rac)。在一些实施方案中，PAK1抑制剂破坏一种或多种PAK1-活化剂相互作用。在一些实施方案中，PAK1抑制剂破坏一种或多种PAK1-效应物相互作用。在一些实施方案中，PAK1抑制剂靶向自动调节机制并促进PAK1的无活性构象。
PAK1抑制剂可包括一种或多种小分子PAK1抑制剂。PAK1抑制剂可包括例如IPA3(1,1'-二硫代二-2-萘酚)、AG-1478(N-(3-氯苯基)-6,7-二甲氧基-4-喹唑啉氨)、FRAX597(6-[2-氯-4-(1,3-噻唑-5-基)苯基]-8-乙基-2-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基]吡啶并[2,3-D]嘧啶-7-酮)、RAX486(6-(2,4-二氯苯基)-8-乙基-2-[[3-氟-4-(1-哌嗪基)苯基]氨基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮)和PF-3758309((S)-N-(2-(二甲基氨基)-1-苯乙基)-6,6-二甲基-3-((2-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)氨基)-4,6-二氢吡咯并[3,4-c]吡唑-5(1H)-甲酰胺)。在一些实施方案中，PAK1抑制剂是IPA3。
肌球蛋白II抑制剂
在一些实施方案中，本文的方法包括抑制肌球蛋白II(例如非肌肉肌球蛋白II(NMII))在培养的上皮细胞中的活性。肌球蛋白II(例如，非肌肉肌球蛋白II(NM II))是ATP依赖性运动蛋白质家族的成员，并且在肌肉收缩和其他运动性过程(例如基于肌动蛋白的运动性)中起作用。非肌肉肌球蛋白II(NM II)是一种肌动蛋白结合蛋白质，其具有肌动蛋白交联和收缩性质，并且受其轻链和重链的磷酸化调节。由于位于汇集(convergent)信号传导途径下游，因此非肌肉肌球蛋白II(NM II)参与细胞粘附、细胞迁移和组织结构的控制。在高等真核生物中，非肌肉肌球蛋白II通过其调节轻链(MLC)在Ser19/Thr18处的磷酸化而被活化。MLC磷酸化控制肌动球蛋白收缩器的组装和其收缩性两者。两组酶通常控制MLC磷酸化。一组包括将MLC磷酸化的激酶(MLC激酶)，其促进活性，另一组是将MLC去磷酸化的磷酸酶，其抑制活性。几种激酶可在体外以及在某些情况下在体内于Ser19/Thr18处磷酸化MLC。这些包括例如MLCK、ROCK、PAK(p21活化的激酶)、柠檬激酶(citron kinase)、ILK(整合素连接激酶)、MRCK(肌强直性营养不良蛋白质激酶相关的cdc42结合激酶)和DAPK(死亡相关蛋白质激酶，包括ZIPK)。存在于平滑肌细胞和非肌肉细胞中的主要肌球蛋白磷酸酶包含三个亚单位：w 130kDa的大亚单位(被称为肌球蛋白磷酸酶靶向亚单位MYPT1(也被称为M130/133、M110或MBS))、38kDa的催化亚单位(1型蛋白质磷酸酶的δ异型体，PP1c)和20kDa的小亚基。Rho相关蛋白质激酶(ROCK)可通过抑制MYPT1以及通过直接磷酸化MLC来活化肌球蛋白II.PAK1可通过非典型蛋白质激酶C(aPKCζ)的磷酸化来活化肌球蛋白II。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种或多种肌球蛋白II抑制剂(例如，非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂)。在一些实施方案中，肌球蛋白II抑制剂结合到肌球蛋白II蛋白质。在一些实施方案中，肌球蛋白II抑制剂结合到肌球蛋白头部结构。在一些实施方案中，肌球蛋白II抑制剂结合到肌球蛋白-ADP-Pi复合物。在一些实施方案中，肌球蛋白II抑制剂破坏肌球蛋白II ATP酶活性。在一些实施方案中，肌球蛋白II抑制剂与ATP竞争结合肌球蛋白II。在一些实施方案中，肌球蛋白II抑制剂与核苷酸竞争结合肌球蛋白亚片段-1。在一些实施方案中，肌球蛋白II抑制剂破坏肌球蛋白II-肌动蛋白结合。在一些实施方案中，肌球蛋白II抑制剂破坏肌球蛋白头部与肌动蛋白和/或底物的相互作用。在一些实施方案中，肌球蛋白II抑制剂破坏ATP诱导的肌动球蛋白解离。在一些实施方案中，肌球蛋白II抑制剂干扰磷酸盐释放过程。在一些实施方案中，肌球蛋白II抑制剂阻止刚性肌动球蛋白的交联。
肌球蛋白II抑制剂(例如，非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂)可包括一种或多种小分子肌球蛋白II抑制剂(例如，小分子非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂)。肌球蛋白II抑制剂可包括例如布雷他汀((±)-1,2,3,3a-四氢-3α-羟基-6-甲基-1-苯基-4H-吡咯并[2,3-b]喹啉-4-酮)和其类似物(例如对硝基布雷他汀、(S)-硝基布雷他汀、S-(-)-7-去甲基-8-硝基布雷他汀等)、BTS(N-苄基对-甲苯磺酰胺)和BDM(2,3-丁二酮一肟)。在一些实施方案中，肌球蛋白II抑制剂是布雷他汀。
ROCK(Rho相关蛋白质激酶)抑制剂
在一些实施方案中，本文的方法包括抑制培养的上皮细胞中Rho激酶(例如，Rho相关蛋白质激酶)的活性。在一些实施方案中，本文的方法不包括抑制培养的上皮细胞中Rho激酶(例如，Rho相关蛋白质激酶)的活性。Rho激酶(例如，Rho相关蛋白质激酶)属于Rho GTP酶蛋白质家族，该家族包括Rho激酶、Rac1激酶和Cdc42激酶。Rho的效应分子是ROCK，其是结合到Rho的GTP结合形式的丝氨酸/苏氨酸激酶。在N末端发现ROCK的催化激酶结构域，其包含丝氨酸/苏氨酸激酶特有的保守基序。ROCK蛋白质还具有中央卷曲螺旋结构域，该结构域包括Rho-结合结构域(RBD)。C-末端含有具有内部富含半胱氨酸的结构域的普列克底物蛋白(pleckstrin)同源(PH)结构域。卷曲螺旋结构域被认为与其他α螺旋蛋白质相互作用。位于卷曲螺旋结构域内的RBD与活化的Rho GTP酶(包括RhoA、RhoB和RhoC)相互作用。PH结构域被认为与例如花生四烯酸和鞘氨醇磷酰胆碱的脂质介质相互作用，并且可在蛋白质定位中起作用。PH结构域和RBD与激酶结构域的相互作用导致自抑制环。另外，激酶结构域参与结合RhoE，RhoE是ROCK活性的负调节物。
ROCK家族包含ROCK1(也被称为ROK-β或p160ROCK)和ROCK2(也被称为ROK-α)。ROCK1的长度为约1354个氨基酸，并且ROCK2的长度为约1388个氨基酸。人ROCK1和人ROCK2的氨基酸序列可分别在UniProt知识库(UniProtKB)保藏号Q13464和075116中找到。人ROCK1和ROCK2的核苷酸序列分别可在GenBank保藏号NM_005406.2和NM_004850中找到。来自多种动物的ROCK1和ROCK2蛋白质的核苷酸和氨基酸序列可在UniProt和GenBank数据库两者中找到。
尽管ROCK亚型在组织中普遍表达，但它们在一些组织中展现出不同的强度。例如，ROCK2在脑和骨骼肌中更普遍，而ROCK1在肝、睾丸和肾脏中更丰富。两种亚型均在血管平滑肌和心脏中表达。在静息状态下，ROCK1和ROCK2两者都主要是胞质的，但在Rho活化后被转位到膜上。Rho依赖性ROCK活化是高度细胞型依赖性的，并且ROCK活性由几种不同的机制调节，包括收缩性、细胞渗透性、迁移和增殖到凋亡的变化。已经鉴别了几种ROCK底物(参见例如，Hu和Lee，Expert Opin.Ther.Targets 9:715-736(2005)；Loirand等，Cir.Res.98:322-334(2006)；以及Riento和Ridley，Nat.Rev.Mol.Cell Bioi.4:446-456(2003)，全部以引用方式并入)。在一些情况下，ROCK在通过结合GTP结合的Rho被活化后将LIM激酶和肌球蛋白轻链(MLC)磷酸酶磷酸化。
抑制Rho激酶(例如，Rho相关蛋白质激酶)的活性可包括降低ROCK1或ROCK2中的至少一种的活性、降低ROCK1或ROCK2中的至少一种的功能或降低ROCK1或ROCK2中的至少一种的表达。活性、功能或表达可能被完全抑制(即无活动、无功能或无表达)；或者相比于未处理细胞，处理细胞中的活性、功能或表达可能较低。在一些实施方案中，抑制Rho激酶(例如，Rho相关蛋白质激酶)的活性涉及阻断ROCK1和/或ROCK2途径的上游效应物，例如GTP结合的Rho，使得ROCK1和/或ROCK2不被活化，或其活性与未处理的细胞相比降低。其他上游效应物包括但不限于整合素、生长因子受体(包括但不限于TGF-β和EGFR)、钙粘着蛋白、G蛋白质偶联受体等。在一些实施方案中，抑制Rho激酶(例如，Rho相关蛋白质激酶)的活性涉及阻断活化的ROCK1和/或ROCK2的下游效应分子的活性、功能或表达，使得ROCK1和/或ROCK2不能传播任何信号，或与未处理的细胞相比，仅可传播降低的信号。下游效应物包括但不限于波形蛋白、LIMK、肌球蛋白轻链激酶、NHE1、丝切蛋白(cofilin)等。
在一些实施方案中，抑制Rho激酶(例如，Rho相关蛋白质激酶)的活性可包括使用一种或多种Rho激酶抑制剂(例如，一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂)。Rho激酶抑制剂(例如，Rho相关蛋白质激酶抑制剂)可包括一种或多种小分子Rho激酶抑制剂(例如，一种或多种小分子Rho相关蛋白质激酶抑制剂)。分子Rho激酶抑制剂(例如Rho相关蛋白质激酶抑制剂)的示例包括例如Y-27632((R)-(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐)、SR 3677(N-[2-[2-(二甲氨基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基-2,3-二氢-1,4-苯并二烷-2-甲酰胺二盐酸盐)、噻唑维文(thiazovivin)(N-苄基-[2-(嘧啶-4-基)氨基]噻唑-4-甲酰胺)、HA1100盐酸盐(1-[(1,2-二氢-1-氧代-5-异喹啉基)磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂卓盐酸盐)、HA1077(盐酸法舒地尔(fasudil hydrochloride))和GSK-429286(4-[4-(三氟甲基)苯基]-N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-氧代-1,4,5,6-四氢-3-吡啶甲酰胺)，其各自可商购。另外的小分子Rho激酶抑制剂(例如，小分子Rho相关蛋白质激酶抑制剂)包括例如描述于国际专利申请公开号WO 03/059913、WO 03/064397、WO 05/003101、WO 04/112719、WO 03/062225和WO 03/062227以及描述于美国专利号7,217,722和7,199,147以及美国专利申请公开号2003/0220357、2006/0241127、2005/0182040和2005/0197328中那些，所有这些专利的内容均以引用方式并入作为参考。
随后的环境
在一些实施方案中，可在一定量的时间后将细胞从上述培养条件中移出并置于随后的环境中。上述任何组分可能在随后的环境中不存在。在一些实施方案中，上述一种或多种抑制剂在随后的环境中不存在。例如，TGF-β抑制剂(例如，TGF-β信号传导抑制剂)、ROCK抑制剂、PAK1抑制剂和肌球蛋白II抑制剂(例如非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂)中的一种或多种可能不存在于随后的环境中。
随后的环境可以是促进细胞分化的环境。随后的环境可以是与最初获得所述细胞的器官或组织(例如，自体植入物)相似或相同的体内环境。随后的环境可以是体外或离体的环境，其接近类似于最初获得所述细胞的器官或组织的某些生化或生理性质。随后的环境可以是合成环境，使得将已知促进体外或离体分化的因子添加到细胞培养物中。例如，可将钙或另外的钙添加到细胞培养物中以促进分化。在一些实施方案中，可添加钙，使得细胞培养基中的钙浓度为至少约1mM以促进分化。例如，细胞培养基中的钙浓度可以是至少约1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2.0mM。在一些实施方案中，将钙添加到细胞培养物中，使得细胞培养基中的钙浓度为约1.5mM以促进分化。
在一些实施方案中，将所述细胞置于随后的环境中，所述环境特异性地刺激细胞分化为最初获得所述细胞的器官或组织的细胞。在一些实施方案中，可将细胞接种到可渗透膜的一侧上。在一些实施方案中，可使在可渗透膜的一侧上培养的细胞暴露于空气，同时所述细胞从可渗透膜的另一侧接收营养素，并且此类培养可称为空气-液体界面。在一些情况下，细胞在空气-液体界面分化期间产生跨膜电阻(TEER)。在一些实施方案中，可在随后的环境中将细胞接种到天然或合成的三维细胞培养表面之中或之上。三维表面的非限制性示例是经涂覆的培养表面。在一些实施方案中，可将细胞包埋在或其他水凝胶中。其他三维培养环境包括例如包含胶原凝胶和/或呈任何构型的合成生物聚合材料(例如水凝胶)的表面。
在一些实施方案中，上皮细胞在培养中形成紧密连接。紧密连接通常是接合在一起以形成流体不可渗透或基本上不可渗透的屏障的细胞膜部分。紧密连接的形成可例如通过紧密连接蛋白质(例如，ZO-1)的免疫荧光染色来显现。在一些实施方案中，上皮细胞可被诱导以在培养中形成紧密连接。例如，当暴露于一定浓度的钙时，上皮细胞可被诱导以形成紧密连接。在一些实施方案中，当暴露于约1mM或更高的钙浓度时，可诱导上皮细胞形成紧密连接。例如，当暴露于约1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM或更高的钙浓度时，可诱导上皮细胞形成紧密连接。在一些实施方案中，当暴露于约1.5mM的钙浓度时，可诱导上皮细胞形成紧密连接。
在一些实施方案中，上皮细胞在培养中形成圆顶或圆顶样结构。圆顶通常是培养中的极化上皮特有的多细胞半囊(hemicyst)结构，并且可在功能上等同于具有跨上皮溶质转运的分化上皮。圆顶可在细胞铺满期间在小区域中偶尔发生，并且通常标志着功能性上皮单层的初始分化过程。在某些情况下，圆顶形成可包括紧密连接蛋白质的表达、不可渗透的底层形成和对下层支撑物的细胞粘附降低(例如，由于细胞层和底层支撑物之间的液体积聚所致)的一种或多种。例如，在用于形态极化细胞的跨上皮转运系统的发展期间可能发生圆顶形成(参见例如Su等(2007)J.Biol.Chem.282(13):9883–9894)。在一些实施方案中，可诱导上皮细胞在培养中形成圆顶或圆顶样结构。例如，当暴露于一定浓度的钙时，可诱导上皮细胞形成圆顶或圆顶样结构。在一些实施方案中，当暴露于约1mM或更高的钙浓度时，可诱导上皮细胞形成圆顶或圆顶样结构。例如，当暴露于约1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM或更高的钙浓度时，可诱导上皮细胞形成圆顶或圆顶样结构。在一些实施方案中，当暴露于约1.5mM的钙浓度时，可诱导上皮细胞形成圆顶或圆顶样结构。
在一些实施方案中，将所述细胞置于不抑制TGF-β信号传导的随后环境中。在一些实施方案中，将所述细胞置于不抑制ROCK的随后环境中。在一些实施方案中，将所述细胞置于不抑制PAK1的随后环境中。在一些实施方案中，将所述细胞置于不抑制肌球蛋白II(例如，非肌肉肌球蛋白II(NM II))的随后环境中。在一些实施方案中，将所述细胞置于不抑制TGF-β信号传导和ROCK的随后环境中。在一些实施方案中，将所述细胞置于不抑制TGF-β信号传导和PAK1的随后环境中。在一些实施方案中，将所述细胞置于不抑制TGF-β信号传导和肌球蛋白II(例如，非肌肉肌球蛋白II(NM II))的随后环境中。
在一些实施方案中，所述细胞在被置于不抑制TGF-β信号传导的细胞培养环境中后，维持或重新获得一种或多种天然功能特征。在一些实施方案中，所述细胞在被置于不抑制ROCK的细胞培养环境中后，维持或重新获得一种或多种天然功能特征。在一些实施方案中，所述细胞在被置于不抑制PAK1的细胞培养环境中后，维持或重新获得一种或多种天然功能特征。在一些实施方案中，所述细胞在被置于不抑制肌球蛋白II(例如，非肌肉肌球蛋白II(NM II))的细胞培养环境中后，维持或重新获得一种或多种天然功能特征。在一些实施方案中，所述细胞在被置于不抑制TGF-β信号传导和ROCK的细胞培养环境中后，维持或重新获得一种或多种天然功能特征。在一些实施方案中，所述细胞在被置于不抑制TGF-β信号传导和PAK1的细胞培养环境中后，维持或重新获得一种或多种天然功能特征。在一些实施方案中，所述细胞在被置于不抑制TGF-β信号传导和肌球蛋白II(例如，非肌肉肌球蛋白II(NM II))的细胞培养环境中后，维持或重新获得一种或多种天然功能特征。
扩增细胞的用途
在某些实施方案中，扩增的上皮细胞群体可用于某些生物医学和实验室用途，例如生物分子产生(例如，蛋白质表达)、诊断学(例如，鉴别异常上皮细胞)和/或治疗学(例如，筛选候选治疗剂；细胞疗法(例如，用于细胞疗法的遗传修饰的细胞))。在一些情况下，扩增的上皮细胞群体可用于自体应用(例如，自体植入物)，并且在某些情况下，扩增的上皮细胞群体可用于非自体应用(例如，药物筛选)。在一些情况下，扩增的上皮细胞群体可被收集和/或分离和/或储存(例如，用于细胞库)。
在一个示例中，扩增的上皮细胞群体可用于蛋白质表达、病毒/疫苗生产等。在一些情况下，扩增的上皮细胞群体可被遗传修饰以表达目标蛋白质(例如，治疗性蛋白质)。在一些情况下，可对上皮细胞或细胞群进行遗传修饰，然后使用本文所述的扩增条件进行扩增。细胞的此类遗传修饰通常不会是意在增加细胞扩增的修饰。相反，细胞的此类遗传修饰将被设计为例如插入编码特定蛋白质的转基因(例如，改良疾病的转基因)。由转基因表达的蛋白质可用作功能形式的缺失或缺陷蛋白质，或者可用作基因或其他蛋白质的遏抑物或抑制剂。然后可将表达特定蛋白质的细胞置于随后的环境中，例如，将自体植入物置于受试者中，使得所述细胞将在体内产生所述蛋白质。
在另一示例中，扩增的上皮细胞群体可用于鉴别用于受试者的候选治疗，所述受试者患有由异常或患病的上皮细胞的存在所标志的病况。此类病症可包括例如瘤形成、增生和恶性肿瘤或良性肿瘤。在一些情况下，可根据本文所述的任何扩增条件来扩增从受试者获得的异常上皮细胞以产生异常上皮细胞的体外群体。例如，循环肿瘤细胞(CTC)可从受试者的循环中分离，并且本文的扩增条件可用于获得足够数目的细胞用于进一步分析，例如细胞的功能表征、表型表征和/或遗传表征。
在另一示例中，扩增的上皮细胞群体可用于鉴别用于受试者的一种或多种候选治疗。例如，可针对产生响应谱(response profile)测定扩增的上皮细胞群体。响应谱通常是一个或多个数据点的集合，其可指示特定治疗将产生期望响应的可能性，例如在正常或异常上皮细胞中。对治疗剂的响应可包括例如细胞死亡(例如，通过坏死、毒性、细胞凋亡等)和/或细胞生长速率的降低。评估对治疗剂的响应的方法包括例如确定剂量响应曲线、细胞存活曲线、治疗指数等。例如，可从携带CFTR基因中的突变的受试者分离鼻或气管上皮细胞，并且本文的扩增条件可用于获得足够数目的细胞用于进一步分析，例如测定用于产生针对治疗剂(例如药物)和/或抗体的响应谱。
在另一示例中，扩增的上皮细胞群体可用于鉴别受试者中的一种或多种异常上皮细胞。例如，可根据本文所述的任何扩增条件来扩增至少一种候选异常上皮细胞。一旦细胞已被扩增，则例如可确定(例如，通过测定mRNA和/或蛋白质表达、组织学评价、免疫组织化学染色)所述细胞的组织起源分布(profile)来确定可能的起源组织。可将细胞的至少一种特征与来自相同组织来源的正常上皮细胞的相同特征进行比较。可比较的细胞特征包括例如细胞生长特性、集落形成、蛋白质组图谱、代谢谱和基因组谱。候选异常上皮细胞和正常上皮细胞的检测差异可能指示候选异常上皮细胞与正常上皮细胞相比是异常的。
在另一示例中，扩增的上皮细胞群体可用于监测受试者中的疾病进展或疾病治疗。监测疾病的进展通常意指周期性地检查受试者的异常状况，以确定异常状况是否进展(恶化)、消退(改善)或保持不变(无可检测到的变化)。可针对进展或消退的各种标志物测定来自受试者的扩增的上皮细胞。监测疾病的进展还可包括监测一种或多种治疗的功效。
实施例
以下所述的实施例说明某些实施方案，且并不限制本技术。
实施例1：材料和方法
除非另有说明，否则使用本实施例中所述的材料和方法进行实施例2到9中所述的细胞培养和其他测定。
细胞培养和群体倍增的确定
使用如实施例2到5和图1和17中所示的培养基，将上皮细胞(前列腺上皮细胞和支气管上皮细胞)以3,000-10,000个活细胞/cm2涂铺于组织培养皿中，并且在37℃与5％CO2下培育。每2或3天更换培养基。当细胞约70-90％铺满时，使用标准胰蛋白酶化方法对它们进行传代培养(sub-culture)。使用Countess II自动化细胞计数器(Life Technologies，AMQAX1000)按照制造商说明书确定总细胞数。
用于这些测定的细胞和培养基包括：PrEC前列腺上皮细胞(Lonza CC-2555)；正常人支气管上皮细胞(Lonza CC-2540)；LNCap克隆FGC细胞系(Sigma-Aldrich,D-073)；含有PrEBM基础培养基以及PrEGM SingleQuot试剂盒补充剂和生长因子的PrEGM BulletKit(Lonza CC-3166)；以及提供有预认证的(prequalified)人重组表皮生长因子1-53(EGF 1-53，以0.2ng/mL使用)和牛垂体提取物(BPE，以30μg/mL使用)的角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo-Fisher 17005-042)。细胞培养材料包括BioCoatTMCellware、I型胶原、T-25烧瓶(Corning,356484)。
用于计算群体倍增(PD)的公式呈现于等式A中：
n＝3.32*(log Y-log l)+X 等式A
其中n＝给定传代培养结束时的最终PD数，Y＝收获时的细胞产量，l＝用作开始该传代培养的接种物的细胞数，并且X＝用于起始被定量的传代培养的接种物的倍增水平。
用于研究中的某些化学品的母液是通过在DMSO中溶解到10mM来制备的。从起始细胞培养之时起，如实施例2到5中所述且如图1和图17中所示，将化学物质添加到培养基中至期望的最终浓度。所用的某些化合物列于下表1中。
定量RT-PCR
使用TRIzol Plus RNA纯化试剂盒(Life Technologies,12183-555)和RNA小型试剂盒(Life Technologies,12183018A)按照制造商说明书制备总RNA。按照供应商提供的方案，使用RNA至CTTM一步试剂盒(1-Step Kit)(LifeTechnologies,4392938)，将一百纳克总RNA用于确定人端粒酶逆转录酶(hTERT)表达。所用hTERT引物和Taqman探针如下：正向引物，5’-TGACACCTCACCTCACCCAC-3’(SEQ ID NO:1)，反向引物，5’-CACTGTCTTCCGCAAGTTCAC-3’(SEQ ID NO:2)和Taqman探针，5’-ACCCTGGTCCGAGGTGTCCCTGAG-3’(SEQ ID NO:3)。
实施例2：上皮细胞在常规细胞培养基(即对照培养条件)中的生长
在该实施例中，使前列腺上皮细胞(PrEC)和支气管上皮细胞(HBEC)在常规细胞培养基(即，对照培养条件)中生长，以证实体外和/或离体上皮细胞生长的某些特性。
在通常用于培养前列腺上皮细胞的两种常规培养基之一中培养前列腺上皮细胞(PrEC)：1)前列腺上皮细胞生长培养基(含有PrEBM基础培养基以及PrEGM SingleQuot试剂盒补充剂和生长因子的PrEGM BulletKit(Lonza CC-3166))，或2)KSFM(角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo-Fisher 17005-042)，其提供有预认证(prequalified)的人重组表皮生长因子1-53(EGF 1-53，以0.2ng/mL使用)和牛垂体提取物(BPE，以30μg/mL使用))。计算每次传代中细胞的群体倍增，并将总群体倍增相对于培养天数绘图(图1，上图)。在两种培养基类型中，前列腺上皮细胞均显示在进入衰老之前仅10到20次群体倍增的有限的细胞复制。在KSFM中培养的前列腺上皮细胞在群体倍增18时展现细胞衰老的形态特征(PD 18；图1，下图)。
在KSFM中培养支气管上皮细胞(HBEC)。计算每次传代中细胞的群体倍增，并将总群体倍增相对于培养天数绘图(图2，上图)。在进入细胞衰老之前，支气管上皮细胞显示仅11次群体倍增的活性复制。在KSFM中培养的支气管上皮细胞在群体倍增11次时展现细胞衰老的特征形态(PD 11；图2，下图)。
通过定量实时PCR在不同传代的支气管上皮细胞和前列腺上皮细胞中检查人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达。染色体的末端由称为端粒的DNA结构的重复片段构成，其防止染色体异常粘在一起或分解(降解)。在正常的上皮细胞中，由于细胞因缺乏端粒酶逆转录酶(TERT)的表达而分裂，因此端粒通常逐渐变短。端粒酶在干细胞中通常是活跃的，并且在大多数无限制地生长和分化的癌细胞中异常活跃。将hTERT表达水平与LNCaP细胞(人前列腺癌细胞系(Sigma-Aldrich,D-073))进行比较，所述人前列腺癌细胞系用作hTERT表达的阳性对照。支气管上皮细胞在早期(p3)或晚期(p5)传代时不表达hTERT。早期传代(p2)的前列腺上皮细胞表达极低水平的hTERT，所述hTERT在第次3传代时快速降低并且到第5次传代时变得检测不到(图3A和图3B)。这些发现确认PrEC和HBEC两者都是正常的上皮细胞。
在培养的前列腺上皮细胞中检查某些细胞标志物的表达。这些细胞并未表达如通过免疫荧光染色所检查的上皮干细胞标志物Lgr5(图4，下图)。而是，所有细胞均对TP63表达染色呈阳性(图4，中图)。TP63基因(转录因子)是基底上皮细胞的标志物，并且通常是上皮组织的正常功能所必需的。使用DAPI染色显现细胞核(图4，上图)。以1:50稀释度使用多克隆Lgr5抗体(抗GPR49/LGR5抗体，LifeSpan Biosciences，LS-A1235)。单克隆抗TP63抗体(Santa Cruz Biotechnology,sc-25268)以1:50稀释度使用。
因此，以上实验证实，在常规细胞培养基(即对照培养条件)中培养的上皮细胞具有有限的体外和/或离体增殖能力、极低或检测不到的端粒酶逆转录酶基因的表达，并且不表达上皮干细胞典型的蛋白质标志物(即不表达上皮干细胞标志物LGR5)。
实施例3：人端粒酶逆转录酶(hTERT)在ALK5抑制剂存在下的表达
在该实施例中，在ALK5抑制剂、Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)或这两者的存在下评估上皮细胞中的hTERT表达。通过定量实时PCR在支气管上皮细胞和前列腺上皮细胞中检查hTERT基因的表达。在KSFM中于不同传代时，用ALK5抑制剂A83-01或Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)、Y-27632或这两种抑制剂处理细胞。如下所述，A83-01在上皮细胞中快速诱导并持续hTERT表达。
如图5A和图5B中所示，支气管上皮细胞在KSFM中的早期(p3)和晚期(p5)传代都不表达hTERT。ALK5抑制剂A83-01稳健地诱导早期传代(p3)的支气管上皮细胞中的hTERT表达，以及晚期传代(p6)的支气管上皮细胞中的持续可测量的hTERT表达。Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632略微诱导早期传代(p3)的支气管上皮细胞中的hTERT表达；然而，它在晚期传代(p6)变得不可检测。在A83-01和Y-27632两者存在下，hTERT表达在支气管上皮细胞中的晚期传代(p6)被诱导并维持。
如图6A和图6B中所示，早期传代(p2)的前列腺上皮细胞表达低水平的hTERT，所述hTERT在第次3传代时快速降低并且到第5次传代时变得不可检测。ALK5抑制剂A83-01快速诱导早期传代(p2)的前列腺上皮细胞中的hTERT表达，以及晚期传代(p5)的前列腺上皮细胞中的持续可测量的hTERT表达。Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632诱导早期传代(p2)的前列腺上皮细胞中的hTERT表达；然而，它在晚期传代(p5)变得不可检测。在A83-10和Y-27632两者存在的情况下，hTERT表达在早期传代(p2)的前列腺上皮细胞中被显著诱导，并且即使在晚期传代(p5)也维持在高水平。该hTERT表达水平与在与3T3-J2饲养层细胞(J2)共培养的前列腺上皮细胞中的hTERT表达水平相当。
实施例4：上皮细胞涂铺效率
在该实施例中，在各种条件下检查上皮细胞涂铺效率，即，有效附着到细胞培养表面、继续分裂并生长成集落的细胞的数目。
如图7中所示，ALK5抑制剂A83-01干扰KSFM中正常组织培养表面(即未经涂覆)上的前列腺上皮细胞涂铺效率。在ALK5抑制剂A83-01的存在下，大多数前列腺上皮细胞即使在3天后也不能附着到常规组织培养表面。然而，那些附着的少数细胞继续增殖。到第8天，当细胞被传代时，多数细胞展现出活跃分裂细胞的特征形态。
如图8中所示，ALK5抑制剂A83-01干扰KSFM中正常组织培养表面(即未经涂覆)上的支气管上皮细胞涂铺效率。在ALK5抑制剂A83-01的存在下，大多数支气管上皮细胞即使在3天后也不能附着到常规组织培养表面。然而，那些附着的少数细胞继续增殖。多数细胞在第7天展现出活跃分裂细胞的特征形态。
如图9中所示，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632改善了KSFM中由A83-01引起的前列腺上皮细胞的低涂铺效率。在涂铺后第2天，在A83-01和Y-27632两者存在的情况下，许多前列腺上皮细胞附着到常规组织培养表面。细胞继续增殖并且多数细胞在第7天展现出活跃分裂细胞的特征形态。
如图10中所示，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632改善了KSFM中由A83-01引起的支气管上皮细胞的低涂铺效率。在涂铺后第2天，在A83-01和Y-27632两者存在的情况下，许多支气管上皮细胞附着到常规组织培养表面。细胞继续增殖并且多数细胞在第7天展现出活跃分裂细胞的特征形态。
如图11中所示，在KSFM中存在A83-01和Y-27632时，使用经胶原I涂覆的组织培养表面显著增加了前列腺上皮细胞的涂铺效率。多数细胞在涂铺后第1天有效地附着到表面，并快速增殖。到第5天，当细胞被传代时，多数细胞展现出活跃分裂细胞的特征形态。
如图12中所示，在KSFM中存在A83-01和Y-27632时，使用经胶原I涂覆的组织培养表面显著增加了支气管上皮细胞的涂铺效率。多数细胞在涂铺后第1天有效地附着到表面，并快速增殖。到第6天，当细胞被传代时，多数细胞展现出活跃分裂细胞的特征形态。
实施例5：包括ALK5抑制剂、Rho激酶抑制剂和其他化合物在内的化合物对上皮细胞增殖的影响
在该实施例中，在包括ALK5抑制剂、Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)和其他化合物的化合物存在下评估前列腺上皮细胞和支气管上皮细胞的增殖。
使前列腺上皮细胞和支气管上皮细胞在存在Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632的KSFM中生长。如图13中所示，尽管连续使用Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632，但前列腺上皮细胞和支气管上皮细胞在晚期传代进入衰老。在第8天或第9天，晚期传代的前列腺上皮细胞和支气管上皮细胞展现出细胞衰老的特征形态，例如平坦且增大的细胞形状。因此，当单独使用时，Y-27632不促进前列腺上皮细胞或支气管上皮细胞的增殖。
为了检查另外的体外和/或离体生长条件的作用，使前列腺上皮细胞在存在仅培养基、ALK5抑制剂A83-01、Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632或两者(含胶原或不含胶原)的KSFM或PrEGM中生长。如图14中所示，前列腺上皮细胞在PrEGM或KSFM中10到20次群体倍增后进入衰老。Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632略微增加前列腺上皮细胞的总群体倍增，尽管所述细胞在达到超过PD20后仍然进入衰老。A83-01也增加总群体倍增；然而，由于A83-01可干扰常规组织培养表面上的涂铺效率(参见实施例4)，因此细胞数目的增加缓慢。在常规的组织培养皿和胶原涂覆的组织培养皿两者上，将A83-01和Y-27632都添加到KSFM中，以快得多速度显著增加前列腺上皮细胞的总群体倍增。因此，当ALK5抑制剂A83-01和Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632组合使用时，前列腺上皮细胞的总群体倍增显著增加。
与上述实验相似，使支气管上皮细胞在存在仅培养基、ALK5抑制剂A83-01、Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632或两者(含胶原或不含胶原)的KSFM中生长。如图15中所示，支气管上皮细胞在KSFM中11次群体倍增后进入衰老。Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632略微增加支气管上皮细胞的总群体倍增，尽管所述细胞在达到超过PD13后仍然进入衰老。A83-01也增加总群体倍增；然而，由于A83-01可干扰常规组织培养表面上的涂铺效率(参见实施例4)，因此细胞数目的增加缓慢。在常规的组织培养表面和胶原涂覆的组织培养表面两者上，将A83-01和Y-27632都添加到KSFM中，以快得多速度显著增加支气管上皮细胞的总群体倍增，后者显示出甚至更快的速度。因此，当ALK5抑制剂A83-01和Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632组合使用时，支气管上皮细胞的总群体倍增显著增加。
在另一实验中，将晚期传代的前列腺上皮细胞在KSFM加如图16中所示的单个化合物中培养，所述化合物在不同浓度(即5μM，实心条；1μM，方格条和0.2μM，空心条)下被测试。在没有添加化合物的对照实验中，5天后细胞数目增加最少。Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)(例如Y-27632、SR 3677、GSK 429286和噻唑维文)导致总细胞数目的略微增加。相比之下，ALK5抑制剂(例如A83-01、SB431542、GW 788388和RepSox)导致5天后总细胞数目的显著增加。PAK1抑制剂IPA-3和肌球蛋白II抑制剂(即，非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂)布雷他汀都不导致细胞增殖的任何增加，并且IPA-3在最高测试浓度(5μM)下引起几乎全部细胞死亡。因此，当单独使用时，ALK5抑制剂显著增加KSFM中晚期传代的前列腺上皮细胞的增殖；当单独使用时，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)略微增加增殖；并且当单独使用时，PAK1抑制剂或肌球蛋白II抑制剂(即非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂))不增加增殖。
在又一实验中，将晚期传代的前列腺上皮细胞在KSFM或补充有A83-01的KSFM加如图17中所示的单个化合物中培养，所述化合物在不同浓度(5μM，实心条；1μM，方格条和0.2μM，空心条)下被测试。在未将抑制剂添加到KSFM的对照实验中，5天后的细胞数目增加最少。A83-01显著增加晚期传代的前列腺前列腺上皮细胞增殖，而Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632导致细胞增殖的略微增加。当使用A83-01和Y-27632两者时，它们协同增加前列腺上皮细胞的增殖。对于其他Rho激酶抑制剂(例如SR3677、GSK 429286和噻唑维文)也观察到此类协同效应。当与A83-01一起用于KSFM中时，PAK1抑制剂IPA-3和肌球蛋白II抑制剂(即，非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂)布雷他汀也协同增加前列腺上皮细胞增殖。相比之下，当将其他ALK5抑制剂(例如GW 788388、SB 431542或RepSox)与A83-01一起使用时，前列腺上皮细胞增殖有很小的额外增加。因此，当与A83-01一起使用时，调节细胞骨架完整性的几类抑制剂协同增加晚期传代的前列腺细胞在KSFM中的增殖。如上所述，这些包括Rho激酶抑制剂(即，Rho相关蛋白质激酶抑制剂)，例如Y-27632、SR 3677、GSK429286和噻唑维文；PAK1抑制剂IPA-3；以及肌球蛋白II抑制剂(即非肌肉肌球蛋白II(NMII)抑制剂)布雷他汀。
实施例6：关于包括ALK5抑制剂、Rho激酶抑制剂和其他化合物在内的化合物对上皮细胞增殖和其他性质的影响的附加研究
在该实施例中，在包括ALK5抑制剂、Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)和其他化合物的化合物存在下评估包皮角质形成细胞、前列腺上皮细胞和支气管上皮细胞的增殖。
在经胶原涂覆的培养皿上，在仅KSFM或补充有1μM ALK5抑制剂A83-01和5μM Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632的KSFM中培养包皮角质形成细胞(图18)、前列腺上皮细胞(图19)和支气管上皮细胞(图20)。评估每次传代中细胞的群体倍增，并将总群体倍增相对于培养天数绘图(图18、图19和图20)。在KSFM中，上皮细胞显示在停止生长之前仅10到20次群体倍增的有限的细胞复制。在具有A83-01和Y-27632的KSFM中，上皮细胞继续增殖40到60次另外的群体倍增。因此，当将ALK5抑制剂A83-01和Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632一起使用时，包皮角质形成细胞、前列腺上皮细胞和支气管上皮细胞的群体倍增显著增加，这表明A83-01和Y-27632一起显著延长了培养中的各种上皮细胞的寿命。
在进一步的研究中，在β-肾上腺素能激动剂(即β-肾上腺素能受体激动剂)的存在下评估上皮细胞生长。在补充有增加浓度的异丙肾上腺素(增加胞质cAMP水平的β-肾上腺素能受体激动剂)的KSFM加1μM A83-01和5μM Y-27632中培养人包皮角质形成细胞(HFK)和人支气管上皮细胞(HBEC)。在6天后对细胞数计数以计算相对于对照的细胞生长。如图30中所示，异丙肾上腺素进一步增加KSFM加A83-01和Y-27632中的上皮细胞生长。
使用表达核定位的红色荧光蛋白(nRFP)的慢病毒载体，为各种上皮细胞(即人包皮角质形成细胞(HFK)、前列腺上皮细胞(PrEC)和人支气管上皮细胞(HBEC))建立稳定的转基因细胞系。此类转基因细胞系(例如，示于图24中)普遍表达nRFP报道基因，并通过标准抗生素选择进行选择。如图23中所示，将HFK/nRFP、PrEC/nRFP和HBEC/nRFP细胞在具有A83-01和Y-27632的KSFM中培养延长的时期。
在早期传代和晚期传代评估在KSFM加A83-01和Y-27632中培养的各种上皮细胞的核型。具体地，使用中期染色体分散对第3次传代(13.5次群体倍增)和第19次传代(62.0次群体倍增)的人包皮角质形成细胞(HFK)；第4次传代(11.1次群体倍增)和第16次传代(45.1次群体倍增)的人支气管上皮细胞(HBEC)；以及第3次传代(13.5次群体倍增)和第13次传代(41.1次群体倍增)的前列腺上皮细胞(PrEC)进行核型分析。核型分析的结果呈现于图21中。在A83-01和Y-27632的存在延长培养后，细胞显示没有明显核型异常的46条正常染色体。图21左下图显示早期传代(p3)的HFK细胞的代表性中期染色体分散，并且图21右下图显示晚期传代(p19)的HFK细胞的代表性中期染色体分散。
评估在仅KSFM或KSFM加A83-01和Y-27632中培养经过几次群体倍增的细胞的平均端粒长度。具体地，使用定量PCR测定确定在仅KSFM或KSFM加A83-01和Y-27632中培养的包皮角质形成细胞的平均端粒长度，并以T/S比(T，端粒；S，单拷贝基因)呈现于图22中。在KSFM加A83-01和Y-27632中培养的包皮角质形成细胞中的端粒的平均长度随着培养物的群体倍增增加而稳定地减小。
评估仅KSFM或KSFM加A83-01和Y-27632中培养的上皮细胞在各种传代时的某些基因的表达。图27提供了表达水平在KSFM加A83-01和Y-27632中下调或上调的代表性基因的列表。从在仅KSFM或KSFM加A83-01和Y-27632中培养的处于不同传代的包皮角质形成细胞提取总RNA。使用RT2 ProfilerTM PCR阵列人类细胞衰老测定(Array Human CellularSenescence assay)(Qiagen，PAHS-050Z)通过定量PCR分析基因表达水平。当细胞在KSFM中在第6次传代进入衰老时，参与应激反应和衰老的几种基因显示增加的表达(即AKT1、ATM、CDKN2A、GADD45A、GLB1、PLAU、SERPINE1和SOD2)，而这些基因的表达在KSFM加A83-01和Y-27632中受到抑制。同样，当细胞在KSFM中第6次传代进入衰老时，粘附分子基因(FN1、THBS1)和中间丝蛋白质(VIM)基因显示增加的表达，而这些基因的表达在KSFM加A83-01和Y-27632中受到抑制。某些基因(CDKN2B、CITED2、CREG1、ID1、MAP2K6、IGFBP3和IGFBP5)的表达在KSFM加A83-01和Y-27632中显著上调，尤其是在晚期传代。因此，有时与细胞衰老相关的几个基因(例如CDKN2B、CITED2、CREG1、ID1、MAP2K6、IGFBP3和IGFBP5)显示在KSFM加A83-01和Y-27632中培养的晚期传代上皮细胞群体中的增加表达。与在KSFM加A83-01和Y-27632中培养的晚期传代的正常上皮细胞中观察到的正常核型和较短的端粒一起，这表明在KSFM加A83-01和Y-27632中扩增的正常上皮细胞获得了特征，使得它们不同于原始上皮细胞群体，然而它们并未转化为异常细胞。
对于在KSFM加A83-01和Y-27632中培养的上皮细胞评估培养基钙含量对细胞行为的影响。使人支气管上皮细胞在KSFM(具有90μM CaCl2)加A83-01和Y-27632中生长。这些细胞分散在整个培养皿中(图28，左图)，并且即使当它们彼此紧密靠近时，也很少有细胞形成细胞间连接。将高浓度(1mM)的CaCl2添加到KSFM加A83-01和Y-27632中导致支气管上皮细胞聚集成紧密簇(图28，右图)。斑块中央的细胞倾向于堆积，并且单个细胞之间的界限通常不可辨别。在某些情况下，簇之间形成异常伸长。
在进一步的研究中，针对在KSFM加A83-01和Y-27632中培养的支气管上皮细胞评估了培养基钙含量对细胞间连接的影响。根据如通过跨上皮电阻(TEER)测量的细胞旁离子流动来评估细胞间连接。如图29(上图)中所示，支气管上皮细胞在KSFM加A 83-01和Y-27632中在高浓度(1mM)的CaCl2存在下建立了使细胞旁离子流动最小化的紧密的细胞间连接，如通过增加的TEER所示。相反，支气管上皮细胞在KSFM加A 83-01和Y-27632中在低浓度(90μM)的CaCl2下未能建立紧密的细胞间连接。将支气管上皮细胞涂铺在多孔膜支撑物(TRANSWELL,Corning,354474)上并维持7天，此时用培养基覆盖膜(浸没相，图29中的灰色框，上图)。在第8天，从膜的顶侧去除培养基，并将细胞暴露于空气中以诱导进一步的分化。此外，如图29(下图)中所示，在KSFM加A 83-01和Y-27632中在高浓度(1mM)的CaCl2存在下，支气管上皮细胞建立随时间而增加的跨膜电阻(TEER)。将支气管上皮细胞涂铺在多孔膜支撑物(TRANSWELL,Corning,354474)上并维持24天，其中在培养持续时间内所述膜被培养基覆盖。跨上皮电阻(TEER)在整个培养时期中保持在高水平。图29(下图)中的每条迹线显示对一个多孔膜上的TEER的测量。
实施例7：用于上皮细胞增殖的成分确定的培养基组合物的鉴别
牛垂体提取物在KSFM和许多无血清细胞培养基中用作促有丝分裂的补充剂。除了其有促有丝分裂活性外，BPE还含有多种成分未确定的蛋白质、脂质和激素。为了鉴别其中上皮细胞能够增殖的一种或多种成分确定的培养基组合物，测试了另外的培养基组合物。具体地，使上皮细胞在含有ALK5抑制剂和Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)的各种成分确定的培养基组合物中增殖，并评估这些细胞群体的生长。成分确定的培养基组合物包含选自以下的一种或多种组分：M*(MCDB-153(改良的)培养基(BiologicalIndustries，目录编号01-059-1，所述制剂可在万维网址bioind.com/page_16682和下表2B中找到)+上皮生长因子(EGF)+酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)+A83-01+Y-27632)；无脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA；Sigma,A8806)；在水稻中表达的重组人血清白蛋白(rHA；Sigma,A9731)；脂质混合物(化学成分确定的脂质浓缩物；Gibco,11905-031)；和ALBUMAX I富含脂质的BSA(Gibco,11020-039)。MCDB-153(Sigma Aldrich,M7403)和改良的MCDB-153(Biological Industries，目录编号01-059-1)中的某些组分以及它们的浓度呈现于下表2A和表2B中。脂质混合物包含乙醇和下表3中列出的组分。ALBUMAX包含BSA和各自约0.5到2.2mg/g BSA的脂肪酸：α-亚麻酸、亚油酸、油酸、硬脂酸和棕榈酸。
*除非另有说明，否则浓度以g/L计。
使HFK细胞和HBEC细胞在M*；M*+ALBUMAX(以1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.3μg/mL和15.6μg/mL)；M*+BSA+脂质混合物(以1:50稀释度、1:100稀释度、1:200稀释度、1:400稀释度、1:800稀释度、1:1600稀释度和1:3200稀释度)；或M*+rHA+脂质混合物(以1:50稀释度、1:100稀释度、1:200稀释度、1:400稀释度、1:800稀释度、1:1600稀释度和1:3200稀释度)中生长。评估细胞群体的生长，并且将结果呈现为图25(对于HFK细胞)和图26(对于HBEC细胞)中的细胞数目的倍数增加。结果表明，白蛋白和脂质混合物可用于支持上皮细胞增殖，而不需要补充牛垂体提取物(BPE)。
实施例8：上皮细胞基因表达谱
在该实施例中，描述了在各种无血清培养基条件下生长的上皮细胞的基因表达谱。
从在KSFM中于第2次和第6次传代、或在KSFM加A 83-01(1μM)和Y-27632(5μM)中于第2次、第13次和第23次传代培养的人包皮角质形成细胞；以及在KSFM加A 83-01(1μM)和Y-27632(5μM)中于第2次和第8次传代培养的气道上皮细胞提取总RNA。用于气道上皮细胞的细胞培养基还包含异丙肾上腺素(3μM)。通过使用定制RT2 ProfilerTM PCR阵列(Qiagen)的定量RT-PCR分析基因表达水平。包括来自人小肠或肺组织的总RNA(Clontech)作为对照。使用2^(Ct肌动蛋白B-Ct基因)计算相对于肌动蛋白B的水平的基因表达水平，其中Ct肌动蛋白B或Ct基因是定量PCR反应的荧光信号越过限定阈值所需的循环次数。Ct肌动蛋白B一般为约18。如果Ct基因高于35，则认为基因的表达水平是不可检测的(ND)。如果Ct基因小于35并且大于或等于30，则认为基因的表达水平较低。如果Ct基因小于29并且大于或等于22，则认为基因的表达水平是中等或适中的。如果Ct基因小于22，则认为基因的表达水平是高的。
如下表4中所示，在KSFM加A 83-01和Y-27632中生长的上皮细胞表达通常在基底上皮细胞中表达的高水平的基因(ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5和TP63)。这些细胞也缺乏某些多能干细胞标志物(例如LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4和SOX2)的表达，并且它们表达中等水平的KLF4。所述细胞也不表达或表达非常低水平的通常在终末分化的上皮细胞中表达的基因，包括CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPB和SFTPD。在KSFM加A83-01和Y-27632中生长的细胞中未检测到在胃上皮细胞、肠上皮细胞或胰腺上皮细胞中高表达的基因，包括CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1和PROM1/CD133。
实施例9：培养中的上皮细胞的表征
在该实施例中，描述了在各种无饲养层且无血清的培养基条件下生长的上皮细胞的某些特征。
支气管上皮细胞分化为支气管球
将在补充有1μm 83-01和5μM Y-27632的KSFM(KSFM+A+Y)中培养的第2次传代的人支气管上皮细胞从KSFM+A+Y条件移出并作为单细胞包埋在中，并且在CloneticsTM B-ALITM空气-液体界面培养基(高钙分化培养基，Lonza)中培养14天。图31显示分化为支气管球的支气管上皮细胞。图31的上图显示在较低(4X)放大倍数下观察到的细胞，并且图31的下图显示在较高(20X)放大倍数下观察到的细胞。具有可见腔的大支气管球示于图31的下图中。
暴露于高钙浓度后的上皮细胞的表征
在高浓度CaCl2存在下在角质形成细胞和支气管上皮细胞培养物中形成的圆顶样结构。具体地，使在低CaCl2(90μM)的补充有1μM A 83-01和5μM Y-27632的KSFM(KSFM+A+Y)中培养的晚期传代的人支气管上皮细胞(HBEC)和晚期传代的人包皮角质形成细胞(HFK)在6孔板中达到铺满。细胞保持在KSFM+A+Y条件下，并且使CaCl2浓度上升到1.5mM，以诱导上皮细胞的分化。7到10天后形成许多圆顶状结构，并且示于图32A到图32D中。
在暴露于高浓度CaCl2之后的角质形成细胞之间观察到紧密连接形成。具体地，使在低CaCl2(90μM)的补充有1μM A83-01和5μM Y-27632的KSFM(KSFM+A+Y)中培养的晚期传代的人包皮角质形成细胞(HFK)达到铺满。细胞保持在KSFM+A+Y条件下，并且使CaCl2浓度上升到1.5mM，以诱导分化。通过使用与Alexa488(ThermoFisher,339188)缀合的单克隆抗体对紧密连接蛋白质ZO-1的免疫荧光染色，揭示细胞间紧密连接的存在，并且将其示于图33中。
在KSFM加A83-01和Y-27632中在高浓度(1.5mM)CaCl2存在下，角质形成细胞在空气-液体界面分化中随时间而建立增加的跨膜电阻(TEER)。具体地，将预先在低CaCl2(90μM)的补充有1μM A83-01和5μM Y-27632的KSFM(KSFM+A+Y)中培养的人包皮角质形成细胞(HFK)涂铺在多孔膜支撑物(TRANSWELL,Corning,354474)上并维持14天。细胞被培养基(KSFM+A+Y和1.5mM CaCl2)覆盖第一天(浸没阶段，图34中的灰色框)，并且暴露于空气达剩下天数。如图34中所示，在整个培养时期中，跨上皮电阻(TEER)达到非常高的水平。
在KSFM加A 83-01和Y-27632中在高浓度(1.5mM)CaCl2存在下，角质形成细胞在空气-液体界面分化中随时间而形成表皮样结构。具体地，将预先在低CaCl2(90μM)的补充有1μM A83-01和5μM Y-27632的KSFM(KSFM+A+Y)中培养的人包皮角质形成细胞(HFK)涂铺在多孔膜支撑物(TRANSWELL,Corning,354474)上并维持14天。细胞被培养基(KSFM+A+Y和1.5mMCaCl2)覆盖第一天，并且在余下的天数中暴露于空气。在实验结束时(即在第14天)，将培养物固定在4％多聚甲醛中，包埋在石蜡中，并且切片用于苏木精和伊红染色(H&E)以揭示其结构。如图35中所示，细胞已分化为多层结构，其中各层类似于角质层、颗粒层、棘层和基底层。
上皮细胞培养物的进一步表征
检查角质形成细胞的单细胞克隆和扩增。具体地，将晚期传代的单一人包皮角质形成细胞(HFK)(预先在KSFM加1μM A 83-01、5μM Y-27632和3μM异丙肾上腺素中培养)涂铺在经胶原I涂覆的384孔板上并在KSFM加1μM A 83-01、5μM Y-27632和3μM异丙肾上腺素中培养。经过10天，所述细胞分裂为超过1000个细胞并形成集落，如图36中所示。
观察到来源于单细胞的角质形成细胞后代的细胞形态的异质性。具体地，使上文所述和图36中所示的单细胞来源的集落在T-25烧瓶中的KSFM加1μM A 83-01、5μM Y-27632和3μM异丙肾上腺素中进一步扩增。观察到细胞形态(如细胞大小)的异质性并且示于图37中。有丝分裂细胞通过特征性圆形形态、相亮光晕(phase bright halo)和中央暗带(指示凝聚染色体)来鉴别。
检查在KSFM加A 83-01、Y-27632和异丙肾上腺素中培养的某些上皮细胞类型的单细胞集落形成效率。具体地，将先前在KSFM加1μM A83-01、5μM Y-27632和3μM异丙肾上腺素中培养的晚期传代的人包皮角质形成细胞(HFK)和人支气管上皮细胞(HBEC)以1个细胞/孔接种到胶原涂覆的384孔板上，并使其在KSFM加1μM A83-01、5μM Y-27632和3μM异丙肾上腺素中生长10天。在第10天，确定每个孔中的细胞数。对具有少于20个细胞、具有21-100个细胞、具有101-500个细胞或具有超过500个细胞的孔(即，集落)的数目进行计数并绘图，且将结果呈现于图38中。
在不同培养基条件下培养的上皮细胞的扩增
培养来自不同组织的上皮细胞以评价它们在不同培养基中的扩增潜力。从ThermoFisher/Gibco(HFKn和HEKa)或Lonza(HMEC、PrEC、HBEC、SAEC和DHBE-CF)获得所述细胞。使用式F＝2n计算倍数扩增，其中F＝n次群体倍增之后的扩增倍数，并且将结果呈现于下表5中。
HFKn，新生儿人包皮角质形成细胞。HEKa，成年人表皮角质形成细胞。HMEC，人乳腺上皮细胞(女性)。PrEC，人前列腺上皮细胞。HBEC，人支气管上皮细胞。SAEC，人小气道上皮细胞。DHBE-CF，来自囊性纤维化患者的患病人支气管上皮细胞。
*注意细胞培养物在其比在KSFM中实现多得多的扩增倍数后自发地暂停，并且在实验暂停时，群体仍在进行活跃分裂。
KSFM，角质形成细胞-SFM(Gibco/Thermo Fisher)。PrGM，前列腺上皮细胞生长培养基(Lonza)。A，ALK5抑制剂A83-01。Y，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)Y-27632。B，肌球蛋白II抑制剂布雷他汀。IPA，I组p21活化激酶(PAK1)抑制剂。GSK，Rho激酶抑制剂(即Rho相关蛋白质激酶抑制剂)GSK-429286。
实施例10：实施方案的实施例
以下所述的实施例说明某些实施方案，且并不限制本技术。
A1.一种用于离体增殖分化的上皮细胞的方法，所述方法包括：
a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养分化的上皮细胞；和
b)在(a)中的所述培养期间抑制所述分化的上皮细胞中的TGF-β信号传导。
A1.1一种用于离体增殖原来静止的上皮细胞的方法，所述方法包括：
a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养原来静止的上皮细胞；和
b)在(a)中的所述培养期间抑制所述原来静止的上皮细胞中的TGF-β信号传导。
A1.2一种用于离体增殖谱系定型的上皮细胞的方法，所述方法包括：
a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养谱系定型的上皮细胞；和
b)在(a)中的所述培养期间抑制所述谱系定型的上皮细胞中的TGF-β信号传导。
A2.一种用于离体增殖上皮细胞的方法，所述方法包括：
a)在无饲养层细胞的条件下培养上皮细胞；
b)在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中的TGF-β信号传导；和
c)在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中p21活化激酶(PAK)的活性。
A2.1根据实施方案A2所述的方法，其中所述上皮细胞包括分化的上皮细胞。
A2.2根据实施方案A2所述的方法，其中所述上皮细胞包括原来静止的上皮细胞。
A2.3根据实施方案A2所述的方法，其中所述上皮细胞包括谱系定型的上皮细胞。
A3.一种用于离体增殖上皮细胞的方法，所述方法包括：
a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养上皮细胞；
b)在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中的TGF-β信号传导；和
c)在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中肌球蛋白(II)的活性。
A3.1根据实施方案A3所述的方法，其中所述上皮细胞包括分化的上皮细胞。
A3.2根据实施方案A3所述的方法，其中所述上皮细胞包括原来静止的上皮细胞。
A3.3根据实施方案A3所述的方法，其中所述上皮细胞包括谱系定型的上皮细胞。
A3.4根据实施方案A3到A3.3中任一项所述的方法，其中所述肌球蛋白II是非肌肉肌球蛋白II(NM II)。
A4.根据实施方案A2到A3.4中任一项所述的方法，其中(a)中的所述培养在含有血清的培养基存在下进行。
A4.1根据实施方案A2到A3.4中任一项所述的方法，其中(a)中的所述培养在无血清培养基存在下进行。
A5.一种用于离体增殖分化的上皮细胞的方法，所述方法包括：
a)在无饲养层细胞的条件下培养分化的上皮细胞；
b)活化所述分化的上皮细胞中的端粒酶逆转录酶；和
c)调节所述分化的上皮细胞中的细胞骨架结构。
A5.1一种用于离体增殖原来静止的上皮细胞的方法，所述方法包括：
a)在无饲养层细胞的条件下培养原来静止的上皮细胞；
b)活化所述原来静止的上皮细胞中的端粒酶逆转录酶；和
c)调节所述原来静止的上皮细胞中的细胞骨架结构。
A5.2一种用于离体增殖谱系定型的上皮细胞的方法，所述方法包括：
a)在无饲养层细胞的条件下培养谱系定型的上皮细胞；
b)活化所述谱系定型的上皮细胞中的端粒酶逆转录酶；和
c)调节所述谱系定型的上皮细胞中的细胞骨架结构。
A5.3根据实施方案A5、A5.1或A5.2所述的方法，其中在(b)中抑制TGF-β信号传导。
A5.4根据实施方案A1到A5.3中任一项所述的上皮细胞，其中(a)和(b)同时进行；或其中(a)、(b)和(c)同时进行。
A5.5根据实施方案A1到A5.4中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞在(a)之前被冷冻并解冻。
A6.根据实施方案A1到A5.5中任一项所述的方法，其中在(b)中抑制一种或多种TGF-β受体的活性。
A7.根据实施方案A6所述的方法，其中在(b)中抑制一种或多种TGF-β受体-配体相互作用。
A8.根据实施方案A6或A7所述的方法，其中所述一种或多种TGF-β受体包括TGF-βI型受体。
A9.根据实施方案A8所述的方法，其中所述TGF-βI型受体选自ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、ALK7和ALK8。
A10.根据实施方案A8所述的方法，其中所述一种或多种TGF-β受体包括ALK5。
A11.根据实施方案A1到A10中任一项所述的方法，其中抑制TGF-β信号传导包括使用一种或多种TGF-β抑制剂和/或一种或多种TGF-β信号传导抑制剂。
A12.根据实施方案A11所述的方法，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂结合到一种或多种TGF-β受体或一种或多种TGF-β配体或这两者。
A13.根据实施方案A11或A12所述的方法，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂破坏一种或多种TGF-β受体-配体相互作用。
A14.根据实施方案A11、A12或A13所述的方法，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂不包括重组蛋白质。
A15.根据实施方案A11到A14中任一项所述的方法，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂不包括头蛋白、DAN、Cerberus或Gremlin。
A16.根据实施方案A11到A15中任一项所述的方法，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂包括一种或多种ALK5抑制剂。
A17.根据实施方案A16所述的方法，其中所述一种或多种ALK5抑制剂包括一种或多种小分子ALK5抑制剂。
A18.根据实施方案A17所述的方法，其中所述一种或多种ALK5抑制剂包括一种或多种ATP类似物。
A19.根据实施方案A16到A18中任一项所述的方法，其中所述一种或多种ALK5抑制剂中的至少一种包含式A的结构：
其中：
X、Y和Z独立地选自N、C和O；
R1、R2和R3独立地选自氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C10环芳基、取代的C5-C10环芳基、C5-C9杂环基、取代的C5-C9杂环基、C5-C9杂环芳基、取代的C5-C9杂环芳基、-接头-(C3-C9环烷基)、-接头-(取代的C3-C9环烷基)、-接头-(C5-C10芳基)、-接头-(取代的C5-C10芳基)、-接头-(C5-C10环芳基)、-接头-(取代的C5-C10环芳基)、-接头-(C5-C9杂环基)、-接头-(取代的C5-C9杂环基)、-接头-(C5-C9杂环芳基)、-接头-(取代的C5-C9杂环芳基)；
n为0或1；
R4、R5和R6独立选自氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、取代的C1-C10烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6烷氧基羰基、取代的C1-C6烷酰基、取代的C1-C6烷氧基羰基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C10环芳基、取代的C5-C10环芳基、C5-C9杂环基、取代的C5-C9杂环基、C5-C9杂环芳基、取代的C5-C9杂环芳基、-接头-(C3-C9环烷基)、-接头-(取代的C3-C9环烷基)、-接头-(C5-C10芳基)、-接头-(取代的C5-C10芳基)、-接头-(C5-C10环芳基)、-接头-(取代的C5-C10环芳基)、-接头-(C5-C9杂环基)、-接头-(取代的C5-C9杂环基)、-接头-(C5-C9杂环芳基)、接头-(取代的C5-C9杂环芳基)；并且
所述取代的烷基、烷氧基、烷酰基、烷氧基羰基环烷基、芳基、环芳基、杂环基或杂环芳基上的取代基是羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C9环烷基、C5-C9杂环基、C1-6烷氧基C1-6烯基、氨基、氰基、卤素或芳基。
A20.根据实施方案A16到A19中任一项所述的方法，其中所述一种或多种ALK5抑制剂选自A83-01、GW788388、RepSox和SB 431542。
A21.根据实施方案A20所述的方法，其中所述一种或多种ALK5抑制剂包括A83-01。
A22.根据实施方案A16到A21中任一项所述的方法，其中所述一种或多种ALK5抑制剂结合到ALK5或一种或多种ALK5配体或这两者。
A23.根据实施方案A16到A22中任一项所述的方法，其中所述一种或多种ALK5抑制剂破坏一种或多种ALK5-配体相互作用。
A24.根据实施方案A1到A23中任一项所述的方法，其中所述方法包括活化所述上皮细胞的端粒酶逆转录酶。
A24.1根据实施方案A1到A24中任一项所述的方法，其中所述方法包括调节所述上皮细胞中的细胞骨架结构。
A24.2根据实施方案A1到A24.1中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
a)活化所述上皮细胞的端粒酶逆转录酶；和
b)调节所述上皮细胞中的细胞骨架结构。
A25.根据实施方案A1到A24.2中任一项所述的方法，其进一步包括在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中Rho激酶和/或Rho相关蛋白质激酶的所述活性。
A26.根据实施方案A25所述的方法，其中Rho激酶和/或Rho相关蛋白质激酶选自Rho激酶1(ROCK 1)和Rho激酶2(ROCK 2)。
A27.根据实施方案A25或A26所述的方法，其中抑制Rho激酶和/或Rho相关蛋白质激酶的所述活性包括使用一种或多种Rho激酶抑制剂和/或一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂。
A28.根据实施方案A27所述的方法，其中所述一种或多种Rho激酶抑制剂和/或所述一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂包括一种或多种小分子Rho激酶抑制剂和/或一种或多种小分子Rho相关蛋白质激酶抑制剂。
A29.根据实施方案A28所述的方法，其中所述一种或多种Rho激酶抑制剂和/或一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂选自Y-27632、SR3677、噻唑维文、HA1100盐酸盐、HA1077和GSK-429286。
A30.根据实施方案A29所述的方法，其中所述一种或多种Rho激酶抑制剂和/或所述一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂包括Y-27632。
A30.1根据实施方案A1或A24中任一项所述的方法，其不包括在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中Rho激酶和/或Rho相关蛋白质激酶的所述活性。
A31.根据实施方案A1到A30.1中任一项所述的方法，其进一步包括在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中p21活化的激酶(PAK)的所述活性。
A32.根据实施方案A31所述的方法，其中所述PAK选自PAK1、PAK2、PAK3和PAK4。
A33.根据实施方案A32所述的方法，其中所述PAK是PAK1。
A34.根据实施方案A33所述的方法，其中抑制PAK1的所述活性包括使用一种或多种PAK1抑制剂。
A35.根据实施方案A34所述的方法，其中所述一种或多种PAK1抑制剂包括一种或多种小分子PAK1抑制剂。
A36.根据实施方案A35所述的方法，其中所述一种或多种PAK1抑制剂包括IPA3。
A37.根据实施方案A1到A36中任一项所述的方法，其进一步包括在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中肌球蛋白(II)的所述活性。
A37.1根据实施方案A37所述的方法，其中所述肌球蛋白II是非肌肉肌球蛋白II(NM II)。
A37.2根据实施方案A37或A37.1所述的方法，其中抑制肌球蛋白II的所述活性包括使用一种或多种肌球蛋白II抑制剂。
A37.3根据实施方案A37.2所述的方法，其中所述一种或多种肌球蛋白II抑制剂包括一种或多种小分子肌球蛋白II抑制剂。
A37.4.根据实施方案A37.2或A37.3所述的方法，其中所述一种或多种肌球蛋白II抑制剂包括布雷他汀。
A38.根据实施方案A1到A37.4中任一项所述的方法，其进一步包括在(a)中的所述培养期间增加所述上皮细胞中的细胞内环腺苷单磷酸(cAMP)水平。
A39.根据实施方案A38所述的方法，其中增加细胞内环腺苷单磷酸(cAMP)水平包括使用一种或多种β-肾上腺素能激动剂和/或一种或多种β-肾上腺素能受体激动剂。
A39.1根据实施方案A39所述的方法，其中所述一种或多种β-肾上腺素能激动剂和/或所述一种或多种β-肾上腺素能受体激动剂包括异丙肾上腺素。
A40.根据实施方案A1到A39.1中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞是在(a)之前从受试者中获得的。
A40.1根据实施方案A40所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
A40.2根据实施方案A40所述的方法，其中所述受试者是人。
A40.3根据实施方案A40到A40.2中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞来自受试者的组织。
A40.4根据实施方案A40.3所述的方法，其中所述上皮细胞来自受试者的分化组织。
A40.5根据实施方案A40到A40.2中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞来自受试者的循环细胞。
A41.根据实施方案A40到A40.5中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞包括来自受试者的原代细胞。
A42.根据实施方案A40到A40.5中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞不包括来自受试者的原代细胞。
A43.根据实施方案A40到A42中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞包括来自受试者的肿瘤细胞。
A44.根据实施方案A41到A43中任一项所述的方法，其中来自受试者的所述上皮细胞选自鳞状细胞、柱状细胞、腺瘤细胞和移行上皮细胞。
A44.1根据实施方案A41到A43中任一项所述的方法，其中来自受试者的所述上皮细胞包括鳞状细胞、柱状细胞、腺瘤细胞和移行上皮细胞中的一种或多种。
A45.根据实施方案A41到A44.1中任一项所述的方法，其中来自受试者的所述上皮细胞包括角质形成细胞上皮细胞。
A45.1根据实施方案A45所述的上皮细胞，其中所述角质形成细胞上皮细胞选自真皮角质形成细胞、眼上皮细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、食道上皮细胞和子宫颈上皮细胞。
A46.根据实施方案A41到A44中任一项所述的方法，其中来自受试者的所述上皮细胞包括非角质形成细胞上皮细胞。
A47.根据实施方案A46所述的方法，其中所述非角质形成细胞上皮细胞包括腺上皮细胞。
A48.根据实施方案A46或A47所述的方法，其中所述非角质形成细胞上皮细胞选自前列腺细胞、乳腺细胞、肝细胞、肝上皮细胞、胆道上皮细胞、胆囊细胞、胰岛细胞、胰腺β细胞、胰腺导管上皮细胞、肺上皮细胞、气道上皮细胞、鼻上皮细胞、肾细胞、膀胱细胞、尿道上皮细胞、胃上皮细胞、大肠上皮细胞、小肠上皮细胞、睾丸上皮细胞、卵巢上皮细胞、输卵管上皮细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞、垂体细胞、腺细胞、羊膜上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、汗腺上皮细胞、皮脂上皮细胞和毛囊细胞。
A48.1根据实施方案A1到A47中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞包括基底上皮细胞。
A48.2根据实施方案A1到A47中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞不是肠上皮细胞。
A49.根据实施方案A1到A48.2中任一项所述的方法，其中(a)中的所述培养在无血清培养基存在下进行。
A49.1根据实施方案A49所述的方法，其中所述无血清培养基是成分确定的无血清培养基。
A49.2根据实施方案A49所述的方法，其中所述无血清培养基是无异源物的无血清培养基。
A49.3根据实施方案A49所述的方法，其中所述无血清培养基是成分确定的无异源物的无血清培养基。
A50.根据实施方案A49到A49.3中任一项所述的方法，其中所述无血清培养基包含钙。
A51.根据实施方案A50所述的方法，其中所述无血清培养基包含浓度低于1mM的钙。
A52.根据实施方案A50所述的方法，其中所述无血清培养基包含浓度低于500μM的钙。
A53.根据实施方案A50所述的方法，其中所述无血清培养基包含浓度低于100μM的钙。
A53.1根据实施方案A53所述的方法，其中所述无血清培养基包含浓度低于约90μM的钙。
A54.根据实施方案A50所述的方法，其中所述无血清培养基包含浓度低于20μM的钙。
A54.1根据实施方案A49到A54中任一项所述的上皮细胞，其中所述无血清培养基包含缓冲液以及选自无机酸、盐、碱性硅酸盐、氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶、聚胺、α-酮酸、有机硫化合物和葡萄糖的一种或多种组分。
A54.2根据实施方案A54.1所述的方法，其中所述一种或多种盐选自氯化钠、氯化钾、乙酸钠和磷酸钠。
A54.3根据实施方案A54.1或A54.2所述的方法，其中所述一种或多种氨基酸选自精氨酸和谷氨酰胺。
A54.4根据实施方案A54.1到A54.3中任一项所述的方法，其中所述缓冲液是HEPES缓冲液。
A54.5根据实施方案A49到A54.4中任一项所述的方法，其中所述无血清培养基包含白蛋白。
A54.6根据实施方案A54.5所述的方法，其中所述白蛋白选自牛血清白蛋白和重组人血清白蛋白。
A54.7根据实施方案A49到A54.6中任一项所述的方法，其中所述无血清培养基包含一种或多种脂质。
A54.8根据实施方案A54.7所述的方法，其中所述一种或多种脂质选自花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸、普流尼克F-68、硬脂酸和聚山梨糖醇酯80。
A54.9根据实施方案A54.8所述的方法，其中所述一种或多种脂质选自亚油酸、亚麻酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸。
A55.根据实施方案A1到A54.9中任一项所述的方法，其包括使用一种或多种促有丝分裂生长因子。
A56.根据实施方案A55所述的方法，其中所述一种或多种促有丝分裂生长因子包括EGF。
A56.1根据实施方案A55所述的方法，其中所述一种或多种促有丝分裂生长因子包括FGF。
A56.2根据实施方案A55所述的方法，其中所述一种或多种促有丝分裂生长因子包括EGF和FGF。
A56.3根据实施方案A56.1或A56.2所述的方法，其中所述FGF包括酸性FGF。
A57.根据实施方案A1到A54.9中任一项所述的方法，其不包括使用促有丝分裂生长因子。
A58.根据实施方案A1到A57中任一项所述的方法，其包括使用一种或多种促有丝分裂的补充剂。
A59.根据实施方案A58所述的方法，其中所述一种或多种促有丝分裂的补充剂包括牛垂体提取物(BPE)。
A59.1根据实施方案A1到A57中任一项所述的方法，其不包括使用促有丝分裂的补充剂。
A60.根据实施方案A1到A59.1中任一项所述的方法，其不包括使用Wnt激动剂或β-连环蛋白激动剂。
A60.1根据实施方案A1到A60中任一项所述的方法，其不包括使用选自以下的组分中的一种或多种：头蛋白、R-脊椎蛋白、Wnt-3a、EGF、烟酰胺、FGF10、胃泌素、p38抑制剂、SB202190、DHT、notch抑制剂、γ分泌酶抑制剂、DBZ和DAPT。
A61.根据实施方案A1到A60.1中任一项所述的方法，其不包括使用细胞外基质。
A62.根据实施方案A1到A60.1中任一项所述的方法，其中(a)中的所述培养在包含涂层的容器中进行。
A63.根据实施方案A62所述的方法，其中所述涂层包含胶原蛋白。
A64.根据实施方案A62所述的方法，其中所述涂层包含基底膜基质。
A65.根据实施方案A1到A64中任一项所述的方法，其中(a)中的所述培养包括扩增所述上皮细胞。
A66.根据实施方案A65所述的方法，其中所述上皮细胞被扩增至少约2倍。
A67.根据实施方案A65所述的方法，其中所述上皮细胞被扩增至少约5倍。
A68.根据实施方案A65所述的方法，其中所述上皮细胞被扩增至少约10倍。
A69.根据实施方案A65所述的方法，其中所述上皮细胞被扩增至少约15倍。
A70.根据实施方案A65所述的方法，其中所述上皮细胞被扩增至少约20倍。
A70.1根据实施方案A65所述的方法，其中所述上皮细胞被扩增至少约100倍。
A70.2根据实施方案A65所述的方法，其中所述上皮细胞被扩增至少约1,000倍。
A70.3根据实施方案A65所述的方法，其中所述上皮细胞被扩增至少约10,000倍。
A70.4根据实施方案A65所述的方法，其中所述上皮细胞被扩增至少约100,000倍。
A70.5根据实施方案A65所述的方法，其中所述上皮细胞被扩增至少约1百万倍。
A70.6根据实施方案A65所述的方法，其中所述上皮细胞被扩增至少约10亿倍。
A70.7根据实施方案A65所述的方法，其中所述上皮细胞被扩增至少约1兆倍。
A71.根据实施方案A65到A70.7中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞被培养约4天。
A72.根据实施方案A65到A70.7中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞被培养约5天。
A73.根据实施方案A1到A72中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞被连续增殖。
A74.根据实施方案A1到A73中任一项所述的方法，其包括将所述上皮细胞传代至少15次。
A75.根据实施方案A1到A73中任一项所述的方法，其包括将所述上皮细胞传代至少25次。
A76.根据实施方案A1到A75中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞的群体在一段时间内倍增。
A77.根据实施方案A76所述的方法，其中所述上皮细胞群体倍增至少20次。
A78.根据实施方案A76所述的方法，其中所述上皮细胞群体倍增至少50次。
A78.1根据实施方案A76所述的方法，其中所述上皮细胞群体倍增至少80次。
A79.根据实施方案A76所述的方法，其中所述上皮细胞群体倍增至少100次。
A80.根据实施方案A76所述的方法，其中所述上皮细胞群体倍增至少120次。
A81.根据实施方案A76所述的方法，其中所述上皮细胞群体倍增至少150次。
A82.根据实施方案A76所述的方法，其中所述上皮细胞群体倍增至少200次。
A83.根据实施方案A76到A82中任一项所述的方法，其中所述时间段为约50天。
A84.根据实施方案A76到A82中任一项所述的方法，其中所述时间段为约100天。
A85.根据实施方案A76到A82中任一项所述的方法，其中所述时间段为约150天。
A86.根据实施方案A76到A82中任一项所述的方法，其中所述时间段为约200天。
A87.根据实施方案A1到A86中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞在(b)期间维持一种或多种天然功能特征。
A88.根据实施方案A1到A86中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞在(b)期间不维持一种或多种天然功能特征。
A89.根据实施方案A1到A88中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞在(b)之后被置于其中不抑制TGF-β信号传导的细胞培养环境中。
A90.根据实施方案A89所述的方法，其中所述上皮细胞在被置于其中不抑制TGF-β信号传导的所述细胞培养环境中后，维持或重新获得一种或多种天然功能特征。
A91.根据实施方案A1到A90中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞可被诱导以分化为多种组织类型。
A91.1根据实施方案A1到A90中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞未获得分化为多种组织类型的能力。
A92.根据实施方案A1到A91.1中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞未获得形成类器官的能力。
A93.根据实施方案A1到A92中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞不是来源于胚胎干细胞。
A93.1根据实施方案A1到A93中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞不是来源于连续增殖的上皮干细胞。
A93.2根据实施方案A1到A93.1中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞来源于包含静止上皮细胞的上皮组织。
A93.3根据实施方案A1到A93.2中任一项所述的方法，所述方法不包括选择连续增殖的上皮干细胞。
A93.4根据实施方案A1到A93.3中任一项所述的方法，所述方法不包括选择肠隐窝细胞。
A93.5根据实施方案A1到A93.4中任一项所述的方法，所述方法不包括选择LGR5+细胞。
A94.根据实施方案A40到A93.5中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不包括连续增殖的上皮干细胞或来源于连续增殖的上皮干细胞的细胞。
A94.1根据实施方案A40到A94中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不包括多能干细胞或来源于多能干细胞的细胞。
A94.2根据实施方案A40到A94.1中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不包括终末分化的上皮细胞。
A94.3根据实施方案A40到A94.2中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不包括胃上皮细胞、肠上皮细胞和/或胰腺上皮细胞。
A94.4根据实施方案A40到A94.3中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不包括肠隐窝细胞。
A94.5根据实施方案A40到A94.4中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不包括LGR5+细胞。
A95.根据实施方案A40到A94.5中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞是上皮细胞的同源群体。
A95.1根据实施方案A40到A95中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞是基底上皮细胞的同源群体。
A95.2根据实施方案A40到A94.5中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞是上皮细胞的异源群体。
A96.根据实施方案A40到A95.2中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞比终末分化的细胞的分化程度低，并且比胚胎干细胞或成体干细胞的分化程度高。
A97.根据实施方案A40到A96中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞表达一种或多种基底上皮细胞标志物。
A98.根据实施方案A40到A97中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞表达ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5和TP63中的一种或多种。
A99.根据实施方案A40到A98中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不表达一种或多种上皮干细胞标志物。
A100.根据实施方案A40到A99中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不表达Lgr5。
A101.根据实施方案A40到A100中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不表达一种或多种多能干细胞标志物。
A102.根据实施方案A40到A101中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不表达LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4和SOX2中的一种或多种。
A103.根据实施方案A40到A102中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不表达一种或多种终末分化的上皮细胞标志物。
A104.根据实施方案A40到A103中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不表达CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPB和SFTPD中的一种或多种。
A105.根据实施方案A40到A104中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不表达一种或多种胃上皮细胞标志物、一种或多种肠上皮细胞标志物和/或一种或多种胰腺上皮细胞标志物。
A106.根据实施方案A40到A105中任一项所述的方法，其中从受试者获得的所述上皮细胞和/或培养中的所述上皮细胞不表达CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1和PROM1/CD133中的一种或多种。
A107.根据实施方案A1到A106中任一项所述的方法，其进一步包括分离离体增殖的上皮细胞群体。
A108.根据实施方案A1到A107中任一项所述的方法，其进一步包括在细胞库中储存离体增殖的上皮细胞群体。
A109.一种离体增殖的上皮细胞群体，其通过根据实施方案A1到A108中任一项所述的方法产生。
A110.根据实施方案A109所述的离体增殖的上皮细胞群体用于产生遗传修饰的细胞的用途。
A111.根据实施方案A109所述的离体增殖的上皮细胞群体用于鉴别用于受试者的一种或多种候选治疗的用途。
A112.根据实施方案A109所述的离体增殖的上皮细胞群体用于鉴别受试者中的一种或多种异常上皮细胞的用途。
A113.根据实施方案A109所述的离体增殖的上皮细胞用于监测受试者中的疾病进展或疾病治疗的用途。
B1.一种用于在无饲养层细胞条件下离体增殖分化的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含一种或多种TGF-β抑制剂和/或一种或多种TGF-β信号传导抑制剂。
B1.1一种用于在无饲养层细胞条件下离体增殖原来静止的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含一种或多种TGF-β抑制剂和/或一种或多种TGF-β信号传导抑制剂。
B1.2一种用于在无饲养层细胞条件下离体增殖谱系定型的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含一种或多种TGF-β抑制剂和/或一种或多种TGF-β信号传导抑制剂。
B1.3一种用于在无饲养层细胞条件下离体增殖分化的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含由TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂组成的小分子抑制剂。
B1.4一种用于在无饲养层细胞条件下离体增殖原来静止的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含由TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂组成的小分子抑制剂。
B1.5一种用于在无饲养层细胞条件下离体增殖谱系定型的上皮细胞的无血清细胞培养基，所述无血清培养基包含由TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂组成的小分子抑制剂。
B1.6根据实施方案B1到B1.5中任一项所述的无血清细胞培养基，其为成分确定的无血清细胞培养基。
B1.7根据实施方案B1到B1.5中任一项所述的无血清细胞培养基，其为无异源物的无血清细胞培养基。
B1.8根据实施方案B1到B1.5中任一项所述的无血清细胞培养基，其为成分确定的无异源物的无血清细胞培养基。
B2.一种用于在无饲养层细胞条件下离体增殖上皮细胞的细胞培养基，所述培养基包含一种或多种TGF-β抑制剂和/或一种或多种TGF-β信号传导抑制剂以及一种或多种PAK1抑制剂。
B2.1一种用于在无饲养层细胞条件下离体增殖上皮细胞的细胞培养基，所述培养基包含由TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂和PAK1抑制剂组成的小分子抑制剂。
B3.一种用于在无饲养层细胞条件下离体增殖上皮细胞的细胞培养基，所述培养基包含一种或多种TGF-β抑制剂和/或一种或多种TGF-β信号传导抑制剂以及一种或多种肌球蛋白II抑制剂。
B3.1根据实施方案B3所述的细胞培养基，其中所述肌球蛋白II是非肌肉肌球蛋白II(NM II)。
B3.2一种用于在无饲养层细胞条件下离体增殖上皮细胞的细胞培养基，所述培养基包含由TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂和肌球蛋白II抑制剂组成的小分子抑制剂。
B3.3根据实施方案B3.2所述的细胞培养基，其中所述肌球蛋白II是非肌肉肌球蛋白II(NM II)。
B4.根据实施方案B2到B3.3中任一项所述的细胞培养基，其中所述上皮细胞包括分化的上皮细胞。
B4.1根据实施方案B2到B3.3中任一项所述的细胞培养基，其中所述上皮细胞包括原来静止的上皮细胞。
B4.2根据实施方案B2到B3.3中任一项所述的细胞培养基，其中所述上皮细胞包括谱系定型的上皮细胞。
B5.根据实施方案B2到B4中任一项所述的细胞培养基，其为含血清培养基。
B5.1根据实施方案B2到B4中任一项所述的细胞培养基，其为无血清培养基。
B5.2根据实施方案B5.1所述的细胞培养基，其为成分确定的无血清培养基。
B5.3根据实施方案B5.1所述的细胞培养基，其为无异源物的无血清培养基。
B5.4根据实施方案B5.1所述的细胞培养基，其为成分确定的无血清培养基。
B6.根据实施方案B1到B5.3中任一项所述的细胞培养基，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂结合到一种或多种TGF-β受体或一种或多种TGF-β配体或这两者。
B7.根据实施方案B1到B6中任一项所述的细胞培养基，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂破坏一种或多种TGF-β受体-配体相互作用。
B8.根据实施方案B1到B7中任一项所述的细胞培养基，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂不包括重组蛋白质。
B9.根据实施方案B1到B8中任一项所述的细胞培养基，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂不包括头蛋白、DAN、Cerberus或Gremlin。
B10.根据实施方案B1到B9中任一项所述的细胞培养基，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂包括一种或多种TGF-β受体抑制剂。
B11.根据实施方案B10所述的细胞培养基，其中所述一种或多种TGF-β受体抑制剂包括一种或多种TGF-βI型受体抑制剂。
B12.根据实施方案B11所述的细胞培养基，其中所述一种或多种TGF-βI型受体抑制剂选自ALK1抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK4抑制剂、ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、ALK7抑制剂和ALK8抑制剂。
B13.根据实施方案B12所述的细胞培养基，其中所述一种或多种TGF-βI型受体抑制剂包括一种或多种ALK5抑制剂。
B14.根据实施方案B13所述的细胞培养基，其中所述一种或多种ALK5抑制剂包括一种或多种小分子ALK5抑制剂。
B15.根据实施方案B15所述的细胞培养基，其中所述一种或多种ALK5抑制剂包括一种或多种ATP类似物。
B16.根据实施方案B14或B15所述的细胞培养基，其中所述一种或多种ALK5抑制剂中的至少一种包含式A的结构：
其中：
X、Y和Z独立地选自N、C和O；
R1、R2和R3独立地选自氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C10环芳基、取代的C5-C10环芳基、C5-C9杂环基、取代的C5-C9杂环基、C5-C9杂环芳基、取代的C5-C9杂环芳基、-接头-(C3-C9环烷基)、-接头-(取代的C3-C9环烷基)、-接头-(C5-C10芳基)、-接头-(取代的C5-C10芳基)、-接头-(C5-C10环芳基)、-接头-(取代的C5-C10环芳基)、-接头-(C5-C9杂环基)、-接头-(取代的C5-C9杂环基)、-接头-(C5-C9杂环芳基)、-接头-(取代的C5-C9杂环芳基)；
n为0或1；
R4、R5和R6独立选自氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、取代的C1-C10烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6烷氧基羰基、取代的C1-C6烷酰基、取代的C1-C6烷氧基羰基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C10环芳基、取代的C5-C10环芳基、C5-C9杂环基、取代的C5-C9杂环基、C5-C9杂环芳基、取代的C5-C9杂环芳基、-接头-(C3-C9环烷基)、-接头-(取代的C3-C9环烷基)、-接头-(C5-C10芳基)、-接头-(取代的C5-C10芳基)、-接头-(C5-C10环芳基)、-接头-(取代的C5-C10环芳基)、-接头-(C5-C9杂环基)、-接头-(取代的C5-C9杂环基)、-接头-(C5-C9杂环芳基)、接头-(取代的C5-C9杂环芳基)；并且
所述取代的烷基、烷氧基、烷酰基、烷氧基羰基环烷基、芳基、环芳基、杂环基或杂环芳基上的取代基是羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C9环烷基、C5-C9杂环基、C1-6烷氧基C1-6烯基、氨基、氰基、卤素或芳基。
B17.根据实施方案B14、B15或B16所述的细胞培养基，其中所述一种或多种ALK5抑制剂选自A83-01、GW788388、RepSox和SB 431542。
B18.根据实施方案B17所述的细胞培养基，其中所述一种或多种ALK5抑制剂包括A83-01。
B19.根据实施方案B13到B18中任一项所述的细胞培养基，其中所述一种或多种ALK5抑制剂结合到ALK5或一种或多种ALK5配体或这两者。
B20.根据实施方案B13到B19中任一项所述的细胞培养基，其中所述一种或多种ALK5抑制剂破坏一种或多种ALK5-配体相互作用。
B21.根据实施方案B1到B20中任一项所述的细胞培养基，其进一步包含一种或多种Rho激酶抑制剂和/或一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂。
B22.根据实施方案B21所述的细胞培养基，其中所述一种或多种Rho激酶抑制剂和/或一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂选自Rho激酶1(ROCK1)抑制剂和Rho激酶2(ROCK 2)抑制剂。
B23.根据实施方案B21或B22所述的细胞培养基，其中所述一种或多种Rho激酶抑制剂和/或所述一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂包括一种或多种小分子Rho激酶抑制剂和/或一种或多种小分子Rho相关蛋白质激酶抑制剂。
B24.根据实施方案B23所述的细胞培养基，其中所述一种或多种Rho激酶抑制剂和/或一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂选自Y-27632、SR 3677、噻唑维文、HA1100盐酸盐、HA1077和GSK-429286。
B25.根据实施方案B14所述的细胞培养基，其中所述一种或多种Rho激酶抑制剂和/或所述一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂包括Y-27632。
B25.1根据实施方案B1到B20中任一项所述的细胞培养基，其不包含Rho激酶抑制剂和/或Rho相关蛋白质激酶抑制剂。
B26.根据实施方案B1到B25.1中任一项所述的细胞培养基，其进一步包含一种或多种PAK1抑制剂。
B27.根据实施方案B26所述的细胞培养基，其中所述一种或多种PAK1抑制剂包括一种或多种小分子PAK1抑制剂。
B28.根据实施方案B27所述的细胞培养基，其中所述一种或多种PAK1抑制剂包括IPA3。
B29.根据实施方案B1到B28中任一项所述的细胞培养基，其进一步包含一种或多种肌球蛋白II抑制剂。
B29.1根据实施方案B29所述的细胞培养基，其中所述一种或多种肌球蛋白II抑制剂包括一种或多种非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂。
B30.根据实施方案B29或B29.1所述的细胞培养基，其中所述一种或多种肌球蛋白II抑制剂包括一种或多种小分子肌球蛋白II抑制剂。
B30.1根据实施方案B30所述的细胞培养基，其中所述一种或多种肌球蛋白II抑制剂包括布雷他汀。
B31.根据实施方案B1到B30.1中任一项所述的细胞培养基，其进一步包含一种或多种β-肾上腺素能激动剂和/或一种或多种β-肾上腺素能受体激动剂。
B31.1根据实施方案B31所述的细胞培养基，其中所述一种或多种β-肾上腺素能激动剂和/或所述一种或多种β-肾上腺素能受体激动剂包括异丙肾上腺素。
B32.根据实施方案B1到B31.1中任一项所述的细胞培养基，其中所述上皮细胞来自受试者。
B32.1根据实施方案B32所述的细胞培养基，其中所述上皮细胞来自受试者的组织。
B32.2根据实施方案B32.1所述的细胞培养基，其中所述上皮细胞来自受试者的分化组织。
B32.3根据实施方案B32到B32.2中任一项所述的细胞培养基，其中所述上皮细胞包括原代细胞。
B33.根据实施方案B32到B32.2中任一项所述的细胞培养基，其中所述上皮细胞不包括原代细胞。
B34.根据实施方案B32到B33中任一项所述的细胞培养基，其中所述上皮细胞包括肿瘤细胞。
B35.根据实施方案B32到B34中任一项所述的细胞培养基，其中来自受试者的所述上皮细胞选自鳞状细胞、柱状细胞、腺瘤细胞和移行上皮细胞。
B35.1根据实施方案B32到B34中任一项所述的细胞培养基，其中来自受试者的所述上皮细胞包括鳞状细胞、柱状细胞、腺瘤细胞和移行上皮细胞中的一种或多种。
B36.根据实施方案B32到B35.1中任一项所述的细胞培养基，其中来自受试者的所述上皮细胞包括角质形成细胞上皮细胞。
B36.1根据实施方案B36所述的细胞培养基，其中所述角质形成细胞上皮细胞选自真皮角质形成细胞、眼上皮细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、食道上皮细胞和子宫颈上皮细胞。
B37.根据实施方案B32到B35中任一项所述的细胞培养基，其中来自受试者的所述上皮细胞包括非角质形成细胞上皮细胞。
B38.根据实施方案B37所述的细胞培养基，其中所述非角质形成细胞上皮细胞包括腺上皮细胞。
B39.根据实施方案B37或B38所述的细胞培养基，其中所述非角质形成细胞上皮细胞选自前列腺细胞、乳腺细胞、肝细胞、肝上皮细胞、胆道上皮细胞、胆囊细胞、胰岛细胞、胰腺β细胞、胰腺导管上皮细胞、肺上皮细胞、气道上皮细胞、鼻上皮细胞、肾细胞、膀胱细胞、尿道上皮细胞、胃上皮细胞、大肠上皮细胞、小肠上皮细胞、睾丸上皮细胞、卵巢上皮细胞、输卵管上皮细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞、垂体细胞、腺细胞、羊膜上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、汗腺上皮细胞、皮脂上皮细胞和毛囊细胞。
B39.1根据实施方案B1到B39中任一项所述的细胞培养基，其中所述上皮细胞包括基底上皮细胞。
B39.2根据实施方案B1到B39中任一项所述的细胞培养基，其中所述上皮细胞不是肠上皮细胞。
B40.根据实施方案B1到B39.2中任一项所述的细胞培养基，其包含钙。
B41.根据实施方案B40所述的细胞培养基，其中所述钙以低于1mM的浓度存在。
B42.根据实施方案B40所述的细胞培养基，其中所述钙以低于500μM的浓度存在。
B43.根据实施方案B40所述的细胞培养基，其中所述钙以低于100μM的浓度存在。
根据实施方案B43所述的方法，其中所述钙以约90μM的浓度存在。
B44.根据实施方案B40所述的细胞培养基，其中所述钙以低于20μM的浓度存在。
B44.1根据实施方案B1到B44中任一项所述的细胞培养基，其包含缓冲液以及选自无机酸、盐、碱性硅酸盐、氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶、聚胺、α-酮酸、有机硫化合物和葡萄糖的一种或多种组分。
B44.2根据实施方案B44.1所述的细胞培养基，其中所述一种或多种盐选自氯化钠、氯化钾、乙酸钠和磷酸钠。
B44.3根据实施方案B44.1或B44.2所述的细胞培养基，其中所述一种或多种氨基酸选自精氨酸和谷氨酰胺。
B44.4根据实施方案B44.1到B44.3中任一项所述的细胞培养基，其中所述缓冲液为HEPES缓冲液。
B44.5根据实施方案B1到B44.4中任一项所述的细胞培养基，其包含白蛋白。
B44.6根据实施方案B44.5所述的细胞培养基，其中所述白蛋白选自牛血清白蛋白和重组人血清白蛋白。
B44.7根据实施方案B1到B44.6中任一项所述的细胞培养基，其包含一种或多种脂质。
B44.8根据实施方案B44.7所述的细胞培养基，其中所述一种或多种脂质选自花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸、普流尼克F-68、硬脂酸和聚山梨糖醇酯80。
B44.9根据实施方案B44.8所述的细胞培养基，其中所述一种或多种脂质选自亚油酸、亚麻酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸。
B45.根据实施方案B1到B44.9中任一项所述的细胞培养基，其包含一种或多种促有丝分裂生长因子。
B46.根据实施方案B45所述的细胞培养基，其中所述一种或多种促有丝分裂生长因子包括EGF。
B46.1根据实施方案B45所述的细胞培养基，其中所述一种或多种促有丝分裂生长因子包括FGF。
B46.2根据实施方案B45所述的细胞培养基，其中所述一种或多种促有丝分裂生长因子包括EGF和FGF。
B46.3根据实施方案B46.1或B46.2所述的细胞培养基，其中所述FGF包括酸性FGF。
B47.根据实施方案B1到B44.9中任一项所述的细胞培养基，其不包含促有丝分裂生长因子。
B48.根据实施方案B1到B47中任一项所述的细胞培养基，其包含一种或多种促有丝分裂的补充剂。
B49.根据实施方案B48所述的细胞培养基，其中所述一种或多种促有丝分裂的补充剂包括牛垂体提取物(BPE)。
B49.1根据实施方案B1到B47中任一项所述的细胞培养基，其不包含促有丝分裂的补充剂。
B50.根据实施方案B1到B49.1中任一项所述的细胞培养基，其不包含Wnt激动剂或β-连环蛋白激动剂。
B50.1根据实施方案B1到B50中任一项所述的细胞培养基，其不包含选自以下的组分中的一种或多种：头蛋白、R-脊椎蛋白、Wnt-3a、EGF、烟酰胺、FGF10、胃泌素、p38抑制剂、SB202190、DHT、notch抑制剂、γ分泌酶抑制剂、DBZ和DAPT。
B51.根据实施方案B1到B50.1中任一项所述的细胞培养基，其不包含细胞外基质。
C1.一种离体增殖的上皮细胞群体，其通过包括以下的方法产生：
a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养分化的上皮细胞；和
b)在(a)中的所述培养期间抑制所述分化的上皮细胞中的TGF-β信号传导。
C1.1一种离体增殖的上皮细胞群体，其通过包括以下的方法产生：
a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养原来静止的上皮细胞；和b)在(a)中的所述培养期间抑制所述原来静止的上皮细胞中的TGF-β信号传导。
C1.2一种离体增殖的上皮细胞群体，其通过包括以下的方法产生：
a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养谱系定型的上皮细胞；和b)在(a)中的所述培养期间抑制所述谱系定型的上皮细胞中的TGF-β信号传导。
C2.一种离体增殖的上皮细胞群体，其通过包括以下的方法产生：
a)在无饲养层细胞的条件下培养上皮细胞；
b)在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中的TGF-β信号传导；和
c)在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中p21活化激酶(PAK)的活性。
C2.1根据实施方案C2所述的上皮细胞，其包括分化的上皮细胞。
C2.2根据实施方案C2所述的上皮细胞，其包括原来静止的上皮细胞。
C2.3根据实施方案C2所述的上皮细胞，其包括谱系定型的上皮细胞。
C3.一种离体增殖的上皮细胞群体，其通过包括以下的方法产生：
a)在无血清且无饲养层细胞的条件下培养上皮细胞；
b)在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中的TGF-β信号传导；和
c)在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中肌球蛋白(II)的活性。
C3.1根据实施方案C3所述的上皮细胞，其包括分化的上皮细胞。
C3.2根据实施方案C3所述的上皮细胞，其包括原来静止的上皮细胞。
C3.3根据实施方案C3所述的上皮细胞，其包括谱系定型的上皮细胞。
C3.4根据实施方案C3到C3.3中任一项所述的上皮细胞，其中所述肌球蛋白II是非肌肉肌球蛋白II(NM II)。
C4.根据实施方案C2到C3.4中任一项所述的上皮细胞，其中(a)中的所述培养在含有血清的培养基存在下进行。
C5.根据实施方案C2到C3.4中任一项所述的上皮细胞，其中(a)中的所述培养在无血清的培养基存在下进行。
C5.1根据实施方案C1到C5中任一项所述的上皮细胞，其中(a)和(b)同时进行；或(a)、(b)和(c)同时进行。
C5.2根据实施方案C1到C5.1中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞在(a)之前被冷冻并解冻。
C6.根据实施方案C1到C5.2中任一项所述的上皮细胞，其中在(b)中抑制一种或多种TGF-β受体的活性。
C7.根据实施方案C6所述的上皮细胞，其中在(b)中抑制一种或多种TGF-β受体-配体相互作用。
C8.根据实施方案C6或C7所述的上皮细胞，其中所述一种或多种TGF-β受体包括TGF-βI型受体。
C9.根据实施方案C8所述的上皮细胞，其中所述TGF-βI型受体选自ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、ALK7和ALK8。
C10.根据实施方案C8所述的上皮细胞，其中所述一种或多种TGF-β受体包括ALK5。
C11.根据实施方案C1到C10中任一项所述的上皮细胞，其中抑制TGF-β信号传导包括使用一种或多种TGF-β抑制剂和/或一种或多种TGF-β信号传导抑制剂。
C12.根据实施方案C11所述的上皮细胞，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂结合到一种或多种TGF-β受体或一种或多种TGF-β配体或这两者。
C13.根据实施方案C11或C12所述的上皮细胞，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂破坏一种或多种TGF-β受体-配体相互作用。
C14.根据实施方案C11、C12或C13所述的上皮细胞，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂不包括重组蛋白质。
C15.根据实施方案C11到C14中任一项所述的上皮细胞，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂不包括头蛋白、DAN、Cerberus或Gremlin。
C16.根据实施方案C11到C15中任一项所述的上皮细胞，其中所述一种或多种TGF-β抑制剂和/或所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂包括一种或多种ALK5抑制剂。
C17.根据实施方案C16所述的上皮细胞，其中所述一种或多种ALK5抑制剂包括一种或多种小分子ALK5抑制剂。
C18.根据实施方案C17所述的上皮细胞，其中所述一种或多种ALK5抑制剂包括一种或多种ATP类似物。
C19.根据实施方案C16到C18中任一项所述的上皮细胞，其中所述一种或多种ALK5抑制剂中的至少一种包含式A的结构：
其中：
X、Y和Z独立地选自N、C和O；
R1、R2和R3独立地选自氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C10环芳基、取代的C5-C10环芳基、C5-C9杂环基、取代的C5-C9杂环基、C5-C9杂环芳基、取代的C5-C9杂环芳基、-接头-(C3-C9环烷基)、-接头-(取代的C3-C9环烷基)、-接头-(C5-C10芳基)、-接头-(取代的C5-C10芳基)、-接头-(C5-C10环芳基)、-接头-(取代的C5-C10环芳基)、-接头-(C5-C9杂环基)、-接头-(取代的C5-C9杂环基)、-接头-(C5-C9杂环芳基)、-接头-(取代的C5-C9杂环芳基)；
n为0或1；
R4、R5和R6独立选自氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、取代的C1-C10烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6烷氧基羰基、取代的C1-C6烷酰基、取代的C1-C6烷氧基羰基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C10环芳基、取代的C5-C10环芳基、C5-C9杂环基、取代的C5-C9杂环基、C5-C9杂环芳基、取代的C5-C9杂环芳基、-接头-(C3-C9环烷基)、-接头-(取代的C3-C9环烷基)、-接头-(C5-C10芳基)、-接头-(取代的C5-C10芳基)、-接头-(C5-C10环芳基)、-接头-(取代的C5-C10环芳基)、-接头-(C5-C9杂环基)、-接头-(取代的C5-C9杂环基)、-接头-(C5-C9杂环芳基)、接头-(取代的C5-C9杂环芳基)；并且
所述取代的烷基、烷氧基、烷酰基、烷氧基羰基环烷基、芳基、环芳基、杂环基或杂环芳基上的取代基是羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C9环烷基、C5-C9杂环基、C1-6烷氧基C1-6烯基、氨基、氰基、卤素或芳基。
C20.根据实施方案C16到C19中任一项所述的上皮细胞，其中所述一种或多种ALK5抑制剂选自A83-01、GW788388、RepSox和SB 431542。
C21.根据实施方案C20所述的上皮细胞，其中所述一种或多种ALK5抑制剂包括A83-01。
C22.根据实施方案C16到C21中任一项所述的上皮细胞，其中所述一种或多种ALK5抑制剂结合到ALK5或一种或多种ALK5配体或这两者。
C23.根据实施方案C16到C22中任一项所述的上皮细胞，其中所述一种或多种ALK5抑制剂破坏一种或多种ALK5-配体相互作用。
C24.根据实施方案C16到C23中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法包括活化所述上皮细胞中的端粒酶和/或调节所述上皮细胞中的细胞骨架结构。
C25.根据实施方案C1到C24中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法进一步包括在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中Rho激酶和/或Rho相关蛋白质激酶的所述活性。
C26.根据实施方案C25所述的上皮细胞，其中Rho激酶和/或Rho相关蛋白质激酶选自Rho激酶1(ROCK 1)和Rho激酶2(ROCK 2)。
C27.根据实施方案C25或C26所述的上皮细胞，其中抑制Rho激酶和/或Rho相关蛋白质激酶的所述活性包括使用一种或多种Rho激酶抑制剂和/或一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂。
C28.根据实施方案C27所述的上皮细胞，其中所述一种或多种Rho激酶抑制剂和/或所述一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂包括一种或多种小分子Rho激酶抑制剂。
C29.根据实施方案C28根据的上皮细胞，其中所述一种或多种Rho激酶抑制剂和/或一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂选自Y-27632、SR 3677、噻唑维文、HA1100盐酸盐、HA1077和GSK-429286。
C30.根据实施方案C29所述的上皮细胞，其中所述一种或多种Rho激酶抑制剂和/或所述一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂包括Y-27632。
C30.1根据实施方案C1到C24中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法不包括在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中Rho激酶和/或Rho相关蛋白质激酶的所述活性。
C31.根据实施方案C1到C30.1中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法进一步包括在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中p21活化的激酶(PAK)的所述活性。
C32.根据实施方案C31所述的上皮细胞，其中所述PAK选自PAK1、PAK2、PAK3和PAK4。
C33.根据实施方案C32所述的上皮细胞，其中所述PAK是PAK1。
C34.根据实施方案C33所述的上皮细胞，其中抑制PAK1的所述活性包括使用一种或多种PAK1抑制剂。
C35.根据实施方案C34所述的上皮细胞，其中所述一种或多种
PAK1抑制剂包括一种或多种小分子PAK1抑制剂。
C36.根据实施方案C35所述的上皮细胞，其中所述一种或多种PAK1抑制剂包括IPA3。
C37.根据实施方案C1到C36中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法进一步包括在(a)中的所述培养期间抑制所述上皮细胞中肌球蛋白II的所述活性。
C37.1根据实施方案C37所述的上皮细胞，其中所述肌球蛋白II是非肌肉肌球蛋白II(NM II)。
C37.2根据实施方案C37或C37.1所述的上皮细胞，其中抑制肌球蛋白II的所述活性包括使用一种或多种肌球蛋白II抑制剂。
C37.3根据实施方案C37.2所述的上皮细胞，其中所述一种或多种肌球蛋白II抑制剂包括一种或多种小分子肌球蛋白II抑制剂。
C37.4根据实施方案C37.2或C37.3所述的上皮细胞，其中所述一种或多种肌球蛋白II抑制剂包括布雷他汀。
C38.根据实施方案C1到C37.4中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法进一步包括在(a)中的所述培养期间增加所述上皮细胞中的细胞内环腺苷单磷酸(cAMP)水平。
C39.根据实施方案C38所述的上皮细胞，其中增加细胞内环腺苷单磷酸(cAMP)水平包括使用一种或多种β-肾上腺素能激动剂和/或一种或多种β-肾上腺素能受体激动剂。
C39.1根据实施方案C39所述的上皮细胞，其中所述一种或多种β-肾上腺素能激动剂和/或所述一种或多种β-肾上腺素能受体激动剂包括异丙肾上腺素。
C40.根据实施方案C1到C40中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞是在(a)之前从受试者中获得的。
C40.1根据实施方案C40所述的上皮细胞，其中所述受试者是哺乳动物。
C40.2根据实施方案C40所述的上皮细胞，其中所述受试者是人。
C40.3根据实施方案C40到C40.2中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞来自受试者的组织。
C40.4根据实施方案C40.3所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞来自受试者的分化组织。
C40.5根据实施方案C40到C40.2中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞来自受试者的循环细胞。
C41.根据实施方案C40到C40.5中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞包括来自受试者的原代细胞。
C42.根据实施方案C40到C40.5中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞不包括来自受试者的原代细胞。
C43.根据实施方案C40到C42中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞包括来自受试者的肿瘤细胞。
C44.根据实施方案C41到C43中任一项所述的上皮细胞，其中来自受试者的所述上皮细胞选自鳞状细胞、柱状细胞、腺瘤细胞和移行上皮细胞。
C44.1根据实施方案C41到C43中任一项所述的上皮细胞，其中来自受试者的所述上皮细胞包括鳞状细胞、柱状细胞、腺瘤细胞和移行上皮细胞中的一种或多种。
C45.根据实施方案C41到C44.1中任一项所述的上皮细胞，其中来自受试者的所述上皮细胞包括角质形成细胞上皮细胞。
C45.1根据实施方案C45所述的上皮细胞，其中所述角质形成细胞上皮细胞选自真皮角质形成细胞、眼上皮细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、食道上皮细胞和子宫颈上皮细胞。
C46.根据实施方案C41到C44中任一项所述的上皮细胞，其中来自受试者的所述上皮细胞包括非角质形成细胞上皮细胞。
C47.根据实施方案C46所述的上皮细胞，其中所述非角质形成细胞上皮细胞包括腺上皮细胞。
C48.根据实施方案C46或C47所述的上皮细胞，其中所述非角质形成细胞上皮细胞选自前列腺细胞、乳腺细胞、肝细胞、肝上皮细胞、胆道上皮细胞、胆囊细胞、胰岛细胞、胰腺β细胞、胰腺导管上皮细胞、肺上皮细胞、气道上皮细胞、鼻上皮细胞、肾细胞、膀胱细胞、尿道上皮细胞、胃上皮细胞、大肠上皮细胞、小肠上皮细胞、睾丸上皮细胞、卵巢上皮细胞、输卵管上皮细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞、垂体细胞、腺细胞、羊膜上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、汗腺上皮细胞、皮脂上皮细胞和毛囊细胞。
C48.1根据实施方案C1到C48中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞包括基底上皮细胞。
C48.2根据实施方案C1到C48中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞不是肠上皮细胞。
C49.根据实施方案C1到C48.2中任一项所述的上皮细胞，其中(a)中的所述培养在无血清培养基存在下进行。
C49.1根据实施方案C49所述的上皮细胞，其中所述无血清培养基是成分确定的无血清培养基。
C49.2根据实施方案C49所述的上皮细胞，其中所述无血清培养基是无异源物的无血清培养基。
C49.3根据实施方案C49所述的上皮细胞，其中所述无血清培养基是成分确定的无异源物的无血清培养基。
C50.根据实施方案C49到C49.3中任一项所述的上皮细胞，其中所述无血清培养基包含钙。
C51.根据实施方案C50所述的上皮细胞，其中所述无血清培养基包含浓度低于1mM的钙。
C52.根据实施方案C50所述的上皮细胞，其中所述无血清培养基包含浓度低于500μM的钙。
C53.根据实施方案C50所述的上皮细胞，其中所述无血清培养基包含浓度低于100μM的钙。
C53.1根据实施方案C53所述的上皮细胞，其中所述无血清培养基包含浓度低于约90μM的钙。
C54.根据实施方案C50所述的上皮细胞，其中所述无血清培养基包含浓度低于20μM的钙。
C54.1根据实施方案C49到C54中任一项所述的上皮细胞，其中所述无血清培养基包含缓冲液以及无机酸、盐、碱性硅酸盐、氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶、聚胺、α-酮酸、有机硫化合物和葡萄糖中的一种或多种。
C54.2根据实施方案C54.1所述的上皮细胞，其中所述一种或多种盐选自氯化钠、氯化钾、乙酸钠和磷酸钠。
C54.3根据实施方案C54.1或C54.2所述的上皮细胞，其中所述一种或多种氨基酸选自精氨酸和谷氨酰胺。
C54.4根据实施方案C54.1到C54.3中任一项所述的上皮细胞，其中所述缓冲液为HEPES缓冲液。
C54.5根据实施方案C49到C54.4中任一项所述的上皮细胞，其中所述无血清培养基包含白蛋白。
C54.6根据实施方案C54.5所述的上皮细胞，其中所述白蛋白选自牛血清白蛋白和重组人血清白蛋白。
C54.7根据实施方案C49到C54.6中任一项所述的上皮细胞，其中所述无血清培养基包含一种或多种脂质。
C54.8根据实施方案C54.7所述的上皮细胞，其中所述一种或多种脂质选自花生四烯酸、胆固醇、DL-α-生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸、普流尼克F-68、硬脂酸和聚山梨糖醇酯80。
C54.9根据实施方案C54.8所述的上皮细胞，其中所述一种或多种脂质选自亚油酸、亚麻酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸。
C55.根据实施方案C1到C54中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法包括使用一种或多种促有丝分裂生长因子。
C56.根据实施方案C55所述的上皮细胞，其中所述一种或多种促有丝分裂生长因子包括EGF。
C56.1根据实施方案C55所述的上皮细胞，其中所述一种或多种促有丝分裂生长因子包括FGF。
C56.2根据实施方案C55所述的上皮细胞，其中所述一种或多种促有丝分裂生长因子包括EGF和FGF。
C56.3根据实施方案C56.1或C56.2所述的上皮细胞，其中所述FGF包括酸性FGF。
C57.根据实施方案C1到C54.9中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法不包括使用促有丝分裂生长因子。
C58.根据实施方案C1到C57中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法包括使用一种或多种促有丝分裂的补充剂。
C59.根据实施方案C58所述的上皮细胞，其中所述一种或多种促有丝分裂的补充剂包括牛垂体提取物(BPE)。
C59.1根据实施方案C1到C57中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法不包括使用促有丝分裂的补充剂。
C60.根据实施方案C1到C59.1中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法不包括使用Wnt激动剂或β-连环蛋白激动剂。
C60.1根据实施方案C1到C60中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法不包括使用选自以下的组分中的一种或多种：头蛋白、R-脊椎蛋白、Wnt-3a、EGF、烟酰胺、FGF10、胃泌素、p38抑制剂、SB202190、DHT、notch抑制剂、γ分泌酶抑制剂、DBZ和DAPT。
C61.根据实施方案C1到C60.1中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法不包括使用细胞外基质。
C62.根据实施方案C1到C60.1中任一项所述的上皮细胞，其中(a)中的所述培养在包含涂层的容器中进行。
C63.根据实施方案C62所述的上皮细胞，其中所述涂层包含胶原蛋白。
C64.根据实施方案C62所述的上皮细胞，其中所述涂层包含基底膜基质。
C65.根据实施方案C1到C64中任一项所述的上皮细胞，其中(a)中的所述培养包括扩增所述上皮细胞。
C66.根据实施方案C65所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被扩增至少约2倍。
C67.根据实施方案C65所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被扩增至少约5倍。
C68.根据实施方案C65所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被扩增至少约10倍。
C69.根据实施方案C65所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被扩增至少约15倍。
C70.根据实施方案C65所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被扩增至少约20倍。
C70.1根据实施方案A65所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被扩增至少约100倍。
C70.2根据实施方案A65所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被扩增至少约1,000倍。
C70.3根据实施方案A65所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被扩增至少约10,000倍。
C70.4根据实施方案A65所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被扩增至少约100,000倍。
C70.5根据实施方案A65所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被扩增至少约1百万倍。
C70.6根据实施方案A65所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被扩增至少约10亿倍。
C70.7根据实施方案A65所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被扩增至少约1兆倍。
C71.根据实施方案C65到C70.7中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被培养约4天。
C72.根据实施方案C65到C70.7中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被培养约5天。
C73.根据实施方案C1到C72中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞被连续增殖。
C74.根据实施方案C1到C73中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法包括将所述上皮细胞传代至少15次。
C75.根据实施方案C1到C73中任一项所述的上皮细胞，其中所述方法包括将所述上皮细胞传代至少25次。
C76.根据实施方案C1到C75中任一项所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞的群体在一段时间内倍增。
C77.根据实施方案C76所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞群体倍增至少20次。
C78.根据实施方案C76所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞群体倍增至少50次。
C78.1根据实施方案C76所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞群体倍增至少80次。
C79.根据实施方案C76所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞群体倍增至少100次。
C80.根据实施方案C76所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞群体倍增至少120次。
C81.根据实施方案C76所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞群体倍增至少150次。
C82.根据实施方案C76所述的上皮细胞，其中所述上皮细胞群体倍增至少200次。
C83.根据实施方案C76到C82中任一项所述的上皮细胞，其中所述时间段为约50天。
C84.根据实施方案C76到C82中任一项所述的上皮细胞，其中所述时间段为约100天。
C85.根据实施方案C76到C82中任一项所述的上皮细胞，其中所述时间段为约150天。
C86.根据实施方案C76到C82中任一项所述的上皮细胞，其中所述时间段为约200天。
C87.根据实施方案C1到C86中任一项所述的上皮细胞，所述细胞在(b)期间维持一种或多种天然功能特征。
C88.根据实施方案C1到C86中任一项所述的上皮细胞，所述细胞在(b)期间不维持一种或多种天然功能特征。
C89.根据实施方案C1到C88中任一项所述的上皮细胞，所述细胞在(b)之后被置于其中不抑制TGF-β信号传导的细胞培养环境中。
C90.根据实施方案C89所述的上皮细胞，所述细胞在被置于其中不抑制TGF-β信号传导的所述细胞培养环境中后，维持或重新获得一种或多种天然功能特征。
C91.根据实施方案C1到C90中任一项所述的上皮细胞，所述细胞可被诱导以分化为多种组织类型。
C91.1根据实施方案C1到C90中任一项所述的上皮细胞，所述细胞未获得分化为多种组织类型的能力。
C92.根据实施方案C1到C91.1中任一项所述的上皮细胞，所述细胞未获得形成类器官的能力。
C93.根据实施方案C1到C92中任一项所述的上皮细胞，所述细胞不是来源于胚胎干细胞。
C93.1根据实施方案C1到C93中任一项所述的上皮细胞，所述细胞不是来源于连续增殖的上皮干细胞。
C93.2根据实施方案C1到C93.1中任一项所述的上皮细胞，所述细胞来源于包含静止上皮细胞的上皮组织。
C93.3根据实施方案C1到C93.2中任一项所述的上皮细胞，所述方法不包括选择连续增殖的上皮干细胞。
C93.4根据实施方案C1到C93.3中任一项所述的上皮细胞，所述方法不包括选择肠隐窝细胞。
C93.5根据实施方案C1到C93.4中任一项所述的上皮细胞，所述方法不包括选择LGR5+细胞。
C94.根据实施方案C40到C93.5中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体不包括连续增殖的上皮干细胞或来源于连续增殖的上皮干细胞的细胞。
C94.1根据实施方案C40到C94中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体不包括多能干细胞或来源于细胞干细胞的细胞。
C94.2根据实施方案C40到C94.1中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体不包括终末分化的上皮细胞。
C94.3根据实施方案C40到C94.2中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体不包括胃上皮细胞、肠上皮细胞和/或胰腺上皮细胞。
C94.4根据实施方案C40到C94.3中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体不包括肠隐窝细胞。
C94.5根据实施方案C40到C94.4中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体不包括LGR5+细胞。
C95.根据实施方案C40到C94.5中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体是上皮细胞的同源群体。
C95.1根据实施方案C40到C95中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体是基底上皮细胞的同源群体。
C95.2根据实施方案C40到C94.5中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体是上皮细胞的异源群体。
C96.根据实施方案C40到C95.2中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体比终末分化的细胞的分化程度低，并且比胚胎干细胞或成体干细胞的分化程度高。
C97.根据实施方案C40到C96中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体表达一种或多种基底上皮细胞标志物。
C98.根据实施方案C40到C97中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体表达ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5和TP63中的一种或多种。
C99.根据实施方案C40到C98中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体不表达一种或多种上皮干细胞标志物。
C100.根据实施方案C40到C99中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体不表达Lgr5.。
C101.根据实施方案C40到C100中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体不表达一种或多种多能干细胞标志物。
C102.根据实施方案C40到C101中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体不表达LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4和SOX2中的一种或多种。
C103.根据实施方案C40到C102中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体不表达一种或多种终末分化的上皮细胞标志物。
C104.根据实施方案C40到C103中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体不表达CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPB和SFTPD中的一种或多种。
C105.根据实施方案C40到C104中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离体增殖的细胞群体不表达一种或多种胃上皮细胞标志物、一种或多种肠上皮细胞标志物和/或一种或多种胰腺上皮细胞标志物。
C106.根据实施方案C40到C105中任一项所述的上皮细胞，其中从受试者获得的所述细胞和/或所述离外增殖的细胞群体不表达CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1和PROM1/CD133中的一种或多种。
C107.根据实施方案C1到C106中任一项所述的上皮细胞用于产生遗传修饰的细胞的用途。
C108.根据实施方案C1到C106中任一项所述的上皮细胞用于鉴别用于受试者的一种或多种候选治疗的用途。
C109.根据实施方案C1到C106中任一项所述的上皮细胞用于鉴别受试者中的一种或多种异常上皮细胞的用途。
C110.根据实施方案C1到C106中任一项所述的上皮细胞用于监测受试者中的疾病进展或疾病治疗的用途。
D1.一种细胞培养组合物，其包含成分确定的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂和Rho激酶抑制剂或Rho相关蛋白质激酶抑制剂。
D2.一种细胞培养组合物，其由成分确定的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂和Rho激酶抑制剂或Rho相关蛋白质激酶抑制剂组成。
D3.一种细胞培养组合物，其包含成分确定的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂、Rho激酶抑制剂或Rho相关蛋白质激酶抑制剂和β肾上腺素能激动剂或β肾上腺素能受体激动剂。
D4.一种细胞培养组合物，其由成分确定的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂、Rho激酶抑制剂或Rho相关蛋白质激酶抑制剂和β肾上腺素能激动剂或β肾上腺素能受体激动剂组成。
D5.一种细胞培养组合物，其包含无异源物的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂和Rho激酶抑制剂或Rho相关蛋白质激酶抑制剂。
D6.一种细胞培养组合物，其由无异源物的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂和Rho激酶抑制剂或Rho相关蛋白质激酶抑制剂组成。
D7.一种细胞培养组合物，其包含无异源物的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂、Rho激酶抑制剂或Rho相关蛋白质激酶抑制剂和β肾上腺素能激动剂或β肾上腺素能受体激动剂。
D8.一种细胞培养组合物，其由无异源物的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂、Rho激酶抑制剂或Rho相关蛋白质激酶抑制剂和β肾上腺素能激动剂或β肾上腺素能受体激动剂组成。
D9.一种细胞培养组合物，其包含成分确定的无异源物的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂和Rho激酶抑制剂或Rho相关蛋白质激酶抑制剂。
D10.一种细胞培养组合物，其由成分确定的无异源物的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂和Rho激酶抑制剂或Rho相关蛋白质激酶抑制剂组成。
D11.一种细胞培养组合物，其包含成分确定的无异源物的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂、Rho激酶抑制剂或Rho相关蛋白质激酶抑制剂和β肾上腺素能激动剂或β肾上腺素能受体激动剂。
D12.一种细胞培养组合物，其由成分确定的无异源物的无血清细胞培养基、脂质混合物、EGF、FGF、白蛋白、TGF-β抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂、Rho激酶抑制剂或Rho相关蛋白质激酶抑制剂和β肾上腺素能激动剂或β肾上腺素能受体激动剂组成。
E1.一种用于离体增殖上皮细胞的方法，其包括：
在无饲养层细胞的扩增培养条件下扩增来源于分化组织的原始上皮细胞群体中的细胞数，由此产生扩增的上皮细胞群体，其中：
所述扩增培养条件包括活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂；
当在所述扩增培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行25次或更多次群体倍增；并且
当在不包含所述试剂的对照培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行不超过20次群体倍增。
E1.1一种用于离体增殖上皮细胞的方法，其包括：
在无血清且无饲养层细胞的条件下扩增来源于分化组织的原始上皮细胞群体中的细胞数，由此产生扩增的上皮细胞群体，其中：
所述扩增培养条件包括活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂；并且
所述原始上皮细胞群体包括静止和/或原来静止的上皮细胞。
E1.2根据实施方案E1所述的方法，其中：
活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂是第一试剂，
所述扩增培养条件进一步包括调节所述群体中的细胞骨架结构的第二试剂，并且
所述对照培养条件不包括所述第一试剂和所述第二试剂。
E1.3根据实施方案E1.1所述的方法，其中所述扩增培养条件进一步包括调节所述群体中细胞骨架结构的试剂。
E2.根据实施方案E1到E1.3中任一项所述的方法，其包括从所述分化组织中分离所述原始上皮细胞群体。
E3.根据实施方案E1到E2中任一项所述的方法，其包括在从所述分化组织分离所述原始上皮细胞群体的细胞之后并且在使所述原始上皮细胞群体与所述无饲养层细胞的扩增培养条件接触之前，在细胞培养中维持或增殖所述细胞。
E4.根据实施方案E1到E3中任一项所述的方法，其中所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体不含有胚胎干细胞。
E5.根据实施方案E1到E4中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
表达一种或多种基底上皮细胞标志物。
E6.根据实施方案E1到E5中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
表达ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5和TP63中的一个或多个。
E7.根据实施方案E1到E6中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达一种或多种上皮干细胞标志物。
E8.根据实施方案E1到E7中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达Lgr5。
E9.根据实施方案E1到E8中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达一种或多种多能干细胞标志物。
E10.根据实施方案E1到E9中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4和SOX2中的一个或多个。
E11.根据实施方案E1到E10中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达一种或多种终末分化的上皮细胞标志物。
E12.根据实施方案E1到E11中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPB和SFTPD中的一个或多个。
E13.根据实施方案E1到E12中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达一种或多种胃上皮细胞标志物、一种或多种肠上皮细胞标志物和/或一种或多种胰腺上皮细胞标志物。
E14.根据实施方案E1到E13中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1和PROM1/CD133中的一个或多个。
E15.根据实施方案E1到E14中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
包括静止和/或原来静止的上皮细胞。
E16.根据实施方案E1到E15中任一项所述的方法，其中活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制转化生长因子β(TGF-β)信号传导的所述试剂包括一种或多种TGF-β信号传导抑制剂。
E17.根据实施方案E16所述的方法，其中所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂包括一种或多种ALK5抑制剂。
E18.根据实施方案E17所述的方法，其中所述一种或多种ALK5抑制剂包括一种或多种小分子ALK5抑制剂。
E19.根据实施方案E17所述的方法，其中所述一种或多种ALK5抑制剂选自A83-01、GW788388、RepSox和SB 431542。
E20.根据实施方案E1到E19中任一项所述的方法，其中所述调节细胞骨架结构的试剂包括Rho相关蛋白质激酶抑制剂、p21活化激酶(PAK)抑制剂和肌球蛋白II抑制剂中的一种或多种。
E21.根据实施方案E20所述的方法，其中所述Rho激酶抑制剂选自Rho相关蛋白质激酶1(ROCK1)抑制剂和Rho相关蛋白质激酶2(ROCK 2)抑制剂。
E22.根据实施方案E20或E21所述的方法，其中所述Rho相关蛋白质激酶抑制剂包括一种或多种小分子Rho相关蛋白质激酶抑制剂。
E23.根据实施方案E22所述的方法，其中所述一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂选自Y-27632、SR 3677、噻唑维文、HA1100盐酸盐、HA1077和GSK-429286。
E24.根据实施方案E20到E23中任一项所述的方法，其中所述p21活化激酶(PAK)抑制剂选自PAK1抑制剂、PAK2抑制剂、PAK3抑制剂和PAK4抑制剂。
E25.根据实施方案E24所述的方法，其中所述p21活化激酶(PAK)抑制剂包括一种或多种小分子PAK1抑制剂。
E26.根据实施方案E25所述的方法，其中所述一种或多种小分子PAK1抑制剂包括IPA3。
E27.根据实施方案E20到E26中任一项所述的方法，其中所述肌球蛋白II抑制剂包括一种或多种非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂。
E28.根据实施方案E27所述的方法，其中所述一种或多种非肌肉肌球蛋白II(NMII)抑制剂包括一种或多种小分子非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂。
E29.根据实施方案E28所述的方法，其中所述一种或多种小分子非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂包括布雷他汀。
E30.根据实施方案E1到E29中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件还进一步包括增加所述群体中细胞内环腺苷单磷酸(cAMP)水平的试剂。
E31.根据实施方案E30所述的方法，其中所述增加细胞内环腺苷单磷酸(cAMP)水平的试剂包含一种或多种β-肾上腺素能受体激动剂。
E32.根据实施方案E31所述的方法，其中所述一种或多种β-肾上腺素能受体激动剂包括异丙肾上腺素。
E33.根据实施方案E1到E32中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件是无血清培养条件。
E34.根据实施方案E1到E33中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件是成分确定的无血清培养条件。
E35.根据实施方案E1到E34中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件是无异源物的培养条件。
E36.根据实施方案E1到E35中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件是成分确定的无异源物的培养条件。
E37.根据实施方案E1到E36中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件包括浓度低于100μM的钙。
E38.根据实施方案E37所述的方法，其中所述钙以约90μM的浓度存在。
E39.根据实施方案E1到E38中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件包括一种或多种促有丝分裂生长因子。
E40.根据实施方案E39所述的方法，其中一种或多种促有丝分裂生长因子包括EGF、FGF或EGF和FGF。
E41.根据实施方案E1到E40中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件不包括细胞外基质。
E42.根据实施方案E1到E41中任一项所述的方法，其中当在所述扩增培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行30次或更多次群体倍增。
E43.根据实施方案E1到E41中任一项所述的方法，其中当在所述扩增培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行50次或更多次群体倍增。
E44.根据实施方案E1到E41中任一项所述的方法，其中当在所述扩增培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行80次或更多次群体倍增。
E45.根据实施方案E1到E41中任一项所述的方法，其中当在所述扩增培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行100次或更多次群体倍增。
E46.根据实施方案E1到E45中任一项所述的方法，其中所述方法不包括在所述原始上皮细胞群体中选择连续增殖的上皮干细胞。
E47.根据实施方案E1到E45中任一项所述的方法，其中所述原始上皮细胞群体不包括连续增殖的上皮干细胞。
E48.根据实施方案E1到E47中任一项所述的方法，其进一步包括分离离体扩增的上皮细胞群体。
E49.根据实施方案E1到E48中任一项所述的方法，其进一步包括在细胞库中储存离体扩增的上皮细胞群体。
E50.一种离体扩增的上皮细胞群体，其通过根据实施方案E1到E49中任一项所述的方法产生。
E51.根据实施方案E50所述的离体扩增的上皮细胞群体用于产生遗传修饰的细胞的用途。
E52.根据实施方案E50所述的离体扩增的上皮细胞群体用于鉴别用于受试者的一种或多种候选治疗的用途。
E53.根据实施方案E50所述的离体扩增的上皮细胞群体用于鉴别受试者中的一种或多种异常上皮细胞的用途。
E54.根据实施方案E50所述的离体扩增的上皮细胞群体用于监测受试者中的疾病进展或疾病治疗的用途。
***
本文引用的每个专利、专利申请、出版物和文献的全部内容在此以引用方式并入。以上专利、专利申请、出版物和文件的引用不是承认任何前述内容是相关的现有技术，它也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。他们的引用并非指示搜索相关公开。所有关于文件的日期或内容的声明都是基于可获得的信息，而并非对它们的准确性或正确性的承认。
可在不脱离所述技术的基本方面的情况下对上文进行修改。尽管已参考一个或多个具体实施方案详细描述了所述技术，但本领域普通技术人员将认识到可对本申请中具体公开的实施方案作出改变，但这些修改和改进在所述技术的范围和精神内。
本文说明性地描述的技术适当地可在不存在本文未具体公开的任何要素的情况下实施。因此，例如，在本文中的每种情况下，术语“包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任一个均可用其他两个术语中的任一个替代。已采用的术语和表达被用作描述而非限制的术语，并且使用此类术语和表达并不排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同物，并且在所要求保护的技术的范围内进行各种修改是可能的。除非上下文中明显描述一个所述要素或超过一个所述要素，否则术语“一(a或an)”可指其修饰的一个或多个要素(例如，“试剂”可意指一种或多种试剂)。如本文所用的术语“约”是指基础参数的10％内(即，加或减10％)的值，并且在值串的开头使用术语“约”修饰每个值(即，“约1、2和3”是指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量可包括90克到110克的重量。此外，当本文描述值的列表(例如，约50％、60％、70％、80％、85％或86％)时，该列表包括其所有中间值和分数值(例如，54％、85.4％)。因此，应当理解，尽管已通过代表性实施方案和任选特征具体地公开了本技术，但本领域技术人员可采用本文所公开的构思的修改和变更，并且认为此类修改和变更在本技术的范围内。
本技术的某些实施方案陈述在所附权利要求书中。

Claims (67)

1.一种用于离体增殖上皮细胞的方法，其包括：
在无饲养层细胞的扩增培养条件下扩增来源于分化组织、胚胎干(ES)细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)的原始上皮细胞群体中的细胞数，由此产生扩增的上皮细胞群体，其中：
所述扩增培养条件包括活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂；
当在所述扩增培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行25次或更多次群体倍增；并且
当在不包含所述试剂的对照培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行不超过20次群体倍增。
2.一种用于离体增殖上皮细胞的方法，其包括：
在无血清且无饲养层细胞的条件下扩增原始上皮细胞群体中的细胞数，由此产生扩增的上皮细胞群体，其中：
所述扩增培养条件包括活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂；并且
所述原始上皮细胞群体包括分化的上皮细胞。
3.一种用于离体增殖上皮细胞的方法，其包括：
在无血清且无饲养层细胞的条件下扩增原始上皮细胞群体中的细胞数，由此产生扩增的上皮细胞群体，其中：
所述扩增培养条件包括活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂；并且
所述原始上皮细胞群体包括静止的上皮细胞和/或原来静止的上皮细胞。
4.一种用于离体增殖上皮细胞的方法，其包括：
在无血清且无饲养层细胞的条件下扩增原始上皮细胞群体中的细胞数，由此产生扩增的上皮细胞群体，其中：
所述扩增培养条件包括活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂；并且
所述原始上皮细胞群体包括谱系定型的上皮细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中：
活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制所述群体中的转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂是第一试剂，
所述扩增培养条件进一步包括调节所述群体中的细胞骨架结构的第二试剂，并且
所述对照培养条件不包括所述第一试剂和所述第二试剂。
6.根据权利要求2、3或4所述的方法，其中所述扩增培养条件进一步包括调节所述群体中细胞骨架结构的试剂。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其包括分离所述原始上皮细胞群体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中从分化组织中分离所述原始上皮细胞群体。
9.根据权利要求7所述的方法，其中从胚胎分离所述原始上皮细胞群体或从来源于胚胎的干细胞培养物中分离所述原始上皮细胞群体。
10.根据权利要求7所述的方法，其中从诱导的多能干细胞(iPSC)培养物中分离所述原始上皮细胞群体。
11.根据权利要求7所述的方法，其中从来自受试者的样品中分离所述原始上皮细胞群体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述样品选自组织活检标本、血液、尿液、排泄物、颊拭子和羊水中的一种或多种。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其包括在分离所述原始上皮细胞群体的细胞之后并且在使所述原始上皮细胞群体接触所述无饲养层细胞的扩增培养条件之前，在细胞培养中维持或增殖所述原始上皮细胞群体的细胞。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的方法，其中所述原始上皮细胞群体和/或所述扩增的上皮细胞群体不含有胚胎干细胞。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
表达一种或多种基底上皮细胞标志物。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
表达ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5和TP63中的一个或多个。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达一种或多种上皮干细胞标志物。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达Lgr5。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达一种或多种多能干细胞标志物。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4和SOX2中的一个或多个。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达一种或多种终末分化的上皮细胞标志物。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPB和SFTPD中的一个或多个。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达一种或多种胃上皮细胞标志物、一种或多种肠上皮细胞标志物和/或一种或多种胰腺上皮细胞标志物。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
不表达CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1和PROM1/CD133中的一个或多个。
25.根据权利要求1到24中任一项所述的方法，其中：
所述原始上皮细胞群体，或
所述扩增的上皮细胞群体，或
所述原始上皮细胞群体和所述扩增的上皮细胞群体，
包括静止的上皮细胞和/或原来静止的上皮细胞。
26.根据权利要求1到25中任一项所述的方法，其中所述活化所述群体中的端粒酶逆转录酶和/或抑制转化生长因子β(TGF-β)信号传导的试剂包括一种或多种TGF-β信号传导抑制剂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述一种或多种TGF-β信号传导抑制剂包括一种或多种ALK5抑制剂。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述一种或多种ALK5抑制剂包括一种或多种小分子ALK5抑制剂。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述一种或多种ALK5抑制剂包括一种或多种ATP类似物。
30.根据权利要求27到29中任一项所述的方法，其中所述一种或多种ALK5抑制剂中的至少一种包含式A的结构：
其中：
X、Y和Z独立地选自N、C和O；
R1、R2和R3独立地选自氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C10环芳基、取代的C5-C10环芳基、C5-C9杂环基、取代的C5-C9杂环基、C5-C9杂环芳基、取代的C5-C9杂环芳基、-接头-(C3-C9环烷基)、-接头-(取代的C3-C9环烷基)、-接头-(C5-C10芳基)、-接头-(取代的C5-C10芳基)、-接头-(C5-C10环芳基)、-接头-(取代的C5-C10环芳基)、-接头-(C5-C9杂环基)、-接头-(取代的C5-C9杂环基)、-接头-(C5-C9杂环芳基)、-接头-(取代的C5-C9杂环芳基)；
n为0或1；
R4、R5和R6独立选自氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、取代的C1-C10烷氧基、C1-C6烷酰基、C1-C6烷氧基羰基、取代的C1-C6烷酰基、取代的C1-C6烷氧基羰基、C3-C9环烷基、取代的C3-C9环烷基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C10环芳基、取代的C5-C10环芳基、C5-C9杂环基、取代的C5-C9杂环基、C5-C9杂环芳基、取代的C5-C9杂环芳基、-接头-(C3-C9环烷基)、-接头-(取代的C3-C9环烷基)、-接头-(C5-C10芳基)、-接头-(取代的C5-C10芳基)、-接头-(C5-C10环芳基)、-接头-(取代的C5-C10环芳基)、-接头-(C5-C9杂环基)、-接头-(取代的C5-C9杂环基)、-接头-(C5-C9杂环芳基)、接头-(取代的C5-C9杂环芳基)；并且
所述取代的烷基、烷氧基、烷酰基、烷氧基羰基、环烷基、芳基、环芳基、杂环基或杂环芳基上的取代基是羟基、C1-C10烷基、羟基C1-C10亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C9环烷基、C5-C9杂环基、C1-6烷氧基C1-6烯基、氨基、氰基、卤素或芳基。
31.根据权利要求27到30中任一项所述的方法、其中所述一种或多种ALK5抑制剂选自A83-01、GW788388、RepSox和SB 431542。
32.根据权利要求1到31中任一项所述的方法，其中所述调节细胞骨架结构的试剂包括Rho相关蛋白质激酶抑制剂、p21活化激酶(PAK)抑制剂和肌球蛋白II抑制剂中的一种或多种。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述Rho激酶抑制剂选自Rho相关蛋白质激酶1(ROCK1)抑制剂和Rho相关蛋白质激酶2(ROCK 2)抑制剂。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述Rho相关蛋白质激酶抑制剂包括一种或多种小分子Rho相关蛋白质激酶抑制剂。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述一种或多种Rho相关蛋白质激酶抑制剂选自Y-27632、SR 3677、噻唑维文、HA1100盐酸盐、HA1077和GSK-429286。
36.根据权利要求32到35中任一项所述的方法，其中所述p21活化激酶(PAK)抑制剂选自PAK1抑制剂、PAK2抑制剂、PAK3抑制剂和PAK4抑制剂。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述p21活化激酶(PAK)抑制剂包括一种或多种小分子PAK1抑制剂。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述一种或多种小分子PAK1抑制剂包括IPA3。
39.根据权利要求32到38中任一项所述的方法，其中所述肌球蛋白II抑制剂包括一种或多种非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述一种或多种非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂包括一种或多种小分子非肌肉肌球蛋白II(NM II)抑制剂。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述一种或多种小分子非肌肉肌球蛋白II(NMII)抑制剂包括布雷他汀。
42.根据权利要求1到41中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件进一步包括增加所述群体中细胞内环腺苷单磷酸(cAMP)水平的试剂。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述增加细胞内环腺苷单磷酸(cAMP)水平的试剂包含一种或多种β-肾上腺素能受体激动剂。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种β-肾上腺素能受体激动剂包括异丙肾上腺素。
45.根据权利要求1到44中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件是无血清培养条件。
46.根据权利要求1到45中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件是成分确定的无血清培养条件。
47.根据权利要求1到46中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件是无异源物的培养条件。
48.根据权利要求1到47中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件是成分确定的无异源物的培养条件。
49.根据权利要求1到48中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件包括浓度低于300μM的钙。
50.根据权利要求1到48中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件包括浓度低于100μM的钙。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述钙以约90μM的浓度存在。
52.根据权利要求1到51中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件包括一种或多种促有丝分裂生长因子。
53.根据权利要求52所述的方法，其中一种或多种促有丝分裂生长因子包括EGF、FGF或EGF和FGF。
54.根据权利要求1到53中任一项所述的方法，其中所述扩增培养条件不包括包含异源组分的细胞外基质。
55.根据权利要求1到54中任一项所述的方法，其中当在所述扩增培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行30次或更多次群体倍增。
56.根据权利要求1到54中任一项所述的方法，其中当在所述扩增培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行50次或更多次群体倍增。
57.根据权利要求1到54中任一项所述的方法，其中当在所述扩增培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行80次或更多次群体倍增。
58.根据权利要求1到54中任一项所述的方法，其中当在所述扩增培养条件下培养时，所述原始上皮细胞群体能够进行100次或更多次群体倍增。
59.根据权利要求1到58中任一项所述的方法，其中所述方法不包括选择连续增殖的上皮干细胞和/或连续增殖的上皮干细胞的体内群体。
60.根据权利要求1到58中任一项所述的方法，其中所述原始上皮细胞群体不包括连续增殖的上皮干细胞，和/或不包括来源于连续增殖的上皮干细胞的体内群体的细胞。
61.根据权利要求1到60中任一项所述的方法，其进一步包括分离离体扩增的上皮细胞群体。
62.根据权利要求1到61中任一项所述的方法，其进一步包括在细胞库中储存离体扩增的上皮细胞群体。
63.一种离体扩增的上皮细胞群体，其通过根据权利要求1到62中任一项所述的方法产生。
64.根据权利要求63所述的离体扩增的上皮细胞群体用于产生遗传修饰的细胞的用途。
65.根据权利要求63所述的离体扩增的上皮细胞群体用于鉴别针对受试者的一种或多种候选治疗的用途。
66.根据权利要求63所述的离体扩增的上皮细胞群体用于鉴别受试者中的一种或多种异常上皮细胞的用途。
67.根据权利要求63所述的离体扩增的上皮细胞群体用于监测受试者中的疾病进展的用途或用于治疗受试者中疾病的用途。
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