CN107625732B - 一种用于治疗肺肿瘤的功能性载药系统及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗肺肿瘤的功能性载药系统及其制备方法与应用。本发明提供的一种载药系统为载药脂质体，其由靶向脂质体包载药物得到，靶向脂质体由卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑叶酸制备得到；药物为粗毛豚草素和/或表没食子儿茶素没食子酸酯；本发明提供的另一种载药系统为载药微球，其由壳聚糖微球包载药物得到，药物为粗毛豚草素。本发明基于粗毛豚草素和/或表没食子儿茶素没食子酸酯在制备治疗肺肿瘤的药物中的应用，提供了包载粗毛豚草素和/或表没食子儿茶素没食子酸酯的载药脂质体和载药微球。本发明为彻底根治肺肿瘤带来了希望，具有重要的理论意义与临床意义。

Description

一种用于治疗肺肿瘤的功能性载药系统及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种功能性载药系统及其制备方法与应用，具体涉及一种用于治疗肺肿瘤的功能性载药系统及其制备方法与应用，属于肺肿瘤药物研究领域。

背景技术

近年来，肿瘤的发病率和死亡率均在明显上升，肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占80％，每年肺癌死亡的人数约为150万。NSCLC恶性程度比较高，而且容易复发和转移，50％以上的患者一旦被确诊就己经到相对晚期。临床治疗多采用放疗和化疗为主的综合治疗，但效果并不理想。放疗难以根除浸润转移的肺癌细胞，化疗无选择性，使得药物在杀伤癌细胞的同时也对正常细胞造成伤害。因此，寻找更为有效和安全的治疗手段成为当前肺癌研究的一个热点。

肺肿瘤的预后较差，也是由于手术切除后的肿瘤耐受和肿瘤复发所致。大多数肿瘤都是由具有不同增殖潜能和移植成瘤活性不同的细胞群组成。构成肿瘤实体的异质细胞群中存在着部分具有自我更新及分化特性的细胞亚群，即肿瘤干细胞(cancer stemcells，CSCs)。目前临床考察放疗和化疗的敏感性以及手术效果的主要指标之一是肿瘤细胞数量减少或肿瘤体积缩小的程度。但根据肿瘤干细胞(CSCs)理论，这不代表肿瘤干细胞的完全清除，如果治疗后肿瘤干细胞继续增殖，肿瘤就有可能在缓解后复发。所以，如能完全杀灭肿瘤组织中的肿瘤干细胞，则肺肿瘤就有被根治的可能。因此，在肿瘤疾病的靶向治疗中，肿瘤干细胞已经成为备受关注的药物设计与筛选的靶点。

粗毛豚草素(HPDL，Hispidulin)是存在于新疆雪莲中的一种黄酮类化合物，其结构式如式Ⅰ所示，有镇咳和明显的祛痰作用。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是从中国绿茶中提取的一种成份，它是绿茶主要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤作用，其结构式如式Ⅱ所示，

发明内容

本发明的目的是提供用于治疗肺肿瘤的功能性载药系统及其制备方法与应用。

本发明首先提供了粗毛豚草素和/或表没食子儿茶素没食子酸酯在制备治疗肺肿瘤的药物或功能性载药系统中的应用，基于所述应用，本发明还进一步提供了包载粗毛豚草素和/或表没食子儿茶素没食子酸酯的载药脂质体和载药微球。

本发明通过将粗毛豚草素和表没食子儿茶素没食子酸酯包载到靶向脂质体中，提高粗毛豚草素和表没食子儿茶素没食子酸酯抗肿瘤作用的同时，还可增强其对肿瘤细胞及其干细胞的促凋亡作用，为杀死肿瘤细胞及其干细胞提供可能，从而防止治疗后因干细胞残留而引起肿瘤复发。

基于粗毛豚草素和/或表没食子儿茶素没食子酸酯在制备治疗肺肿瘤的药物中的应用，本发明提供了一种载药脂质体，其由靶向脂质体包载药物得到；

所述靶向脂质体由卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FA)制备得到；

所述药物为粗毛豚草素和/或表没食子儿茶素没食子酸酯。

所述靶向脂质体中，各原料的摩尔份数可为：

各原料的摩尔份数为：

所述卵磷脂60～65份；

所述胆固醇5～10份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1～5份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸0.5～5份；

各原料的摩尔份数具体可为1)或2)：

1)

所述卵磷脂60～65份；

所述胆固醇5～10份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸0.5～5份；

2)

所述卵磷脂63.86份；

所述胆固醇9.83份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸0.83份。

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇具体可为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸具体可为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸(DSPE-PEG-FA)。

所述靶向脂质体可通过包括如下步骤的方法制备：所述卵磷脂、所述胆固醇、所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸通过薄膜分散法得到所述靶向脂质体。

所述载药脂质体的药脂比可为1：10～30；

当所述药物为所述粗毛豚草素时，所述药脂比可为1：20；当所述药物为所述表没食子儿茶素没食子酸酯时，所述药脂比可为1：10；当所述药物为所述粗毛豚草素和所述表没食子儿茶素没食子酸酯时，所述药脂比可为1：6.7。

所述药脂比指的是所述药物的质量与所述靶向脂质体中的所述卵磷脂和所述胆固醇的质量之和的比值。

本发明提供的载药脂质体可用于治疗肺肿瘤，具体可为非小细胞肺癌，更优选肺腺癌。

本发明提供的载药脂质体能够抑制肺肿瘤细胞和/或肺肿瘤干细胞增殖、促进肺肿瘤细胞和/或肺肿瘤干细胞凋亡以及增强肺肿瘤细胞和/或肺肿瘤干细胞对药物摄取能力，所述肺肿瘤细胞为肺腺癌细胞，具体可为A549细胞，所述肺肿瘤干细胞可为肺腺癌干细胞，具体可为A549干细胞。

本发明以粗毛豚草素为药物，以叶酸为肺癌靶向功能配体修饰到脂质体表面上，表没食子儿茶素没食子酸酯为肺肿瘤干细胞诱导凋亡剂包载在脂质体内，构建的全新的具有肺癌靶向功能的载药脂质体，能够使药物到达病灶部位，靶向浓集于肺肿瘤诱导肺肿瘤细胞及其干细胞的凋亡，大大提高化疗效果，有效防止肿瘤复发，为彻底根治肺肿瘤带来了希望，具有重要的理论意义与临床意义。

基于粗毛豚草素在制备治疗肺肿瘤的药物中的应用，本发明提供了一种载药微球，由壳聚糖微球包载药物得到；

所述药物为粗毛豚草素。

所述壳聚糖微球可通过现有常规的方法进行制备，如采用乳化交联的方法制备；

水相可采用壳聚糖醋酸溶液，药物粗毛豚草素分散于水中，油相可采用液体石蜡；乳化剂采用Span80和/或Tween80，交联剂采用戊二醛。

本发明将粗毛豚草素包载到壳聚糖微球中，由于微球本身具有一定的靶向性及缓释性，将其制成载药微球，通过控制粒径，实现药物靶向性，控制药物释放速度，降低药物的毒副作用，提高抗肿瘤作用。

所述载药微球的药脂比可为1：10～30；

所述药脂比指的是所述药物的质量与所述壳聚糖微球中的壳聚糖的质量的比值。

本发明提供的载药微球可用于治疗肺肿瘤，具体可为非小细胞肺癌，更优选肺腺癌。

本发明提供的载药微球能够抑制肺肿瘤细胞和/或肺肿瘤干细胞增殖、促进肺肿瘤细胞和/或肺肿瘤干细胞凋亡以及增强肺肿瘤细胞和/或肺肿瘤干细胞对药物摄取能力，所述肺肿瘤细胞为非小细胞肺癌，具体可为A549细胞，所述肺肿瘤干细胞可为肺腺癌干细胞，具体可为A549干细胞。

本发明以粗毛豚草素为药物，以壳聚糖微球为药物载体，构建的全新的具有肺癌靶向功能的载药微球，能够使药物到达病灶部位，靶向浓集于肺肿瘤诱导肺肿瘤细胞及其干细胞的凋亡，大大提高化疗效果，有效防止肿瘤复发，为彻底根治肺肿瘤带来了希望，具有重要的理论意义与临床意义。

附图说明

图1为本发明载药脂质体(FA-HPDL-EGCG-脂质体)的药物释放曲线，其中，图1(A)表示的是HPDL、HPDL+EGCG、HPDL-脂质体、HPDL-EGCG-脂质体和FA-HPDL-EGCG-脂质体中的粗毛豚草素药物释放曲线，图1(B)表示的是EGCG、HPDL+EGCG、HPDL-脂质体、HPDL-EGCG-脂质体和FA-HPDL-EGCG-脂质体中的的EGGC药物释放曲线。

图2为肺腺癌A549细胞(图2(A))及肿瘤干细胞球(图2(B))形态。

图3为肺腺癌A549干细胞鉴定结果，其中图3(A)表示CD133⁺标记空白组，图3(B)表示CD133⁺标记实验组；图3(C)表示ALDH1⁺标记空白组；图3(D)表示ALDH1⁺标记实验组。

图4为不同载药脂质体对肺腺癌A549细胞的抑制作用。

图5为不同载药脂质体对A549细胞的凋亡作用，其中，图5(A)表示游离HPDL对肺腺癌A549的凋亡作用，图5(B)表示游离EGCG对肺腺癌A549的凋亡作用，图5(C)表示HPDL-脂质体对肺腺癌A549的凋亡作用，图5(D)表示EGCG-脂质体对肺腺癌A549的凋亡作用，图5(E)表示游离HPDL+EGCG对肺腺癌A549的凋亡作用，图5(F)表示HPDL-EGCG-脂质体对肺腺癌A549的凋亡作用，图5(G)表示FA-HPDL-EGCG-脂质体对肺腺癌A549的凋亡作用，图5(H)表示空白脂质体对肺腺癌A549的凋亡作用。

图6为激光共聚焦法检测细胞对不同载药脂质体在细胞内的分布行为，其中，图6(A)、图6(B)、图6(C)和图6(D)分别表示的荧光为药物粗毛豚草素、PI、Hoechst33258和前面三种荧光图的叠加。

图7为肺腺癌A549细胞对不同载药脂质体的摄取能力。

图8为本发明载药微球中的药物释放曲线。

图9为载药微球的扫描电镜图。

图10为载药微球对肺腺癌A549细胞的抑制作用。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例所用的试剂和仪器如下：

1、实验试剂和细胞

蛋黄卵磷脂(EPC)购自Germany Lipoid company,ShangHai local agent,China；胆固醇(cholesterol)购自北京双旋微生物培养基制品厂；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)购自日本油脂株式会社(日本NOF公司)；粗毛豚草素购于上海同田生物科技有限公司)EGCG购自成都植标化纯生物技术有限公司；硫酸铵((NH₄)₂SO₄)，分析纯，购自天津市福晨化学试剂厂；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸购于美国NANOCS公司；壳聚糖购于上海蓝季科技发展有限公司；液体石蜡购于天津永晟精细化工有限公司；Span-80购于北京索莱宝科技有限公司；Tween-80购于天津市光复精细化研究所；DMEM高糖培养基、DMEM/F12高糖培养基、0.25％胰酶购于Gibico公司；胎牛血清购自杭州四季青生物科技有限公司；青霉素-链霉素双抗试剂(100×)购于北京索莱宝生物科技有限公司；人基本成纤维细胞生长因子(bFGF)、人表皮生长因子(EGF)购自美国PeproTech公司；B27购自美国Gibco公司；磺酰罗丹明B蛋白(SRB)购自美国Sigma公司。肺腺癌A549细胞购自中国科学院上海细胞所。

2、实验仪器

聚碳酯过滤器(孔径为400、200nm)购自Millipore(Bedford,MA,USA)；Waters e2695高效液相色谱仪(美国waters公司)；UV-2401PC型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；马尔文粒度测定仪(英国马尔文仪器公司)；SartoriusBP211D电子天平(德国赛多利斯集团)；超声波清洗器(天鹏电子新技术北京有限公司)；EYELA-1000S型旋转蒸发仪(日本EYELA东京理化器械株式会社)；真空干燥箱(PZE-6030，真空度<133Pa，上海精宏实验设备有限公司)；扫描电镜(JSM-6490LV，JEOL)；JY92细胞超声破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；恒温振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂)；透析袋(截留分子量8000-12000)；脂质体挤压器(德国赛多利斯集团)；流式细胞仪(美国BD公司)CO2恒温培养箱(Thermo科技有限公司，美国)；酶标免疫测定仪(上海基因科技有限公司)。

实施例1、脂质体的制备

一、空白脂质体的制备

1、空白脂质体的制备

将卵磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000按摩尔比63.86：9.83：1溶解在甲醇中，旋转蒸发除去甲醇，在茄形瓶中35℃、40rpm旋转蒸发成膜，加入250mM硫酸铵10mL，先在水浴中超声5min，然后转移到血清瓶中在JY92型超声波细胞粉碎机中进一步超声(超声工作时间为10s，间歇时间为30s，全程时间为10min，保护温度为35℃)，再使用脂质体挤压器分别过400nm和200nm聚碳脂膜各3次，采用透析法用PBS液(pH＝7.4)更换脂质体外相液，得到空白脂质体。

2、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸修饰的空白脂质体的制备

将卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG-FA按摩尔比63.86：9.83：1：0.83溶解在甲醇中，旋转蒸发除去甲醇，在茄形瓶中35℃、40rpm旋转蒸发成膜，加入250mM硫酸铵10mL，先在水浴中超声5min，然后转移到血清瓶中在JY92型超声波细胞粉碎机中进一步超声(超声工作时间为10s，间歇时间为30s，全程时间为10min，保护温度为35℃)，再使用脂质体挤压器分别过400nm和200nm聚碳脂膜各3次，采用透析法用PBS液(pH＝7.4)更换脂质体外相液，得到靶向空白脂质体。

二、载药脂质体的制备

药脂比＝粗毛豚草素和/或EGCG的质量：脂质体中卵磷脂和胆固醇的质量之和。

将粗毛豚草素以1：20的药脂比与卵磷脂、胆固醇等溶解在甲醇中，操作方法同一中的步骤1，得到载有粗毛豚草素的脂质体(HPDL-脂质体)。将EGCG以1：10的药脂比与卵磷脂、胆固醇等溶解在甲醇和三氯甲烷中，操作方法同一中的步骤1，得到载EGCG的脂质体(EGCG-脂质体)。将EGCG和HPDL以1：6.7的药脂比与卵磷脂、胆固醇等溶解在甲醇和三氯甲烷中，操作方法同一中的步骤1，得到载粗毛豚草素和EGCG的脂质体(HPDL-EGCG-脂质体)。

上述方法得到的粗毛豚草素-EGCG脂质体，按照一中的步骤2得到DSPE-PEG-FA修饰的粗毛豚草素和EGCG的脂质体(FA-HPDL-EGCG-脂质体)。

实施例2、脂质体的性能测定

一、包封率的测定

采用透析法去除未包封的粗毛豚草素和EGGC，高效液相色谱法测定含量。取适量透析前粗毛豚草素脂质体、EGCG脂质体、FA-HPDL-EGCG脂质体加乙腈消解，测定粗毛豚草素和EGCG含量；另取透析后的粗毛豚草素脂质体、EGCG脂质体、FA-HPDL-EGCG脂质体加乙腈消解，测定脂质体中包载的EGCG的含量，按照公式(1)计算药物包封率：

包封率％＝W_包/W_总×100％ (1)

其中W_总为总药量；W_包表示脂质体包载的药量。

在所制备的载药脂质体中，粗毛豚草素的包封率可达86％，EGCG的包封率可达75％。

二、粒径和电位测定

分别将1mL新制得的空白脂质体、HPDL-脂质体、EGCG-脂质体和HPDL-EGCG-脂质体和FA-HPDL-EGCG-脂质体用PBS稀释，使用Nano Series Zen 4003Zeta Sizer(Malverninstruments,Ltd,UK)测定脂质体的粒径、多分散系数和Zeta电位。不同脂质体的粒径、多分散系数(PDI)和zeta电位的测定结果见表1。脂质体粒径分布均匀，粒径大小在90nm～120nm之间。各载药脂质体都略带负电，说明脂质体囊泡之间具有适量的静电排斥力，贮存稳定性更好，不易发生聚沉。

表1不同脂质体粒径及Zeta电位(n＝3)

三、载药脂质体的释放

分别精密量取1.00mL游离HPFL、游离EGCG、HPDL-脂质体、EGCG-脂质体、HPDL-EGCG-脂质体、FA-HPDL-EGCG脂质体混悬液转入经处理的透析袋中，系紧透析袋两端，悬置在盛有25倍释放介质的锥形瓶中，置于恒温振荡器中，于37±0.5℃中恒温振荡48h，在设定的取样时间取样，并立即补入等体积透析介质，过0.45μm微孔滤膜，进样20μL，HPLC分析测定。根据公式(2)计算HPDL和EGCG释放百分率：

F(％)＝(C_t/C_总)×100％ (2)

C_t/C_总为各时间点实测浓度与按标示量计算得到的溶出介质中浓度之比，由此求得不同时间的释放百分率F(％)，绘制释放曲线。

由图1(A)可知，粗毛豚草素游离药释放速度较快，在48h时达到88％，48h时HPDL-脂质体、EGCG-脂质体、HPDL-EGCG-脂质体和FA-HPDL-EGCG-脂质体中粗毛豚草素释放率为30％左右，释放缓慢，无突释现象。由图1(B)可知，EGCG游离药释放速度较快，在48h时达到86％以上，48h时EGCG-脂质体、HPDL-EGCG-脂质体和FA-HPDL-EGCG-脂质体中EGCG释放率为30％左右，释放缓慢，无突释现象。上述结果表明，粗毛豚草素和EGCG以脂质体为载体时稳定性良好，目标脂质体具有缓释作用。

实施例3、载药脂质体体外对肺腺癌A549细胞的抑制作用研究

一、培养条件

1、肺腺癌A549细胞培养条件

将肺腺癌A549细胞培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEMF12高糖培养基中，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱孵育，肺腺癌A549细胞贴壁生长，细胞形态呈梭形，(图2(A)所示)，取对数生长期细胞进行实验。

2、肺腺癌A549干细胞培养条件

取处于对数生长期的A549细胞，用PBS清洗，0.25％胰酶消化，吹打成单细胞悬液，重悬于无血清培养基(含有DMEM/F12，bFGF、EGF，B27)，4～5天后细胞增殖可形成悬浮生长的肿瘤干细胞球，呈球形，细胞连接紧密，形态如图2(B)所示。干细胞球的传代方法具体为：将悬浮生长的肿瘤干细胞球连同培养基一起转移至试管内，以1000r/min离心5min，弃上清，无血清培养基重悬细胞，反复吹打，使细胞团分解成单细胞，按1：2或者1：3的比例接种于25cm²底面积培养瓶，添加无血清培养基至6mL/瓶，继续在37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养，取培养14天的A549干细胞球进行实验。

3、干细胞的鉴别

由于CD133⁺和ALDH1⁺在干细胞表面高表达，故用来鉴定A549干细胞。

CD133标记干细胞试验：

将原干细胞液倒入离心管，离心5min，弃去上清液，PBS(含有0.5％BSA)洗涤，使用0.25％胰酶进行消化，培养液终止消化再次离心，弃去上清液后使用PBS洗涤后，加入一定的细胞培养液，使得细胞的浓度为1×10⁶。配制好细胞悬液后，分别取两管细胞液各100μL，一管为对照组，一管为实验组。空白对照组加入5μLPBS，实验组加入5μLCD133抗体，避光孵育30min，再次离心，离心后使用PBS进行洗涤。300μLPBS重悬，上机检测。

4、Aldefluor试剂盒鉴定干细胞试验

使用前将试剂盒放到室温下(15-25℃)，在Aldefluor干粉的小瓶中加入25μLDMSO，室温下混匀孵育1分钟(Aldefluor干粉为橘红色，加入DMSO时变成黄绿色)。然后加入25μL 2N HCl，混匀，室温下孵育15分钟。在试剂瓶中加入360μL Aldefluor缓冲液充分混匀后分装，-20℃保存。

另外取离心后细胞，Aldefluor buffer重悬，调整细胞数为1×10⁶/mL，标记A549细胞组和悬浮细胞球组，并分别标记实验组及对照组。在实验组EP管中分别加入1mL细胞悬液，在对照组EP管中加入5uL DEAB抑制剂，迅速盖好EP管的盖子(DEAB溶解于95％的酒精里，应防止挥发)。

实验组中加入5μL活化的Aldefluor，混匀后，立即转移0.5mL混合液到对照组中(加DEAB的试管)。因ALDH酶促反应迅速，在加入Aldefluor试剂后应立即转移0.5mL到加DEAB的对照EP管中。

将实验组和对照组EP管，37℃孵育45分钟后，1000r/m，离心5min。弃去上清液，Aldefluor缓冲液重悬细胞，后置于冰上或4℃。待流式细胞仪分析ALDH1high细胞比例。

由图3可知，于同型对照相比，肺腺癌A549干细胞中CD133⁺表达量为98.0％、ALDH1⁺的表达量为71.4％。从结果中可以看出CD133⁺和ALDH1⁺在所培养的肺腺癌A549干细胞球中高表达，说明上述培养条件适合干细胞的生长和增殖。

二、配制不同浓度的载药脂质体

配制系列浓度的游离粗毛豚草素、游离EGCG、游离HPDL-EGCG、HPDL-脂质体、EGCG-脂质体、HPDL-EGCG-脂质体和FA-HPDL-EGCG-脂质体，取10μL上述药物溶液分别加入细胞培养孔中，使各实验组最终的药物浓度梯度为：0、0.5、1、5、10、20、30、40μM。

三、载药脂质体对肺腺癌A549细胞的抗增殖作用

取对数生长期的3000个/孔肺腺癌A549细胞190μL/孔接种于96孔板中，37℃，5％CO₂条件下培养24h；将配制系列浓度的游离粗毛豚草素、游离EGCG、游离HPDL-EGCG、HPDL-脂质体、EGCG-脂质体、HPDL-EGCG-脂质体和FA-HPDL-EGCG-脂质体各取10μL分别加入细胞培养孔中，每个浓度设四个复孔。给药后继续培养24h，经SRB方法获得每孔吸收度OD值(540nm)，计算不同载药脂质体对A549细胞的抑制作用，如图4所示。从图4中可以看出，游离HPDL对A549细胞的抑制作用较弱，但与EGCG联用后，可明显增强对A549细胞的生长抑制作用；FA-HPDL-EGCG-脂质体对A549的抗增殖作用优于其他载药脂质体组。

实施例4、载药脂质体体外对肺腺癌A549细胞的凋亡作用研究

取对数生长期的肺腺癌A549细胞以2×10⁵个/孔接种于6孔板中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。细胞生长24h后，加入游离粗毛豚草素、游离EGCG、游离HPDL-EGCG、HPDL-脂质体、EGCG-脂质体、HPDL-EGCG-脂质体和FA-HPDL-EGCG-脂质体(HPDL和EGCG的终浓度为10μM)，每个药物设三个复孔。置培养箱中继续培养24h后，用冷PBS漂洗3遍，不含EDTA的胰酶消化，离心(1000rpm离心3min)后用PBS洗涤细胞两次，300μL回流的PBS将离心的下沉细胞吹匀。之后依次加入500μL的Binding Buffer、5μL Annexin V-APC、5μL 7-AAD，混匀后于室温避光的条件下反应10min，经流式细胞仪检测。

实验结果如图5所示，游离粗毛豚草素、游离EGCG、游离HPDL-EGCG、HPDL-脂质体、EGCG-脂质体、HPDL-EGCG-脂质体和FA-HPDL-EGCG-脂质体对A549细胞的凋亡率分别为9.5％、14.1％、23.4％、25.5％、31.3％、33.7％和42.0％。由上述结果可以看出，粗毛豚草素本身对A549细胞肺腺细胞具有促凋亡作用，但是作用较弱，加入EGCG后对A549细胞促凋亡作用增大；粗毛豚草素-EGCG用脂质体作为载体后对A549细胞的促凋亡作用明显增高。经统计学分析，与其他各组相比具有显著性差异，说明其促凋亡作用明显强于其他各组。

实施例5、共聚焦显微镜研究不同载药脂质体在肺腺癌A549细胞内的分布

将A549细胞接种于12孔板中，接种密度为2×10⁴个/孔，24h后，贴壁生长，将FA-HPDL-EGCG-L、HPDL-EGCG-L、HPDL+EGCG、EGCG-L、HPDL-L、及HPDL、EGGC分别加入各孔(粗毛豚草素和EGGC的终浓度为10μM)，置二氧化碳培养箱中，37℃培养2小时，依次用冷PBS漂洗三次，4％多聚甲醛固定10min，Hoechst33258细胞核染色5min后，PI染色5min。激光共聚焦显微镜以480nm波长的激光束激发粗毛豚草素，以346nm波长的激光束激发Hoechst33258，然后用Aim Image Examiner软件进行图像分析。

共聚焦显微镜图6显示，粗毛豚草素各制剂经A549肺腺癌细胞内吞后主要分布在细胞核中，如图所示，与其他各组相比，靶向性FA-HPDL-EGGC-L作用后A549细胞的红色荧光强度最强，显示其在A549细胞内分布量最多，说明靶向脂质体可增强A549细胞对药物的内吞作用。

实施例6、肺腺癌A549细胞对不同载药脂质体的摄取试验

目前对于微粒给药系统体内评价的一个重要方面是研究其在体内的吸收和转运情况，较常用的方法是进行荧光标记后示踪给药系统的体内转运行为。香豆素6(Coumarin-6)是一种激光转化率较高、性能比较稳定的脂溶性激光染料。本试验采用薄膜分散法制备包载模型药物粗毛豚草素和荧光标记物香豆素6的脂质体，研究A549细胞的体外摄取情况。

取A549细胞，收集离心后接种在含有载玻片的12孔板上，含血清培养基培养，2万/孔，于37℃二氧化碳培养箱中，相对湿度95％的条件下孵育24h。分别加入游离粗毛豚草素、游离EGCG、游离HPDL-EGCG、HPDL-脂质体、EGCG-脂质体、HPDL-EGCG-脂质体和FA-HPDL-EGCG-脂质体。置培养箱中继续培养2h后，孵育完毕后，用冷的PBS洗涤细胞三次，经0.25％胰酶消化收集，再用PBS吹打成细胞悬液，经流式细胞仪检测。结果如图7所示，在A549细胞的摄取实验中，与游离药和其他各组载药脂质体相比，FA-HPDL-EGCG--香豆素-脂质体显示出最强的A549细胞的摄取能力。

实施例7、微球的制备

1、空白壳聚糖微球的制备

取5mL3wt％冰醋酸溶液加入到已精密称量50mg的壳聚糖粉末中，于磁力搅拌器下搅拌至溶液澄清作为水相；另量取液体石蜡10mL，边搅拌边加入乳化剂Span80及Tween80共0.3mL(Span80：Tween80＝3:1(体积))，作为油相。将已搅拌好的水相通过注射器缓慢滴入油相中，乳化2h后，加入1mL 25wt％戊二醛固化，继续搅拌2h，待固化完全倒入离心管离心，倾倒出上层油相，下层微球经石油醚洗涤3遍，正丁醇脱水，真空干燥即得空白微球。

粗毛豚草素壳聚糖微球的制备：精密称取。随后制备方法同空白微球。

2、载药微球的制备

将粗毛豚草素以1：10的药脂比溶解在甲醇中，然后加入至壳聚糖醋酸溶液中，其余操作方法步骤1，得到载有粗毛豚草素的载药微球。

实施例8、微球的性能测定

一、包封率的测定

取5mL甲醇加入到已精密称取50.0mg的粗毛豚草素壳聚糖微球中，超声20min助溶，放置过夜后将微球研磨，于4000r min^-1条件下离心3min，取上清液置于25mL量瓶中，甲醇定容，经0.45μm微孔滤膜过滤，20μL进样，HPLC法测定粗毛豚草素含量。

在所制备的载药微球中，粗毛豚草素的包封率可达75％。

二、粒径和电位测定

取适量已真空干燥的粗毛豚草素壳聚糖微球，将其溅金后用扫描电镜观察目标微球的形态，由图9可知，制备的粗毛豚草素壳聚糖微球间跨距较小，形态圆整，表面光滑，平均粒径约为5μm。

三、载药微球的释放

将已精密称取的适量载药微球和粗毛豚草素游离药，分别加入到已提前处理好的透析袋中，于透析袋内加入2mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，随后将透析袋放入锥形瓶中，于锥形瓶外加入透析介质PBS100mL，于37±0.5℃条件下恒温振荡48h。分别于0.5，1，2，3，4，5，6，8，12，24，48h取样5mL，并同时补入5mL PBS，样品依次过0.45μm微孔滤膜，进样20μL，HPLC分析测定，绘制释放曲线。

根据公式(2)计算粗毛豚草素释放百分率：

F(％)＝(C_t/C_总)×100％ (2)

C_t/C_总为各时间点实测浓度与按标示量计算得到的溶出介质中浓度之比，由此求得不同时间的释放百分率F(％)，绘制释放曲线。

由图8可知，粗毛豚草素游离药释放速度较快，在48h时达到80％，48h时粗毛豚草素微球中的粗毛豚草素释放率为69％左右，释放缓慢，无突释现象。上述结果表明，粗毛豚草素以微球为载体时稳定性良好，目标微球具有一定的缓释作用。

实施例9、载药微球体外对肺腺癌A549细胞的抑制作用研究

一、培养条件

1、肺腺癌A549细胞培养条件

具体方法同实施例3中一中的步骤1。

2、肺腺癌A549干细胞培养条件

具体方法同实施例3中一中的步骤2。

3、干细胞的鉴别

具体方法同实施例3中一中的步骤3。

4、Aldefluor试剂盒鉴定干细胞试验

具体方法同实施例3中一中的步骤4。

二、配制不同浓度的载药微球

配制系列浓度的游离粗毛豚草素、空白微球、粗毛豚草素微球，取10μL上述药物溶液分别加入细胞培养孔中，使各实验组最终的药物浓度梯度为：0、0.5、1、5、10、20、30、40μM。

三、载药微球对肺腺癌A549细胞的抗增殖作用

取对数生长期的3000个/孔肺腺癌A549细胞190μL/孔接种于96孔板中，37℃，5％CO₂条件下培养24h；将配制系列浓度的游离粗毛豚草素、空白微球、粗毛豚草素微球各取10μL分别加入细胞培养孔中，每个浓度设四个复孔。给药后继续培养24h，经SRB方法获得每孔吸收度OD值(540nm)，计算不同载药脂质体对A549细胞的抑制作用，如图10所示。从图10中可以看出，游离HPDL对A549细胞的抑制作用较弱，将药物包载在微球中后，可增强对A549细胞的生长抑制作用。

综上所述，本发明构建的多功能靶向脂质体，粒径大小均一，药物释放稳定；对肺腺癌A549细胞具有很强的抗增殖作用；显著增加肺腺癌A549细胞对药物的摄取；可诱导肺腺癌A549细胞的凋亡；可明显提高脂质体穿透肺癌的能力，进而将药物输送至肿瘤部位，杀死肿瘤细胞，预防肿瘤复发。且本发明构建的载药微球间跨距较小，形态圆整，表面光滑，平均粒径约为5μm，粗毛豚草素微球缓释作用明显且拟合度较高，药物释放稳定；对肺腺癌A549细胞具有一定的抗增殖作用。

Claims (2)

1.载药脂质体在下述1）-4）中的任一种中的应用：

1）制备治疗肺肿瘤的药物；

2）制备抑制肺肿瘤细胞和/或肺肿瘤干细胞增殖的产品；

3）制备促进肺肿瘤细胞和/或肺肿瘤干细胞凋亡的产品；

4）制备增强肺肿瘤细胞和/或肺肿瘤干细胞对药物摄取能力的产品；

所述肺肿瘤为非小细胞肺癌；

所述载药脂质体由靶向脂质体包载药物得到；

所述靶向脂质体由卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸制备得到；

所述药物为粗毛豚草素和表没食子儿茶素没食子酸酯；

所述载药脂质体的药脂比为1：6.7；

所述药脂比指的是所述药物的质量与所述靶向脂质体中的所述卵磷脂和所述胆固醇的质量之和的比值；

所述靶向脂质体中，各原料的摩尔份数为：

所述卵磷脂63.86份；

所述胆固醇9.83份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 1份；

所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸0.83份。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述靶向脂质体按照包括如下步骤的方法制备得到：

所述卵磷脂、所述胆固醇、所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸通过薄膜分散法得到所述靶向脂质体。

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