CN107557405B - 利用复合菌剂制备絮凝剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用复合菌剂制备絮凝剂的方法，假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.GHS18和交替假单胞菌Pseudoalteromonas sp.JP之间的生长繁殖有明显的协同作用，制备得到的絮凝剂脱色絮凝效果均优于单一菌种发酵得到的絮凝剂。絮凝剂制法，包括种子液培养、液体培养基的制备、扩大发酵培养、絮凝剂的制备。本发明利用无机酸水解农作物废弃物得到水解液来代替培养基中的碳源，节省成本；并且采用沙土作为载体，使菌种附着在载体上，使得絮凝剂有效成分能简单、彻底的从培养液中分离出来。
Description
技术领域
本发明涉及净水技术领域，具体是用于一种利用复合菌剂制备絮凝剂的方法。
背景技术
絮凝技术被广泛应用在给水、废水絮凝净化、发酵工业、固液分离等方面，絮凝效果取决于选取的絮凝剂的种类。 目前，用于水处理行业的絮凝剂主要有两大类 ：以铝系、铁系及其聚合物为代表的无机絮凝剂和以PAM及其衍生物为代表的有机高分子絮凝剂。它们凭借其在使用过程中絮凝效果好且成本低得到广泛的应用，但是它们对环境存在不安全性已引起人们足够的重视。 铝系絮凝剂中铝离子易引起老年性痴呆症 ；铁系絮凝剂中铁离子对金属有腐蚀作用，容易引起处理后水中带有颜色，增加污泥处理负荷；PAM的单体有很强的神经毒性，有很强的致癌性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用复合菌剂制备絮凝剂的方法。假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18和交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP协同发酵得到的胞外多糖制备得到的絮凝剂脱色絮凝效果好，对生物体无潜在毒性，绿色健康；在发酵期间菌种附着在载体上，可轻松分离，且发酵期间以农作物废弃物水解液为碳源，絮凝剂制备成本低。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18和交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP协同发酵得到的胞外多糖制得絮凝剂。其中，假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18的分类命名为假交替单胞菌（Pseudoalteromonassp.），于2016年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No. 12913。交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP的分类命名为交替假单胞菌（Pseudoalteromonassp.），于2016年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No. 12914。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号。上述两株海洋细菌均从中国浙江舟山朱家尖一处海水养殖场养殖的菲律宾蛤仔吐泥中分离筛选获得。
海洋菌株GHS18的16S rDNA全基因（1277 bp）已向美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702262。其全序列如下：
ATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTATCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAGCCTCGGTTCTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC。
海洋菌株JP的16S rDNA全基因（1279 bp）已向美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702268。其全序列如下：
AATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAACCTCGGTTCTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACCTGCGAAGGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA CACCGCC。
利用复合菌剂制备絮凝剂的方法，包括种子液培养、液体培养基的制备、扩大发酵培养、絮凝剂的制备。其中，液体培养基的成分为：农作物废弃物水解液150-250ml/L、硫酸铵0.5-1.0g/L、酵母膏0.4-0.6g/L、磷酸氢二钾1.5-5 g/L、磷酸二氢钾0.4-2g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.2-7.4，115-121℃高压灭菌20-30min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1 g/L、氯化钙1.3 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.058 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.014 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0014g/L、蒸馏水余量。农作物废弃物水解液代替葡萄糖为海洋假交替单胞菌提供碳源，大幅降低了培养基的制备成本。在发酵培养期间，本发明的海洋细菌可充分利用培养基中的碳源、氮源及生长因子，进行旺盛的新陈代谢，产生大量的代谢产物---胞外多糖。
作为优选，农作物废弃物水解液的制备方法为：将农作物废弃物切段烘干后粉碎过筛，按料液比1:4-10加入0.7-2.5%硫酸水解，水解温度为105-121℃，水解时间为1-4h，水解完加入氢氧化钙调节至中性，高速离心取上清液即为农作物废弃物水解液。无机酸将分子量大的纤维素水解成小分子糖，使得海洋假交替单胞菌可轻松将其作为碳源进行利用。以农作物废弃物为原料制备海洋假交替单胞菌的液体发酵培养基，变废为宝，大幅降低絮凝剂的制备成本；农作物废弃物为禾本科植物秸秆。
作为优选，种子液培养步骤为将假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18接种于斜面培养基，于22-27℃恒温培养24-72h后，加入培养基体积0.7-1.3倍的无菌水，振荡制得种子液一；将菌种换成交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP，重复上述步骤，得到种子液二，将种子液一和种子液二按质量比为0.8-3.0：0.8-3.0混合得到种子液三。上述种子液的培养可将本发明海洋细菌从保藏状态恢复到新陈代谢旺盛的状态，生长繁殖速度快，得到数量充足的菌种。
作为优选，扩大发酵培养步骤为每100ml液体发酵培养基接入0.2-0.5ml种子液和6-9g载体，于22-27℃恒温摇床发酵培养；摇床速率为100-140r/min，发酵培养时间为24-72h；载体为沙土，沙土重量比组成为60-90%沙和10-40%土。在发酵培养期间，海洋细菌可充分利用培养基中的碳源、氮源及生长因子，进行旺盛的新陈代谢，产生大量的代谢产物---胞外多糖；胞外多糖具有优异的脱色絮凝效果。
作为优选，絮凝剂的制备步骤为将发酵液静置或低速离心，取下层固体，喷雾干燥或冷冻干燥得到絮凝剂。海洋细菌附着在沙土上生长繁殖，并随沙土一起沉降，同时菌种的代谢产物---胞外多糖可以一并获取。上述絮凝剂有效成分分离操作简单，无需醇沉操作，降低人工成本和材料成本。絮凝剂用量少，脱色率高，形成的絮团大，沉降速度快，性能稳定，脱色絮凝效果好；对生物体无潜在毒性，绿色健康。
作为优选，斜面培养基成分为：葡萄糖15-25g/L、尿素0.44-0.52g/L、硫酸铵0.19-0.24g/L、酵母膏0.4-0.6g/L、磷酸氢二钾1.5-5 g/L、磷酸二氢钾0.4-2g/L、琼脂12-17g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.2-7.4，115-121℃高压灭菌20-35min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1 g/L、氯化钙1.3 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.058 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002g/L、六氯化二铝 0.014 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0014g/L、蒸馏水余量。上述培养基不仅能提供适合本发明海洋细菌适宜的环境，还能提供菌种生长繁殖所需的碳源、氮源及生长因子，菌种的繁殖速度快，并且能诱导菌种分泌产生大量的胞外多糖，胞外多糖产量提高。
作为优选，沙土优选菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土。菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土对于絮凝剂产生菌有极佳的粘附性能，使得絮凝剂能简单地从培养液中分离出来，且分离率很高。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.以农作物废弃物为原料制备海洋假交替单胞菌的液体发酵培养基，变废为宝，大幅降低絮凝剂的制备成本；
2. 沙土对于絮凝剂产生菌有极佳的粘附性能，使得絮凝剂能简单地从培养液中分离出来，且分离率很高；
3. 假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18和交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP之间的生长繁殖有明显的协同作用，制备得到的絮凝剂脱色絮凝效果均优于单一菌种发酵得到的絮凝剂，具有明显进步；
4. 絮凝剂用量少，脱色率高，对高岭土的絮凝率达到92％以上；对高浓度废水脱色具有较高活性，对亚甲基蓝、孔雀石绿、结晶紫的脱色率达95％以上、99.6％以上和99％以上；形成的絮团大，沉降速度快，性能稳定，脱色絮凝效果好；对生物体无潜在毒性，绿色健康。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18和交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP协同发酵得到的胞外多糖制得的絮凝剂。其中，假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18的分类命名为假交替单胞菌（Pseudoalteromonassp.），于2016年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No. 12913。交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP的分类命名为交替假单胞菌（Pseudoalteromonassp.），于2016年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No. 12914。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号。上述两株海洋细菌均从中国浙江舟山朱家尖一处海水养殖场养殖的菲律宾蛤仔吐泥中分离筛选获得。
利用复合菌剂制备絮凝剂最优选的方法，包括以下步骤：
1）种子液培养：将假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18接种于斜面培养基，于25℃恒温培养36h后，加入培养基体积1.2倍的无菌水，振荡制得种子液一；将菌种换成交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP，重复上述步骤，得到种子液二，将种子液一和种子液二按质量比为1:1混合得到种子液三；
2）液体培养基的制备：按照以下成份及其浓度配置液体培养基：芦苇秸秆水解液200ml/L、硫酸铵0.7g/L、酵母膏0.5g/L、磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.3g/L和余量陈化海水；调节pH为7.3，121℃高压灭菌20min。其中，芦苇秸秆水解液的制备方法为：将芦苇秸秆切段烘干后粉碎过筛，按料液比1:8加入1.7%硫酸水解，水解温度为121℃，水解时间为2h，水解完加入氢氧化钙调节至中性，高速离心取上清液即为芦苇秸秆水解液；
3）扩大发酵培养：每100ml液体发酵培养基接入0.4ml种子液三和8g载体，于25℃恒温摇床发酵培养；摇床速率为140r/min，发酵培养时间为36h；载体为菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土，沙土重量比组成为70%沙和30%土；
4）絮凝剂的制备：将发酵液静置3h，取下层固体，冷冻干燥得到絮凝剂。
斜面培养基成分为：葡萄糖20g/L、尿素0.48g/L、硫酸铵0.21g/L、酵母膏0.54g/L、磷酸氢二钾3.8g/L、磷酸二氢钾1.2g/L、琼脂16g/L和余量陈化海水；调节pH为7.3，121℃高压灭菌20min。
实施例2：
利用复合菌剂制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：
1）种子液培养：种子液培养步骤为将假交替单胞菌Pseudoalteromonassp. GHS18接种于斜面培养基，于25℃恒温培养24h后，加入培养基体积1.3倍的无菌水，振荡制得种子液一；将菌种换成交替假单胞菌Pseudoalteromonassp. JP，重复上述步骤，得到种子液二，将种子液一和种子液二按质量比为1：2混合得到种子液三。斜面培养基成分为：葡萄糖22g/L、尿素0.48g/L、硫酸铵0.20g/L、酵母膏0.6g/L、磷酸氢二钾3.1 g/L、磷酸二氢钾1.2g/L、琼脂15g/L和余量人工海水；调节pH为7.3，115℃高压灭菌30min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1 g/L、氯化钙1.3 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.058 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.014 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0014g/L、蒸馏水余量；
2）液体培养基的制备：按照以下成份及其浓度配置液体培养基：水稻秸秆水解液250ml/L、硫酸铵1.0g/L、酵母膏0.6g/L、磷酸氢二钾4.1g/L、磷酸二氢钾1.2g/L和余量人工海水；调节pH为7.4，115℃高压灭菌30min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1 g/L、氯化钙1.3 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06g/L、硼酸0.058 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.014 g/L、氨水0.002 g/L、硝酸锂 0.0014g/L、蒸馏水余量。其中，水稻秸秆水解液的制备方法为：将水稻秸秆切段烘干后粉碎过筛，按料液比1:10加入2.1%硫酸水解，水解温度为121℃，水解时间为1.5h，水解完加入氢氧化钙调节至中性，高速离心取上清液即为水稻秸秆水解液；
3）扩大发酵培养：每100ml液体发酵培养基接入0.4ml种子液三和9g载体，于24℃恒温摇床发酵培养；摇床速率为130r/min，发酵培养时间为72h；载体为菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土，沙土重量比组成为80%沙和20%土；
4）絮凝剂的制备：将发酵液低速离心，取下层固体，喷雾干燥得到絮凝剂。
实施例3：絮凝活性的测定
采用絮凝活性测试法 (R.Kurane，K.Takeda，T.Suzuki.Screening andCharacteristeristics of Microbial Flocculants.Agric.Biol.Chem.1986 ：2301-2307) 对高岭土悬浊液的絮凝活性进行测定，取5g/L的高岭土悬浊液93ml，加入5ml 1％(m/v)CaCl2做助凝剂，加入 2ml 实施例1样品，调节 pH 值为 9，混合快速搅拌 1min，再慢速搅拌 5min，静置 10min，取水平面下 1cm 处混合液，可见分光光度计测 550nm 下吸光度 A，同时以 2ml 蒸馏水代替样品作为对照，测吸光度 B，计算絮凝率，FR(％ ) ＝ (A-B)/A×100％。则絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝率为 93.17％。
实施例4：脱色活性测定
取10ml亚甲基蓝和孔雀石绿(10mg/L)以及10mL结晶紫(20mg/L)于大试管中，加入1ml 浓度为 2g/L 的实施例1样品，漩涡振荡 1min，调节溶液 pH 值为9，静置 30min ，取水平面下 1cm 处的溶液，测定相应染料在最大吸收波长处的吸光度，脱色前溶液的吸光度为A，脱色后溶液的吸光度为A0，计算脱色率，DR(％) ＝ (A-A0)/A×100％。则絮凝剂对亚甲基蓝、孔雀石绿和结晶紫的脱色率分别为 95.82％、99.78％和 99.11％。
实施例5：沉降实验
在培养进入生长稳定期的100ml新鲜小球藻藻液中加入1ml浓度为2g/L的实施例1样品，混合快速搅拌1min，再慢速搅拌5min，静置30min，小球藻沉降率83%。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋大学
<120> 利用复合菌剂制备絮凝剂的方法
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1277
<212> DNA
<213> 海洋细菌Pseudoalteromonas sp. GHS18
<400> 1
atgcttggga acatgccttg aggtggggga caacagttgg aaacgactgc taataccgca 60
taatgtctac ggaccaaagg gggcttcggc tctcgccttt agattggccc aagtgggatt 120
agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgatcc ctagctggtt tgagaggatg 180
atcagccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 240
attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg 300
ttgtaaagca ctttcagtca ggaggaaagg ttagtagtta atacctgcta tctgtgacgt 360
tactgacaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc 420
gagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgtacgcagg cggtttgtta agcgagatgt 480
gaaagccccg ggctcaacct gggaactgca tttcgaactg gcaaactaga gtgtgataga 540
gggtggtaga atttcaggtg tagcggtgaa atgcgtagag atctgaagga ataccgatgg 600
cgaaggcagc cacctgggtc aacactgacg ctcatgtacg aaagcgtggg gagcaaacgg 660
gattagatac cccggtagtc cacgccgtaa acgatgtcta ctagaagctc ggagcctcgg 720
ttctgttttt caaagctaac gcattaagta gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta 780
aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg 840
caacgcgaag aaccttacct acacttgaca tacagagaac ttaccagaga tggtttggtg 900
ccttcgggaa ctctgataca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtt gtgagatgtt 960
gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccct atccttagtt gctagcaggt aatgctgaga 1020
actctaagga gactgccggt gataaaccgg aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat 1080
ggcccttacg tgtagggcta cacacgtgct acaatggcgc atacagagtg ctgcgaactc 1140
gcgagagtaa gcgaatcact taaagtgcgt cgtagtccgg attggagtct gcaactcgac 1200
tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg tatcagaatg acgcggtgaa tacgttcccg 1260
ggccttgtac acaccgc 1277
<210> 2
<211> 1279
<212> DNA
<213> 海洋细菌Pseudoalteromonas sp. JP
<400> 2
aatgcttggg aacatgcctt gaggtggggg acaacagttg gaaacgactg ctaataccgc 60
ataatgtcta cggaccaaag ggggcttcgg ctctcgcctt tagattggcc caagtgggat 120
tagctagttg gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgacgatc cctagctggt ttgagaggat 180
gatcagccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 240
tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggccttcgg 300
gttgtaaagc actttcagtc aggaggaaag gttagtagtt aatacctgct agctgtgacg 360
ttactgacag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg 420
cgagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgtacgcag gcggtttgtt aagcgagatg 480
tgaaagcccc gggctcaacc tgggaactgc atttcgaact ggcaaactag agtgtgatag 540
agggtggtag aatttcaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctgaagg aataccgatg 600
gcgaaggcag ccacctgggt caacactgac gctcatgtac gaaagcgtgg ggagcaaaca 660
ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtct actagaagct cggaacctcg 720
gttctgtttt tcaaagctaa cgcattaagt agaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt 780
aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat 840
gcaacgcgaa gaaccttacc tacacttgac atacagagaa cttaccagag atggtttggt 900
gccttcggga actctgatac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgagatgt 960
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaacccc tatccttagt tgctagcagg taatgctgag 1020
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ctccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc gtatcagaat gacgcggtga atacgttccc 1260
gggccttgta cacaccgcc 1279
Claims (9)
1.利用复合菌剂制备絮凝剂的方法，包括种子液培养、液体培养基的制备、扩大发酵培养、絮凝剂的制备，其特征在于：所述的复合菌剂包括保藏号为CGMCC No.12913的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)GHS18和保藏号为CGMCC No.12914的交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)JP。
2.根据权利要求1所述的利用复合菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于：
所述的液体培养基的成分为：农作物废弃物水解液150-250ml/L、硫酸铵0.5-1.0g/L、酵母膏0.4-0.6g/L、磷酸氢二钾1.5-5g/L、磷酸二氢钾0.4-2g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.2-7.4，115-121℃高压灭菌20-30min；
其中，人工海水配方为：氯化钠25.0g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1g/L、氯化钙1.3g/L、碳酸氢钠0.2g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06g/L、硼酸0.058g/L、硅酸钠0.0024g/L、磷酸0.002g/L、六氯化二铝0.014g/L、氨水0.002g/L、硝酸锂0.0014g/L、蒸馏水余量。
3.根据权利要求2所述的利用复合菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于：所述的农作物废弃物水解液的制备方法为：将农作物废弃物切段烘干后粉碎过筛，按料液比1:4-10加入0.7-2.5％硫酸水解，水解温度为105-121℃，水解时间为1-4h，水解完加入氢氧化钙调节至中性，高速离心取上清液即为农作物废弃物水解液。
4.根据权利要求2所述的利用复合菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于：所述的农作物废弃物为禾本科植物秸秆。
5.根据权利要求1所述的利用复合菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于：所述的种子液培养步骤为将假交替单胞菌（ Pseudoalteromonas sp.） GHS18接种于斜面培养基，于22-27℃恒温培养24-72h后，加入培养基体积0.7-1.3倍的无菌水，振荡制得种子液一；将菌种换成交替假单胞菌（ Pseudoalteromonas sp.） JP，重复上述步骤，得到种子液二，将种子液一和种子液二按质量比为0.8-3.0：0.8-3.0混合得到种子液三。
6.根据权利要求5所述的利用复合菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于：所述的扩大发酵培养步骤为每100ml液体发酵培养基接入0.2-0.5ml种子液三和6-9g载体，于22-27℃恒温摇床发酵培养；摇床速率为100-140r/min，发酵培养时间为24-72h；所述载体为沙土，所述沙土重量比组成为60-90％沙和10-40％土。
7.根据权利要求1所述的利用复合菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于：所述的絮凝剂的制备步骤为将发酵液静置或低速离心，取下层固体，喷雾干燥或冷冻干燥得到絮凝剂。
8.根据权利要求5所述的利用复合菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于：
所述的斜面培养基成分为：葡萄糖15-25g/L、尿素0.44-0.52g/L、硫酸铵0.19-0.24g/L、酵母膏0.4-0.6g/L、磷酸氢二钾1.5-5g/L、磷酸二氢钾0.4-2g/L、琼脂12-17g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.2-7.4，115-121℃高压灭菌20-35min；
其中，人工海水配方为：氯化钠25.0g/L、氯化镁1.9g/L、硫酸镁3.1g/L、氯化钙1.3g/L、碳酸氢钠0.2g/L、氯化钾0.68g/L、溴化钠0.06g/L、硼酸0.058g/L、硅酸钠0.0024g/L、磷酸0.002g/L、六氯化二铝0.014g/L、氨水0.002g/L、硝酸锂0.0014g/L、蒸馏水余量。
9.根据权利要求6所述的利用复合菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于：所述的沙土为菲律宾蛤仔养殖地的天然沙土。
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