[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN107531783B - 靶向bmp6抗体的组合物和方法 - Google Patents

靶向bmp6抗体的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107531783B
CN107531783B CN201580076468.1A CN201580076468A CN107531783B CN 107531783 B CN107531783 B CN 107531783B CN 201580076468 A CN201580076468 A CN 201580076468A CN 107531783 B CN107531783 B CN 107531783B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
antigen
binding fragment
seq
anemia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580076468.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107531783A (zh
Inventor
丛枫
W·迪特里希
N·乔治
刘�东
A·沙克特
A·索尼
周劲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG filed Critical Novartis AG
Publication of CN107531783A publication Critical patent/CN107531783A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107531783B publication Critical patent/CN107531783B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及人BMP6的抗体及其抗原结合片段及其组合物和使用方法。

Description

靶向BMP6抗体的组合物和方法
相关申请
本申请要求2014年12月19日提交的美国系列号62/094,716和2015年6月19日提交的美国系列号62/181,803的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请包含已经以ASCII形式电子提交的序列表，并且通过引用整体并入本文。所述的ASCII副本创建于2015年12月16日，名称为PAT056599-WO-PCT_SL.txt，大小为68,301字节。
导言
本发明涉及抗人BMP6的抗体及其抗原结合片段和其组合物及其使用方法。
背景技术
贫血在慢性肾脏疾病(CKD)患者中普遍存在，并且与较低的生活质量和较高的不良结局风险(包括心血管疾病和死亡)相关。CKD患者中的几种贫血管理模式包括使用红细胞生成刺激剂(ESA)、口服和静脉补充铁和输血。然而，许多患者对这些治疗没有足够的反应或需要更高剂量的ESA和/或铁。高剂量的铁也可能引起与氧自由基产生和过敏反应相关的毒性。这些治疗可能缺乏有效性，因为它们不能完全解决贫血的根本原因，即受损的铁吸收和从身体储备中的铁动员。
目前尝试通过高剂量的肠胃外铁的共同施用管理促红细胞生成素抗性。然而，静脉内制剂中的大多数铁首先被巨噬细胞处理，其用于红细胞生成的利用度依赖于膜铁转运蛋白(ferroportin)介导的铁输出。
在许多贫血患者中，膜铁转运蛋白介导的铁输出被高水平的hepcidin抑制。另外的证据表明，增加的hepcidin水平与血液透析中差的ESA反应性相关。因此，hepcidin降低剂可能是改善该患者群体中的ESA难治性贫血和以铁限制为特征的其它形式的慢性疾病贫血(ACD)的有效策略。
因此，降低循环中hepcidin水平的方法应在慢性肾脏疾病患者存在的ESA难治性贫血中增加铁吸收、促进隔离的铁的释放和促进红细胞生成。
尽管目前存在用于治疗与贫血相关的疾病和疾患的治疗选择，但仍然需要有效治疗贫血并且是耐受性良好的改良组合物。
发明内容
本发明提供分离的BMP6结合分子(例如，BMP6结合抗体或其抗原结合片段)、包含这种分子的药物组合物、制备这种分子和组合物的方法、及将其用于降低hepcidin水平和治疗贫血的方法。
在一个方面，本发明提供了分离的BMP6抗体或其抗原结合片段，其包含表1中任意抗体的任意1、2、3、4、5或6个CDR。
在一个方面，本发明提供了分离的BMP6抗体或其抗原结合片段，其包含抗体3的6个CDR，如表1所述。
在一个方面，本发明提供了分离的BMP6抗体或其抗原结合片段，其包含抗体5的6个CDR，如表1所述。
在一个方面，本发明提供了分离的BMP6抗体或其抗原结合片段，其包含抗体6的6个CDR，如表1所述。
在一个方面，本发明提供了分离的BMP6抗体或其抗原结合片段，其包含抗体7的6个CDR，如表1所述。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并且包含：
分别为SEQ ID NO：9、10和11的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：19、20和21的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并且包含：
分别为SEQ ID NO：12、13和14的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：22、23和24的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并且包含：
分别为SEQ ID NO：29、30和31的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：39、40和41的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并且包含：
分别为SEQ ID NO：32、33和34的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：42、43和44的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并且包含：
分别为SEQ ID NO：49、50和51的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：59、60和61的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并且包含：
分别为SEQ ID NO：52、53和54的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：62、63和64的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并且包含：
分别为SEQ ID NO：69、70和71的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：79、80和81的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，或
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并且包含：
分别为SEQ ID NO：72、73和74的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：82、83和84的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并且包含：
SEQ ID NO：15的VH(重链可变结构域)序列；
SEQ ID NO：35的VH序列；
SEQ ID NO：55的VH序列；或者
SEQ ID NO：75的VH序列。
在本发明的一个实施方案中，结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段包含VH序列，所述VH序列与以上描述的VH序列之一具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、在至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并且包含：
SEQ ID NO：25的VL(轻链可变结构域)序列；
SEQ ID NO：45的VL序列；
SEQ ID NO：65的VL序列；或者
SEQ ID NO：85的VL序列。
在本发明的一个实施方案中，结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段包含VL序列，所述VL序列与以上描述的VL序列之一具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、在至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并且包含：
SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：25的VL序列；
SEQ ID NO：35的VH序列和SEQ ID NO：45的VL序列；
SEQ ID NO：55的VH序列和SEQ ID NO：65的VL序列；或者
SEQ ID NO：75的VH序列和SEQ ID NO：85的VL序列。
在本发明的一个实施方案中，结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段包含VH序列和VL序列，所述VH序列与以上描述的VH序列之一具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、在至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性；并且所述VL序列与以上描述的VL序列之一具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、在至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性。在一个实施方案中，VH和VL源自表1中列出的相同抗体。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并且包含：
SEQ ID NO：17的重链序列；
SEQ ID NO：37的重链序列；
SEQ ID NO：57的重链序列；或者
SEQ ID NO：77的重链序列。
在本发明的一个实施方案中，结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链序列，所述重链序列与以上描述的重链序列之一具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、在至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并且包含：
SEQ ID NO：27的轻链序列；
SEQ ID NO：47的轻链序列；
SEQ ID NO：67的轻链序列；或者
SEQ ID NO：87的轻链序列。
在本发明的一个实施方案中，结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链序列，所述轻链序列与以上描述的轻链序列之一具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、在至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP6并包含重链和轻链，其中：
SEQ ID NO：17的重链序列和SEQ ID NO：27的轻链序列；
SEQ ID NO：37的重链序列和SEQ ID NO：47的轻链序列；
SEQ ID NO：57的重链序列和SEQ ID NO：67的轻链序列；或者
SEQ ID NO：77的重链序列和SEQ ID NO：87的轻链序列。
在本发明的一个实施方案中，结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段包含重链序列和轻链序列，所述重链序列与以上描述的重链序列之一具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、在至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性，并且所述轻链序列与以上描述的轻链序列之一具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、在至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，但小于100％的序列同一性。在一个实施方案中，所述重链和轻链源自表1中列出的相同抗体。
在本发明的一个实施方案中，提供了特异性结合BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与以下之任一个或多个具有至少90％、95％、97％、98％或至少99％序列同一性的至少一个互补决定(CDR)序列：
分别为SEQ ID NO：9、10和11的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：19、20和21的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：12、13和14的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：22、23和24的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：29、30和31的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：39、40和41的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：32、33和34的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：42、43和44的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：49、50和51的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：59、60和61的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：52、53和54的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：62、63和64的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：69、70和71的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：79、80和81的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或者
分别为SEQ ID NO：72、73和74的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：82、83和84的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在本发明的一个实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合BMP6，并且包含与以下之任一个或多个相同的至少一个互补决定(CDR)序列：
分别为SEQ ID NO：9、10和11的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：19、20和21的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：12、13和14的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：22、23和24的LCDR1、LCDR2和LCDR3序；
分别为SEQ ID NO：29、30和31的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：39、40和41的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：32、33和34的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：42、43和44的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：49、50和51的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：59、60和61的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：52、53和54的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：62、63和64的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：69、70和71的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：79、80和81的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或者
分别为SEQ ID NO：72、73和74的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：82、83和84的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合BMP6，其中所述抗体包含至少一个选自以下的重链CDR序列：
SEQ ID NO：12、13和14的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；
SEQ ID NO：29、30和31的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；
SEQ ID NO：32、33和34的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；
SEQ ID NO：49、50和51的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；
SEQ ID NO：52、53和54的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；
SEQ ID NO：69、70和71的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；
SEQ ID NO：72、73和74的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列；和
SEQ ID NO：9、10和11的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合BMP6，其中所述抗体包含至少一个选自以下的轻链CDR序列：
分别为SEQ ID NO：19、20和21的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：22、23和24的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：39、40和41的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：42、43和44的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：59、60和61的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：62、63和64的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：79、80和81的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；和
分别为SEQ ID NO：82、83和84的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有至少约1×107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1或1011M-1的亲和常数(KA)。在一个实施方案中，本发明提供特异性结合BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有至少1×107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1或1011M-1的亲和常数(KA)。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合BMP6，其中所述抗体或其抗原结合片段以不超过约1nM或不超过约0.1nM的Kd结合BMP6。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合BMP6，其中所述抗体或其抗原结合片段以不超过1nM或不超过0.1nM的Kd结合BMP6。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合BMP6，其中所述抗体或其抗原结合片段以Kd≤1nM或≤0.1nM结合BMP6。在一个实施方案中，Kd由Biacore测量。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合BMP6，并抑制BMP6活性。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合BMP6，并且与以下表1中所述的抗体交叉竞争(交叉阻断)。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段与以下表1中所述的抗体交叉竞争结合相同的BMP6表位。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段对人BMP6的亲和力，比对人BMP2、人BMP5或人BMP7中任意的亲和力，高至少约100倍、500倍或1000倍。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段对人BMP6的亲和力，比对人BMP2、人BMP5或人BMP7中任意的亲和力，高至少100倍、500倍或1000倍。在实施方案中，对BMP6的特异性通过ELISA测量。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段对人BMP6的亲和力，比对人BMP2的亲和力，高至少约100倍、500倍或1000倍。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段对人BMP6的亲和力，比对人BMP2的亲和力，高至少100倍、500倍或1000倍。在实施方案中，对BMP6的特异性通过ELISA测量。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段对人BMP6的亲和力，比对人BMP5的亲和力，高至少约100倍、500倍或1000倍。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段对人BMP6的亲和力，比对人BMP5的亲和力，高至少100倍、500倍或1000倍。在实施方案中，对BMP6的特异性通过ELISA测量。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段对人BMP6的亲和力，比对人BMP7的亲和力，高至少约100倍、500倍或1000倍。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段对人BMP6的亲和力，比对人BMP7的亲和力，高至少100倍、500倍或1000倍。在实施方案中，对BMP6的特异性通过ELISA测量。
在本发明的一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段不具有可检测的与人BMP2或BMP5的结合(例如，在ELISA中)。
在本发明的一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段不具有针对人BMP2的可检测的活性(例如，在ELISA中)。
在本发明的一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段不具有针对人BMP5的可检测的活性(例如，在ELISA中)。
在一个实施方案中，本发明的特异性结合BMP6的抗体及其抗原结合片段是分离的单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的特异性结合BMP6的抗体及其抗原结合片段是分离的人单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的特异性结合BMP6的抗体及其抗原结合片段是人源化的单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的特异性结合BMP6的抗体及其抗原结合片段是分离的嵌合抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段包含人重链恒定区和人轻链恒定区。
在本发明的一个实施方案中，特异性结合BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段是单链抗体。
在本发明的一个实施方案中，特异性结合BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段是Fab片段。
在本发明的一个实施方案中，特异性结合BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段是scFv。
在一个实施方案中，本发明的抗体是IgM或IgG。在本发明的一个实施方案中，IgG是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个实施方案中，IgG是IgG1。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含框架，其中氨基酸已经被取代到来自相应的人VH或VL种系序列的抗体框架中。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段是免疫缀合物的组分。在一个实施方案中，免疫缀合物可以包含分离的抗体或其抗原结合片段和以下作为非限制性实例中的任意：酶、毒素、激素、生长因子或药物。
在本发明的一个实施方案中，通过Fc区的突变，分离的抗体或其抗原结合片段具有改变的效应子功能。
在本发明的一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段交叉阻断表1中列出的抗体或其分离的抗原结合片段。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段抑制肝细胞(例如在体外的肝细胞系和/或原代人肝细胞)中BMP6诱导的hepcidin表达。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段抑制肝细胞(例如在体外的肝细胞系和/或原代人肝细胞)中BMP6诱导的hepcidin表达的至少约50％。例如，分离的抗体或其抗原结合片段抑制肝细胞中BMP6诱导的hepcidin表达的至少约50、60、70、80、90或100％。作为非限制性实例，可以通过测量hepcidin mRNA的量或蛋白质水平来测量hepcidin表达。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段抑制肝细胞(例如在体外的肝细胞系和/或原代人肝细胞)中BMP6诱导的hepcidin表达的至少50％。例如，分离的抗体或其抗原结合片段抑制肝细胞中BMP6诱导的hepcidin表达的至少50、60、70、80、90或100％。作为非限制性实例，可以通过测量hepcidin mRNA的量或蛋白质水平来测量hepcidin表达。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段在体外降低人BMP6的活性。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段在体外降低人BMP6的活性，如在HEP3B-BRE-Luc报告基因测定试验中测量的。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合BMP6，并且其结合包含序列QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO:92,或SEQ ID NO:89的氨基酸88至102)的人BMP6的表位。一方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合BMP6，并且其结合由序列QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO:92,或SEQ ID NO:89的氨基酸88至102)组成的人BMP6的表位。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段，对由序列QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO:92,或SEQ ID NO:89的氨基酸88至102)组成的人BMP6的表位的亲和力，比对(a)由序列QTLVHFINPETVPKP(SEQ ID NO:93,或SEQ ID NO:90的氨基酸88至102)组成的人BMP7的表位或(b)由序列QTLVHLMFPDHVPKP(SEQ ID NO:94,或SEQ ID NO:91的氨基酸87至101)组成的人BMP5的表位的亲和力，高至少约100倍。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段，对由序列QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO:92,或SEQ IDNO:89的氨基酸88至102)组成的人BMP6的表位的亲和力，比对(a)由序列QTLVHFINPETVPKP(SEQ ID NO:93,或SEQ ID NO:90的氨基酸88至102)组成的人BMP7的表位或(b)由序列QTLVHLMFPDHVPKP(SEQ ID NO:94,或SEQ ID NO:91的氨基酸87至101)组成的人BMP5的表位的亲和力，高至少100倍。作为非限制性实例，这样的分离的抗体或其抗原结合片段可以包含：(a)分别为SEQ ID NO：69、70和71的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：79、80和81的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列或(b)分别为SEQ ID NO：72、73和74的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQID NO：82、83和84的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：75的VH序列和SEQ ID NO：85的VL序列。在一个实施方案中，亲和力由Biacore测量。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段，对由序列QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO:92,或SEQ ID NO:89的氨基酸88至102)组成的人BMP6的表位的亲和力，比对(a)由序列QTLVHFINPETVPKP(SEQ ID NO:93,或SEQ ID NO:90的氨基酸88至102)组成的人BMP7的表位或(b)由序列QTLVHLMFPDHVPKP(SEQ ID NO:94,或SEQ ID NO:91的氨基酸87至101)组成的人BMP5的表位的亲和力，高至少约500倍。作为非限制性实例，这样的分离的抗体或其抗原结合片段可以包含：(a)分别为SEQ ID NO：69、70和71的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：79、80和81的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列或(b)分别为SEQ ID NO：72、73和74的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQID NO：82、83和84的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：75的VH序列；和SEQ ID NO：85的VL序列。在一个实施方案中，亲和力由Biacore测量。
另一方面，本发明提供了包含前述任意方面或实施方案中的分离的抗体或其抗原结合片段的组合物，例如药物组合物。
在一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，组合物还包含另外的治疗剂。
在本发明的一个实施方案中，另外的治疗剂降低BMP6的活性。
在本发明的一个实施方案中，另外的治疗剂是siRNA、抗体或其抗原结合片段、或小分子。
在本发明的一个实施方案中，另外的治疗剂选自：红细胞生成刺激剂(ESA)和铁(例如膳食补充铁或静脉内铁)。
在本发明的一个实施方案中，另外的治疗剂是红细胞生成刺激剂(ESA)，例如EPO。
在一个实施方案中，可以与治疗方法或步骤(例如本文所述或本领域已知的)结合，将表1中所述的分离的抗体或其抗原结合片段施用于有需要的患者。可以在所述的方法或步骤之前、之后或与所述的方法或步骤同时施用表1中所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，治疗方法或步骤是输血。在一个实施方案中，治疗方法或步骤是透析。在一个实施方案中，治疗方法或步骤是施用ESA，例如EPO。在一个实施方案中，治疗方法或步骤是施用铁，例如静脉内(IV)铁。在一个实施方案中，治疗方法或步骤是施用ESA(例如EPO)和施用铁(例如静脉内铁)。在一个实施方案中，治疗方法或步骤是上述任意的组合。
另一方面，本发明包括编码本文所述的任何抗体或其抗原结合片段的核酸(多核苷酸)。在一个实施方案中，本发明提供了编码表1中所述的分离的抗体或其抗原结合片段的核酸，所述的分离的抗体或其抗原结合片段包含以下任一项或多项：
分别为SEQ ID NO：9、10和11的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：19、20和21的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：12、13和14的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：22、23和24的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：29、30和31的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：39、40和41的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：32、33和34的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：42、43和44的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：49、50和51的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：59、60和61的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：52、53和54的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：62、63和64的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；
分别为SEQ ID NO：69、70和71的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：79、80和81的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；或者
分别为SEQ ID NO：72、73和74的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：82、83和84的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在一个实施方案中，本发明提供编码表1中所述的分离的抗体或其抗原结合片段的核酸(多核苷酸)，所述的分离的抗体或其抗原结合片段包含选自以下序列的氨基酸序列：
SEQ ID NO：17的重链序列；
SEQ ID NO：15的VH序列；
SEQ ID NO：27的轻链序列；
SEQ ID NO：25的VL序列；
SEQ ID NO：37的重链序列；
SEQ ID NO：35的VH序列；
SEQ ID NO：47的轻链序列；
SEQ ID NO：45的VL序列；
SEQ ID NO：57的重链序列；
SEQ ID NO：55的VH序列；
SEQ ID NO：67的轻链序列；
SEQ ID NO：65的VL序列；
SEQ ID NO：77的重链序列；
SEQ ID NO：75的VH序列；
SEQ ID NO：87的轻链序列；和
SEQ ID NO：85的VL序列。
在一个实施方案中，本发明提供编码表1中所述的分离的抗体或其抗原结合片段的核酸(多核苷酸)，所述的分离的抗体或其抗原结合片段包含与选自以下的序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列：
SEQ ID NO：17的重链序列；
SEQ ID NO：15的VH序列；
SEQ ID NO：27的轻链序列；
SEQ ID NO：25的VL序列；
SEQ ID NO：37的重链序列；
SEQ ID NO：35的VH序列；
SEQ ID NO：47的轻链序列；
SEQ ID NO：45的VL序列；
SEQ ID NO：57的重链序列；
SEQ ID NO：55的VH序列；
SEQ ID NO：67的轻链序列；
SEQ ID NO：65的VL序列；
SEQ ID NO：77的重链序列；
SEQ ID NO：75的VH序列；
SEQ ID NO：87的轻链序列；和
SEQ ID NO：85的VL序列。
在一个实施方案中，本发明提供编码表1中所述的分离的抗体或其抗原结合片段的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸包含选自以下的序列：
SEQ ID NO：18的重链序列；
SEQ ID NO：38的重链序列；
SEQ ID NO：58的重链序列；
SEQ ID NO：78的重链序列；
SEQ ID NO：28的轻链序列；
SEQ ID NO：48的轻链序列；
SEQ ID NO：68的轻链序列；
SEQ ID NO：88的轻链序列；
SEQ ID NO：16的VH序列；
SEQ ID NO：36的VH序列；
SEQ ID NO：56的VH序列；
SEQ ID NO：76的VH序列；
SEQ ID NO：26的VL序列；
SEQ ID NO：46的VL序列；
SEQ ID NO：66的VL序列；和
SEQ ID NO：86的VL序列。
在另一方面，本发明还提供了包含这种核酸或多核苷酸的载体。
在另一方面，本发明还提供了包含这种核酸或多核苷酸的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在本发明的一个实施方案中，分离的宿主细胞包含含有这种核酸或多核苷酸的载体。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的宿主细胞，其包含(1)编码本发明的抗体重链的重组核酸区段，和(2)编码本发明的抗体轻链的第二重组核酸区段；其中所述DNA区段分别可操作地连接到第一和第二启动子，并且能够在所述宿主细胞中表达。在本发明的另一个实施方案中，分离的宿主细胞包含分别编码本发明抗体的重链和轻链的重组DNA区段，其中所述DNA区段可操作地连接至启动子，并且能够在所述宿主细胞中表达。在一个实施方案中，宿主细胞是非人哺乳动物细胞系。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明提供了本文所述的BMP6抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体或宿主细胞在制备药物中的用途。本发明提供了本文所述的抗体或其抗原结合片段用作药物。本发明提供了本文所述的抗体或其抗原结合片段用于治疗。本发明提供了本文所述的抗体或其抗原结合片段用于治疗贫血，例如慢性疾病的贫血。在一个实施方案中，慢性疾病是慢性肾脏疾病。在一个实施方案中，慢性疾病是癌症。在一个实施方案中，慢性疾病是炎症。在实施方案中，贫血患者已经或正在接受红细胞生成刺激剂(ESA)(例如促红细胞生成素(EPO))治疗。
另一方面，本发明提供了使用本文所述的抗体及其抗原结合片段、以及包含这种抗体及其抗原结合片段的组合物的方法。在一个方面，本发明提供了降低有需要的患者中的hepcidin的活性或水平的方法，所述方法包括向该患者施用本文所述的BMP6抗体或其抗原结合片段的步骤。在该方法的一个实施方案中，hepcidin的活性或水平降低至少50％。在一个实施方案中，患者患有贫血。在实施方案中，贫血是慢性疾病的贫血(ACD)，例如慢性肾脏疾病(CKD)贫血、癌症贫血或炎症贫血。在一个实施方案中，贫血是红细胞生成刺激剂(ESA)抗性贫血或铁限制性贫血(iron-restricted anemia)。
本发明提供了治疗有需要的患者的贫血的方法，所述方法包括向该患者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段的步骤。在实施方案中，贫血是慢性疾病贫血(ACD)，例如慢性肾脏疾病(CKD)贫血、癌症贫血或炎症贫血。在一个实施方案中，贫血是红细胞生成刺激剂(ESA)抗性贫血或铁限制性贫血。在实施方案中，患者正在或已经用红细胞生成刺激剂(ESA)(例如促红细胞生成素(EPO))治疗。在实施方案中，贫血是EPO低反应性贫血。在实施方案中，贫血是铁限制性贫血。在实施方案中，患者是长期血液透析患者。
在另一个实施方案中，本发明提供了抑制有需要的患者的BMP6的方法，其中所述方法包括向该患者施用有效量的包含本发明的抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤。在实施方案中，患者患有贫血。在实施方案中，贫血是慢性疾病贫血(ACD)，例如慢性肾脏疾病(CKD)贫血、癌症贫血或炎症贫血。在一个实施方案中，贫血是红细胞生成刺激剂(ESA)抗性贫血或铁限制性贫血。在实施方案中，患者正在或已经用红细胞生成刺激剂(ESA)(例如促红细胞生成素(EPO))治疗。在实施方案中，贫血是EPO低反应性贫血。在实施方案中，贫血是铁限制性贫血。在实施方案中，患者是长期血液透析患者。
本发明还提供降低细胞中BMP6活性的方法，其包括使细胞与本发明的抗体或其抗原结合片段接触的步骤。
本发明进一步提供了提高有需要的患者的血清铁水平、转铁蛋白饱和度(TSAT)、网织红细胞血红蛋白含量(CHr)、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容的方法，所述方法包括向该患者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段的步骤。
本发明还提供了增加或维持患者血红蛋白水平的方法，所述方法包括向该患者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。在实施方案中，患者患有贫血。在实施方案中，贫血是慢性疾病贫血(ACD)，例如慢性肾脏疾病(CKD)贫血、癌症贫血或炎症贫血。在一个实施方案中，贫血是红细胞生成刺激剂(ESA)抗性贫血或铁限制性贫血。在实施方案中，患者正在或已经用红细胞生成刺激剂(ESA)(例如促红细胞生成素(EPO))治疗。在实施方案中，贫血是EPO低反应性贫血。在实施方案中，贫血是铁限制性贫血。在实施方案中，患者是长期血液透析患者。在实施方案中，该方法还包括，相对于没有本文所述的抗体或抗原结合片段治疗时的EPO剂量需求和/或铁剂量需求，降低患者的铁剂量需求、降低患者的EPO剂量需求、或降低患者的铁剂量需求和患者的EPO剂量需求。在实施方案中，增加血红蛋白水平或维持血红蛋白水平到至少约10.0、至少约11.0、或至少约12.0g/dL的水平。在实施方案中，增加血红蛋白水平或维持血红蛋白水平到至少10.0、至少11.0、或至少12.0g/dL的水平。
在任何上述方法中，向患者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段的步骤包括向患者施用包含本文所述的抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤。
在任何上述方法中，抗体或其抗原结合片段可以以0.001至0.1mg/kg的剂量施用，例如以0.001mg/kg、0.0016mg/kg、0.0025mg/kg、0.0040mg/kg、0.0063mg/kg、0.01mg/kg、0.016mg/kg、0.025mg/kg、0.040mg/kg、0.063mg/kg或0.1mg/kg的剂量施用。在任何上述方法中，抗体或其抗原结合片段可以以约0.001至约0.1mg/kg的剂量施用，例如以约0.001mg/kg、约0.0016mg/kg的剂量、约0.0025mg/kg、约0.0040mg/kg、约0.0063mg/kg、约0.01mg/kg、约0.016mg/kg、约0.025mg/kg、约0.040mg/kg、约0.063mg/kg、约0.1mg/kg的剂量施用。
在实施方案中，静脉内施用抗体或其抗原结合片段。在实施方案中，皮下施用抗体或其抗原结合片段。在实施方案中，通过在约30至约60分钟的时间内输注，施用抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本发明提供了BMP6的抗体或其抗原结合片段，其包含表1中列出的CDR。本发明提供了表1中列出的BMP6的抗体或其抗原结合片段。本发明提供了编码含有表1中列出的CDR的BMP6抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，多核苷酸或核酸是分离的。在本发明的一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段是分离的。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
如本文所用，“BMP6”是指蛋白质骨形态生成蛋白6(BMP6)或编码BMP6的基因或核酸。Hahn等人1992Genomics 14:759-62；Sauermann等人1993J.Neurosci.Res.33:142-7；NCBI Gene ID:654。BMP6也称为：BMP-6；VGR；VGR1；外部IDs:OMIM:112266MGI:88182；HomoloGene:1300；GeneCards:BMP6基因。同源序列:物种:人类:Entrez:654；Ensembl:ENSG00000153162；UniProt:P22004；RefSeq(mRNA):NM_001718；RefSeq(蛋白质):NP_001709；位置(UCSC):Chr 6:7.73–7.88Mb；物种:小鼠:Entrez:12161；Ensembl:ENSMUSG00000039004；UniProt:P20722；RefSeq(mRNA):NM_007556；RefSeq(protein):NP_031582；位置(UCSC):Chr 13:38.35–38.5Mb。如本文所述，结合BMP6的抗体、其抗原结合片段与BMP6蛋白结合。
本文所用的“BMP2”是指蛋白质骨形态生成蛋白2(BMP2)或编码BMP2的基因或核酸。BMP2也称为：BDA2；和BMP2A；外部ID OMIM:112261MGI:88177HomoloGene:926GeneCards:BMP2基因。物种:人类；Entrez:650；Ensembl:ENSG00000125845；UniProt:P12643；RefSeq(mRNA):NM_001200；RefSeq(蛋白质):NP_001191；位置(UCSC):Chr 20:6.75–6.76Mb.物种:小鼠；Entrez:12156；Ensembl:ENSMUSG00000027358；UniProt:P21274；RefSeq(mRNA):NM_007553；RefSeq(蛋白质):NP_031579；位置(UCSC):Chr 2:133.55–133.56Mb。如本文所述，结合BMP2的抗体或其抗原结合片段与BMP2蛋白结合。
本文所用的“BMP5”是指蛋白质骨形态生成蛋白5(BMP5)或编码BMP5的基因或核酸。BMP5也称为：MGC34244；外部ID OMIM:112265MGI:88181HomoloGene:22412GeneCards:BMP5基因。物种:人类；Entrez:653；Ensembl:ENSG00000112175；UniProt:P22003；RefSeq(mRNA):NM_021073；RefSeq(蛋白质):NP_066551；位置(UCSC):Chr 6:55.62–55.74Mb.物种:小鼠；Entrez:12160；Ensembl:ENSMUSG00000032179；UniProt:P49003；RefSeq(mRNA):NM_007555；RefSeq(protein):NP_031581；位置(UCSC):Chr 9:75.78–75.9Mb。如本文所述，结合BMP5的抗体、其抗原结合片段与BMP5蛋白结合。
如本文所用，“BMP7”是指蛋白质骨形态生成蛋白7(BMP7)或编码BMP7的基因或核酸。BMP7也称为：成骨蛋白-1；OP-1；外部ID OMIM:112267MGI:103302HomoloGene:20410GeneCards:BMP7基因。物种:人类；Entrez:655；Ensembl:ENSG00000101144；UniProt:P18075；RefSeq(mRNA):NM_001719；RefSeq(蛋白质):NP_001710；位置(UCSC):Chr 20:55.74–55.84Mb.物种:小鼠；Entrez:12162；Ensembl:ENSMUSG00000008999；UniProt:P23359；RefSeq(mRNA):NM_007557；RefSeq(蛋白质):NP_031583；位置(UCSC):Chr 2:172.87–172.94Mb。如本文所述，结合BMP7的抗体、其抗原结合片段与BMP7蛋白结合。
“hepcidin”是指基因hepcidin或蛋白质hepcidin，一种肽激素。hepcidin也被称为：HAMP(hepcidin抗微生物蛋白或肽)；HEPC；HFE2B；LEAP1(LEAP-1)；PLTR；OMIM:606464；HomoloGene:81623；GeneCards:HAMP Gene；Entrez 57817；Ensembl ENSG00000105697；UniProt P81172；RefSeq(mRNA)NM_021175；RefSeq(蛋白质)NP_066998；位置(UCSC)Chr19:35.77–35.78Mb.Krause等人FEBS Lett.480:147-150；和Pigeon等人2001J.Biol.Chem.276:7811-9。还参见:Ganz 2003Blood 102:783-8；Roy等人2005Curr.Opin.Hemat.12:107-111；Fleming等人2006Semin.Liver Dix.25:411-9；Park等人2001J.Biol.Chem.276:7806-10；Majore等人2002Haematologica 87:221-2；Kluver等人2002J.Pept.Res.59:241-8；Hunter等人2002J.Biol.Chem.277:37597-603；Weinstein等人2003Blood 100:3776-81；Nemeth等人2003Blood 101:2461-3；Roetto等人2003Nat.Genet.33:21-2；Strausberg等人2003Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-903；Gehrke等人2003Blood 102:371-6；Merryweather-Clarke等人2004Human Mol.Genet.12:2241-7；Clark等人2003Genome Res.13:2265-70；Roetto等人2004Blood 103:2407-9；Jacolot等人2004Blood 103:2835-40；和Ota等人2004Nat.Genet.36:40-45。
本文所用的“贫血”是指，红细胞数量的减少或血液中血红蛋白或铁的含量的减少，以及血液携氧能力的降低。
可以使用本领域已知的任何方法诊断贫血，包括作为非限制性实例，男性中基于血红蛋白少于约130至140g/L(13至14g/dL)，女性中血红蛋白少于约120至130g/L(12至13g/dL)。Janz等人2013Emerg.Med.Pract.15:1-15；和Smith 2010Am.J.Man.Care16Supp.S59-66。
如本文所用，术语“BMP6抗体”、“抗人BMP6抗体”、“BMP6结合抗体”、“BMP6拮抗剂抗体”等(及其抗原结合片段)包括结合蛋白BMP6的抗体(和其抗原结合片段)。
本文所用的术语“抗体”、“抗原结合片段”、“抗原结合部分”等包括整个抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键链间连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白。每个重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区域可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL包含按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列的三个CDR和四个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”、“其抗原结合片段”、“抗原结合部分”等等，是指完整抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合给定抗原(如BMP6)的能力。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段完成。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，一种包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的单域抗体(dAb)片段(Ward等人，1989Nature 341：544-546)；和分离的互补决定区(CDR)。
此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH被分开的基因编码，但是它们可以通过人工肽接头使用重组方法连接起来，使得它们能够被制成单一蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见例如Bird等人，1988Science 242：423-426；和Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。这样的单链抗体可以包括一个或多个抗体的“抗原结合部分”。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的用途。
抗原结合部分也可以并入单域抗体(single domain antibodies)、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、内抗体(intrabodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、v-NAR和双scFv中(参见例如Hollinger和Hudson，2005，Nature Biotechnology，23，9，1126-1136)。抗体的抗原结合部分可以嫁接到基于多肽(如III型纤连蛋白(Fn3))的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述纤连蛋白多肽单抗体(monobody))。
抗原结合部分可以并入包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，其可以与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人.,1995Protein Eng.8(10):1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用，术语“亲和力”(Affinity)是指单个抗原位点处的抗体与抗原之间相互作用的强度。在每个抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在许多位点处相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
如本文所用，术语“亲和性”(Avidity)是指抗体-抗原复合体的整体稳定性或强度的信息量度。它由三个主要因素控制：抗体表位亲和力；抗原和抗体的效价(valency)；以及相互作用部分的结构布置。最终，这些因素界定了抗体的特异性，即特定抗体与精确抗原表位结合的可能性。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码子编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。
本文所用的术语“结合特异性”是指单个抗体结合位点仅与一个抗原决定簇反应的能力。抗体的结合位点位于分子的Fab部分，并由重链和轻链的高变区构成。抗体的结合亲和力是单个抗原决定簇与抗体上单个结合位点之间的反应强度。其是抗原决定簇与抗体的结合位点之间存在的吸引力和排斥力的总和。
两个实体之间的特异性结合是指具有至少1×107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1或1011M-1的平衡常数(KA或KA)的结合。短语抗体(例如，BMP6结合抗体)的“特异性(或选择性)结合”是指，决定在蛋白质和其它生物制剂的异质群体中存在关连抗原(例如，人BMP6蛋白)的结合反应。除了上述平衡常数(KA)之外，本发明的BMP6结合抗体通常还具有约1×10-2s-1、1×10-3s-1或更低的解离速率常数(Kd或KD或KD)，并且其与BMP6结合的亲和力比其与非特异性抗原(例如BMP2、BMP5或BMP7)的结合亲和力高至少两倍。短语“识别抗原的抗体”和“抗原的特异性抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
两个实体之间的特异性结合是指，具有至少102M-1、至少5X102M-1、至少103M-1、至少5X103M-1、至少104M-1至少5X104M-1、至少105M-1、至少5X105M-1、至少106M-1、至少5X106M-1、至少107M-1、至少5X107M-1、至少108M-1、至少5X108M-1、至少109M-1、至少5X109M-1、至少1010M-1、至少5X1010M-1、至少1011M-1、至少5X1011M-1、至少1012M-1、至少5X1012M-1、至少1013M-1、至少5X1013M-1、至少1014M-1、至少5X1014M-1、至少1015M-1或至少5X1015M-1的平衡常数(KA)(kon/koff)的结合。
术语“嵌合抗体”(或其抗原结合片段)是一种抗体分子(或其抗原结合片段)，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，从而使抗原结合位点(可变区)与不同或改变种类、效应子功能和/或物种的恒定区连接，或与赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等)连接；或(b)可变区或其部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，可以通过用来自人免疫球蛋白的恒定区替换小鼠抗体的恒定区来修饰小鼠抗体。由于用人恒定区的替换，与原始小鼠抗体相比，嵌合抗体可以在保留其识别抗原的特异性同时在人中具有降低的抗原性。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指，编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质可以由多个功能相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子限定丙氨酸的每个位置，密码子可以改变为所述任何相应的密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，它们是保守修饰变异中的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了每个可能的核酸沉默变异。技术人员将认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(除了AUG——通常是甲硫氨酸的唯一密码子，以及TGG——通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能相同的分子。因此，在每个所述的序列中隐含了编码多肽的每个核酸沉默变异。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对多肽序列的取代、缺失或添加，其导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域公知的。保守修饰变体还包括并且不排除本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。以下八组含有互为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(1984))。在一个实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
本文所用的术语“阻断”是指阻止或阻碍相互作用或过程，例如阻止配体依赖性或配体非依赖性信号传导。
本文所用的术语“识别”是，指抗体、其抗原结合片段发现其构象表位并与其相互作用(例如结合)。
术语“交叉阻断”、“交叉阻断的”、“交叉阻断性”、“竞争”、“交叉竞争”和相关术语在本文中可互换使用，是指在标准竞争结合测定法中抗体或其它结合剂干扰其它抗体或结合剂与BMP6结合的能力。
可使用标准竞争结合测定法测定抗体或其它结合剂能够干扰另一种抗体或结合分子与BMP6结合的能力或程度，从而确定其是否可以称为根据本发明的交叉阻断。一种合适的测定法包括使用Biacore技术(例如通过使用BIAcore 3000仪器(Biacore，Uppsala，Sweden))，其可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。用于测量交叉阻断的另一种测定法使用基于ELISA的方法。
术语“中和”是指抗体与其靶标结合后降低靶标的活性、水平或稳定性；例如，BMP6抗体在结合BMP6后通过至少部分降低BMP6的活性、水平或稳定性(例如信号传导或其在hepcidin水平和贫血中的作用)而中和BMP6。
术语“表位”是指能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面组群组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者的结合丧失，而与后者的结合不丧失。
术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或以其它方式与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由诸如氨基酸BMP6或碳水化合物或糖侧链等分子的化学活性表面组群组成，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是“线性”或“构象的”。
术语“线性表位”是指这样的表位，在该表位上蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点都沿着蛋白质的一级氨基酸序列(连续的)线性存在。
如本文所用，对于IgG抗体，术语“高亲和力”是指，抗体对靶抗原(例如BMP6)的KD为10-8M或更低、10-9M或更低、或10-10M、或10-11M或更低。然而，对于其它抗体同种型，“高亲和力”结合可以变化。例如，对于IgM同种型，“高亲和力”结合是指抗体具有10-7M或更低、或10-8M或更低的KD。
本文所用的术语“人抗体”(或其抗原结合片段)旨在包括，具有可变区的抗体(及其抗原结合片段)，在所述可变区中框架区和CDR区都源于人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，所述恒定区也可以来源于这样的人序列，例如人种系序列或人种系序列的突变形式。本发明的人抗体及其抗原结合片段可以包括不是人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。
本文所用的短语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”(或其抗原结合片段)是指具有基本相同的氨基酸序列或来自相同的遗传来源的多肽，包括抗体、抗体片段、双特异性抗体等。该术语还包括具有单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
术语“人单克隆抗体”(或其抗原结合片段)是指，显示单一结合特异性的抗体(及其抗原结合片段)，其具有框架区和CDR区都源自人序列的可变区。在一个实施方案中，人单克隆抗体由包括与永生化细胞融合的B细胞的杂交瘤产生，其中所述B细胞从基因组包含了人重链转基因和轻链转基因的转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得。
如本文所用的短语“重组人抗体”(或其抗原结合片段)包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体(及其抗原结合片段)，如从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，从转化以表达人抗体的宿主细胞(例如转染瘤(transfectoma))分离的抗体，从重组的、组合人抗体文库分离的抗体，以及通过任何其它方法(包括将全部或部分人免疫球蛋白基因、序列剪接到其它DNA序列)制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有可变区，在所述可变区中框架区和CDR区源自人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，可以对这样的重组人抗体进行体外诱变(或者当使用人Ig序列的转基因动物时，可以进行体内体细胞诱变)，并由此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列，尽管源自人种系VH和VL序列并与人种系VH和VL序列相关，但可以不天然存在于体内的人抗体种系库中。
如本文所用的“人源化”抗体(或其抗原结合片段)是保留非人抗体的反应性而在人中具有较弱免疫原性的抗体(或其抗原结合片段)。这可以通过例如保留非人CDR区并将抗体的剩余部分替换为其人对应物(即恒定区以及可变区的框架部分)来实现。参见，例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92,1988；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498,1991；and Padlan,Molec.Immun.,31:169-217,1994。人工程化技术的其它实例包括但不限于美国专利号5,766,886中公开的Xoma技术。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”是指两个或更多个序列或子序列相同。如使用以下序列比较算法之一、或通过手动比对和目视检查测量的，当为获得比较窗(或指定区域)上的最大对应性而进行比较和比对时，如果两个序列具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域，或者当未指定时在整个序列上，60％同一、任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一)，那么这两个序列是“基本上相同的”。任选地，在长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域、或更优选在长度为100至500个或1000个或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上，存在同一性。任选地，在长度为至少50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域、或更优选在长度为100至500个或1000个或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上，存在同一性。
对于序列比较，通常一个序列作为参照序列，与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。
如本文所使用的“比较窗口”包括，具有选自20至600个、通常约50至约200个、更通常约100至约150个的任何连续位置数的区段，在该区段中一个序列可以与具有相同连续位置数的参照序列在两个序列进行最佳对齐后进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。可以通过以下方法进行用于比较的序列的最佳比对：例如，Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性比对算法，Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988的相似性检索方法,以及这些算法的计算机化执行程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,遗传计算机小组,575Science Dr.,Madison,Wis.)，或手动比对和目视检查(参见，例如,Brent等人,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,Inc.(ringbou ed.,2003))。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别在Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中描述了。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。该算法包括首先通过识别查询序列中长度W的短字元来识别高得分序列对(HSP)，其中所述短字元与数据库序列中相同长度的字元比对时匹配或满足一定正值阈值得分T。T被称为邻域字元得分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始邻域字元命中物作为启动搜索的种子发挥作用，以找到包含它们的较长HSP。字元命中物沿着每个序列向两个方向延伸，只要可以增加累积比对得分即可。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的奖励得分；总是>0)和N(不匹配残基的罚分，总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，停止每个方向上的字元命中物延伸：累积比对得分从其最大实现值下降量X；由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积得分走向零或以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字元长度(N)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及双链比较，作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字元长度3、期望值(E)10、BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4，以及双链比较，作为默认值。
BLAST算法还执行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787,1993)。由BLAST算法提供的一种相似性度量是最小和概率(P(N))，其指示两个核苷酸或氨基酸序列之间因偶然发生匹配的概率。例如，如果测试核酸与参照核酸的比较中最小和概率小于约0.2、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001，则核酸与参照序列相似。
两个氨基酸序列之间的百分比同一性也可以使用已经并入到ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17,1988)来确定，其中使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12、空位罚分4。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用已经并入GCG软件包GAP程序(可从www.gcg.com获得)中的Needleman和Wunsch算法(J.Mol,Biol.48:444-453,1970)来确定，其中使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重16、14、12、10、8、6或4，长度权重1、2、3、4、5或6。
除了上面提到的序列同一性百分比以外，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是，第一核酸编码的多肽与针对第二核酸编码的多肽产生的抗体具有免疫交叉反应性，如下所述。因此，例如，当一个多肽与第二多肽仅仅存在保守取代差异时，通常两个肽基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子或其互补物在严紧条件下彼此杂交，如下所述。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是，这些序列可用相同的引物来扩增。
本文所用的术语“分离的抗体”(或其抗原结合片段)是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(或其抗原结合片段)(例如，特异性结合BMP6的分离的抗体基本上不含特异性结合BMP6以外的抗原的抗体)。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。
术语“同种型”是指由重链恒定区基因提供的抗体类别(例如IgM、IgE、IgG(如IgG1或IgG4))。同种型还包括这些类别的修饰版本，其中已经针对Fc功能进行修饰，例如以增加或减少效应子功能或与Fc受体的结合。
本文所用的术语“Kassoc”或“Ka”或“KA”或“KA”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“Kdis”或“Kd”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。在一个实施方案中，如本文所用的术语“KD”旨在表示解离常数，其从Kd与Ka的比值(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域熟知的方法测定抗体的KD值。一种用于测定抗体KD的方法是使用表面等离子体共振，或使用如
Figure BDA0001382481410000341
系统的生物传感器系统。
本文所用的术语“单克隆抗体”(或其抗原结合片段)或“单克隆抗体(或其抗原结合片段)组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子(或其抗原结合片段)的制剂。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或连接的核酸，这样的核酸可以是合成的、天然存在的和非天然存在的，与参照核酸具有相似的结合特性，并且以与参照核苷酸类似的方式代谢。这样的类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，如下详述，可以通过产生如下序列来实现简并密码子取代，在所述序列中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081,1991；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。
术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能关系。通常，它是指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列在合适的宿主细胞或其它表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子或增强子序列可操作地连接到编码序列。通常，可操作地连接到转录序列的启动子转录调节序列在物理上与转录序列是连续的，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列，例如增强子，不需要在物理上与其所增强转录的编码序列连续或位于与其紧靠的位置。
如本文所用，术语“优化”是指已经改变核苷酸序列以使用在生产细胞或生物体(通常为真核细胞，例如，毕赤酵母细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中优选的密码子编码氨基酸序列。优化的核苷酸序列被工程化以完全或尽可能多地保留起始核苷酸序列原始编码的氨基酸序列，其也称为“亲本”序列。本文中的优化序列已被工程化成具有在哺乳动物细胞中优选的密码子。然而，文中也设想这些序列在其它真核细胞或原核细胞中的优化表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也被称为优化的。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另有说明，特定的多肽序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体。
本文所用的术语“重组人抗体”(或其抗原结合片段)包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体(及其抗原结合片段)，例如从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，从转化以表达人抗体的宿主细胞分离的抗体(例如来自转染瘤)，从重组、组合人抗体文库分离的抗体，以及通过任何其它方法(包括将全部或部分人免疫球蛋白基因、序列剪接到其它DNA)制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有可变区，在所述可变区中框架区和CDR区源自人种系免疫球蛋白序列。然而，在一个实施方案中，这样的重组人抗体可以进行体外诱变(或者当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是源自人种系VH和VL序列并与人种系VH和VL序列相关的序列，而其可以不天然存在于体内的人抗体种系库中。
术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)是指引入了重组表达载体的细胞。应当理解，这些术语不仅旨在指特定的主题细胞，而且还指这样的细胞的后代。因为在后续的世代中可能由于突变或环境影响而发生一些修饰，所以后代可以实际上与亲本细胞不相同，但是仍然包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非另有说明，术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
术语“治疗”包括施用组合物或抗体，以预防或延缓疾病(例如贫血)的症状、并发症或生物化学标记的发作，减轻疾病、病症或疾患的症状、或阻止或抑制疾病、病症或疾患的进一步发展。治疗可以是预防性的(防止或延迟疾病的发作，或防止其临床或亚临床症状的表现)或治疗性的(在疾病表现后抑制或减轻症状)。
术语“载体”旨在表示能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指其中可以连接其它DNA区段的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中其它DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中利用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括其它形式的表达载体，例如用于等同功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，术语“血细胞比容”或“红细胞比容”也称为细胞压积(PCV)或红细胞体积分数(EVF)，其是血液中红细胞的体积(％)。其通常为男性约45％，女性约为50％。它与血红蛋白浓度、白细胞计数和血小板计数一起，被认为是个体的全血计数结果的组成部分。在一个实施方案中，贫血是指异常低的血细胞比容，与红细胞增多症相反(其是异常高的血细胞比容)。
附图说明
图1A显示在报告基因测定试验中拮抗剂抗体5、6和7对BMP活性的抑制。显示了针对BMP2、BMP5、BMP6和BMP7的活性。图1B显示ELISA结合测定试验，测试抗体7与人BMP6、人BMP7、人BMP5、小鼠BMP6、hBaffR、BSA和Neu的结合。在该图和各种其它图中，以及说明书的其它地方，Ab 5＝抗体5；Ab 6＝抗体6；和Ab 7＝抗体7。
图2显示单个剂量大鼠类选(triage)PK研究的药效学曲线。使用抗体5、6和7。在给药(10mg/kg，静脉内)后1小时、6小时、1天、2天、4天、8天和16天，测量血清hepcidin和铁含量。
图3显示BMP6抗体对铁代谢的血清生物标志物的剂量依赖性影响。顶部：在指定剂量下单次静脉内注射抗体6后，随时间推移的血清hIgG浓度。底部：左图是单次抗体6或对照人IgG注射后血清hepcidin浓度的定量分析，右图为血清铁浓度。
图4显示在炎症小鼠模型的ESA抗性贫血中BMP6抗体的治疗性处理。顶部：炎症模型的BA诱导的ESA抗性贫血的实验方案。底部：BA处理后第13天的红细胞生成参数。HGB：血红蛋白；HCT：血细胞比容；RETA：网织红细胞计数；RET-HE：网织红细胞血红蛋白当量。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，相对于BA+EPO+hIgG1。
图5显示通过HDxMS(氢/氘交换偶联质谱法)绘制的线性表位。显示由抗体 7结合的BMP6的表位(人BMP6的残基88-102(QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO:92)))。使用HDXMS发现抗体676(市售的BMP6抗体的人源化版本)与由人BMP6的残基23-35(VSSASDYNSSELK(SEQ IDNO:95))组成的表位结合。
图6显示研究BMP6抗体的安全性和有效性的临床程序第1部分的方案。
图7显示研究BMP6抗体的安全性和有效性的临床程序的剂量调整决定树。
图8显示研究BMP6抗体的安全性和有效性的临床程序第2部分的方案。
图9显示在雄性大鼠中单次给药抗体7的药代动力学特征。
图10显示抗体7对大鼠铁代谢的血清生物标志物的剂量依赖性影响。显示在指定剂量下单次抗体7或对照(赋形剂)注射后血清hepcidin浓度的定量分析。左图显示施用后头24小时内效果的放大视图。
图11显示抗体7对大鼠血清铁的依赖性影响。显示在指定剂量下单次抗体7或对照(赋形剂)注射后血清铁浓度的定量分析。左图显示施用后头24小时内效果的放大视图。
图12显示在猕猴(cynomolgus monkey)中抗体7(3mg/kg)单个剂量静脉内注射的浓度-时间曲线。绘制的是总抗体7浓度(游离的和BMP6结合的)。
图13显示以3mg/kg的剂量单次静脉内注射抗体7后，雄性猕猴中的血清hepcidin和Fe浓度。显示来自三只不同猴子的数据，以及平均值。
具体实施方式
本发明提供了特异性结合BMP6蛋白的抗体及其抗原结合片段、以及药物组合物、制备方法以及使用这些抗体和组合物的方法。
BMP6抗体和其抗原结合片段
本发明提供了特异性结合人BMP6的抗体及其抗原结合片段。
BMP6是分泌的BMP家族生长因子配体，已经被鉴定为铁代谢激素hepcidin的肝表达的关键内源调节剂。不受任何特定理论的束缚，本公开内容表明，BMP6拮抗剂抗体，作为降低hepcidin的疗法，预期可以通过克服对红细胞生成刺激剂(ESA)的抗性而有益于患有铁限制性贫血的患者，所述红细胞生成刺激剂抗性实质上地增加基础疾病的发病率，并且常是不良后果的预测因子。
抗人BMP6抗体的实例是抗体3、5、6和7，其序列列于表1中。
抗体5、6和7均以高亲和力结合人BMP6，具有比对人BMP7、人BMP5和人BMP2高的选择性(参见图1A)。所有这些抗体也都表现出在大鼠中降低血清hepcidin和增加血清铁(见图2)。
为进一步提供靶向该通路可以改善功能性终点的证据，我们测试了BMP6特异性抗体(抗体5至7)在正常小鼠和大鼠中调节铁代谢的血清生物标志物的能力，以及在炎症贫血小鼠模型中逆转ESA抗性贫血的能力。我们发现，给动物单次注射BMP6抗体导致血清铁水平的持续增加，伴随着循环hepcidin的有效抑制。此外，治疗性处理炎症诱发贫血的小鼠，显著改善了响应并行的促红细胞生成素治疗的红细胞生成参数。
在本公开中，在炎症贫血小鼠模型中抑制BMP6信号传导实质上改善了铁依赖性红细胞参数。
本文公开的BMP6拮抗剂抗体代表了一种新型治疗方法，其安全地改善促红细胞生成素低反应性的贫血。不受任何特定理论的束缚，本公开表明，这可通过动员铁存储并使其可用于红细胞区室(erythroid compartment)的需求而发生。
在一个实施方案中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP6蛋白质的亲和力比其对人BMP5或人BMP7蛋白质之任一的亲和力高100倍、500倍或1000倍。不与BMP7结合而针对BMP6的特异性是重要的，因为BMP6的敲除对小鼠不致死。然而，敲除BMP7的小鼠在出生后死亡，有肾、眼和骨缺陷。两个基因中任意基因的单个敲除不会改变心脏发生，但BMP6和BMP7的双重敲除在心脏中表现出几种缺陷和延迟；胚胎死于心脏功能不全。BMP7在预防与纤维化相关的慢性心脏病的进展中是重要的。因此，抗BMP6抗体与BMP7的交叉反应性是不希望的。本文提供的抗体对BMP6的特异性超过BMP7；参见例如表4A。图1B还显示对人BMP6的结合特异性超过人BMP2、BMP5和BMP7蛋白质的证据。相比之下，例如商业上可从R&D Systems获得的BMP6抗体在报告基因测定试验中显示出与BMP7的强交叉反应性，其抑制BMP6和BMP7二者。
本发明的抗体包括但不限于如实施例中所述的分离的人单克隆抗体(参见下文第6部分)。这样的抗人BMP6抗体的实例是抗体3、5、6和7，其序列列于表1中。
成熟抗体7源自NOV0442_VL(YGQ)Germlining/PTM去除，其源自亲本IgG hitNOV0442(VH3_3-15，V111e)。在ELISA结合测定试验中抗体7以高亲和力结合人BMP6，相比于人BMP7具有500倍以上的选择性(即，对人BMP6的亲和力比对人对BMP7的亲合力高500倍以上)。该抗体对人BMP2或BMP5也无可检测的活性。由亲本IgG NOV0442和抗体7识别的BMP6肽显示于图5中。该肽包含人BMP6的氨基酸QTLVHLMNPEYVPKP(SEQ ID NO:92)。与IgG NOV0442和抗体7相反，人源化mAb507(R&D Systems)与人BMP6的序列VSSASDYNSSELK(SEQ ID NO：95)结合。因此，IgG NOV0442和抗体7识别的表位代表新的BMP6表位。抗体7还能体外抑制BMP6与受体的结合。对BMP6与BMPR1A的结合抑制最大59％；对BMPR1B的结合抑制最大85％；并且对RGM-c的结合抑制最大72％。在大鼠中单次10mg/kg处理导致循环hepcidin的持续抑制。在小鼠中估计的最小有效剂量小于或等于0.1mg/kg。在猴子中3mg/kg的单次抗体剂量后血清铁也显示增加，hepcidin显示降低。在使用流产布鲁氏菌(Brucella abortus)抗原模拟贫血的小鼠中，抗体7(2mg/kg)的治疗效果与对长期EPO治疗的临床显著红细胞生成反应一致，其中血红蛋白从基线逐渐增加>2.0g/dL。
在抗体7中，通过LCDR2内的N51Q突变去除潜在的翻译后修饰位点以增加后期产物均一性。源自VH3/λ1框架的该抗体被工程化，以匹配最接近的人种系序列：在VH中V40A突变，在VL中D1Q、I2S突变、和引入氨基酸Y49和G50以修复其中最初缺失这2个残基的框架。
该工作产生了抗体7(＝NOV0958＝NOV0806_VH[V40A]_VL[D1Q,I2S,Y49,G50,N51Q])。
抗体3、5、6和7都显示出，与对人BMP2、BMP5或BMP7蛋白相比，对人BMP6蛋白的高特异性。预测所有这些抗体的表位相同，因为亲和力成熟之前其全部源自单一亲本Fab。例如，抗体3在HCDR2的亲和力成熟之前与抗体5和7共享相同的Fab克隆。抗体5源自NOV0442(VH3_3-15,VI1_1e)→NOV0442_VL(YGQ)→(HCDR2亲和力成熟)→抗体5。抗体3源自NOV0442(VH3_3-15,VI1_1e)→NOV0442_VL(YGS)→(HCDR2亲和力成熟)→抗体3。在实施例中提供了关于产生本文所述的抗体的其它细节。
本发明提供特异性结合BMP6(例如人BMP6蛋白)的抗体，所述抗体包含表1所列的VH结构域。本发明还提供特异性结合BMP6蛋白的抗体，所述抗体包含VH CDR，所述VH CDR具有表1中列出的任一VH CDR的氨基酸序列。特别地，本发明提供特异性结合BMP6蛋白的抗体，所述抗体包含一个、二个、三个、四个、五个或更多个具有表1中列出的任何VH CDR的氨基酸序列的VH CDR(或备选地由其组成)。
本发明还提供特异性结合BMP6的抗体及其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1所列的VH氨基酸序列(或备选地由其组成)，其中在框架序列(例如，不是CDR的序列)中不超过约10个氨基酸已被突变(其中，作为非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)。本发明还提供特异性结合BMP6的抗体及其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1所列的VH氨基酸序列(或替代地由其组成)，其中在框架序列(例如，不是CDR的序列)中不超过10个氨基酸已被突变(其中，作为非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)。
本发明还提供特异性结合BMP6的抗体及其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1所列的VH氨基酸序列(或备选地由其组成)，其中在框架序列(例如，不是CDR的序列)中不超过约20个氨基酸已被突变(其中作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)。本发明还提供特异性结合BMP6的抗体及其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1所列的VH氨基酸序列(或备选地由其组成)，其中在框架序列(例如，不是CDR的序列)中不超过20个氨基酸已被突变(其中作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)。
本发明还提供特异性结合BMP6的抗体及其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1所列的VL氨基酸序列(或备选地由其组成)，其中在框架序列(例如，不是CDR的序列)中不超过约10个氨基酸已被突变(其中作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)。本发明还提供特异性结合BMP6的抗体及其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1所列的VL氨基酸序列(或备选地由其组成)，其中在框架序列(例如，不是CDR的序列)中不超过10个氨基酸已被突变(其中作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)。
本发明还提供特异性结合BMP6的抗体及其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1所列的VL氨基酸序列(或备选地由其组成)，其中在框架序列(例如，不是CDR的序列)中不超过约20个氨基酸已被突变(其中作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)。本发明还提供特异性结合BMP6的抗体及其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1所列的VL氨基酸序列(或备选地由其组成)，其中在框架序列(例如，不是CDR的序列)中不超过20个氨基酸已被突变(其中作为各种非限制性实例，突变是添加、取代或缺失)。
本发明提供特异性结合BMP6蛋白的抗体及其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1所列的VL结构域。本发明还提供特异性结合BMP6蛋白的抗体及其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含VL CDR，所述VL CDR具有表1所列的任一VL CDR的氨基酸序列。特别地，本发明提供特异性结合BMP6蛋白的抗体及其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含一个、二个、三个或更多个具有表1中列出的任何VL CDR的氨基酸序列的VL CDR(或备选地由其组成)。
本发明的其它抗体及其抗原结合片段包括已经突变的氨基酸，但在CDR区中仍与表1所述序列中描述的CDR区具有至少60、70、80、90或95百分比同一性。在一个实施方案中，其包括突变的氨基酸序列，其中CDR区，当与表1所述序列中描述的CDR区相比时，有不超过1、2、3、4或5个氨基酸已被突变。
本发明还提供编码特异性结合BMP6蛋白的抗体及其抗原结合片段的VH、VL、全长重链以及全长轻链的核酸序列。这样的核酸序列可以被优化以用于在哺乳动物细胞中表达(例如，表1显示了抗体3、5、6和7的重链和轻链的实例核酸序列)。
表1.本发明的BMP6抗体实例
Figure BDA0001382481410000431
Figure BDA0001382481410000441
Figure BDA0001382481410000451
Figure BDA0001382481410000461
Figure BDA0001382481410000471
Figure BDA0001382481410000481
Figure BDA0001382481410000491
Figure BDA0001382481410000501
Figure BDA0001382481410000511
Figure BDA0001382481410000521
Figure BDA0001382481410000531
本发明的其它抗体及其抗原结合片段包括其中氨基酸或编码氨基酸或核酸已被突变、但仍与表1所述序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％百分比同一性的那些抗体及其抗原结合片段。在一个实施方案中，其包括突变氨基酸序列，其中当与表1所述序列中描述的可变区相比时，在可变区中有不超过1、2、3、4或5个氨基酸被突变，同时保持基本上相同的治疗活性。
在另一个具体实施方案中，本发明提供结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含分别为SEQ ID NO：9、10和11的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：19、20和21的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在另一个具体实施方案中，本发明提供结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含分别为SEQ ID NO：12、13和14的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：22、23和24的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在另一个具体实施方案中，本发明提供结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含分别为SEQ ID NO：29、30和31的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：39、40和41的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在另一个具体实施方案中，本发明提供结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含分别为SEQ ID NO：32、33和34的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：42、43和44的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在另一个具体实施方案中，本发明提供结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含分别为SEQ ID NO：49、50和51的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：59、60和61的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在另一个具体实施方案中，本发明提供结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含分别为SEQ ID NO：52、53和54的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：62、63和64的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在另一具体实施方案中，本发明提供结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含分别为SEQ ID NO：69、70和71的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：79、80和81的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在另一个具体实施方案中，本发明提供结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含分别为SEQ ID NO：72、73和74的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及分别为SEQ IDNO：82、83和84的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
由于这些抗体中的每一个均可以与BMP6结合，所以VH、VL、全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码氨基酸序列的核苷酸序列)可以“混合并匹配”以产生本发明的其它BMP6结合抗体及其抗原结合片段。可以使用本领域已知的结合测定试验(例如，ELISA和实施例部分中描述的其它测定)来测试这种“混合并匹配”的BMP6结合抗体。当这些链被混合和匹配时，来自特定VH/VL对的VH序列应当用结构相似的VH序列替换。类似地，来自特定全长重链/全长轻链对的全长重链序列应当用结构相似的全长重链序列替换。类似地，来自特定VH/VL对的VL序列应当用结构相似的VL序列替换。同样，来自特定全长重链/全长轻链对的全长轻链序列应当用结构相似的全长轻链序列替换。
另一方面，本发明提供包含如表1所述的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的BMP6结合抗体。使用Kabat系统(Kabat等人1991Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242)或使用Chothia系统[Chothia等人1987J.Mol.Biol.196:901-917；and Al-Lazikani等人1997J.Mol.Biol.273:927-948]描绘CDR区。
考虑到这些抗体中的每一个都可以结合BMP6，并且抗原结合特异性主要由CDR1、2和3区提供，故VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列可以“混合并匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以混合并匹配，但每个抗体必须含有VH CDR1、2和3以及VL CDR1、2和3以产生本发明的其它BMP6结合分子。可以使用本领域已知的结合测定试验和实施例中描述的那些结合测定试验(例如，ELISA)来测试这样的“混合并匹配的”BMP6结合抗体。当VH CDR序列被混合并匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当由结构相似的CDR序列替换。类似地，当VL CDR序列被混合并匹配时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应由结构相似的CDR序列替换。对于本领域技术人员而言，很明显地，可以通过用与本文所示的本发明单克隆抗体的CDR序列结构相似的序列突变一个或多个VH和/或VL CDR区序列来产生新的VH和VL序列。
因此，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合区，其包含含有选自SEQ IDNO：29、49、69、12、32、52、72或9中任意的氨基酸序列的重链可变区CDR1；含有选自SEQ IDNO：10、30、50、70、13、33、53或73中任意的氨基酸序列的重链可变区CDR2；含有选自SEQ IDNO：11、31、51、71、14、34、54或74中任意的氨基酸序列的重链可变区CDR3；含有选自SEQ IDNO：19、39、59、79、22、42、62或82中任意的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；含有选自SEQ IDNO：20、40、60、80、23、43、63或83中任意的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和含有选自SEQID NO：21、41、61、81、24、44、64或84中任意的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；其中抗体特异性结合BMP6。
在一个实施方案中，特异性结合BMP6的抗体是表1中描述的抗体。
如本文所用，如果抗体的可变区或全长链是从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得的，则该人抗体包含作为特定种系序列的“产物”或“源自”特定种系序列的重链或轻链可变区或全长重链或轻链。这样的系统包括，用感兴趣的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或用感兴趣的抗原筛选噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。由此，可以通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择在序列上最接近(即最大％同一性)人抗体序列的人种系免疫球蛋白序列，以鉴定作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体。由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入的定点突变，与种系序列相比，作为特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以含有氨基酸差异。然而，在VH或VL框架区中，所选择的人抗体通常在氨基酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90％的同一性，并且含有这样的氨基酸残基，通过所述氨基酸残基，与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)相比，可以将该人抗体鉴别为人的。在某些情况下，人抗体可以在氨基酸序列上与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％、或至少95％、或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。通常，重组人抗体将显示在VH或VL框架区中与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体可以显示与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个、甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。
BMP家族成员和hepcidin
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合BMP6的抗体或其结合片段。在一个实施方案中，抗体或其结合片段描述于表1中。
在一个实施方案中，抗体或其结合片段特异性结合BMP6，但不结合其它BMP蛋白(例如BMP2、BMP5或BMP7)。
BMP6是分泌的BMP家族生长因子配体，其成熟活性形式是30kDa二硫键连接的同二聚体。该蛋白质是TGF-β超家族的成员。骨形态生成蛋白以其诱导骨和软骨生长的能力而被知晓。BMP6能够在间充质干细胞中诱导所有的成骨标志物。
骨形态生成蛋白(BMP)是可诱导异位骨生长的分泌型信号传导分子家族。BMP是转化生长因子-β(TGF-β)超家族的一部分。BMP最初通过脱矿化骨提取物在体内在骨外位置诱导软骨内成骨的能力而获得鉴定。根据其在胚胎发生早期的表达，提出由该基因编码的BMP在早期发育中具有作用。此外，该BMP与BMP5和BMP7密切相关的事实引起对其可能的骨诱导活性的猜测。已经鉴定了BMP6的其它功能，如Nature Genetics April；41[4]：386-8中所描述的。
敲除BMP6的小鼠是能活的和可育的，并且显示正常的骨和软骨发育。
BMP6是hepcidin的关键调节剂，hepcidin是由肝脏分泌的小肽，其是哺乳动物中铁代谢主要调节物。hepcidin控制十二指肠中吸收的膳食铁的量以及控制网状内皮细胞释放的铁。各种刺激因素可以使hepcidin上调，包括炎症和铁超载，并且贫血、缺氧和缺铁引起hepcidin下调。
不受任何特定理论的约束，本公开表明，BMP6拮抗剂抗体作为降低hepcidin的疗法，预期可以通过克服对红细胞生成刺激剂(ESA)的抗性而有益于患有铁限制性贫血的患者，所述对红细胞生成刺激剂(ESA)的抗性实质性地增加基础疾病的发病率，并且常是不良后果的预测因子。通过与BMPR1和BMPR2受体的相互作用，BMP6诱导受体二聚化和hepcidin的转录。在肝细胞和肌肉细胞中BMP6还与HJV共受体结合。
因此，已知BMP6增加hepcidin的表达。已知hepcidin是参与铁稳态的关键激素。高的hepcidin水平与ACD中的铁限制性红细胞生成相关。
WO 2010/056981公开了向小鼠施用BMP6抗体降低了hepcidin并增加了铁。
BMP6在本领域进一步描述于，例如：Hahn等人1992Genomics 14:759-62；Sauermann等人1993J.Neurosci.Res.33:142；Celeste等人1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:9843；Schluesener等人1995Atherosclerosis 113:153；Gitelman等人1994J.CellBiol.126:1595；Barnes等人1997W.J.Urol.13:337；和Hamdy等人1997Cancer Res.57:4427。
BMP2与其它骨形态生成蛋白一样，在骨和软骨的发育中起重要作用。它涉及hedgehog信号通路、TGF-β信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用。它也参与心肌细胞分化和上皮至间充质转化。BMP2具有许多重要的作用，如Kishimoto等人1997Dev.124：4457；Ma等人2005Dev.132：5601；Wang等人Bone 48：524；和Rosen 2009Cyt.GrowthFact.Rev.20:475所述。因此优选BMP6抗体不结合BMP2。
BMP2进一步描述于例如：Sampath等人1990J.Biol.Chem.265:13198；Chen等人2004Growth Factors 22:233；Marie等人2002Histol.Histopath.17:877；Nickel等人2001J.Bone Joint Surg.83-A Supp.1:S7-14；Kirsch等人2000FEBS Lett.468:215；Kirsch等人2000EMBO J.19:3314；Gilboa等人2000Mol.Biol.Cell 11:1023。
BMP5也是TGF-β超家族的成员。像其它BMP一样，已知其具有诱导骨和软骨发育的能力。BMP5在小梁网和视神经头中表达，可能在发育和正常功能中起作用。它也在肺和肝中表达。
关于BMP5的其它信息是本领域已知的，例如Hahn等人1992Genomics 14:759；Beck等人2003BMC Neurosci.2:12；Celeste等人1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9843；和Sakaue等人1996Biochem.Biophys.Res.Comm.221:768。
BMP7也是TGF-β超家族的成员。与BMP蛋白家族的其它成员一样，它在间充质细胞转化为骨和软骨中起关键作用。它诱导SMAD1和SMAD5的磷酸化，其又诱导许多成骨基因的转录。
如上所述，敲除BMP6的小鼠是能活的和可育的，并且显示正常的骨和软骨发育。然而，敲除BMP7的小鼠在出生后死亡，伴有肾、眼和骨缺陷。两个基因中任一个的单独敲除不会改变心脏发生，但是BMP2和BMP7的双敲除在心脏中表现出若干缺陷和延迟；胚胎死于心脏功能不全。BMP7在预防与纤维化相关的慢性心脏病的进展中是重要的。因此，抗BMP6抗体与BMP7的交叉反应性是不希望的。
与BMP7相关的其它信息在本领域中提供，例如Hahn等人1992Genomics 14:759；Chen等人2004Growth Factors 22:233；Itoh等人2001EMBO J.20:4132；Zeisberg等人2003Am.J.Physiol.Renal Physiol.285:F1060；Kallui等人.2009J.Clin.Invest.119:1420；和Wang等人2001J.Am.Soc.Neph.12:2392。
hepcidin是一种肽激素，也称为HAMP(hepcidin抗微生物蛋白质或肽)。
最近在小鼠进化中的基因复制事件导致了小鼠中存在两个相似的hepcidin基因：hepcidin1和hepcidin2。Ilyin等人2003FEBS Lett.542：22-26。小鼠hepcidin2缺少在哺乳动物hepcidin中发现的若干保守残基。Lou等人2004Blood 103:2816-2821。
hepcidin基因产物参与维持铁的稳态，并且对于调节巨噬细胞中的铁储存和肠的铁吸收是必要的。这些肽表现出抗微生物活性。
前原蛋白(或前激素原或preprohepcidin)(84aa)和原蛋白(或激素原或prohepcidin)(60aa)被加工成20、22和25个氨基酸的成熟肽。25-aa肽主要由肝脏分泌，被认为是铁代谢的“主调节剂”。20和22-aa代谢物存在于尿液中。hepcidin的N端区是功能所需要的；5个N-末端氨基酸的缺失导致功能丧失。
活性hepcidin肽富含半胱氨酸，其形成稳定其β片层结构的分子内键。
hepcidin主要在肝脏合成，少量被发现在其它组织中合成。Bekri等人2006Gastroent.131:788-96。
25-aa hepcidin肽主要由肝脏分泌，其被认为是铁代谢的“主调节剂”。hepcidin通过结合铁输出通道膜铁转运蛋白而抑制铁转运，所述膜铁转运蛋白位于肠道的肠细胞基底外侧表面和网状内皮细胞(巨噬细胞)的质膜上。通过抑制膜铁转运蛋白，hepcidin防止肠道的肠细胞向肝门静脉系统分泌铁，从而功能上减少铁的吸收。通过抑制膜铁转运蛋白也可防止巨噬细胞释放铁；因而hepcidin维持铁稳态。hepcidin活性也是慢性炎症(如炎症性肠病、慢性心力衰竭、癌症、类风湿性关节炎和肾功能衰竭等)贫血中见到的铁隔离(sequestration)的部分原因。
hepcidin基因中的突变引起2B型血色素沉着症，也称为青少年血色素沉着症，是一种由严重铁过载引起的疾病，导致心肌病、肝硬化和内分泌衰竭。大多数青少年血色素沉着病例是由于hepcidin生成的调节剂hemojuvelin的突变引起的。
工程化过表达hepcidin的遗传修饰小鼠在出生后不久便死亡，伴有严重缺铁，这表明hepcidin在铁调节中起中心的而非冗余的作用。hepcidin与炎症贫血相关联的第一个证据来自研究人员检查的两名肝脏肿瘤患者的组织，所述患者患有对铁补充剂不反应的严重小细胞性贫血(microcytic anemia)。肿瘤组织过度生成hepcidin，手术去除肿瘤治愈贫血。
存在许多疾病，其中不能充分吸收铁导致缺铁和缺铁性贫血。治疗取决于hepcidin水平，因为如果hepcidin阻碍肠的吸收，口服治疗可能无效。
在一个实施方案中，BMP6抗体或其结合片段的施用降低hepcidin的活性和/或水平，因此可用于治疗贫血。在一个实施方案中，本发明涉及在有需要的患者中降低hepcidin的活性或水平的方法，所述方法包括向患者施用BMP6抗体或其抗原结合片段的步骤。在一个实施方案中，hepcidin的活性或水平降低至少50％。
hepcidin的抑制剂，例如BMP6抗体，可用于治疗hepcidin相关疾病。这包括，与hepcidin和/或突变体和/或野生型和/或突变hepcidin的过表达相关的任何疾病，和/或由hepcidin和/或突变体的存在和/或野生型和/或突变hepcidin的过表达和/或hepcidin通过尿的减少肾清除可引起疾病进展的增强或预后的恶化的疾病。hepcidin相关疾病的非限制性实例包括：贫血、缺铁性红细胞生成、低铁血症、膳食铁吸收受损、铁隔离(ironsequestration)、炎症贫血(AI)、动脉粥样硬化、糖尿病和多神经变性疾病(multipleneurodegenerative disorder)如阿尔茨海默病、帕金森病和弗里德里希共济失调、心力衰竭、慢性肾脏疾病、心肾贫血综合征、感染、失血、溶血、维生素B12或叶酸缺乏、甲状旁腺功能亢进、血红蛋白病和恶性肿瘤、癌症、艾滋病、手术、发育迟缓和/或脱发。在一个实施方案中，受试者是透析患者。在一个实施方案中，hepcidin相关疾病是贫血，受试者是透析患者。铁和ESA难治性贫血的流行率在长期血液透析患者中较高。
贫血包括例如慢性疾病的贫血(ACD)、慢性肾脏疾病(CKD)贫血、癌症贫血、红细胞生成刺激剂(ESA)抗性贫血和/或铁限制性贫血。
CKD贫血是慢性肾脏疾病的常见和早期并发症。癌症贫血是由血液恶性肿瘤和一些实体瘤引起的。如本文所定义，该术语还包括化疗诱导的贫血，其是由化疗剂引起的贫血。慢性肾脏疾病的贫血可使糖尿病性神经病变、心血管疾病、视网膜病变和其它问题恶化。癌症相关的贫血与死亡风险增加有关。
一些慢性疾病如癌症、肾脏疾病和自身免疫性疾病可导致贫血。过度活跃的炎性细胞因子可引起铁稳态的异常调节、降低红细胞生成以及减少红细胞寿命。贫血的一些治疗包括施用ESA、促红细胞生成素、铁(作为膳食补充剂)或输血。
hepcidin是参与铁稳态的关键激素。hepcidin的高水平与ACD中的铁限制性红细胞生成相关。已知BMP6增加hepcidin的表达。
BMP6的各种类型的抗体及其抗原结合片段如下所述。
同源抗体
在另一个实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包含与表1所述序列同源的氨基酸序列，所述抗体结合BMP6，并保留表1中所述抗体的期望功能特性。
例如，本发明提供包含重链可变区和轻链可变区的分离的单克隆抗体(或其功能性抗原结合片段)，其中重链可变区包含与选自SEQ ID NO:16、36、56或76的氨基酸序列具有至少80％、至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列；轻链可变区包含与选自SEQ IDNO：26、46、66或86的氨基酸序列具有至少80％、至少90％、或至少95％同一性的氨基酸序列；所述抗体特异性结合BMP6蛋白，并且抗体可以在溶血测定试验中抑制红细胞裂解，其中所述的溶血测定试验是本领域已知的。在一个具体实例中，当使用以100pM人BMP6重构的人BMP6耗竭的血清时，这种抗体在溶血测定试验中具有20-200pM的IC 50值。
在一个实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与表1所示的序列至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方案中，除了在不超过1、2、3、4或5个氨基酸位置的氨基酸取代之外，VH和/或VL氨基酸序列可以相同。可以通过诱变(例如，定点或PCR介导的诱变)分别编码SEQ ID NO：16、36、56或76；和26、46、66或86的核酸分子，获得与表1所述的VH和VL区具有高度(即，80％或更高)同一性的VH和VL区的抗体，然后使用本文所述的功能测定试验测试编码的改变抗体所保留的功能。
在一个实施方案中，全长重链和/或全长轻链氨基酸序列可以与表1所示的序列至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。具有分别与SEQ ID NO:18、38、58或78中任意的全长重链和SEQ ID NO:28、48、68或88中任意的全长轻链高度(即，80％或更高)同一的全长重链和全长轻链的抗体，可以通过诱变(例如，定点或PCR介导的诱变)分别编码这样的多肽的核酸分子获得，然后使用本文所述的功能测定试验测试编码的改变抗体所保留的功能。
在一个实施方案中，全长重链和/或全长轻链核苷酸序列可以与表1所示的序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方案中，重链和/或轻链可变区的核苷酸序列可以与表1所示的序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
如本文所使用的，两个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置数目的函数(即，％同一性等于相同位置的数目/位置总数X100)，其中考虑为了两个序列的最佳比对需要引入的空位数、以及每个空位的长度。两个序列之间的序列比较和百分比同一性的确定可以使用如下面非限制性实施例中描述的数学算法来完成。
另外或替代地，本发明的蛋白质序列还可以用作“查询序列”，以对公共数据库进行搜索以例如识别相关序列。例如，这样的搜索可以使用Altschul等人，1990J.Mol.Biol.215:403-10的BLAST程序(版本2.0)进行。
具有保守修饰的抗体
在一个实施方案中，本发明的抗体具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个具有基于本文所述抗体的规定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中抗体保留了本发明的BMP6结合抗体及其抗原结合片段的期望功能性质。因此，本发明提供由包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区组成的分离的单克隆抗体或其功能性抗原结合片段，其中：重链可变区CDR1包含选自SEQ ID NO：29、49、69、12、32、52、72或9之任一的氨基酸序列或其保守变体；重链可变区CDR2包含选自SEQ ID NO：10、30、50、70、13、33、53或73之任一的氨基酸序列或其保守变体；重链可变区CDR3包含选自SEQ ID NO：11、31、51、71、14、34、54或74之任一的氨基酸序列或其保守变体；轻链可变区CDR1包含选自SEQ IDNO：19、39、59、79、22、42、62或82之任一的氨基酸序列或其保守变体；轻链可变区CDR2包含选自SEQ ID NO：20、40、60、80、23、43、63或83之任一的氨基酸序列或其保守变体；和轻链可变区CDR3包含选自SEQ ID NO：21、41、61、81、24、44、64或84之任一的氨基酸序列或其保守变体；所述抗体或其抗原结合片段特异性结合BMP6，并在溶血测定试验中抑制红细胞裂解。
在一个实施方案中，本发明的优化用于在哺乳动物细胞中表达的抗体具有全长重链序列和全长轻链序列，其中这些序列中的一个或多个具有基于本文所述的抗体的规定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明的BMP6结合抗体及其抗原结合片段的期望功能特性。因此，本发明提供优化用于在哺乳动物细胞中表达的分离的单克隆抗体针，其由全长重链和全长轻链组成，其中：全长重链具有选自SEQ ID NO：18、38、58或78和其保守修饰的氨基酸序列；全长轻链具有选自SEQ ID NO：28、48、68或88和其保守修饰的氨基酸序列；所述抗体特异性结合BMP6；并且抗体在本文所述的溶血测定试验中抑制红细胞裂解。在一个具体实施方案中，当使用以100pM人BMP6重构的人BMP6耗竭的血清时，这种抗体在溶血测定试验中具有20-200pM的IC 50值。
结合相同表位的抗体
本发明提供与表1中所示的BMP6结合抗体结合相同表位的抗体。由抗体7结合的表位如图5所示。因此，可以基于在BMP6结合测定试验中与本发明的其它抗体及其抗原结合片段交叉竞争(例如，以统计学上显著的方式竞争性抑制结合)的能力来鉴定另外的抗体。测试抗体能够抑制本发明的抗体及其抗原结合片段与BMP6蛋白结合，说明测试抗体可与本发明抗体竞争结合BMP6；根据非限制性理论，这样的抗体可以与其竞争的抗体结合BMP6上相同或相关(例如，结构上相似或空间上接近)的表位。在某个实施方案中，与本发明的抗体及其抗原结合片段结合相同的BMP6表位的抗体是人单克隆抗体。可以如本文所述制备和分离这样的人单克隆抗体。
一旦确定了抗原上的期望表位，就可以产生针对该表位的抗体，例如使用本发明中描述的技术。或者，在开发过程中，抗体的产生和表征可以阐明关于期望表位的信息。然后根据该信息，可以竞争性筛选结合相同表位的抗体。实现这一点的方法是进行交叉竞争研究以发现彼此竞争性结合(例如抗体竞争性结合抗原)的抗体。国际专利申请WO2003/48731中描述了基于交叉竞争而对抗体进行“分组”(binning)的高通量方法。如本领域技术人员将理解的，实际上抗体可以特异性结合的任何物质都可以是表位。表位可以包括抗体结合的那些残基。
通常，对特定靶抗原特异的抗体将优先识别蛋白质和/或大分子复杂混合物中靶抗原上的表位。
可以使用本领域公知的任何数量的表位作图技术来鉴定包括表位的给定多肽的区域。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66(Glenn E.Morris,Ed.,1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。例如，可以通过例如如下方式确定线性表位：在固体支持物上并行地合成大量的肽，这些肽对应于蛋白质分子的部分，使肽与抗体反应而肽仍然连接到支持物上。这样的技术是本领域已知的，例如描述在美国专利号4,708,871；Geysen等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:3998-4002；Geysen等人,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:78-182；Geysen等人,(1986)Mol.Immunol.23:709-715。类似地，通过确定氨基酸BMP6的空间构象，如通过例如氢/氘交换、x射线晶体学和二维核磁共振，可以容易地鉴定构象表位。参见，例如，Epitope Mapping Protocols，同上。还可以使用标准抗原性和亲水性图来鉴定蛋白质的抗原性区域，如使用例如可从OxfordMolecular Group获得的Omiga版本1.0软件程序计算。该计算机程序采用Hopp/Woods方法,Hopp等人,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA 78:3824-3828，用于确定抗原性谱；和Kyte-Doolittle技术,Kyte等人,(1982)J.MoI.Biol.157:105-132，用于确定亲水性图。
工程化和修饰的抗体
还可以使用具有本文所示的一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始材料，工程化构建修饰的抗体，来制备本发明的抗体，其中修饰的抗体可以具有与起始抗体不同的性质。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内(例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内)的一个或多个残基来工程化抗体。另外或替代地，可以通过修饰恒定区内的残基来工程化抗体，例如以改变抗体的(一种或多种)效应子功能。
可以进行的可变区工程化的一个类型是CDR嫁接。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，各抗体之间CDR内的氨基酸序列比CDR以外的序列更多样化。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包括来自特定天然存在的抗体的CDR序列，其嫁接到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上(参见例如，Riechmann,L等人,1998 Nature 332:323-327；Jones,P.等人,1986Nature321:522-525；Queen,C.等人,1989Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86:10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539,和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
这样的框架序列可以从公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的公开文献中获得。例如，可以在“VBase”人种系序列数据库(可从互联网www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得)以及Kabat,E.A.,等人,1991Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242；Tomlinson,I.M.,等人,1992J.fol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等人,1994Eur.JImmunol.24:827-836中，找到人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列；这些文献各自的内容通过引用明确地并入本文。
用于本发明抗体及其抗原结合片段的框架序列的实例是，在结构上与本发明所选的抗体及其抗原结合片段使用的框架序列类似的那些，例如本发明的单克隆抗体所使用的共有序列和/或框架序列。可以将VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列嫁接到与框架序列所来源的种系免疫球蛋白基因中存在的框架区具有相同序列的框架区上，或者CDR序列可以嫁接到与种系序列相比含有一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现，在某些情况下，有利的是突变框架区内的残基以维持或增强抗体的抗原结合能力(参见例如，Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基，从而改善感兴趣抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)，称作“亲和力成熟”。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并这可以在本文所述的和实施例中提供的体外或体内测定试验中评估对抗体结合或其它感兴趣的功能性质的影响。可以引入保守修改(如上所述)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，CDR区域内通常改变不超过一个、二个、三个、四个或五个残基。
将抗原结合结构域嫁接到支架的替代框架中
可以使用多种抗体/免疫球蛋白框架或支架，只要所得的多肽包含至少一个特异性结合BMP6的结合区域即可。这样的框架或支架包括5种主要独特型的人免疫球蛋白、其抗原结合片段，并且包括其它动物物种的免疫球蛋白，优选具有人源化方面。在这方面，单重链抗体(如在驼类动物中鉴定的重链抗体)是特别有意义的。本领域技术人员继续发现和开发新的框架、支架和片段。
一方面，本发明涉及使用非免疫球蛋白支架产生基于非免疫球蛋白的抗体的方法，其中本发明的CDR可以嫁接到所述的非免疫球蛋白支架上。可以使用已知的或未来的非免疫球蛋白框架和支架，只要它们可以包含对靶BMP6蛋白特异的结合区域即可。已知的非免疫球蛋白框架或支架包括但不限于纤连蛋白(Compound Therapeutics，Inc.，Waltham，Mass)、锚蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、结构域抗体(Domantis,Ltd.,Cambridge,Mass.,和Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂质运载蛋白(lipocalin)(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小模块化免疫药物(TrubionPharmaceuticals Inc.,Seattle,Wash)、maxybodies(Avidia,Inc.,Mountain View,Calif)、蛋白A(Affibody AG，Sweden)和affilin(γ-晶状体蛋白或泛素)(SciI ProteinsGmbH，Halle，Germany)。
纤连蛋白支架基于III型纤连蛋白结构域(例如，III型纤连蛋白的第十模块(10Fn3结构域))。III型纤连蛋白结构域具有7或8个β链，其分布在两个β片之间，它们本身彼此堆叠以形成蛋白质的核心；并且还包含将β链彼此连接的环(类似于CDR)，这些环是溶剂暴露的。在β片层夹心的每个边存在至少三个这样的环，其中所述边是垂直于β链方向的蛋白质的边界(参见美国专利号6,818,418)。这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白，尽管整体折叠与最小功能性抗体片段(重链可变区，其在骆驼和美洲驼IgG中包含整个抗原识别单元)的整体折叠密切相关。由于这种结构，非免疫球蛋白抗体模拟抗体的抗原结合特征，在性质和亲和力上相似。这些支架可用于体外的环随机化和改组策略中，其类似于抗体在体内的亲和力成熟过程。这些基于纤连蛋白的分子可以用作支架，其中可以使用标准克隆技术，用本发明的CDR替换分子的环区。
锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白来源的重复模块的蛋白质作为支架承载可用于结合不同靶标的可变区。锚蛋白重复模块是由两个反平行α-螺旋和β-转角组成的33个氨基酸的多肽。可变区的结合大多通过使用核糖体展示来优化。
Avimer衍生自含有天然A结构域的蛋白质，如LRP-1。这些结构域天然地用于蛋白质-蛋白质相互作用，而在人类中超过250种蛋白质在结构上基于A结构域。Avimer由多个通过氨基酸接头连接的不同“A-结构域”单体(2-10)组成。可以使用例如美国专利申请公开号20040175756；20050053973；20050048512和20060008844中描述的方法，产生可以与靶抗原结合的Avimer。
Affibody亲和配体是由三螺旋束组成的小的简单蛋白质，以蛋白A的IgG结合结构域之一的支架为基础。蛋白A是来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白质。该支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个被随机化以产生具有大量配体变体的Affibody文库(参见例如美国专利号5,831,012)。Affibody分子模拟抗体，与150kDa的抗体分子量相比，Affibody的分子量为6kDa。尽管其尺寸小，Affibody分子的结合位点与抗体的结合位点相似。
Anticalin是由Pieris ProteoLab AG公司开发的产品。它们源自脂质运载蛋白，其是通常参与化学敏感或不溶性化合物的生理运输或储存的广泛存在的小而稳健的一组蛋白质。几种天然脂质运载蛋白存在于人组织或体液中。蛋白质结构让人联想到免疫球蛋白，在刚性框架的顶部有高变环。然而，与抗体或其重组片段不同，脂质运载蛋白由具有160至180个氨基酸残基的单个多肽链组成，仅略微大于单个免疫球蛋白结构域。构成结合口袋的四个环的组显示出显著的结构可塑性，并且可以容忍各种侧链。因此，结合位点可以在专利方法中重塑，以便以高亲和力和特异性识别不同形状的规定靶分子。脂质运载蛋白家族中的一种蛋白质，Pieris Brassicae的胆汁三烯结合蛋白(bilin-binding protein，BBP)已被用于通过诱变四环组来开发anticalin。描述anticalin的专利申请的一个例子在PCT公开号WO 199916873中。
Affilin分子是小的非免疫球蛋白，其基于针对蛋白质和小分子的特异亲和力而设计。新的affilin分子可以非常快速地从两个文库中选择，每个文库基于不同的人源性支架蛋白。Affilin分子不显示与免疫球蛋白蛋白的任何结构同源性。目前，使用两个affilin支架，其中之一是γ晶状体蛋白(一种人结构性眼晶状体蛋白质)，另一个是“泛素”超家族蛋白质。两个人支架都非常小，显示出高温稳定性和几乎抗pH变化和变性剂的抗性。这种高稳定性的主要原因是蛋白质展开的β片层结构。在WO200104144中描述了γ晶状体蛋白衍生的蛋白质的实例，WO2004106368中描述了“泛素样”蛋白质的实例。
蛋白质表位模拟物(PEM)是模拟蛋白质的β-发夹二级结构的中等大小、环状、肽样分子(MW1-2Da)，蛋白质的β-发夹二级结构是参与蛋白质-蛋白质相互作用的主要二级结构。
可以使用本领域已知的方法产生人BMP6结合抗体。例如，用于将非人抗体转化成工程化的人抗体的人化技术(humaneering technology)。美国专利公开号20050008625描述了一种体内方法，其用人可变区替代抗体中的非人抗体可变区、同时保持相同的或提供相对于非人抗体更好的结合特性。该方法依赖于表位引导的、用全人抗体替代非人参照抗体的可变区。所得人抗体通常在结构上与参照非人抗体无关，但与参照抗体结合相同抗原上的相同表位。简而言之，在响应于测试抗体与抗原结合的报告系统存在下，在细胞中在“竞争者”和参照抗体(“lest抗体”)的多样杂合体文库之间建立对有限量抗原的竞争结合，以实现该连续表位引导的互补替代方法。竞争者可以是参照抗体或其衍生物，如单链Fv片段。竞争者也可以是与参照抗体结合相同表位的抗原的天然或人工配体。竞争者的唯一要求是其与参照抗体结合相同的表位，并且其与参照抗体竞争结合抗原。测试抗体具有来自非人参照抗体的一个共同抗原结合V区，和随机选自各种来源(如人抗体组文库)的另一个V区。来自参照抗体的共同V区用作引导，以相同的方向将测试抗体定位在抗原的相同表位上，使得选择偏向于与参照抗体具有最高的抗原结合忠实度。
可以使用许多类型的报告系统来检测测试抗体和抗原之间期望的相互作用。例如，互补的报告片段可以分别与抗原和测试抗体连接，使得仅当测试抗体结合抗原时，才发生通过片段互补的报告物激活。当测试抗体-和抗原-报告物片段融合物与竞争者共表达时，报告物激活取决于测试抗体与竞争物竞争的能力，其与测试抗体对抗原的亲和力成正比。可以使用的其它报告系统包括如美国专利申请系列号10/208,730(公布号20030198971)所公开的自主抑制报告物再激活系统的再活化物(RAIR)，或美国专利申请系列号10/076,845(公开号20030157579)中公开的竞争性激活系统。
使用连续表位引导的互补性替换系统，进行选择以鉴定细胞表达单个测试抗体与竞争者、抗原和报告组分。在这些细胞中，每个测试抗体与竞争者一对一地竞争与有限量的抗原结合。报告物的活性与结合测试抗体的抗原量成正比，而这又与测试抗体对抗原的亲和力和测试抗体的稳定性成正比。当表达测试抗体后，根据测试抗体相对于参照抗体的活性来最初选择测试抗体。第一轮的选择结果是一组“杂合”抗体，其中每一个由来自参照抗体的相同非人V-区和来自文库的人V-区组成，并且每一个都与参照抗体结合抗原上的相同表位。在第一轮中选择的杂合抗体中一个或多个将具有与参照抗体相当或更高的抗原亲和力。
在第二V区替代步骤中，将第一步骤中选择的人V区用作引导，使用多样的关连人V-区文库来选择用于剩余非人参照抗体V区的人替代物。第一轮选择的杂合抗体也可以用作第二轮选择的竞争者。第二轮选择的结果是一组全人抗体，其结构不同于参照抗体，但与参照抗体竞争结合相同抗原。一些选定的人抗体与参照抗体结合相同抗原上的相同表位。在这些选择的人抗体中，一个或多个以相当于或高于参照抗体的亲和力结合相同表位。
使用上述小鼠或嵌合BMP6结合抗体之一作为参照抗体，该方法可以容易地用于产生以相同的结合特异性和相同或更好的结合亲和力结合人BMP6的人抗体。此外，这样的人BMP6结合抗体也可以从通常产生人抗体的公司商购获得，例如KaloBios,Inc.(MountainView,Calif)。
驼源抗体(camelid antibody)
从骆驼和单峰骆驼(Camelus bactrianus和Calelus dromaderius)家族的成员，包括新世界成员，如美洲驼物种(Lama paccos、Lama glama和Lama vicugna)，获得的抗体蛋白质已在尺寸、结构复杂性和在人受试者中的抗原性方面被表征。如在自然界中发现的，来自该类哺乳动物家族的某些IgG抗体缺少轻链，因此在结构上不同于来自其它动物的抗体的典型四链四级结构(两条重链和两条轻链)。参见PCT/EP93/02214(1994年3月3日公开的WO 94/04678)。
驼源抗体的区域是鉴定为VHH的小的单一可变结构域，其可以通过遗传工程获得，以产生对靶具有高亲和力的小蛋白质，得到称为“驼源纳米抗体(nanobody)”的低分子量抗体来源蛋白。参见1998年6月2日授权的美国专利号5,759,808；还参见Stijlemans,B.等人,2004J Biol Chem 279:1256-1261；Dumoulin,M.等人,2003Nature 424:783-788；Pleschberger,M.等人2003Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo,V.等人2002Int J Cancer 89:456-62；和Lauwereys,M.等人1998EMBO J 17:3512-3520。驼源抗体和抗体片段的工程化文库可从例如Ablynx，Ghent，Belgium商业获得。与非人来源的其它抗体及其抗原结合片段一样，可以重组改变驼源抗体的氨基酸序列，以获得更接近于人序列的序列，即该纳米抗体可以“人源化”。因此，可以进一步降低驼源抗体对人的天然低抗原性。
驼源纳米抗体的分子量约为人IgG分子的十分之一，该蛋白质的物理直径仅为几纳米。小尺寸的一个结果是驼源纳米抗体能够结合功能上不可见于较大抗体蛋白质的抗原位点，即，驼源纳米抗体可用作试剂检测使用经典免疫学技术时隐藏的抗原，并且可用作可能的治疗剂。因此，小尺寸的另一个结果是，驼源纳米抗体可以通过结合到靶蛋白的沟槽或窄裂缝中的特定位点而发挥抑制作用，并因此可以以比经典抗体更接近经典低分子量药物功能的方式起作用。
低分子量和紧凑的尺寸进一步导致，驼源纳米抗体是非常热稳定的、具有抵抗极端pH和蛋白水解消化的稳定性，并且具有弱抗原性。另一个结果是，驼源纳米抗体容易从循环系统移出到组织中，甚至穿过血脑屏障并可以治疗影响神经组织的疾患。纳米抗体可进一步促进跨血脑屏障的药物转运。参见2004年8月19日公布的美国专利申请20040161738。这些特征与对人的低抗原性相结合，表明了很大的治疗潜力。此外，这些分子可以在原核细胞如大肠杆菌中完全表达，并且作为融合蛋白被噬菌体表达，并且是功能性的。
因此，本发明的一个特征是对BMP6具有高亲和力的驼源抗体或纳米抗体。在本文的一个实施方案中，驼源抗体或纳米抗体是天然产生于驼源动物中，即使用本文所述的用于其它抗体的技术，用BMP2或其肽片段免疫后由驼类动物生产。或者，可以工程化产生结合BMP6的驼源纳米抗体，即如本文实施例中所述，例如通过使用BMP6作为靶，通过淘选方法从展示适当诱变的驼源纳米抗体蛋白的噬菌体文库中选择产生。还可通过遗传工程化进一步定制工程化的纳米抗体，使其在受体受试者中的半衰期为45分钟到两周。在一个具体实施方案中，通过将本发明的人抗体的重链或轻链的CDR序列嫁接到纳米抗体或单域抗体框架序列中，获得驼源抗体或纳米抗体，例如PCT/EP93/02214中所述。
双特异性分子和多价抗体
另一方面，本发明涉及包含本发明的BMP6结合抗体或其片段的双特异性或多特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合区可以被衍生化或连接到另一功能分子，例如另一肽或蛋白质(例如受体的另一抗体或配体)，以产生结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。实际上，本发明的抗体可以衍生化或连接到一个以上的其它功能分子以产生结合两个以上不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；这样的多特异性分子也旨在涵盖在本文所用的术语“双特异性分子”中。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可以功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其它方式)到一个或多个其它结合分子，如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，使得产生双特异性分子。
因此，本发明包括包含至少一个对BMP6的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。例如，第二靶表位是不同于第一靶表位的BMP6的另一表位。
另外，对于其中双特异性分子是多特异性的本发明，除了第一和第二靶表位之外，分子可以进一步包括第三结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段作为结合特异性，所述抗体片段包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv。抗体也可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小的片段，如Fv或单链构建体，如Ladner等人美国专利号4,946,778所述。
双抗体是其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达的二价、双特异性分子，其中VH和VL结构域通过接头连接，所述接头太短而不能允许在同一链上的两个结构域之间配对。VH和VL结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger等人,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poijak等人,1994Structure2:1121-1123)。可以通过在相同细胞内表达具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构型)或具有结构VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)的两条多肽链来产生双抗体。它们中的大多数可以在细菌中以可溶形式表达。单链双抗体(scDb)可以通过用约15个氨基酸残基的接头连接两条形成双抗体的多肽链产生(参见Holliger和Winter,1997Cancer Immunol.Immunother.,45(3-4):128-30；Wu等人,1996Immunotechnology,2(1):21-36)。scDb可以可溶的、活性单体形式在细菌中表达(参见Holliger和Winter,1997Cancer Immunol.Immunother.,45(34):128-30；Wu等人.,1996Immunotechnology,2(1):21-36；Pluckthun和Pack,1997Immunotechnology,3(2):83-105；Ridgway等人,1996Protein Eng.,9(7):617-21)。双抗体可以与Fc融合以产生“二-双抗体”(参见Lu等人，2004J.Biol.Chem.279(4)：2856-65)。
可以用于本发明的双特异性分子中的其它抗体是鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。
可以通过使用本领域已知的方法缀合结合特异性组分来制备本发明的双特异性分子。例如，可以单独产生双特异性分子的每个结合特异性，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-SMCC)(参见例如Karpovsky等人,1984J.Exp.Med.160:1686；Liu,M A等人.,1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其它方法包括Paulus,1985Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等人,1985Science229:81-83)和Glennie等人,1987J.Immunol.139:2367-2375)中描述的那些。缀合剂可以是SATA和磺基-SMCC，二者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，Ill.)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两个重链的C端铰链区的巯基键合而缀合。在一个特别的实施方案中，在缀合之前，铰链区被修饰为含有奇数个巯基残基，例如一个。
或者，可以在相同的载体中编码两种结合特异性并在相同宿主细胞中表达和组装。当双特异性分子是mAb X mAb、mAb X Fab、Fab X F(ab')2或配体X Fab融合蛋白时，该方法特别有用。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498和美国专利号5,482,858。
可以通过例如酶联免疫吸附测定试验(ELISA)、放射免疫测定试验(REA)、FACS分析、生物测定试验(例如生长抑制)或Western印迹测定试验，证实双特异性分子与其特异性靶标的结合。这些测定试验中的每一种通常通过使用对感兴趣的复合物特异的标记的试剂(例如，抗体)来检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。
另一方面，本发明提供了多价化合物，其包含与BMP6结合的本发明的抗体及其抗原结合片段的至少两个相同或不同的抗原结合部分。抗原结合部分可以通过蛋白质融合或共价或非共价连接，而连接在一起。备选地，已经描述了双特异性分子的连接方法。例如，可以通过将本发明的抗体及其抗原结合片段与结合本发明的抗体及其抗原结合片段的恒定区(例如Fc或铰链区)的抗体或抗原结合片段交联，获得四价化合物。
例如在Borean专利EP 1 012 280B1中描述了三聚化结构域。例如在PCT/EP97/05897中描述了五聚化模块。
具有延长的半衰期的抗体
本发明提供在体内具有延长的半衰期的特异性结合BMP6的抗体。
许多因素可能影响蛋白质在体内的半衰期。例如，肾脏过滤、肝脏代谢、蛋白水解酶(蛋白酶)降解和免疫原性反应(例如抗体的蛋白质中和以及巨噬细胞和树突状细胞摄取)。可以使用各种策略来延长本发明的抗体及其抗原结合片段的半衰期。例如，通过化学连接聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗体支架、聚唾液酸(PSA)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合配体和碳水化合物屏蔽物；通过遗传融合结合血清蛋白的蛋白质，如白蛋白、IgG、FcRn、和转铁蛋白；通过偶联(遗传或化学)结合血清蛋白的其它结合部分，如纳米抗体、Fab、DARPins、Avimer、Affibody和anticalin；通过遗传融合rPEG、白蛋白、白蛋白结构域、白蛋白结合蛋白和Fc；通过并入纳米载体、缓释制剂或医疗装置中。
为了延长抗体在体内的血清循环，可以通过PEG与抗体N或C末端的位点特异性缀合或通过赖氨酸残基上存在的ε-氨基，使用或不使用多功能接头，将惰性聚合物分子如高分子量PEG连接到抗体或其片段。为了使抗体聚乙二醇化，通常在一个或多个PEG基团可以与抗体或抗体片段连接的条件下，使抗体、其抗原结合片段与聚乙二醇(PEG)(如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。聚乙二醇化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在包括已经用于衍生其它蛋白质的任何形式的PEG，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在一个实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化(aglycosylate)抗体。可以使用导致生物活性损失最小的线性或分支聚合物衍生化。可以通过SDS-PAGE和质谱法密切监测缀合度，以确保PEG分子与抗体的适当缀合。未反应的PEG可以通过尺寸排阻或通过离子交换色谱法与抗体-PEG缀合物分离。可以使用本领域技术人员熟知的方法，例如通过本文所述的免疫测定试验，测试PEG衍生的抗体的结合活性以及体内功效。聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的抗体及其抗原结合片段。参见例如，Nishimura等人的EP0154316和Ishikawa等人的EP 0401384。
其它修饰的聚乙二醇化技术包括重构化学正交定向工程化技术(ReCODE PEG)，其通过包含tRNA合成酶和tRNA的重构系统将化学上特定的侧链并入生物合成的蛋白中。该技术使得能够将30个以上的新氨基酸并入在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中生物合成的蛋白质。tRNA可以在琥珀密码子所位于的任何地方并入一个规范氨基酸，从而将琥珀密码子从终止密码子转化为并入化学修饰氨基酸的信号密码子。
重组聚乙二醇化技术(rPEG)也可用于血清半衰期延长。该技术涉及将300-600个氨基酸的非结构蛋白质尾遗传融合到现有的药物蛋白质上。由于这种非结构蛋白链的表观分子量比其实际分子量高大约15倍，蛋白质的血清半衰期大大增加。与需要化学缀合和再纯化的传统聚乙二醇化相比，该制造工艺大大简化，而且产品是均质的。
聚唾液酸化(Polysialytion)是另一种技术，其使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)来延长活性寿命并提高治疗性肽和蛋白质的稳定性。PSA是唾液酸(糖)的聚合物。当用于蛋白质和治疗性肽药物递送时，聚唾液酸在缀合物上提供保护性微环境。这增加了治疗性蛋白质在循环中的活性寿命，并防止其被免疫系统识别。PSA聚合物天然存在于人体内。它被进化数百万年的某些细菌所采用，用其包被细菌壁。然后这些天然的聚唾液酸化细菌能够通过分子模拟来挫败身体的防御系统。PSA，天然的最终隐形技术，可以容易地从这样的细菌大量生产并具有预定的物理特性。即使与蛋白质偶联时，细菌PSA也是完全非免疫原性的，因为其与人体中的PSA化学上相同。
另一种技术包括使用与抗体连接的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物。HES是衍生自蜡质玉米(waxy maize)淀粉的改性天然聚合物，其可以被身体的酶代谢。通常施用HES溶液来替代缺血量和改善血液的流变性质。抗体的HES化可以通过提高分子的稳定性以及通过减少肾清除率，延长循环半衰期，从而增加生物活性。通过改变不同的参数，例如HES的分子量，可以定制各种HES抗体缀合物。
还可以将一个或多个氨基酸修饰(即取代、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链Fc域片段)，产生具有增加的体内半衰期的抗体。参见例如国际公开号WO 98/23289；国际公开号WO 97/34631和美国专利号6,277,375。
此外，抗体可以与白蛋白缀合，以使抗体或抗体片段在体内更稳定或在体内具有更长的半衰期。这些技术在本领域中是公知的，参见例如国际公开号WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；和欧洲专利EP 413,622。
增加半衰期的这些策略在纳米抗体、基于纤连蛋白的结合剂以及需要增加体内半衰期的其它抗体或蛋白质中是特别有用的。
抗体缀合物
本发明提供特异性结合BMP6的抗体或其抗原结合片段，其重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)到异源蛋白质或多肽(或其抗原结合片段，优选至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)上，产生融合蛋白。特别地，本发明提供了融合蛋白，其包含本文所述抗体的抗原结合片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段，F(ab)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR)和异源蛋白质、多肽或肽。将蛋白质、多肽或肽融合或缀合到抗体或抗体片段的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946；欧洲专利号EP 307,434和EP 367,166；国际公开号WO 96/04388和WO91/06570；Ashkenazi等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539；Zheng等人,1995,J.Immunol.154:5590-5600；和Vil等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341。
可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)技术产生其它的融合蛋白。可以使用DNA改组来改变本发明的抗体及其抗原结合片段的活性(例如，具有较高亲和力和较低解离速率的抗体及其抗原结合片段)。一般地参见，美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等人,1997,Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson,等人,1999,J.Mol.Biol.287:265-76；和Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques24(2):308-313(这些专利和出版物中的每一篇通过引用整体并入本文)。可以通过在重组之前使用易错PCR、随机核苷酸插入或其它方法进行随机诱变来改变抗体及其抗原结合片段或编码的抗体及其抗原结合片段。编码特异性结合BMP6的抗体、其抗原结合片段的多核苷酸可以与一个或多个异源分子的一个或多个组分、基序、节段(section)、部分、结构域、片段等重组。
此外，抗体及其抗原结合片段可以与标记序列(例如肽)融合以促进纯化。在一个实施方案中，标记氨基酸序列是六-组氨酸肽(SEQ ID NO：96)，如在pQE载体中提供的标签(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)，其中许多是商业上可获得的。如Gentz等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824中描述的，例如，六-组氨酸(SEQ ID NO：96)可以方便融合蛋白纯化。可用于纯化的其它肽标签包括但不限于对应于源自流感血凝素蛋白的表位的血凝素(“HA”)标签(Wilson等人，1984，Cell 37：767)，以及“flag”标签。
在一个实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段与诊断或可检测试剂缀合。这样的抗体可作为临床检查程序的一部分用于监测或预后疾病或病患的发作、发展、进展和/或严重性，如确定特定治疗的功效。可以通过将抗体与可检测的物质偶联来实现这种诊断和检测，所述可检测的物质包括但不限于各种酶，如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，如但不限于链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，如但不限于鲁米诺；生物发光材料，如但不限于萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质，如但不限于碘(131I，125I，123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In，113In，112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga，67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166H、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；使用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属，以及非放射性顺磁金属离子。
本发明还包括与治疗部分缀合的抗体及其抗原结合片段的用途。抗体、其抗原结合片段可以与治疗性部分缀合，所述治疗性部分如细胞毒素(例如细胞抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性金属离子(如α发射体)。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。
此外，抗体、其抗原结合片段可以与修饰给定生物反应的治疗部分或药物部分缀合。治疗部分或药物部分不应被解释为限于经典的化疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质、肽或多肽。这样的蛋白质可以包括例如毒素如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤溶酶原激活剂、凋亡剂、抗血管生成剂；或生物反应调节剂，例如淋巴因子。
此外，抗体可以与治疗性部分缀合，所述治疗性部分如放射性金属离子，如α-发射体(如213Bi)或可用于缀合放射性金属离子(包括但不限于131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)与多肽的大环螯合剂。在一个实施方案中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”-四乙酸(DOTA)，其可通过接头分子连接到抗体上。这种接头分子在本领域中是公知的，并且描述于Denardo等人,1998,Clin Cancer Res.4(10):2483-90；Peterson等人,1999,Bioconjug.Chem.10(4):553-7；和Zimmerman等人,1999,Nucl.Med.Biol.26(8):943-50，各自通过引用整体并入。
将治疗性部分与抗体缀合的技术是公知的，参见例如Amon等人,"MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",在MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(等人)中,第243-56页(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,"Antibodies For Drug Delivery",在Controlled DrugDelivery(第二版),Robinson等人(编辑)中,第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",在Monoclonal Antibodies 84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(编辑)中,第475-506页(1985)；"Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy",在MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(编辑)中,第303-16页(Academic Press 1985),和Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.62:119-58。
抗体也可以连接到固体支持物上，固体支持物对于免疫测定试验或靶抗原的纯化特别有用。这种固体载体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
生产本发明抗体的方法
编码抗体的核酸
本发明提供基本上纯化的核酸分子，其编码包含上述BMP6结合抗体链的区段或结构域的多肽。本发明的一些核酸包含编码SEQ ID NO：16、36、56或76中任意所示的重链可变区的核苷酸序列；和/或编码SEQ ID NO：26、46、66或86中任意所示的轻链可变区的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，核酸分子是表1中鉴定的那些。本发明的一些其它核酸分子包含与表1中鉴定的那些核苷酸序列基本上(例如，至少65、80％、95％或99％)相同的核苷酸序列。当由合适的表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够表现出BMP6抗原结合能力。
本发明还提供了编码表1所示的BMP6结合抗体的重链或轻链的至少一个CDR区，通常所有三个CDR区的多核苷酸。一些其它多核苷酸编码表1所示的BMP6结合抗体的重链和/或轻链的全部或基本上全部的可变区序列。由于密码子简并性，每个免疫球蛋白氨基酸序列可以由多个核酸序列编码。
本发明的核酸分子可以编码抗体的可变区和恒定区。本发明的一些核酸序列包含编码成熟重链可变区序列的核苷酸，所述成熟重链可变区序列与SEQ ID NO：16、36、56或76中任意所示的成熟重链可变区序列基本上(例如，至少80％、90％或99％)相同。一些其它核酸序列包含编码成熟轻链可变区序列的核苷酸，所述成熟轻链可变区序列与SEQ ID NO：26、46、66或86中任意所示的成熟轻链可变区序列基本上(例如，至少80％、90％或99％)相同。
多核苷酸序列可以通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变现有的编码BMP6结合抗体或其结合片段的序列(例如下文实施例中所述的序列)而产生。可以通过本领域已知的方法来完成核酸的直接化学合成，如Narang等人,1979,Meth.Enzymol.68:90的磷酸三酯法；Brown等人,Meth.Enzymol.68:109,1979的磷酸二酯法；Beaucage等人,Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺酯法(diethylphosphoramidite)；和美国专利号4,458,066的固体支持物法。可以如，例如PCR Technology:Principles and Applications for DNAAmplification,H.A.Erlich(编辑),Freeman Press,NY,N.Y.,1992；PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications,Innis等人.(编辑),Academic Press,San Diego,Calif.,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991；和Eckert等人.,PCRMethods and Applications 1:17,1991中所述，通过PCR将突变引入多核苷酸序列。
本发明还提供了用于产生上述BMP6结合抗体的表达载体和宿主细胞。可以使用各种表达载体来表达编码BMP6结合抗体链或结合片段的多核苷酸。可以使用基于病毒的和非病毒的表达载体在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体，通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒，和人类人工染色体(参见例如Harrington等人，Nat Genet.15：345,1997)。例如，可用于在哺乳动物(例如，人)细胞中表达BMP6结合多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(Invitrogen,San Diego,Calif.)、MPSV载体和本领域已知的许多其它用于表达其它蛋白质的载体。有用的病毒载体包括基于以下的载体：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于SV40的载体、乳头瘤病毒、HBP Epstein Barr病毒、痘苗病毒载体和SemlikiForest病毒(SFV)。参见Brent等人，同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995和Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
表达载体的选择取决于待表达载体的目的宿主细胞。通常，表达载体含有与编码BMP6结合抗体链或抗原结合片段的多核苷酸可操纵地连接的启动子和其它调控序列(例如，增强子)。在一个实施方案中，诱导型启动子用于防止插入序列在诱导条件以外表达。诱导型启动子包括，例如阿拉伯糖启动子、lacZ启动子、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。可以在非诱导条件下扩增转化的生物体的培养物，而不偏向编码序列的表达产物被宿主细胞更好地耐受的群体。除了启动子之外，还可能需要或期望其它调节元件用于有效表达BMP6结合抗体链或抗原结合片段。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其它序列。另外，可以通过包含适合于所使用的细胞系统的增强子来增强表达的效率(参见，例如Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.20：125,1994；和Bittner等人，Meth.Enzymol.，153：516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置，以形成与插入的BMP6结合抗体序列编码的多肽的融合蛋白。更常见的是，插入的BMP6结合抗体序列在包含在载体中之前与信号序列连接。用于接收编码BMP6结合抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时还编码恒定区或其部分。这样的载体允许将可变区表达为与恒定区的融合蛋白，从而导致产生完整抗体及其抗原结合片段。通常，这样的恒定区域是人的。
用于携带和表达BMP6结合抗体链的宿主细胞可以是原核的或真核的。大肠杆菌是用于克隆和表达本发明的多核苷酸的一种原核宿主。适合使用的其它微生物宿主包括芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌和其它肠杆菌科细菌，如沙门氏菌、沙雷氏菌和各种假单胞菌属物种。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达调控序列(例如复制起点)。此外，可以存在任何数量的各种众所周知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达，任选地具有操纵子序列，并且具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。其它微生物，如酵母，也可用于表达本发明的BMP6结合多肽。还可以使用与杆状病毒载体组合的昆虫细胞。
在一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明的BMP6结合多肽。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，如实施例中所述的1D6.C9骨髓瘤杂交瘤克隆)或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，下面列举的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何正常的非永生或正常或异常的永生动物或人细胞。例如，已经开发了能够分泌完整免疫球蛋白的许多合适的宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。哺乳动物组织细胞培养物用于表达多肽的用途通常在例如Winnacker，FROM GENES TO CLONES，VCH Publishers，NY，NY，1987中讨论。哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见，例如，Queen等人，Immunol.Rev.89：49-68,1986)和必需的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有源自哺乳动物基因或源自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调控的或可调节的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRPpoIIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有感兴趣的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主(参见Sambrook等，同上)。其它方法包括例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、弹道方法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合(Elliot和O'Hare，Cell88：223,1997)、试剂增强的DNA吸收和离体转导。对于长期、高产量的重组蛋白质生产，常需要稳定的表达。例如，可以使用包含病毒复制起点或内源表达元件和选择性标记基因的本发明表达载体，制备稳定表达BMP6结合抗体链或结合片段的细胞系。引入载体后，可以在丰富培养基中允许细胞生长1-2天，然后再转换至选择性培养基。选择性标记物的目的是赋予对选择的抗性，其存在允许成功表达引入序列的细胞在选择性培养基中生长。可以使用适合细胞类型的组织培养技术，使抗性、稳定转染的细胞增殖。
本发明单克隆抗体的产生
可以通过多种技术生产单克隆抗体(mAb)，包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，1975Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。可以使用许多技术生产单克隆抗体，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌转化。
用于制备杂交瘤的动物系统可以是鼠系统。小鼠中的杂交瘤生产是一个成熟的程序。免疫方案和分离用于融合的免疫脾细胞的技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
可以基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列来制备本发明的嵌合或人源化抗体及其抗原结合片段。可以使用标准分子生物学技术从感兴趣的鼠杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并将其工程化成含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人框架。参见例如Winter的美国专利号5,225,539和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6180370。
在某个实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生针对BMP6的人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括分别在本文中称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb
Figure BDA0001382481410000871
(Medarex，Inc.)包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微基因座(miniloci)以及灭活内源性μ和γ链基因座的靶向突变(参见，例如，Lonberg等人，1994Nature 368(6474)：856-859)。因此，该小鼠表现出小鼠IgM或K的表达降低，并且响应免疫，该引入的人重链和轻链转基因经历种类转换和体细胞突变以产生高亲和力的人IgG-κ单克隆(Lonberg,N.等人,1994同上；综述参见Lonberg,N.,1994Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.和Huszar,D.,1995Intern.Rev.Immunol.13:65-93,和Harding,F.和Lonberg,N.,1995Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。在Taylor,L.等人,1992Nucleic Acids Research20:6287-6295；Chen,J.等人,1993International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:3720-3724；Choi等人,1993Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等人,1993EMBO J.12:821-830；Tuaillon等人,1994J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等人,1994International Immunology 579-591；和Fishwild,D.等人,1996Nature Biotechnology 14:845-851中，进一步描述了HuMAb小鼠的制备和用途、以及这些小鼠携带的基因组修饰，上述文献的全部内容通过引用整体特别地并入本文。还可以参见美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429；全部属于Lonberg和Kay；Surani等人的美国专利号5,545,807；PCT公开号WO 92103918、WO93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO98/24884和WO 99/45962，全部属于Lonberg和Kay；和Korman等人的PCT公开号WO 01/14424。
在另一个实施方案中，可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠生成本发明的人抗体，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠。这些小鼠在本文中称为“KM小鼠”，详细描述在Ishida等人的PCT公开WO 02/43478中。
再有，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在本领域是可获得的，并且可用于生成本发明的BMP6结合抗体及其抗原结合片段。例如，可以使用称为Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代转基因系统。这样的小鼠在例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。
此外，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统在本领域是可获得的，可用于生成本发明的BMP6结合抗体。例如，可以使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；这样的小鼠描述于Tomizuka等人,2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727。此外，本领域已经描述了携带人重链和轻链转染色体的奶牛(Kuroiwa等人，2002Nature Biotechnology 20：889-894)，其可以用于生成本发明的BMP6结合抗体。
也可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备本发明的人单克隆抗体。用于分离人抗体的这种噬菌体展示方法在本领域中建立或在以下实施例中描述。参见例如：Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484和5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
也可以使用其中已经重构了人免疫细胞的SCID小鼠，制备本发明的人单克隆抗体，该小鼠在免疫后可产生人抗体应答。这样的小鼠描述于例如Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767。
框架或Fc工程化
本发明的工程化抗体及其抗原结合片段包括其中对VH和/或VL内的框架残基进行了修饰的那些，例如，以改善抗体的性质。通常进行这种框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”成相应的种系序列。更具体地说，已经经历体细胞突变的抗体可能含有不同于该抗体所来源的种系序列的构架残基。可以通过比较抗体框架序列与该抗体所来源的种系序列来鉴定此类残基。为了将框架区序列回复到其种系配置，例如可以通过定点诱变将体细胞突变“回复突变”到种系序列。这种“回复突变”的抗体也旨在被本发明涵盖。
框架修饰的另一种类型涉及突变框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基以除去T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也被称为“去免疫化”，其在Carr等人的美国专利公开号20030153043中有更详细的描述。
除框架或CDR区内进行的修饰之外或作为其替代，本发明的抗体可以被工程化以包括Fc区内的修饰，通常以改变抗体的一种或多种功能性质，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以连接到抗体)或被修饰以改变其糖基化，再次改变抗体的一种或多种功能性质。这些实施方案中的每一个在下面进一步详细描述。Fc区域中的残基编号是Kabat的EU索引中的编号。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得铰链区中的半胱氨酸残基的数目被改变，例如增加或减少。在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述了这种方法。改变CH1铰链区中的半胱氨酸残基数目，可以例如以促进轻链和重链的组装，或增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，突变抗体的Fc铰链区，以降低抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中，使得抗体相对于天然Fc-铰链结构域具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。这种方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中更详细地描述。
在另一个实施方案中，修饰抗体以增加其生物学半衰期。各种方法是可能的。例如，可以引入以下突变中的一个或多个：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利号6,277,375所述。或者，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区域内改变抗体以含有从IgG Fc区的CH2结构域的两个环获得的挽救受体(salvage receptor)结合表位，如Presta等人的美国专利号No.5,869,046和6,121,022。
在一个实施方案中，通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替换一个或多个氨基酸，使得抗体对效应子配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力待改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1成分。这种方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和第5,648,260中更详细地描述。
在另一个实施方案中，可以用不同的氨基酸残基替换选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合和/或减少或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中更详细地描述。
在另一个实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。这种方法在Bodmer等人的PCT公开WO94/29351中进一步描述。
在另一个实施方案中，修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰一个或多个氨基酸来增加抗体对Fc-γ受体的亲和力。这种方法进一步描述在Presta的PCT公开WO00/42072中。此外，已经作图定位了人IgG1上Fc-γRI、Fc-γRII、Fc-γRIII和FcRn的结合位点，并描述了具有改善的结合的变体(参见Shields,R.L.等人,2001J.Biol.Chen.276:6591-6604)。
在另一个实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化抗体(即，抗体缺少糖基化)。糖基化可以改变，例如以提高抗体对“抗原”的亲和力。这样的碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，从而消除该位点处的糖基化。这样的无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。这样的方法进一步详细地描述在Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
另外或替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有降低量的岩藻糖基残基的低岩藻糖化抗体或具有增加的二分型GlcNac结构的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。这样的碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已经在本领域中描述，并且可以用作宿主细胞在其中表达本发明的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，该FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，由此在这样的细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系LecI3细胞，其具有降低的将岩藻糖连接到Asn(297)连接的碳水化合物上的能力，这也导致在该宿主细胞中表达的抗体低岩藻糖化(也参见Shields,R.L.等人,2002J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO99/54342描述了工程化细胞系以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰基葡糖氨基转移酶III(GnTIII))，由此在该工程化的细胞系中表达的抗体呈现增加的二分型GlcNac结构，其导致抗体的ADCC活性增加(也参见Umana等人，1999Nat.Biotech.17：176-180)。
工程化构建改变的抗体的方法
如上所述，具有本文所示的VH和VL序列或全长重链和轻链序列的BMP6结合抗体可用于通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列、或与其连接的恒定区，产生新的BMP6结合抗体。因此，在本发明的另一方面，本发明的BMP6结合抗体的结构特征用于产生结构相关的BMP6结合抗体，其保留本发明的抗体及其抗原结合片段的至少一种功能性质，如与人BMP6结合以及还抑制BMP6的一种或多种功能性质(例如，在溶血测定试验中抑制红细胞裂解)。
例如，如上所述，本发明的抗体及其抗原结合片段的一个或多个CDR区或其突变可以与已知的框架区和/或其它CDR重组组合以产生另外的、重组工程化的本发明BMP6结合抗体及其抗原结合片段。其它类型的修饰包括之前的章节中描述的那些。用于工程方法的起始材料可以是本文提供的VH和/或VL序列中的一个或多个，或其一个或多个CDR区。为了产生工程化的抗体，不需要实际制备(即，表达为蛋白质)具有本文提供的一个或多个VH和/或VL序列、或其一个或多个CDR区的抗体。相反地，可以使用序列中包含的信息作为起始材料产生源自初始序列的“第二代”序列，然后制备“第二代”序列并表达为蛋白质。
还可以通过筛选具有固定的CDR3序列或如US20050255552中所述的最小必需结合决定簇以及在CDR1和CDR2序列上的多样性的抗体文库，来制备改变的抗体序列。可以根据适用于从抗体文库筛选抗体的任何筛选技术进行筛选，如噬菌体展示技术。
可使用标准分子生物学技术制备和表达改变的抗体序列。由改变的抗体序列编码的抗体是保留本文所述的BMP6结合抗体的一种、部分或全部功能性质的抗体，所述功能特性包括但不限于特异性结合人BMP6蛋白；抗体在溶血测定试验中抑制红细胞裂解。
可以使用本领域可获得的和/或本文所述的标准测定试验，例如实施例中所述的那些(例如，ELISA)来评估改变的抗体的功能特性。
在本发明的抗体及其抗原结合片段的工程化方法的一个实施方案中，可以沿BMP6结合抗体编码序列的全部或部分随机或选择性地引入突变，并且可以如本文所述筛选所得修饰的BMP6结合抗体的结合活性和/或其它功能性质。本领域已经描述了突变方法。例如，Short的PCT公开WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接组装或其组合来产生和筛选抗体突变的方法。或者，Lazar等人的PCT公开WO 03/074679描述了使用计算筛选方法优化抗体的物理化学性质的方法。
本发明抗体的表征
可以通过各种功能测定试验来表征本发明的抗体及其抗原结合片段。例如，可以通过其抑制BMP6的能力来表征。
可以通过直接标记感兴趣的抗体来检测抗体与BMP6结合的能力，或者抗体可以是未标记的，使用本领域已知的各种夹心测定试验间接检测结合。
在一个实施方案中，本发明的BMP6结合抗体及其抗原结合片段阻断参照BMP6结合抗体与BMP6多肽结合、或与参照BMP6结合抗体竞争与BMP6多肽结合。这些抗体可以是上述的完全人BMP6结合抗体。其也可以是与参照抗体结合相同表位的其它小鼠、嵌合或人源化BMP6结合抗体。阻断参照抗体的结合或与参照抗体竞争结合的能力表明，所测试的BMP6结合抗体结合的表位，与通过参照抗体所定义的表位相同或相似，或与参照BMP6结合抗体所结合的表位充分接近。这样的抗体特别可能具有针对参照抗体所鉴定的有利性质。阻断参照抗体或与参照抗体竞争的能力可以通过例如竞争结合测定试验来确定。使用竞争结合测定试验，检测被测试抗体抑制参照抗体与共同抗原如BMP6多肽的特异性结合的能力。如果过量的测试抗体基本上抑制参照抗体的结合，则测试抗体与参照抗体竞争抗原的特异性结合。基本上抑制意味着，测试抗体通常使参照抗体的特异性结合降低至少10％、25％、50％、75％或90％。
有许多已知的竞争结合测定试验可用于评估抗体与参照抗体对特定蛋白质(在本文的情况下为BMP6)的竞争结合。这些方法包括例如固相直接或间接放射免疫测定试验(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定试验(EIA)、夹心竞争性测定试验(参见Stahli等人，Methods in Enzymology 9：242-253,1983)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人，J.Immunol.137：3614-3619,1986)、固相直接标记测定试验、固相直接标记夹心测定试验(参见Harlow&Lane，同上)、使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人，Molec.Immunol.25：7-15,1988)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人.，Virology 176：546-552,1990)和直接标记的RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32：77-82,1990)。通常，这种测定试验涉及使用与固体表面结合的纯化抗原或携带抗原的细胞、未标记的测试BMP6结合抗体和标记的参照抗体。通过测定在测试抗体存在下与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量竞争性抑制。通常测试抗体过量存在。通过竞争性测定试验(竞争抗体)鉴定的抗体包括与参照抗体结合相同表位的抗体和与参照抗体结合充分接近的相邻表位从而发生空间位阻的抗体。
为了确定所选择的BMP6结合单克隆抗体是否结合独特的表位，可以使用市售试剂(例如，来自Pierce Rockford Ill的试剂)将每种抗体生物素化。可以使用BMP6多肽包被的ELISA板，使用未标记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行竞争性研究。可以用链霉亲和素-碱性磷酸酶探针检测生物素化的MAb结合。为了确定纯化的BMP6结合抗体的同种型，可以进行同种型ELISA。例如，可以在4℃用1μg/ml的抗人IgG过夜包被微量滴定板的孔。用1％BSA封闭后，将板与1μg/ml或更少的单克隆BMP6结合抗体或纯化的同种型对照反应，在环境温度下持续1至2小时。然后可以使孔与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶缀合的探针反应。然后显色和分析板，以便可测定纯化抗体的同种型。
为了证明单克隆BMP6结合抗体与表达BMP6多肽的活细胞的结合，可以使用流式细胞术。简言之，可以将表达BMP6的细胞系(在标准生长条件下生长)与各种浓度的BMP6结合抗体在含有0.1％BSA和10％胎牛血清的PBS中混合，并在37℃下孵育1小时。洗涤后，将细胞与荧光素标记的抗人IgG抗体在与一抗染色相同的条件下反应。可以通过FACScan仪器、使用光和侧向散射特性对单细胞门控，以分析样品。(除了或代替)流式细胞术试验，可以使用荧光显微镜的替代分析。可以如上所述精确染色细胞，并通过荧光显微镜检查。该方法允许单个细胞的可视化，但根据抗原的密度可能降低敏感性。
可通过Western印迹进一步测试本发明的BMP6结合抗体及其抗原结合片段与BMP6多肽或抗原片段的反应性。简言之，可以从表达BMP6的细胞制备纯化的BMP6多肽或融合蛋白或细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用10％胎牛血清封闭，并用待测试的单克隆抗体进行探测。可以使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.，St.Louis，Mo.)显色。
功能测定试验的实例也在下面的实施例部分中描述。
预防和治疗用途
本发明提供了通过向有需要的受试者施用有效量的本发明抗体及其抗原结合片段来治疗与增加的BMP6活性相关的疾病或疾患的方法。在具体实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用有效量的本发明的抗体及其抗原结合片段来治疗贫血的方法。
本发明的抗体及其抗原结合片段特别可用于预防贫血的进展。它也可以与其它疗法组合用于治疗贫血患者。
在一个实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用有效量的本发明的抗体及其抗原结合片段来治疗BMP6相关的疾病或疾患的方法。已知与BMP6相关的疾病或疾患的实例包括：贫血，作为非限制性实例包括：慢性疾病的贫血(ACD)、慢性肾脏疾病(例如与慢性肾脏疾病相关的)贫血、癌症贫血、炎症贫血、红细胞生成刺激剂(ESA)抗性贫血(例如促红细胞生成素(EPO)抗性贫血、ESA低反应性贫血(例如EPO低反应性贫血)、功能性缺铁性贫血和/或铁限制性贫血。
在一个具体实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用有效量的本发明的抗体及其抗原结合片段治疗BMP6相关疾病或病患的方法，其中所述疾病或病患是贫血症。在一个实施方案中，贫血是慢性疾病贫血。在一个实施方案中，慢性疾病是慢性肾脏疾病。在一个实施方案中，慢性疾病是癌症。在一个实施方案中，慢性疾病是炎症。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是ESA(例如，EPO)抗性贫血。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是ESA(例如，EPO)低反应性贫血。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是铁限制性贫血。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者是长期血液透析(HD)受试者。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者患有肾脏疾病，例如终末期肾病。
在具体实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用有效量的本发明的抗体及其抗原结合片段治疗BMP6相关疾病或病患的方法，其中所述疾病或病患是功能性缺铁性贫血。在一个实施方案中，受试者是ESA(例如，EPO)治疗的长期血液透析患者。在一个实施方案中，受试者是患有慢性肾脏疾病的ESA(例如，EPO)治疗的长期血液透析的患者。
在一个具体实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用有效量的包含本发明的抗体的组合物治疗贫血的方法。在具体实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用有效量的包含本发明抗体的组合物治疗贫血的方法。在一个实施方案中，贫血是慢性肾脏疾病的贫血。在一个实施方案中，贫血是ESA(例如EPO)抗性贫血。在一个实施方案中，贫血是ESA(例如EPO)低反应性贫血。在一个实施方案中，贫血是铁限制性贫血。在一个实施方案中，贫血是与肾脏疾病相关的贫血，例如慢性肾脏疾病。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者是长期血液透析(HD)的受试者。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者患有肾脏疾病，例如终末期肾病。
在一个具体实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用有效量的包含本发明抗体的组合物治疗BMP6相关疾病或病患的方法，其中所述疾病或病患是功能性缺铁性贫血。在一个实施方案中，受试者是ESA(例如，EPO)治疗的长期血液透析的患者。在一个实施方案中，受试者是患有慢性肾脏疾病的ESA(例如，EPO)治疗的长期血液透析的患者。
在一个具体实施方案中，本发明提供治疗贫血的方法。
在一个具体实施方案中，本发明提供通过向有需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段来减少受试者的ESA(例如EPO)给药需求的方法。在一个实施方案中，贫血是慢性疾病的贫血。在一个实施方案中，慢性疾病是慢性肾脏疾病。在一个实施方案中，慢性疾病是癌症。在一个实施方案中，慢性疾病是炎症。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是ESA(例如，EPO)抗性贫血。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是ESA(例如，EPO)低反应性贫血。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是铁限制性贫血。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者是长期血液透析(HD)的受试者。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者患有肾脏疾病，例如终末期肾病。
在一个具体实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段来减少受试者的ESA(例如EPO)给药需求的方法，其中所述受试者患有功能性缺铁性贫血。在一个实施方案中，受试者是ESA(例如，EPO)治疗的长期血液透析的患者。在一个实施方案中，受试者是患有慢性肾脏疾病的ESA(例如，EPO)治疗的长期血液透析的患者。
在一个具体实施方案中，本发明提供通过向有需要的受试者施用有效量的包含本发明的抗体的组合物减少受试者的ESA(例如，EPO)给药需求的方法。在一个实施方案中，受试者患有贫血。在一个实施方案中，贫血是慢性疾病的贫血。在一个实施方案中，慢性疾病是慢性肾脏疾病。在一个实施方案中，慢性疾病是癌症。在一个实施方案中，慢性疾病是炎症。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是ESA(例如，EPO)抗性贫血。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是ESA(例如，EPO)低反应性贫血。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是铁限制性贫血。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者是长期血液透析(HD)的受试者。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者患有肾脏疾病，例如终末期肾病。
在一个具体实施方案中，本发明提供通过向有需要的受试者施用有效量的包含本发明抗体的组合物减少受试者的ESA(例如，EPO)给药需求的方法，其中所述受试者患有功能性缺铁性贫血。在一个实施方案中，受试者是ESA(例如，EPO)治疗的长期血液透析的患者。在一个实施方案中，受试者是患有慢性肾脏疾病的ESA(例如，EPO)治疗的长期血液透析的患者。
在一个具体实施方案中，本发明提供通过向有需要的受试者施用有效量的本发明的抗体及其抗原结合片段来减少受试者的铁(例如，IV铁)给药需求的方法。在一个实施方案中，受试者患有贫血。在一个实施方案中，贫血是慢性疾病的贫血。在一个实施方案中，慢性疾病是慢性肾脏疾病。在一个实施方案中，慢性疾病是癌症。在一个实施方案中，慢性疾病是炎症。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是ESA(例如，EPO)抗性贫血。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是ESA(例如，EPO)低反应性贫血。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是铁限制性贫血。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者是长期血液透析(HD)的受试者。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者患有肾脏疾病，例如终末期肾病。
在一个具体实施方案中，本发明提供通过向有需要的受试者施用有效量的本发明的抗体及其抗原结合片段减少受试者的铁(例如，IV铁)给药需求的方法，其中所述受试者患有功能性缺铁性贫血。在一个实施方案中，受试者是ESA(例如，EPO)治疗的长期血液透析的患者。在一个实施方案中，受试者是患有慢性肾脏疾病的ESA(例如，EPO)治疗的长期血液透析患者。
在一个具体实施方案中，本发明提供通过向有需要的受试者施用有效量的包含本发明的抗体的组合物减少受试者的铁(例如，IV铁)给药需求的方法。在一个实施方案中，受试者患有贫血。在一个实施方案中，贫血是慢性疾病的贫血。在一个实施方案中，慢性疾病是慢性肾脏疾病。在一个实施方案中，慢性疾病是癌症。在一个实施方案中，慢性疾病是炎症。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是ESA(例如，EPO)抗性贫血。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是ESA(例如，EPO)低反应性贫血。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是铁限制性贫血。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者是长期血液透析(HD)的受试者。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者患有肾脏疾病，例如终末期肾病。
在一个具体实施方案中，本发明提供通过向有需要的受试者施用有效量的包含本发明的抗体的组合物减少受试者的铁(例如，IV铁)给药需求的方法，其中所述受试者患有功能性缺铁性贫血。在一个实施方案中，受试者是ESA(例如，EPO)治疗的长期血液透析患者。在一个实施方案中，受试者是患有慢性肾脏疾病的ESA(例如，EPO)治疗的长期血液透析的患者。
在一个具体实施方案中，本发明提供用于减少受试者的铁(例如，IV铁)给药需求并减少受试者的ESA(例如，EPO)给药需求的方法，所述方法包括施用本发明的抗体或抗原结合片段或包含所述抗体或抗原结合片段的组合物。在一个实施方案中，贫血是慢性疾病的贫血。在一个实施方案中，慢性疾病是慢性肾脏疾病。在一个实施方案中，慢性疾病是癌症。在一个实施方案中，受试者患有贫血。在一个实施方案中，慢性疾病是炎症。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是ESA(例如，EPO)抗性贫血。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是ESA(例如，EPO)低反应性贫血。在一个实施方案中，贫血(例如，慢性疾病的贫血)是铁限制性贫血。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者是长期血液透析(HD)的受试者。在实施方案中，包括在任何上述实施方案中，受试者患有肾脏疾病，例如终末期肾病。
在一个实施方案中，本发明提供通过向有需要的受试者施用有效量的本发明的抗体及其抗原结合片段来动员隔离的铁的方法。
在一个实施方案中，本发明提供通过向有需要的受试者施用有效量的包含本发明的抗体的组合物动员隔离的铁的方法。
在一个实施方案中，本发明提供用于改善(例如，增加)患有贫血的受试者中血红蛋白水平、同时减少对促红细胞生成素和/或铁(例如IV铁)的给药需求的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，贫血是与慢性疾病相关的贫血。在一个实施方案中，改善血红蛋白水平包括将血红蛋白水平提高至临床实践指南所规定的水平，例如Kidney Disease:Improving Global Outcomes(KDIGO)Anemia Work Group.KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in ChronicKidney Disease.Kidney inter.,Suppl.2012；2:279–335，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，改善血红蛋白的水平包括将血红蛋白的水平提高到至少约11.0g/dL，例如提高到约11.0g/dL到约12.5g/dL。在一个实施方案中，改善血红蛋白的水平包括将血红蛋白的水平提高到至少11.0g/dL，例如提高到11.0g/dL到12.5g/dL。
在一个实施方案中，本发明提供用于改善(例如，增加)患有贫血的受试者中血红蛋白水平、同时减少对促红细胞生成素和/或铁(例如，IV铁)的给药需求的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含本发明抗体的组合物。在一个实施方案中，贫血是与慢性疾病相关的贫血。在一个实施方案中，改善血红蛋白的水平包括将血红蛋白水平提高至临床实践指南所规定的水平，例如Kidney Disease:Improving Global Outcomes(KDIGO)Anemia Work Group.KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in ChronicKidney Disease.Kidney inter.,Suppl.2012；2:279–335，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，改善血红蛋白的水平包括将血红蛋白的水平提高到至少约11.0g/dL，例如提高到约11.0g/dL到约12.5g/dL。在一个实施方案中，改善血红蛋白的水平包括将血红蛋白的水平提高到至少11.0g/dL，例如提高到11.0g/dL到12.5g/dL。
在一个实施方案中，本发明提供用于维持患有贫血的受试者中血红蛋白水平、同时减少对促红细胞生成素和/或铁(例如，IV铁)的给药需求的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，贫血是与慢性疾病相关的贫血。在一个实施方案中，改善血红蛋白的水平包括将血红蛋白水平提高至临床实践指南所规定的水平，例如Kidney Disease:Improving Global Outcomes(KDIGO)Anemia WorkGroup.KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic KidneyDisease.Kidney inter.,Suppl.2012；2:279–335，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，改善血红蛋白的水平包括将血红蛋白的水平提高到至少约11.0g/dL，例如提高到约11.0g/dL到约12.5g/dL。在一个实施方案中，改善血红蛋白的水平包括将血红蛋白的水平提高到至少11.0g/dL，例如提高到11.0g/dL到12.5g/dL。
在一个实施方案中，本发明提供用于维持患有贫血的受试者中血红蛋白水平、同时减少对促红细胞生成素和/或铁(例如，IV铁)的给药需求的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含本发明抗体的组合物。在一个实施方案中，贫血是与慢性疾病相关的贫血。在一个实施方案中，改善血红蛋白的水平包括将血红蛋白水平提高至临床实践指南所规定的水平，例如Kidney Disease:Improving Global Outcomes(KDIGO)Anemia WorkGroup.KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic KidneyDisease.Kidney inter.,Suppl.2012；2:279–335，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，改善血红蛋白的水平包括将血红蛋白的水平提高到至少约11.0g/dL，例如提高到约11.0g/dL到约12.5g/dL。在一个实施方案中，改善血红蛋白的水平包括将血红蛋白的水平提高到至少11.0g/dL，例如提高到11.0g/dL到12.5g/dL。
在一个实施方案中，表1中所述的分离的抗体或其抗原结合片段可以，与如本文所述或本领域已知的治疗方法或过程结合，施用于有需要的患者。作为非限制性实例，这样的方法或过程包括：施用治疗有效量的ESA(例如EPO)、促红细胞生成素或铁、以及输血。治疗通常间隔地持续一周、一个月、三个月、六个月或一年的时间。在一些患者中，在长达患者剩余的生命时间内施用治疗。
当本发明的治疗剂与另一种药剂一起施用时，可以依次以任何次序施用或同时施用二者。在一些方面，将本发明的抗体施用于也正在接受第二药剂或方法(例如ESA、促红细胞生成素、铁、输血)治疗的受试者。在其它方面，结合分子与外科治疗联合施用。
用于与BMP6结合抗体组合治疗的合适药剂包括本领域已知的抑制或降低BMP6的表达、水平、稳定性和/或活性的药剂。此类药剂包括BMP6的抗体、siRNA和小分子。
各种BMP6抗体是本领域已知的，包括，尤其是以下文献中描述的那些：
Andriopoulos等人2009Nat.Genet.41:482-487；
Arndt等人2010Gastroent.138:372-382；
Bames等人1995World J.Urol.13:337-343；
Camaschella等人2009Nat.Genet.41:386-388；
Celement等人1999Int.J.Cancer 80:250-256；
Corradini等人2011Hepatol.54:273-284；
Crews等人2010J.Neuro.30:12252-12262；
Dai等人2005Cancer Res.65:8274；
Darby等人2007J.Pathol.214:394-404；
Hadziahmetovic等人2011 179:335-348；
Hamdy等人1997Cancer Res.57:4427；
Haudenschild等人2004Cancer Res.64:8276；
Hee等人2008J.Orth.Res.27:162-168；
Herrera等人2009BMC Cell Biol.10:20；
Inagaki等人2005Endocrin.147:2681-2689；
Jung等人2008Stem Cells 26:2042-2051；
Kaiser等人1998J.Invest.Derm.111:1145-1152；
Kautz等人2011Haematol.96:199-203；
Khalaf等人2012Eur.J.Endocrin.168:437-444；
Kochanowska等人2002Exp.Biol.Med.227:57-62；
Li等人2006Int.J.Med.Sci.3:97-105；
Meynard等人2011Blood 118:747-756；
Pederson等人2008Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:20764-69；
Plant等人2002J.Bone Min.Res.17:782-790；
Schluesener等人1994Atheroscl.113:153-156；
Schluesener等人2004GLIA 12:161-164；
Shi等人2009Fert.Steril.92:1794-1798；
Varley等人1996Exp.Neur.140:84-94；
Wang等人2007Mol.Cell.Neurosci.34:653-661；和
Zhang等人2006Neurosci.138:47-53；
U.S.Pat.No.8,795,665；和
WO 2010/056981；
本领域已知BMP6的其它抗体，许多是商售的。
本领域已知多种BMP6的siRNA，包括，尤其是以下文献中描述的那些：
He等人2003Cell.Signal.25:1372-1378；
Ikeda等人2012PLoS 0040465；
Kautz等人2008Blood 112:1503；
Mi等人2011J.Cancer Res.Clin.Oncol.137:245；
Xia等人2007J.Biol.Chem.282:18129-18140；
Xia等人2008Blood 111:5195；and
Yang等人2009Int.J.Bioch.Cell Biol.41:853-861。
BMP6的其它抑制剂是已知的。这些中的任何一种可以与本文公开的任何抗体或其抗原结合片段组合使用。
组合治疗方案可以是相加的、或者可以产生协同结果(例如，BMP2活性的降低比针对两种药剂的组合使用所预期的更多)。在一个实施方案中，本发明提供了用于预防和/或治疗贫血或如上所述的其它BMP6相关疾病的组合疗法，该组合疗法使用本发明的BMP6结合抗体和抗贫血剂或方法如ESA、促红细胞生成素、铁或输血。
诊断用途
在一个方面，本发明包括在生物样品(例如，血液、血清、细胞、组织)中或罹患疾病或病患的个体、或有发展贫血相关病患的风险的个体中，测定BMP6和/或核酸表达以及BMP6功能的诊断测定试验。
诊断测定试验，如竞争性测定试验，依赖于标记的类似物(“示踪剂”)与测试样品分析物竞争共同结合配偶体上的有限数量的结合位点的能力。结合配偶体通常在竞争之前或之后是不溶的，然后将与结合配偶体结合的示踪剂和分析物从未结合的示踪剂和分析物中分离。可以通过倾析(其中结合配偶体是预先不溶解的)或通过离心(其中结合配偶体在竞争性反应之后沉淀)来完成这种分离。测试样品分析物的量与通过标记物质的量测量的结合示踪剂的量成反比。使用已知的分析物量制备剂量-反应曲线，并与测试结果进行比较，以便定量确定测试样品中存在的分析物的量。当酶用作可检测标记物时，这些测定试验称为ELISA系统。在这种形式的测定试验中，抗体和BMP6结合抗体之间的竞争性结合导致，结合的BMP6(优选本发明的BMP6表位)是血清样品中抗体的量度，最特别地血清样品中的中和抗体的量度。
测定试验的一个显著优点是直接测量中和抗体(即干扰BMP6、特别是表位结合的抗体)。这种测定试验，特别是以ELISA测试形式的测定试验，在临床环境和常规血液筛查中具有相当多的应用。
在患有贫血相关疾患的患者的临床诊断或监测中，检测BMP6蛋白，与来自正常受试者的相应生物样品中的水平相比，指示患有贫血相关疾病的患者。
US2006/0067935中描述了体内诊断或成像。简而言之，这些方法通常包括向患者施用或引入诊断有效量的BMP6结合分子，其可操作地连接到可通过非侵入性方法检测的标记物或标记。使抗体-标记物缀合物有足够的时间定位并结合BMP6。然后使患者暴露于检测装置以识别可检测标记物，从而形成BMP6结合分子在患者组织中的位置的图像。通过测定抗体-标记物是否与组织成分结合来检测BMP6结合抗体或其抗原结合片段的存在。与没有贫血的正常个体相比，检测到BMP6蛋白或蛋白组合水平的增加，指示贫血相关病症的易感性和/或发作。本发明的这些方面也用于组织成像方法和组合的诊断和治疗方法中。
本发明还涉及预测医学领域，其中诊断测定试验、预后测定试验、药物基因组学和监测临床试验用于预后(预测)目的，从而预防性地治疗个体。
本发明还提供预后(或预测)测定试验，其用于确定个体是否有风险发生与BMP6通路活性失调相关的病患。例如，可以在生物样品中分析BMP6基因的突变。这样的测定试验可以用于预后或预测目的，从而在特征为BMP6、核酸表达或活性的疾患或与BMP6、核酸表达或活性相关的疾患发作之前预防性治疗个体。
本发明的另一方面提供了确定个体中BMP6核酸表达或BMP6活性从而为该个体选择合适的治疗或预防剂的方法(本文称为“药物基因组学”)。药物基因组学允许基于个体的基因型(例如，检查个体的基因型以确定个体对特定药剂反应的能力)来选择用于个体治疗或预防的药剂(例如药物)。
本发明的另一方面提供了一种在临床试验中监测药剂(例如药物)对BMP6的表达或活性的影响的方法。
药物组合物
本发明提供药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的BMP6结合抗体或其结合片段。组合物可以另外含有一种或多种适于治疗或预防BMP6相关疾病(例如贫血)的其它治疗剂。药学载体增强或稳定组合物、或促进组合物的制备。药学上可接受的载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。
本发明的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。施用途径和/或模式根据所期望的结果而变化。施用可以是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下，或在靶位点附近施用。药学上可接受的载体应适用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，可以将活性化合物(即抗体、双特异性和多特异性分子)包被在材料内以保护化合物免受可能使化合物失活的酸和其它天然条件的作用。
组合物应该是无菌和流动的。例如可以通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的粒径、和通过使用表面活性剂，维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇或山梨醇)和氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶来实现可注射组合物的长期吸收。
可以根据本领域熟知和常规实施的方法制备本发明的药物组合物。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,第20版,2000；和Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。优选在GMP条件下制备药物组合物。通常，在本发明的药物组合物中使用治疗有效剂量(effective dose)或有效剂量(efficaciousdose)的BMP6结合抗体。通过本领域技术人员已知的常规方法将BMP6结合抗体配制成药学上可接受的剂型。调整剂量方案以提供最佳期望的反应(例如治疗反应)。例如，可以施用单个快速浓注(bolus)、可以随时间施用几个分开的剂量、或者如治疗情况的紧急程度所指示，剂量可按比例减少或增加。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于施用和剂量均匀。用于本文的单位剂量形式是指物理上离散的单位，其适合作为单个剂量用于待治疗受试者；每个单位含有与所需药物载体联合的预定量的经计算可以产生所需治疗效果的活性化合物。
可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得一定量的活性成分，所述活性成分量对于特定患者、组合物和施用模式可以有效达到所需的治疗反应，且对该患者无毒性。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄率、治疗的持续时间、与所使用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前的病史等等因素。
医师或兽医可以以低于实现期望治疗效果所需的水平，作为药物组合物中使用的本发明抗体及其抗原结合片段的开始剂量，并逐渐增加剂量，直到实现所需效果。通常，用于治疗本文所述的过敏性炎性病患的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述不同因素包括施用方式、靶位点、患者的生理状况、患者是否是人或动物、其它施用药物、以及治疗是预防性还是治疗性的。需要滴定治疗剂量以优化安全性和有效性。对于用抗体全身给药，剂量范围为宿主体重的约0.0001至100mg/kg、更通常为0.01至15mg/kg。一个示例的治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次全身施用。对于抗体的玻璃体内施用，剂量范围为约0.0001至约10mg。一个示例的治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次全身施用。
抗体通常可以多次施用。单剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者中BMP6结合抗体的血液水平来指示。在全身施用的一些方法中，调整剂量以达到1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中达到25-500μg/ml的血浆抗体浓度。或者，可以作为持续释放制剂施用抗体，在这种情况下需要较低频度的施用。剂量和频度根据患者中抗体的半衰期而变化。通常，人源化抗体比嵌合抗体和非人抗体显示更长的半衰期。施用的剂量和频度可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，相对较低的剂量在一段长时间内以相对不频繁的间隔施用。有些患者在其剩余的生命中持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要相对高的剂量以相对短的间隔施用，直到疾病的进展降低或终止，并且优选直到患者的疾病症状部分或完全改善为止。此后，可以向患者施予预防方案。
在一个具体实施方案中，包含本发明的抗体或抗原结合片段的组合物以0.001mg/kg至0.1mg/kg的剂量(抗体或其抗原结合片段)施用。在具体实施方案中，包含本发明的抗体或抗原结合片段的组合物以约0.001mg/kg至约0.1mg/kg的剂量施用。在具体实施方案中，包含本发明的抗体或抗原结合片段的组合物以0.001mg/kg、0.0016mg/kg、0.0025mg/kg、0.0040mg/kg、0.0063mg/kg、0.01mg/kg、0.016mg/kg、0.025mg/kg、0.040mg/kg、0.063mg/kg或0.1mg/kg的剂量施用。在一个具体实施方案中，包含本发明的抗体或抗原结合片段的组合物以约0.001mg/kg、约0.0016mg/kg、约0.0025mg/kg、约0.0040mg/kg、约0.0063mg/kg、约0.01mg/kg、约0.016mg/kg、约0.025mg/kg、约0.040mg/kg、约0.063mg/kg或约0.1mg/kg的剂量施用。在一个实施方案中，施用包含本发明的抗体或抗原结合片段的组合物，包括例如以任何上述剂量，静脉内施用。在实施方案中，静脉内施用是静脉内输注。在实施方案中，输注在30-60分钟内进行。在实施方案中，输注在约30-60分钟内进行。
实施例
提供以下实施例以进一步举例说明本发明，但不限制其范围。本发明的其它变体对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的，并且包括在所附权利要求书中。
实施例1
实施例尤其描述了抗体3、5、6和7。
描述了这些抗体与亲本抗体之间的关系：
Figure BDA0001382481410001091
全部克隆是人IgG1抗体。
缩写列表
Figure BDA0001382481410001092
Figure BDA0001382481410001101
Figure BDA0001382481410001111
Figure BDA0001382481410001121
概述
在此工作中，我们已经通过使用人噬菌体展示文库，应用噬菌体展示，成功地鉴定了特异性抗人BMP6抗体。
介绍
贫血在慢性肾脏疾病(CKD)患者中普遍存在，并且与较低的生活质量和较高风险的不良后果(包括心血管疾病和死亡)相关。
BMP6抗体的一个目的是，作为降hepcidin疗法，通过同时增加血红蛋白和降低对红细胞生成刺激剂(如促红细胞生成素)和静脉内铁的需要，来帮助患有铁限制性贫血的患者。hepcidin降低剂可能是在该患者群体以及以铁限制性为特征的其它慢性疾病贫血(ACD)形式中改善ESA低反应性贫血的有效策略。
该项目的总体目标是鉴定和开发能够降低hepcidin水平的BMP6抗体，从而通过减少红细胞生成刺激剂(ESA)的需求，帮助患有铁限制性贫血的患者。在这项工作中，我们应用噬菌体展示来鉴定BMP6特异性的结合物。
优选的BMP6抗体满足以下列出的大多数或全部标准：
在人BMP6上Fab片段的解离常数(KD值)低于1nM。
与人BMP6相比，在cyno BMP6抗原上的KD值弱不超过5倍。
与人BMP6相比，在小鼠BMP6抗原上的KD值弱不超过5倍。
对人BMP6的选择性超过对人BMP5和人BMP7的，具有100倍以上的差异。
在HEP3B-BRE-Luc报告基因测定试验中，结合并中和BMP6信号传导活性的能力。用hBMP蛋白(R&D)诱导以BRE2-luc2报告基因稳定转染的HEP3B细胞，并用抗BMP6抗体处理。BrightGlo测定试验在处理后24小时进行。
在肝细胞系和原代人肝细胞中抑制BMP6诱导的hepcidin表达的能力。
低至中度的可开发风险。一种最终的抗体形式是人IgG1。
使用如前所述的可商购的噬菌体展示文库(Knappik等人2000J.Mol.Biol.296:57-86,Prassler等人 2011J.Mol.Biol.413:261-278)产生抗体，并采用在噬菌体表面上展示Fab的技术(Rothe等人，2008J.Mol.Biol.376：1182-1200)。在来自R&D Systems的hBMP6上进行淘选和初步ELISA筛选。蛋白质结合命中物的ELISA筛选导致hBMP6特异性结合物的鉴定。进一步表征抗体Fab片段与小鼠BMP6同源物的物种交叉反应性，并测定它们对人BMP6的结合亲和力。还使用hBMP2、hBMP5和hBMP7蛋白在ELISA中检查Fab的特异性。还在报告基因测定试验中评估Fab的BMP6特异活性。
基于该初始表征，将几个克隆转化为人IgG1形式，并使用相同的结合、特异性和活性测定试验进行表征。该功能表征的结果，与由可开发性评估得到的性质组合，导致选择了3个克隆用于亲和力成熟(NOV0429、NOV0441和NOV0442)。
将克隆在其LCDR3或其HCDR2中进行随机化，每个亲本克隆产生2个新的Fab文库。使用来自Peprotech的hBMP6进行固相淘选，使用来自Peprotech的随机生物素化的hBMP6进行液相淘选。对大肠杆菌Fab裂解物的MSD-SET筛选，组合在hBMP5和hBMP7蛋白质上进行的特异性ELISA，导致鉴定出与亲本克隆相比具有改善亲和力的hBMP6特异性结合物。然后将这些改善的衍生物转化为人IgG1形式，并在ELISA和RGA中进一步表征，以评估其hBMP6特异活性。
选择具有期望性质和良好可开发性质的18个成熟抗体克隆用于工程化(去除潜在的PTM位点和种系化)。在微小规模表达中作为hIgG1产生28个所得变体并如前所述表征。
该功能表征的结果，与可开发性评估得到的结果组合，导致选择先导候选物。
在直接包被的抗原上的ELISA筛选
使用ELISA筛选，从淘选结果鉴定了与靶抗原结合的单个Fab克隆。使用含有Fab的大肠杆菌粗裂解物，测试了Fab片段(参见第2.3.3节)。
使用在4℃以50mM柠檬酸盐缓冲液pH 4.7中的1.5μg/mL浓度的hBMP6_RD过夜包被的Maxisorp 384孔板，进行初次筛选。
使用hBMP6_RD(50mM柠檬酸盐缓冲液pH 4.7中1.5μg/mL)包被的Maxisorp 96孔板进行初次命中物的二次筛选，以及用hBMP7(50mM柠檬酸盐缓冲液pH 4.7中3μg/mL)包被的Maxisorb 96孔板进行特异性检测。
洗涤后，将板用PBS中的5％脱脂乳封闭2小时。加入含Fab的大肠杆菌裂解物，并在室温下允许结合2小时。为了检测结合的Fab片段，用TBST洗涤板5次，并以1/5000的稀释度加入AP-抗人F(ab')2抗体。在室温下孵育2小时后，将板用TBST洗涤5次，并根据制造商的说明书加入AttoPhos底物。在加入底物后10分钟，在ELISA读数器中读板。
亲和力成熟后的SET筛选
原则上如下所述进行亲和力排序。根据(Haenel等人，2005)描述的原理通过溶液平衡滴定法对成熟结合物排序，用不同浓度的抗原过夜平衡恒定量的稀释的BEL提取物。
然后将混合物转移至先前用抗原包被的MSD板，孵育和洗涤后，加入合适的MSD-Sulfo-标签标记的检测抗体。
随后，使用Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD，USA)通过ECL检测来量化未结合的Fab浓度。
使用XLfit(IDBS)软件处理结果，应用相应的拟合模型(第2.6.2.2节)来估计亲和力，从而鉴定通过亲和力成熟最大程度改善的克隆。
体外测定试验
通过ELISA评估选择性和交叉反应性
为了确定抗BMP6抗体的物种交叉反应性，将重组人和小鼠BMP6蛋白结合到板上，并通过ELISA测定抗体结合重组蛋白的能力。为了评估选择性，还评估了与最接近的同源物人BMP5和BMP7的结合。
通过在4℃下以3-5ug/mL过夜直接固定，以抗原试剂包被ELISA板。hBMP6(Peprotech)在50mM Tris pH8.0中稀释用于包被。hBMP6、mBMP6和hBMP5(R&D Systems)在50mM柠檬酸盐缓冲液pH 4.7中稀释。hBMP7(Peprotech)在50mM柠檬酸盐缓冲液pH 4.7中稀释。作为无关抗原，hDKK1-His在PBS中以5μg/mL包被。
第二天，弃去抗原溶液，并将板用100μL TBST洗涤三次。随后每个孔用100μL 5％牛奶在TBST中在室温下封闭2小时。在随后的实验中，用100uL的Superblock封闭缓冲液进行封闭。
用100μL TBST洗涤板3次后，将每种抗原与浓度分别为1uM和0.2uM(PBST缓冲液中)的40uL纯化的Fab或IgG样品孵育。
在室温下孵育2小时后，将板再次洗涤三次，并通过加入40uL1:5000稀释的AP缀合的抗人IgG F(ab2)二抗，检测结合的Fab/IgG。在室温下1小时后，通过根据制造商的方案，加入40uL AttoPhos底物，使信号显色，并用ELISA板读数器，使用430nm的激发波长和535nm的发射波长，立即分析板。
亲和力评估
ELISA结合曲线
通过在50mM Tris缓冲液pH8.0中以1.5μg/mL直接固定并在4℃过夜温育，将hBMP6(Peprotech)抗原包被到ELISA板上。第二天，弃去抗原溶液，将板用100μLTBST洗涤3次。然后每个孔用100μL 5％牛奶在TBST中在室温下封闭2小时。在随后的实验中，用100uL的Superblock封闭缓冲液进行封闭。
用100μL TBST洗涤板3次后，将抗原与30μL系列稀释的纯化Fab或IgG样品孵育，对于Fab，在PBST中从1uM至0.03nM系列稀释，对于IgG，在PBST中从0.5uM至0.01nM系列稀释。
在室温下孵育2小时后，将板再次洗涤三次，并通过加入30uL 1：5000稀释的AP缀合的抗人IgG F(ab2)二抗，检测结合的Fab/IgG。在室温下1小时后，根据制造商的方案通过加入30uL AttoPhos底物使信号显色，并用ELISA板读数器，使用430nm的激发波长和535nm的发射波长，立即分析板。
使用Sector Imager 6000(MSD)通过溶液平衡滴定(SET)方法测定KD
基本上如文献(Friquet等人，1985)所述进行溶液中的亲和力测定。为了改善SET方法的灵敏度和准确性，将其从经典的ELISA转变为基于ECL的技术(Haenel等人，2005)。
根据制造商的说明书，用MSD Sulfo-TAGTM NHS-酯(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD，USA)标记1mg/mL山羊抗人IgG(Fab)2片段特异性抗体。
实验在聚丙烯微量滴定板和含有0.5％(w/v)BSA和0.02％(v/v)Tween20的PBS作为测定缓冲液中进行。未标记的抗原进行2n系列稀释，起始浓度比预期KD高至少10倍。没有抗原的孔用于确定Bmax值；仅含有测定缓冲液的孔用于确定背景。加入适量的结合物(抗体浓度与预期KD相似或低于预期的KD，最终体积60μL)，将混合物在室温下过夜孵育。
用抗原(30μL/孔)包被MSD板。用含有0.05％(v/v)Tween20的PBS洗涤板后，将平衡的样品转移到板(30μl/孔)中并孵育20分钟。洗涤后，将30μl/孔的MSD-Sulfo-标签标记的检测抗体(抗人(Fab)2，最终稀释度通常为1:2000)加入到MSD板中，并在室温下在Eppendorf振荡器上孵育30分钟(700rpm)。
在洗涤MSD板并加入30μL/孔MSD读取缓冲液T与表面活性剂之后，使用SectorImager 6000(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD，USA)检测电化学发光信号。
使用XLfit(IDBS)软件应用定制的拟合模型评估数据。对于Fab分子的KD测定，使用以下拟合模型(根据(Haenel等人，2005)，并根据(Abraham等人，1996)进行了修改)：
Figure BDA0001382481410001171
[Fab]t：应用的总Fab浓度
x：应用的总可溶性抗原浓度(结合位点)
Bmax：无抗原的最大Fab信号
KD：亲和力
对于IgG分子的KD测定，使用以下的IgG拟合模型(根据(Piehler等人，1997)进行修改)：
Figure BDA0001382481410001172
[IgG]：应用的总IgG浓度
x：应用的总可溶性抗原浓度(结合位点)
Bmax：没有抗原的最大IgG信号
KD：亲和力
实验设置：
Fab的KD测定基本上如下进行：在4℃下，用10uL/孔的10mM Tris缓冲液pH8中的hBMP6以1-3μg/mL，过夜包被MSD板。随后，用含有5％BSA的PBS封闭板1小时。hBMP6抗原用于游离Fab片段的滴定。将抗原储备溶液在10mM Tris缓冲液pH 8.0中1:40预稀释至475nM，然后用测定缓冲液调节至预期的起始浓度用于滴定。
ForteBio Octet动力学测量
通过Bio-Layer Interferometry技术进行动力学参数的测定来进行亲和力评估。
使用链霉亲和素Dip和Read生物传感器，测量纯化的Fab样品。将板放置在OctetQK仪器(ForteBio)中，并使其在恒温室中平衡至25℃。通过将传感器置于含有15ug/mL生物素化的hBMP6抗原的孔中600秒来开始试验。然后将传感器放置在含有0、200、400、800和1600nM纯化的Fab样品的孔中。使用0nM Fab浓度进行背景测定。通过测量层厚度(纳米，nm)随时间的变化，记录Fab结合和解离各800秒，全部在计算机控制下进行。使用Octet User软件3.0版自动处理数据。
Biacore动力学测量
使用纯化的Fab和IgG样品以及人BMP6和BMP7抗原进行测量。
通过ELISA对表位分组(epitope binning)
通过竞争性ELISA进行表位分组，以将抗体分至相同表位或显著重叠表位的组，即能够抑制彼此的结合的抗体。
抗BMP6IgG以20uL在PBS中以66nM包被Maxisorp 384孔板。将板在4℃下过夜孵育。用TBST洗涤两次后，将板在室温下用100uL/孔的Superblock封闭缓冲液封闭2.5小时，然后用TBST洗涤两次。
在板封闭期间，Peprotech hBMP6以66nM在PBST中与PBST中300nM的纯化抗BMP6Fab(Flag-His标记的)在eppendorf管中预混合(提及混合物中的最终浓度)。在室温下孵育2小时后，根据板布置，将20uL预混合的hBMP6/Fab加入到封闭的抗BMP6IgG包被的孔中，并在室温下孵育最多20分钟。
将板用TBST洗涤四次，并将在PBST中1/1000稀释的抗His6-POD(如SEQ ID NO：96所公开的“His6”)抗体缀合物加入到板中。在室温下孵育1小时后，用TBST洗涤板5次。向每个孔中加入化学发光ELISA底物溶液，使用Tecan板读数器，无孵育时间，读取发光。
报告基因测定试验(RGA)中的体外效力
在报告基因测定试验(RGA)中作为纯化的Fab片段和/或IgG样品测试抗体克隆。
简言之，用pGL4-BRE2-Luc2慢病毒载体稳定转染HEP3B肝癌细胞系，所述慢病毒载体在驱动萤火虫萤光素酶的启动子中含有BMP-应答元件BRE。来自R&D系统的BMP蛋白用于诱导信号传导。在处理后24小时进行BrightGlo测定试验。
对脱靶活性的评估
Progen
Figure BDA0001382481410001191
AV-VAR EP包含384个纯化的细胞外或分泌蛋白，所述蛋白在大肠杆菌中表达为N末端His标签融合蛋白。
与5ug/mL的抗hBMP6抗体孵育后，通过使用DyLight649缀合的F(ab')2——山羊抗hIgG F(ab')2片段特异性抗体，检测结合的抗体。
内部对照hIgG的信号设置为100％；相对hIgG归一化脱靶活性；当信号等于或高于4％(该截断值对应于在背景上测量的m+3)时，命中物被认为是阳性的。
小鼠模型中的体内功效
已经在ESA抗性贫血小鼠模型中测试了抗体5、抗体6和抗体7纯化抗体。
结果
抗BMP6抗体的表征
工程化IgG的特异性评估
以微量规模产生28种抗hBMP6工程化IgG(种系化和PTM去除)，并以浓度0.2uM进行了特异性ELISA测试。
选择保留了与其它BMP蛋白质的有限交叉反应性、并且与非工程化的成熟克隆相比对hBMP6具有强亲和力的工程化变体，用于进一步表征。
·所有NOV0429工程化IgG变体显示高度增加的非特异性BSA结合。
·NOV0441工程化IgG变体，与其成熟亲本相比，显示对hBMP5略有增加的交叉反应性。
·NOV0442工程化IgG变体保留了对hBMP7和hBMP5的有限交叉反应性。
表2.工程化IgG抗体克隆的特异性ELISA；灰色突出显示3个先导抗体
Figure BDA0001382481410001211
Figure BDA0001382481410001221
报告基因测定试验(RGA)中的活性
如前所述，测试了28个微量级产生的抗hBMP6工程化IgG(种系化和去除PTM)。结果总结在表3中。
·NOV0429工程化IgG变体显示了3至5倍改善的BMP6活性，但反过来获得了与所有其它BMP的激动剂活性。
·NOV0441工程化IgG变体对所有三种其它BMP获得了一些交叉反应性。
·NOV0442工程化IgG变体显示出改善的BMP活性，但也在最高浓度25ug/ml显示出对BMP7诱导的系统的一些抑制作用。
表3.RGA中工程化IgG抗体克隆的活性；IC50值为[ug/mL]。选择NOV0951、NOV0954和NOV0958作为先导抗体。
Figure BDA0001382481410001222
Figure BDA0001382481410001231
可开发性评估S-DAS 3
在种系化(germlining)和去除PTM之后，对18个成熟克隆的23个抗hBMP6工程化变体进行第三可开发性评估。
除了2个克隆(NOV0942，NOV0429的HCDR2衍生物；NOV0944，NOV0441的LCDR3衍生物)由于高聚集水平而显示高风险之外，发现其余抗体具有有利的风险可开发性质。
由于低的生产性滴度，另外两个克隆被标记为中等风险特征(NOV0957和NOV0960，NOV0442亲本抗体的HCDR2衍生物)。
表4.抗BMP6抗体的S-DAS 3总结(23个工程化的hIgG1s)；选择NOV0951、NOV0954和NOV0958作为先导抗体。
Figure BDA0001382481410001241
关键PTM基序
是 推荐去除的PTM基序(NG、NS、DG、N-Glyc、Cys、H-N30X)
由于物理化学特性的总体可开发性风险
低 低风险
中 中度风险
高 高风险:推荐-不继续使用该候选物；该候选物不满足一般DAS标准
聚集体
低 IgG的单体含量至少95％
中 IgG的单体含量90％至95％
高 IgG的单体含量低于90％；该候选物不满足一般DAS标准(≥90％)
生产率
低 在瞬时表达系统中IgG生产率为至少10mg/L
中 在瞬时表达系统中IgG生产率为5至10mg/L
高 在瞬时表达系统中IgG生产率低于5mg/L；该候选物不满足一般DAS标准(≥5mg/L)
pI
≥8.2
<8.2；表明一定的风险；可能引起聚集/配制问题
Tm(pH 7.4)
≥68℃
<68℃；表明一定的稳定性风险；可能引起聚集/配制问题
疏水性
≥0.8M(NH4)2SO4
<0.8M(NH4)2SO4；表明一定的风险；可能引起聚集/配制问题、高粘度、沉淀；
对脱靶活性的评估
在如上所述的用384个纯化的细胞外或分泌蛋白包被的Protagen UNIchip上，测试了3个先导候选物NOV0951、NOV0954和NOV0958以纯化的hIgG1形式的脱靶结合。其均显示出低的脱靶活性(≤10命中)，这可以被认为是无问题的。
表5.3个先导抗体蛋白芯片结果的总结。
Figure BDA0001382481410001251
(*)：相对于hsIgG(＝100％)归一化的脱靶活性
Figure BDA0001382481410001252
阳性命中以灰色强调
先导和后备抗体的选择
基于RGA中的蛋白结合数据、活性和特异性数据以及可开发性评估，决定选择工程化的候选物NOV0951、NOV0954、NOV0958作为先导抗体。此外，与抗体676相比，这些候选物都显示出优越的hBMP6特异性窗口。工程化的候选物NOV0961、NOV0943、NOV0945被认为是后备抗体。表6概括了最终候选物的家族树。
表6.所选抗hBMP6先导和后备抗体的家族树
Figure BDA0001382481410001261
结论与讨论
该项目的一个目标是揭示抑制BMP6信号传导、因此适用于治疗慢性疾病的贫血的抗体。
因此，应用3种不同的基于蛋白质的淘选策略。初步ELISA命中物主要来自固相淘选池，在RGA的活性测试后12个抗体显示出抑制hBMP6信号传导。源自淘选子代码2023.5的3个抗体克隆(NOV0429、NOV0441和NOV0442)显示出BMP6特异的活性和良好的可开发性质，因此选择其用于亲和力成熟。
为每个抗体克隆生成2个文库，其中LCDR3或HCDR2被随机化。应用3种不同的成熟淘选策略。在SET筛选、特异性ELISA和测序之后，发现18个成熟抗体克隆在RGA中特异性抑制BMP6信号传导，并被选择用于工程化。
对来自NOV0442家族的成熟克隆进行LCDR2中潜在脱酰胺位点的去除、框架修复和种系化。这产生抗体NOV0951、NOV0954、NOV0958和NOV0961，其显示与它们各自的非突变成熟亲本具有相似的结合特性。
对来自NOV0441家族的成熟克隆进行种系化，这产生抗体NOV0943、NOV0945和NOV0946，其显示与其各自的非突变成熟亲本相比，具有增加的对BMP5的交叉反应性。
基于其抑制BMP6信号传导的能力、对其它BMP蛋白有限的交叉反应性、以及其有利的可开发性特征，以更高的量生产了NOV0951、NOV0954和NOV0958并进一步评价其作为EPO抗性(铁限制性)贫血的治疗药物的用途。使用ESA抗性贫血小鼠模型来确定其体内功效。
对3个先导抗体NOV0951、NOV0954和NOV0958进行最终可开发性评估。通过测定其在大鼠中的PK特征来评估3个先导抗体的体内适宜性。
表7总结了满足项目开始时定义的抗体需求的最终潜在候选物的性质。
表7.所选抗hBMP6先导抗体的特征
Figure BDA0001382481410001271
实施例2-抗BMP6抗体的体外和体内活性以及PK/PD
材料
测试化合物是抗体5、6和7(表8)，在50mM柠檬酸盐缓冲液pH 7.0，150mM NaCl中的浓度为约8mg/ml，并在动物施用前在PBS中稀释。使用雄性C56BL/6小鼠或Sprague Dawley大鼠(表9)。
表8.BMP6拮抗剂抗体的特性
Figure BDA0001382481410001281
表9 动物特征
Figure BDA0001382481410001282
对于BMP报告基因测定试验，构建了在启动子中包含BMP应答元件BRE的慢病毒载体[Korchynskyi等人.2002.J.Biol.Chem.277:4882-9]，该启动子驱动源自pGL4-BRE2-Luc2的萤火虫萤光素酶。慢病毒载体用于稳定转染HEP3B肝癌细胞株。将细胞系维持在具有10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素和5ug/ml杀稻瘟菌素(Blasticidin)的EMEM中。重组人BMP蛋白购自R&D Systems。
在60ml瓶中流产布鲁氏菌环测试抗原(Brucella abortus RingTest Antigen)(菌株1119-3)购自美国Department of Agriculture,Animal and Plant HealthInspection Service,National Veterinary Services Laboratories,Ames,Iowa。流产布鲁氏菌环测试抗原含有在酚化缓冲液中的杀死、染色的流产布鲁氏菌菌株1119-3细胞的悬浮液。每个60mL瓶子的浓度约为109个颗粒/ml。以下列方式洗涤和制备5×109储存液。首先，将60毫升瓶子从冰箱中取出并彻底混合。然后将500ml BA转移到500mL离心瓶中。然后使用超速离心机以10,000rpm离心15分钟。除去上清液并重新悬浮于100mL PBS中，得到5×109个颗粒/ml储存液，将其等分并在-80℃冷冻。
动物维护条件
在适应和研究期间，将动物以群居方式笼养在微型隔离器固体底笼中。将动物保持在如下标准光照周期中：12小时黑暗、12小时光照(开灯：6:30AM，关灯：6:30PM)，室温21-23℃，湿度30-70％。在适应和研究期间，动物自由获得啮齿动物饮食和饮水(自由)。
实验条件
在BMP报告基因测定试验中测定抗体活性
在典型的测定试验中，384孔板上将0.6×104BRE-Luc2HEP3B细胞接种在25ul基础培养基(除了将血清降低至2％外)中。在第二天，加入在PBS中稀释的抗体，然后加入BMP6至终浓度10ng/ml。用无任何血清的EMEM培养基将体积调至50ul，使最终血清浓度为1％。作为计数试验(counter assay)，平行进行用BMP2/4/7的激活。使用Envision板读数器(PerkinElmer)，根据制造商的说明在抗体加入后24小时进行BrighGlo测定试验(Promega)。与对照抗体的完全报告分子活化相比，数据计算为每种抗体的抑制百分比。
单剂量抗体在大鼠中的药代动力学研究
大鼠PK类选研究并不旨在以确定的统计学确定性来确定经典的PK参数，而是旨在提供测试抗体的血清半衰期的估计。3只动物注射单个IV剂量的抗体。
对于小鼠剂量反应性PK/PD研究，将动物分成相等数量的两个单独的组。每组包括赋形剂和化合物处理的小鼠。一组在抗体注射后第2、4天进行分析，而第二组在抗体注射后第6、8天进行分析。分组的原因是减少对连续采血的需要，使得对血清铁参数的影响保持最小。动物组显示在表10中。
表10.设计、动物分配和测试物剂量
Figure BDA0001382481410001301
建立小鼠炎症贫血和治疗性处理
以下列方式制备5×108BA注射用颗粒(用于10只小鼠)。因为将注射200μl/小鼠，故起始浓度需要为2.5×109个颗粒/ml。使用PBS将储存液稀释2倍。例如，10只小鼠乘以0.200μl＝2ml+20％余量＝2.2mL的2.5×109个颗粒/ml是需要的。1.1ml BA储存液+1.1mLPBS。在ESA处理前1至8天施用BA显示导致6至7天后钝化的HGB反应。
C57BL/6小鼠注射BA(3×108个颗粒/小鼠)，并通过ELISA(KMC0061，LifeTechnologies)在5小时后测量血清IL6水平以确定炎症反应。从研究中排除IL6浓度低于所有BA处理动物平均值的95％置信区间的动物，导致一些组中少于5-6只小鼠。进行这种排除，以降低由于纳入不具有足够炎症以减弱ESA反应的动物而带来假阳性结果的可能性。在排除过程之后，小鼠在第6天静脉内注射如所示的抗体，并在相对于BA处理的第7天施用100mg/kg EPO(100g/kg皮下达贝泊汀α(darbepoetin alfa)，Amgen)。6天后测量对ESA和抗体治疗的反应。
药代动力学、药效学和功效终点分析
对于小鼠和大鼠的PK/PD研究，在抗体注射后的指定时间点收集血清样品。使用血清等分试样通过自动化高通量免疫测定系统(Gyros)来确定循环的抗体浓度，其中生物素化的抗人IgG作为一抗捕获抗体。将每个样品的第二血清等分试样用于定量比色铁试验(Quntichrom，DIFE-250，Bioassay Systems)。第三等分试样处理用于大鼠或小鼠hepcidin-25肽的LC-MS定量，其中按照先前描述的修改步骤进行。Li等人2009.J.Pharm.Tox.Meth.59:171-80。
对于BA诱导的贫血和抗体治疗研究，在终止时通过心脏穿刺在包被EDTA的BDMicrotainer管中获得最后一次采血。全血用于在XT-2000iV血液分析仪上进行的全血计数分析。功效终点包括HGB、HCT、RETA和RET-HE。
统计分析
进行单因素方差分析(ANOVA)，随后进行Bonferroni的事后检验，以分析血液学参数的组差异(p<0.05被认为显著)。数据报告为平均值±SEM。
结果
在细胞BMP依赖性转录测定试验中BMP6拮抗剂抗体的生物学活性
所有三种BMP6拮抗剂抗体5、6和7完全抑制人肝癌细胞系Hep3B中重组人BMP6诱导的BMP报告分子(BRE-luc)活性的生物活性(IC50＝0.4nM，相对于0.3nM rhBMP6)，因此在1:1Ag/mAb摩尔比具有活性或更好。相对于相关BMP家族蛋白(包括BMP2、5和7)，这些抗体显示出对BMP6的良好选择性，具有500倍或更高的选择性窗口。见图1。
BMP6拮抗剂抗体在大鼠中的Snapshot药代动力学和药效学特征
通过颈静脉导管，静脉内注射10mg/kg体重的BMP6抗体5、6和7，进行SpragueDawley大鼠的单次剂量类选药代动力学研究。比较三种抗体在血清中的总抗体浓度-时间关系(特别是t1/2，MRT)与标准曲线，表明与典型的人IgG一致的特征(见图2和表11)。没有靶介导的药物沉积(deposition)的迹象。在该剂量下，所有BMP6抗体到注射后第1天将血清hepcidin抑制至低于检测水平。hepcidin表达的持续强烈抑制到第16天仍然明显，表明活性持续时间长。相应地，在抗体注射后第2天观察到循环铁浓度的瞬时峰值升高，并且到第16天水平保持升高。
在单次注射抗体后，随时间测量血清抗体浓度。在给药后(10mg/kg，静脉内)1小时、6小时、1、2、4、8、16、28天收集样品。
表11.单次剂量大鼠类选PK研究中的关键参数
参数 抗体5 抗体6 抗体7
T<sub>1/2</sub>(天) 9.1 7.8 9.2
C<sub>max</sub>(ug/ml) 140.7 189.0 146.2
平均停留时间(天) 8.6 7.0 6.9
同样，在单次静脉内注射抗体7(在大鼠中，剂量为10、3、1、0.3、0.1和0.03mg/kg；在猴子中3mg/kg)后，通过ELISA在指定的时间测量大鼠和猕猴中抗体7的总血清浓度(游离的和BMP6结合的)，其中大鼠中的LLOQ为46ng/mL(虚线)，猴子中的LLOQ为0.2ug/mL(虚线)。结果示于图9(大鼠)和12(猴子)。
在小鼠和猕猴中BMP6抗体治疗后血清铁参数的剂量依赖性反应
为了进一步定义铁代谢对BMP6抗体治疗的剂量依赖性反应，如所示，向初次用于实验的(naive)C57BL/6小鼠注射递增剂量的抗体6，范围从0.02至0.5mg/kg，如所示。选择抗体6作为3个抗体的代表，因为它们共享类似的框架、啮齿动物PK特征和体外活性。在处理后2天，单次剂量0.5或0.1mg/kg显著抑制血清hepcidin，并相应地增加血清铁浓度。然而，只有0.5mg/kg，在注射后长达8天观察到对铁代谢的强烈持续影响。见图3。这些结果表明，使用有力的BMP6拮抗剂抗体可以容易地实现剂量依赖性的饱和靶中和。
参见图3，BMP6抗体对铁代谢的血清生物标志物的剂量依赖性影响。上图：指定剂量的抗体6单次静脉内注射后随时间的血清hIgG浓度。下图：左图是单次抗体6或对照人IgG注射后血清hepcidin浓度的定量分析，右图是血清铁浓度。
使用抗体7进行类似的实验。在雄性Sprague-Dawley大鼠中测试抗体7对循环血清hepcidin的剂量和时间依赖性抑制。以剂量范围从0.03mg/kg至10mg/kg静脉内注射施用单次剂量的抗体7后，在给药后0.25、1、2、6小时和1、2、4、7和14天收集血清样品。通过LC/MS测量血清hepcidin水平，其中LLOQ＝9ng/mL。在相同动物中也测量了血清铁水平。结果报告在图11中。
这些结果表明本发明的抗BMP6抗体能够引起血清铁的剂量依赖性增加。该效果是稳健的并在抗体施用后持续至少2周。
还在猕猴中测试了血清铁参数响应于抗BMP6抗体受到的影响。雄性猕猴以3mg/kg的剂量单次静脉内注射抗体7。在注射后的指定天数，收集血清样品并分析总血清铁(Fe)和hepcidin浓度。结果示于图13。显示来自3只动物个体的数据(相对于给药前的基线水平绘图)。平均值由“x”线表示。在抗体施用后24小时观察到血清铁的增加和血清hepcidin的抑制，并且该效果在28天的研究结束时仍然存在(相对于给药前水平)。这些结果表明在非人灵长类动物中本发明的BMP6抗体有力地诱导hepcidin表达并降低循环铁浓度。
在小鼠的炎症驱动的ESA抗性贫血中BMP6抗体对红细胞参数的影响
进行实验以评估抗BMP6抗体在炎症贫血小鼠模型中的治疗应用。见图4。用流产布鲁氏菌抗原(BA)处理的小鼠6天后出现贫血。用抗BMP6抗体加重组促红细胞生成素(EPO)(隔一天开始)处理贫血动物，并且在相对于BA的第13天监测抗体治疗对贫血进展的影响。在治疗开始和第13天之间HGB和HCT值降低，这些值抵抗单独的EPO治疗。组合BMP6抗体与EPO治疗有效地恢复了EPO反应性和显著提高了HGB和HCT水平。如RETA持续增加以及网织红细胞血红蛋白含量恢复所反映的，该效应与伴随的促红细胞生成素活性刺激有关，表明对红细胞生成区室中功能性缺铁导致的血红素合成的矫正。
参见图4，BMP6抗体在ESA抗性的炎症贫血小鼠模型中的治疗性处理。上图：BA诱导的ESA抗性炎症贫血模型的实验方案。下图：在BA处理后第13天的红细胞生成参数。HGB：血红蛋白；HCT：血细胞比容；RETA：网织红细胞计数；RET-HE：网织红细胞血红蛋白当量。
p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，相对于BA+EPO+hIgG1
实施例3-用于在人中测试BMP6抗体的临床计划
临床试验计划：使用结合人BMP6的抗体或其抗原结合片段进行治疗评估。
终末期肾脏疾病(ESRD)的患者即使有、也只产生非常少的促红细胞生成素(EPO)，通常需要周期性施用外源性EPO和静脉内(IV)输注铁，以使EPO诱导合成Hgb。高达三分之一的长期血液透析(HD)患者对EPO没有足够的反应，主要是由于细胞内的铁隔离。hepcidin主要由肾脏清除，而通过透析的去除是不充分的。因此，长期HD患者倾向具有显著升高的hepcidin水平，其阻断铁动员用于红细胞生成。一旦体内铁储存达到临界水平(由高血清铁蛋白(ferritin)水平指示)，IV铁治疗就不再有效或不再被推荐。目前的指南建议不要向高铁蛋白水平的贫血透析患者给予静脉内铁，因此这些患者可能会接受甚至更高的EPO剂量，具有EPO低反应性贫血的潜在相关风险(Kidney Disease Improving Global Outcomes(KDIGO)Anemia Work Group 2012)。血液透析(Kilpatrick等人，2008，Lopez-Gomez等人2008，Fukuma等人2012)和腹膜透析患者(Suttorp等人2013)中EPO低反应性贫血导致与贫血和较高EPO剂量相关的全因死亡率风险显著增加。本公开的结合人BMP6的分离抗体或其抗原结合片段可以通过改善血红蛋白(Hgb)水平同时降低EPO和静脉内铁给药需求而有益于患有铁限制性贫血的慢性肾脏疾病患者。较低的EPO抗性指数(EPO剂量与Hgb水平的比)与较低的死亡率风险相关。
总之，使用本公开的结合人BMP6的分离抗体或其抗原结合片段进行治疗的目的是动员隔离的铁，然后可以降低EPO和铁的剂量需求以及改善Hgb水平，所有这些有望改善患者后果。这是使用结合人BMP6的分离抗体或其抗原结合片段进行的首次在人体中的单剂量治疗研究。该研究将评估长期血液透析患者群体中的安全性、耐受性、药代动力学、药效学和功效。研究的目的为，评估是否有必要在慢性肾脏疾病相关贫血中一步临床开发使用结合人BMP6的分离抗体或其抗原结合片段的治疗。
调查计划
研究设计
这是结合人BMP6的分离抗体或其抗原结合片段的首次人体、两部分、单次剂量、非验证性研究，以评估在长期血液透析患者人群中的安全性、耐受性、PK，PD和功效。第1部分是首次在人中、单次剂量、开放剂量调查研究。第2部分是随机、双盲、安慰剂对照的单次剂量研究，将比较结合人BMP6的分离抗体或其抗原结合片段的两种剂量水平。
安全性评估将包括身体检查、ECG、生命体征、标准临床实验室评估(血液学、血液化学、血清铁指数)不良事件和严重不良事件监测。
第1部分
第1部分的目的是(a)评估单次剂量安全性、PK、PD和耐受性，和(b)确定结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段的最小PAD，其定义为在第1部分中测试的在给药后29天导致Hgb增加(从基线的中位数变化
Figure BDA0001382481410001361
0.5g/dL)的最低剂量。
在第1部分期间，将进行筛查访视，其中将确定进入研究的患者资格(图6)。符合条件的患者将被接纳到研究场地，并在基线访视期间重新评估资格标准。必须在给药前获得和审阅所有基线安全性评估结果。
图6提供并概述了第1部分的研究设计。患者将被要求在第1天到达研究地点，直接进行常规透析访视。然后，患者将接受结合人BMP6的抗体或其抗原结合片段的输注(确切剂量将取决于组群)。如果可能，优选在两个透析间日(inter-dialysis days)之前(例如星期五或星期六)的透析当天进行给药，并且在当天透析期后给药。然而，如果不可能，则可以不在两个透析间日之前的透析当天给药。在给药后，第1部分的前两名患者将留下至少48小时进行安全性和PK/PD评估。患者将在第4和6天返回研究地点进行PK/PD评估，然后每周进行PK评估总共29天，安全性评估总共12周，研究结束的访视大约在第85天。研究访视，包括除透析后PK评估以外的所有实验室检查，都应在患者的日程临床透析访视前进行。
第1部分将以预测不具有药理活性的剂量开始。根据结合人BMP6的分离抗体或其抗原结合片段的单次剂量后每个组群的Hgb中位数变化和转铁蛋白饱和度(TSAT)水平，针对随后的每个第1部分组群调整剂量，参见在统计学考虑事项部分中的讨论和图7所示。该决策树的目的是确定诱导铁动员(通过给药后一周在6名患者的组群中至少4名患者观察到转铁蛋白饱和度(TSAT)水平>50％来指示)和增加Hgb的最小可行剂量。如果在给药后29天铁被动员但Hgb未增加至少0.5g/dL，则分析临床数据以评估潜在的混杂因素(例如由于过度非研究性放血引起的失血)。来自赞助者的可用调查员和代表将回顾每组群的不良事件，并将在(a)已知与慢性肾功能衰竭相关的医疗问题和(b)非临床毒理学发现的背景下评估这些事件。不再给随后的组群给药，直到调查员和赞助者表明可以安全地继续。
图7提供了调整第1部分中的剂量的算法。包括Hgb测量的血液工作将在透析前进行。起始剂量为0.01mg/kg。在第1部分中，患者将被分配到多达6个开放式剂量组群中的一组，每组多达6名患者。如上定义的，结合人BMP6的分离抗体或其抗原结合片段的最小PAD将是选择用于第2部分的较低剂量臂。如图7所示，每个后续组群的剂量可以被调高或调低。如果最低可行剂量(0.001mg/kg)导致Hgb的中位数增加≥0.5g/dL，则其将是最小PAD和选择用于第2部分的较低剂量，第1部分中评估的下一个最高剂量将是用于第2部分的较高剂量臂。如果第1部分评估的最高剂量(0.1mg/kg)是最小PAD，则第2部分将仅进行2臂：安慰剂和最小PAD。如果在第1部分需要额外的剂量组群，则这些组群将如本文所述加入。
每个第1部分组群将包括6名患者。第一部分的第一组群中的前2名患者将相隔至少7天给药。随后的第一部分组群患者的给药时间将根据各地点的时间表和支持资源的可行性来安排。所有第一部分的患者的随访将持续给药后12周。
第2部分
第2部分的目的是(a)评估安全性、PK、PD和耐受性，以及(b)基于Hgb相应于结合人BMP6的抗体与安慰剂的单次剂量发生的变化来确定功效。第2部分将包括多达三个臂：最多两个Ab剂量臂和一个安慰剂臂(图8)。两个Ab剂量臂将来自第1部分中产生的数据。第2部分将包括约60名患者，随机1：1：1分至三臂。如果在第1部分中最小PAD也是评估的最高剂量(0.1mg/kg)，那么第2部分将只有两臂：最小PAD和安慰剂。在这种情况下，40名患者将随机分至两臂，随机化比例为1：1。第2部分的样本大小可以根据第1部分中Hgb从基线变化的变异性进行调整。
图8提供了第2部分的研究设计。在第2部分中将进行筛查访视，其中将确定患者进入研究的资格。基线访视期间根据资格标准重新评估符合条件的患者。必须在给药前获得和审阅所有基线安全性评估结果。
患者将被要求在第1天到达研究地点，直接进行其常规透析访视。然后患者将接受Ab或安慰剂的输注(由随机分配确定)。如果可能，优选在两个透析间日(inter-dialysisday)之前的透析当天(例如星期五或星期六)进行给药，并且在该天的透析后给药。然而，如果不可能，则可以在不先于两个透析间日的透析当天给药。患者将在第4天和第6天返回研究地点，然后每周进行随访评估。在随访期间，患者将进行常规安全性评估，也将收集PK数据85天。研究访视可以在患者的日程透析访视之后进行，以配合患者的透析时间表。在Ab(或安慰剂)给药后，所有入选第2部分的患者均会随访12周。
EPO剂量管理(两部分)
根据每个透析地点的标准护理程序来管理两个部分期间的个体EPO剂量调整。作为地点评估的一部分回顾地点程序，并检查其是否符合“治疗指南”(KDIGO ClinicalPractice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group2012)的标准。除了地点特定的指南用于管理高于目标水平的Hgb值外，调查人员可自行决定，通过治疗性放血管理在研究期间的任何时间上达到≥13g/dL的Hgb水平的患者。
静脉铁管理(两部分)
接受IV铁负荷剂量(100mg/周)的患者将被排除在研究之外。本研究中可以包括每周接受维持性IV铁(<100mg/周)的患者。每周维持性IV铁剂量将在Ab给药的第1周开始时保持。在Ab给药后第一周期间监测铁指数，补救性铁治疗和维持性IV铁管理将遵循标准护理指南、按照管理血液透析单位的方案进行。作为地点评估的一部分回顾地点程序，并检查其是否符合治疗指南的标准(KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia inChronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012)。
研究设计原理
两部分研究设计的原理
在相同患者群中两部分研究设计的原理是，安全和有效地鉴定最小PAD，旨在最小化暴露于潜在的亚治疗剂量的患者和组群的数量。第2部分评估，与安慰剂组相比，最小PAD以及一个高于最小PAD的剂量水平(第1部分中测定)的功效。
设计第1部分以在开放标签研究中评估Ab的单次剂量安全性、耐受性、PK/PD以及最小PAD。根据Ab给药后第29天每个剂量组群的Hgb中位数变化来确定最小PAD。用于PAD确定标准的原理是，在EPO剂量改变后，临床上有意义的EPO反应可能需要多达4周。如果Ab在目标群体中动员铁，那么可以使患者目前的EPO剂量发挥更稳健的红细胞生成作用。在PAD确定标准中列出的29天Hgb范围所基于的是，响应于EPO剂量，临床显著和安全的Hgb增加速率(经29天约0.5g/dL)。寻求最小PAD而不是最大效果的原理是，过度稳固的Hgb反应在该患者群体中是一个安全风险，正如目前的标准护理指南(Kidney Disease Improving GlobalOutcomes(KDIGO)Anemia Work Group 2012)中目标Hgb范围所反应的。第1部分的安全性和耐受性评估的目标是(a)鉴定安全信号，和(b)获得剂量调整决策信息，确保选择用于第2部分的剂量(最小PAD+1个更高剂量)适合进一步评估相对于安慰剂的安全性和功效。虽然第1部分不足以提供无偏安全性评估，但是第2部分中的安慰剂组和较大的样本量将使得能够进行最小PAD和一个更高剂量下的无偏安全性评估。除了安全性、耐受性和PK/PD，第二部分涉及以在双盲研究中评估相对于安慰剂的功效。功效评估主要基于Hgb，其中EPO抗性指数(ERI＝每周重量调整的EPO剂量除以Hgb)作为关键的次要终点。ERI提供实现给定Hgb值所需的EPO量的定量量度，因此除了单独的Hgb外，还提供临床上重要的信息。
透析患者中FIH的原理
首次人类研究(FIH)将在长期血液透析(HD)患者而不是健康志愿者(HV)中进行。由于以下一些原因，HV中响应于人BMP6Ab的安全性、耐受性和PK/PD评估可能不能转化到长期HD患者身上：
与HV不同，具有贫血、高血清铁蛋白和低TSAT的长期HD患者具有长期累积的细胞内铁储存。因此，与响应于低剂量Ab的铁动员相关的安全性、耐受性和药理作用最适于在长期HD患者中评估。在具有正常肾功能的HV中，hepcidin(其中BMP6是关键调节剂)被肾脏过滤，并在尿液中有效排出，导致循环水平低。相比之下，在长期HD患者中hepcidin通过透析而被低率和暂时过滤，导致较高的循环水平(Zaritsky等人，2010)。此外，正常肾脏将动态调节内源性EPO水平，Hgb响应于Ab的变化可能不明显。因此，与通过BMP6通路调节hepcidin相关的安全性和耐受性以及Ab对Hgb的作用最适合在长期HD患者中评估。
用于目标患者群的原理
本研究旨在于EPO低反应性、铁限制性贫血中评估抗人BMP6Ab。建立的临床指南(KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney DiseaseAnemia Work Group 2012)将EPO低反应性定义为需要两次EPO剂量增加(高于稳定剂量多达50％)以维持稳定的Hgb浓度。提议的资格标准旨在选择具有贫血和以下铁限制性临床指标的稳定长期HD患者：增加的铁蛋白和低TSAT(TSAT＝血清铁/总铁结合能力；TSAT与血清铁紧密相关)。此外，EPO和IV铁剂量的调整将遵循严格用于Hgb、TSAT和铁蛋白的护理目标标准。这种设计减少了超调(over-shooting)所需Hgb靶标的风险，因为铁和血液学参数的变化将继续按照护理标准进行管理。此外，在基线前1周内接受IV铁负荷剂量的患者将被排除。可以包括接受维持IV铁的患者(如果符合所有其它资格标准)。包括这些患者的基本原理是，美国目前的护理标准规定Hgb和TSAT被维持在窄的范围内，因此，为了达到较低的TSAT资格标准，全面撤出维持性铁治疗将使患者面临TSAT低于25％的风险，从而使得必须给予根据护理标准的IV铁负荷给药。然而，在维持性IV铁上合格的患者在Ab给药周开始时将保持其每周的IV铁剂量，并且将继续维持性IV铁治疗(仅根据监测的铁指标，由地点护理程序标准确定)。
剂量/方案、治疗持续时间的原理
起始剂量的原理
基于在大鼠和猕猴中进行的13周(14剂量)GLP毒理学研究得到的无副作用水平(NOAEL)，计算最大推荐起始剂量(MRSD)。动物每周接受的静脉内推注剂量为0.1、1、10和100mg/kg。在结合人BMP6的分离抗体或其抗原结合片段的最后一次剂量后，1和100mg/kg剂量组(仅)在大鼠中随后跟踪16周或在猕猴中跟踪24周。首先通过计算来自这些研究的NOAEL(0.1mg/kg)的人等同剂量(HED)——被认为适用于分子量>100kDa的药物的方法——并且随后应用安全系数10以解释非临床物种与患者之间的差异(如存储铁的量和对红细胞生成的需求)，来估计MRSD。从IND所需毒理学研究中收集的毒代动力学(TK)数据，推断非临床物种的PK参数。然后使用异速放大(allometric scaling)估计患者中相应的PK参数，并且使用这些参数来预测患者中在给定剂量下作为时间函数的游离的结合人BMP6的分离抗体或其抗原结合片段的浓度。将毒理学研究的TK数据与患者中基于模型的Ab PK进行比较，表明比NOAEL/HED低10倍的剂量预计可以产生基于Ab浓度的(最小)10倍余量。
在动物研究中观察到的响应于Ab的血清铁最大水平可能低估预测的对Ab的人铁响应，因为已经施用IV铁疗法的HD患者可能具有比健康动物更高的铁组织储存。然而，与健康的非贫血动物不同，预期HD患者利用释放的血清铁用于红细胞生成；因此动物模型可能会高估铁升高的持续时间。在13周的研究中观察到的肝脏病理学在4周的研究中没有观察到，表明毒性是由于累积暴露于血清铁所致而不是对急性铁释放的反应。
为了解释预期的非临床物种与患者之间在存储铁上的差异，还根据基于模型的血清铁浓度分析，预测了MRSD。导致毒理学发现的血清铁累积暴露表示为铁的曲线下面积(FeAUC)。在这种方法中，对NOAEL剂量(0.1mg/kg)计算的Fe AUC被认为是足够安全的。然后预测患者中在提议的MRSD下的Fe AUC，并与非临床物种在NOAEL下的Fe AUC进行比较。由于患者在MRSD下的模型预测的血清铁暴露比非临床物种在NOAEL下的低>10倍，因此以安全系数10降低NOAEL/HED被认为足以估计MRSD。因此，建议的MRSD为0.01mg/kg。
剂量调整的原理
对于这项研究，最大测试剂量(xmax)是在2个IND所需毒理学研究之每一个中对应于NOAEL的HED：0.1mg/kg。最小可行性测试剂量(xmin)是基于相容性研究的技术上可行的最低剂量：0.001mg/kg。根据安全性、TSAT和Hgb标准，评估MRSD(x0)(图7)。如果x0导致相对于给药前Hgb中位数变化<0.5g/dL，则通过x0和xmax之间在自然对数底标度上的线性外推(预期为S形剂量-反应关系)，指导x+的选择(图7)。以上提供用于该剂量递增的临时剂量。这些临时剂量可以根据对每个组群之间非正式期中分析过程的数据的回顾进行调整。该方法将一直持续到鉴定最小PAD或达到xmax。如果xmax导致Hgb中位数变化<0.5g/dL，则评估该剂量的安全性，并且基于安全性、PK和PD数据来决定是否修改方案以添加剂量超过xmax的额外组群。如果在第1部分中测试的最高剂量导致Hgb中位数增加<0.5g/dL，不升高TSAT高于50％，且该剂量低于xmax，则可以修改方案以添加额外的组群。
如果反而x0导致相对于给药前Hgb中位数变化≥0.5g/dL，则将下一组群的剂量调整至xmin。如果xmin也导致Hgb的中位数变化≥0.5g/dL，则xmin被视为最小PAD，在第2部分中评估xmin和x0。如果xmin导致Hgb的中位数变化<0.5g/dL，且TSAT≤50％(图7)，则通过自然底对数标度上间隔(xmin，x0)内的线性外推来增加剂量，直到鉴定出最小PAD或直到已经评估了6个剂量(组群)为止。以上提供间隔内(xmin，x0)的临时剂量。这些临时剂量可以根据对每个组群之间非正式期中分析过程的数据的回顾进行调整。最小PAD定义为测试导致相对于给药前Hgb中位数变化≥0.5g/dL的最低剂量。
Ab将作为单次剂量静脉内输注施用，以确保血清铁暴露(Fe AUC)小于与非临床毒理学研究中的不良发现相关的血清铁暴露(Fe AUC)。在第1天的血液透析之后立即输注Ab溶液，以使透析对PK或即时剂量后铁生物利用度的潜在影响最小化。透析后额外的约30分钟的给药输注(仅在给药当天)预计不会对患者造成任何显著的风险或不适。
选择比较剂的原理
安慰剂在第2部分中用作比较剂，以允许对临床结果的无偏评估。
期中分析/设计调整的目的和时机
在第1部分中，在6名患者的每组群完成第4周的剂量后评估之后，进行非正式期中分析，以作出用于下面组群的剂量调整决定。由剂量调整小组的所有成员，包括可用调查员和来自赞助者的代表，对安全和PD标记物进行回顾。只有确定了安全性和耐受性、并且如图7所示满足PD条件后，才能开始新的组群。在第1部分中为多达5次非正式的期中分析。在第1部分的最后组群的所有患者完成了第4周的剂量后评估后，计划正式的期中分析，以评估所研究剂量的临床效果。并可能引发额外的非临床研究，并且可以通知随后的临床研究。体温、血压、脉率、ECG评估、血液化学、血液学铁指数、EPO抗性指数以及不良事件(在第1部分中直至最后组群的第29天收集的)，将包括在内。
对于第2部分，选择最小PAD和比最小PAD高一个水平的剂量。如果最低可能的测试剂量诱导Hgb增加≥0.5g/dL，则选择两个最低测试剂量用于部分2。
风险和收益
对于参与本研究的患者的潜在益处可以包括EPO和IV铁需求的减少，以及治疗期间以及以后的一段时间改善的Hgb水平。
通过遵守资格标准并且在施用Ab后头48小时对所有患者进行紧密的临床监测(并且对第1部分中的前两名患者留观)，可以使本试验中患者的风险最小化。
与铁动员相关的潜在风险包括(a)铁重新分布到组织和器官如脾脏、肝脏、心脏、胰腺和垂体，和(b)对细菌感染的易感性小幅增加，特别是在留置血管导管的患者中。几个资格标准降低并发症的风险。与铁重新分布相关，可观察到增加的肝功能检查水平。与血液学和铁参数并行，监测肝脏功能。护理标准Hgb靶标的超调可能导致红细胞增多症。可以进行Hgb管理、EPO治疗和铁治疗。
已经施用IV铁治疗的HD患者可比健康动物具有更高的铁组织储存；因此，在用结合人BMP6的分离抗体或其抗原结合片段治疗的患者中观察到的血清铁最大水平，可能超过动物研究中看到的血清铁最大水平。然而，与健康动物不同，预期HD患者将利用释放的血清铁用于红细胞生成；因此动物模型可能会高估铁升高的持续时间。预期在MRSD下模型预测的Ab暴露(例如，Cmax，AUC)比在非临床研究中在NOAEL下观察到的低10倍。预期这种暴露不会导致与临床前研究中观察到的肝脏转氨酶升高和肝脏中单细胞坏死相关的血清铁暴露(AUC)水平。在描述的安全性评估之后，将Ab剂量升高至NOAEL。长期铁负荷患者以及接受肠胃外铁的患者的临床经历，可能并不一定预测由Ab诱导的细胞内铁急性增加可能引发的影响。因此，Ab诱导的急性铁毒性的潜在风险可能是低的。急性铁毒性可能影响心脏、肝脏和/或胰腺。急性铁毒性的临床表现可包括心脏传导缺陷、肝转氨酶升高和葡萄糖不耐受/高血糖。严重的急性铁毒性也可能包括代谢性酸中毒、电解质异常和神经病理学表现。在发生急性铁毒性的情况下，患者可以用铁螯合治疗(如去铁胺(deferoxamine))联合血液透析，紧急治疗。作为研究的一部分，计划经115天的时间从每个患者收集最多134mL(第1部分)和172mL(第2部分)血液。除了此外，还将附加用于监测任何安全性结果的附加样品。这不被认为对该群体构成风险。
迄今为止，还没有对抗人BMP6抗体进行过生殖毒性研究。通过在猕猴的13周毒性研究中对卵巢和睾丸及其附属生殖器官进行仔细的标准组织病理学检查，已经评估对雄性或雌性生殖器官的潜在影响。没有观察到治疗相关的影响。BMP6敲除小鼠显示延迟的胸骨骨化和铁过载(Meynard等人2009)。
显著的胎儿和母亲发病率和死亡率与长期血液透析相关。在一项回顾性组群研究中，将长期血液透析的女性(267例分娩)与接受肾移植的女性(264例分娩)进行比较，血液透析的女性表现出较高比率的胎盘早剥、输血、小于胎龄儿、胎儿死亡和产妇死亡(Saliem等，2015)。因此，具有生育潜力的妇女应该使用高度有效的避孕措施来防止在结合人BMP6的分离抗体或其抗原结合片段施用期间以及在最后一次剂量后125天内妊娠。
群体
研究群体由终末期肾脏疾病患者组成，所述患者需要每周至少两次的长期血液透析治疗，并且具有功能性缺铁性贫血的临床迹象(定义为在明显存在足够的铁储存下的贫血，如通过铁蛋白和转铁蛋白饱和水平测定的)。第1部分包括计划最初在6个组群中评估多达36名患者(6名患者/组群)。如果在6组群后，对TSAT和Hgb没有见到影响，并且没有安全性问题(由可用调查员和赞助者的代表确定)，则可以添加多达另外2个6名患者的组群(总计在第1部分中48名患者)。第2部分由多达3臂组成(从第1部分选择用于进一步评估的2个剂量水平，以及安慰剂组)，每臂多达约20名患者(第2部分共60名患者)。因此，计划入选总共约96名患者(至最大108名)，其中约60名在第2部分随机分配。预期约60名患者(第1部分12名，第2部分48名)完成研究。研究者必须确保所有被考虑参加研究的患者符合以下资格标准。研究者不应采用额外的标准，以便研究群体代表所有符合条件的患者。
通过在筛选和第一基线处检查所有资格标准来建立患者选择。资格标准的相关记录(例如清单)必须与研究地点的原始资料一起存储。偏离任何入选标准的患者被排除入选本研究。
入选标准(两部分)
有资格纳入本研究的患者必须满足以下所有标准：
1.在进行任何评估之前，必须取得书面知情同意书。如果不能以书面形式表示同意，则必须进行正式记录和作证，理想地通过独立的可信的证人。
2.在筛选时年龄≥18岁。
3.在筛选前血液透析依赖持续至少2个月。
4.对于终末期肾病每周至少2次接受足够的血液透析；足够被定义为筛选前在最新的月度评估中Kt/V≥1.2。
5.根据透析地点的贫血管理方案，接受长期促红细胞生成素(EPO)治疗。在基线前14天，EPO剂量不增加50％或以上。EPO治疗必须仅仅是短效制剂(不是达比泊汀(darbepoetin))，而且是静脉内施用(不是SC)。
6.Hgb≥8.5，包括Hgb≥8.5和<11.5g/dL，并且在基线相对于之前14天，增加不≥0.5g/dL。
7.在基线前铁蛋白200-2000ng/mL(含)持续至少28天(可以包括筛选)。
8.在基线前90天内至少在一个时间点上TSAT≤30％，在基线上TSAT≤30％。
排除标准(两部分)
满足以下任何标准的患者不符合纳入本研究的资格。研究人员不得再采用额外的排除措施，以确保研究人群代表所有符合条件的患者。
1.在入选的5个半衰期内、或直到预期的药效动力学效应已经恢复到基线(以较长者为准)，使用其它调查药物。
2.对研究药物或治疗性抗体的超敏史。
3.已知血色素沉着症的诊断。
4.已知骨髓恶性肿瘤、淋巴恶性肿瘤或骨髓增生异常综合征。
5.筛选前2个月内透析AV瘘血栓形成的病史，或筛选前6个月内发生2次或以上AV瘘血栓形成。
6.严重并发肝脏疾病/功能障碍(Child-Pugh评分≥6)或之前肝移植
7.心力衰竭(New York Heart Association(NYHA)功能类别III或IV)
8.筛选的过去2个月内需要干预的胃肠道出血。如果符合所有其它肝功能资格标准，则可以包括丙型肝炎病毒(HCV)感染患者。
9.在基线前4周内，ALT、AST或胆红素≥1.5x ULN。
10.在筛选时不受控制的肾性骨营养不良，被定义为完整的PTH≥750pg/mL。
11.在筛选前2周内的任何时候，易发生严重感染风险增加的状况，如留置血管导管(中心静脉导管或血液透析导管)或需要抗生素治疗的活动性感染。
12.在基线前4周内施予输血。
13.在基线前1周内接受负荷剂量(100mg/周)的IV铁。
14.在给药前12个月内的药物或酒精滥用史，或通过筛选期间进行的实验室测定试验所指示的这种滥用的迹象。
15.阳性乙型肝炎表面抗原检测结果。
16.免疫缺陷疾病史，包括阳性HIV(ELISA和Western blot)检测结果。
17.如果在使用结合人BMP6的抗体或抗原结合片段给药后至少125天使用高效避孕，在本研究中可以纳入具有生育潜力的妇女。高效避孕被定义为以下之一：a.完全禁欲(当与患者的首选和常规生活方式一致时)。定期禁欲(例如日历、排卵、症状体温避孕法(symptothermal)、排卵后方法)和抽离不是可接受的避孕方法。b.男/女绝育。c.使用口服、注射或植入激素的避孕方法或放置宫内节育器(IUD)或宫内节育器系统(IUS)或具有类似功效(失败率<1％)的其它形式的激素避孕，例如激素阴道环或透皮激素避孕。
治疗
研究性治疗
本研究中的研究性治疗是结合人BMP6的抗体或抗原结合片段，例如抗BMP6IgG1、完全人抗体。在液体溶液中提供抗体。储存液浓度将根据待施用的剂量在现场稀释。在各组间保持输血时间相对恒定，大约30分钟。第1部分将是开放标签单次剂量，而第2部分将是双盲、单次剂量、与匹配的安慰剂(赋形剂对照)相比较。抗人BMP6Ab活性物质和安慰剂将在小瓶中作为液体供应。活性物质和安慰剂中的赋形剂是相同的。
治疗臂
在第1部分中，患者将被分配到每组群6位患者组成的多达6个剂量组群中的一个。第一部分是开放标签治疗。起始剂量、最高剂量和剂量调整原理如上所述。表12(在MRSD下Hgb<0.5g/dL)和表13(在MRSD下Hgb≥0.5g/dL)给出第1部分的临时剂量。
表12：第1部分的临时剂量水平
Figure BDA0001382481410001491
该表旨在作为第1部分剂量调整的示例仅用于指导。可以使用中间或更高剂量水平，并且可以基于每个组群之间非正式的期中分析过程中的数据评估，跳过一些剂量水平。实际剂量水平将由诺华公司(Novartis)以书面形式确认，并且在对新一组群的患者进行治疗前提供给所有参与研究的地点。
表13：第1部分的临时剂量水平
Figure BDA0001382481410001492
该表旨在作为第1部分剂量调整的示例仅用于指导。可以使用中间或更高的剂量水平，并且可以基于在每组群之间的非正式期中分析过程中的数据评估，跳过一些剂量水平。
研究治疗定义为：
·A：单次剂量的安慰剂。
·B：以最小PAD的单次剂量的抗人BMP6Ab，如第1部分所确定。
·C：以高于最小PAD一个剂量水平的单次剂量的抗人BMP6Ab，如第1部分所确定。
伴随治疗
在研究开始之前和在研究期间，在纳入标准中定义的时间框内施用或采取的所有处方药物、非处方药物和显著的非药物治疗(包括物理治疗和输血)必须记录在CRF的伴随药物/显著非药物治疗部分。药物条目应具体到商品名称、单次剂量和单位、施用频度和途径、开始和中止日期以及治疗原因。
功效/药效学
功效评估如下所述。用于功效评估的样本将在不同的时间点收集。将对血液学实验室进行评估。在每次组群间非正式期中分析期间，作为研究第1部分期间剂量调整评估的一部分，回顾Hgb和Fe指数。如果最初设置的样本收集时间被认为对于理解铁和PK之间的关系不是最佳的，则在第1部分的后续组群中可以改变样本收集时间。
铁指数小组
预期抗人BMP6Ab从身体储备中动员Fe，导致血清Fe参数的变化，所述血清Fe参数包括：血清铁、转铁蛋白饱和度(TSAT)、未结合的Fe结合能力(UIBC)、总Fe结合能力(TIBC)、铁蛋白和网织红细胞血红蛋白含量(CHr)。这些将使用验证的测定试验在血清中测量。
安全性
以下详述安全性评估。
身体检查
完整的身体检查将包括一般外观、皮肤、颈部(包括甲状腺)、眼睛、耳朵、鼻子、喉咙、肺、心脏、腹部、背部、淋巴结、四肢、血管和神经系统的检查。如果基于医疗史和/或症状指示，可以进行直肠、外生殖器、乳房和/或骨盆检查。
在开始研究药物之前存在的重要发现必须包括在患者eCRF的相关医疗史/当前医学状况屏中。在开始研究药物之后符合不良事件定义的重大发现必须记录在患者eCRF的不良事件屏上。
生命体征
·体温
·血压(BP)
·脉搏
身高和体重
·身高
·体重
·计算身体质量指数(BMI)(体重(kg)/[身高(m)]2)
实验室评估
将针对定义不良事件的标准，对实验室测试结果的临床相关偏差进行评估，如果符合标准，则会进行报告。重复评估是强制性的，直到结果正常化或直到变化不再与临床相关。
血液学
测量血红蛋白、血细胞比容、红细胞计数、白细胞分类计数(white blood cellcount with differential)和血小板计数。对铁指数进行监测。
临床化学
监测钠、钾、肌酐、尿素、氯化物、白蛋白、钙、碱性磷酸酶、总胆红素、LDH、GGTA、ST和ALT。如果总胆红素浓度增加到正常上限的1.5倍以上，则应区分直接和间接反应胆红素。
心电图(ECG)
PR间期、QRS持续时间、心率、RR、QT、QTc。Fridericia QT校正公式(QTcF)应当用于临床决策。
妊娠和生育能力评估
无论报告的生殖/绝经状态如何，都需要对所有女性患者进行妊娠试验。
本研究将进行血清妊娠试验。如果阳性，病人必须中止试验。
当在筛选和基线上进行时，必须在患者给药之前收到该测试的结果。
药代动力学
收集PK样品。作为研究第1部分期间的剂量调整评估的一部分，在每个组群间非正式的期中分析期间，对PK数据进行回顾。如果最初设置的样本收集时间被认为不足以或不适合表征PK特征，则在随后的组群中可以改变样本收集时间。抽血次数和总血量不超过方案中规定的数量。
在所有剂量水平在所有患者中收集和评估PK样品。
使用ELISA测定试验，测定游离抗人BMP6Ab的浓度。预期的定量下限(LLOQ)为10pg/mL。
未处理(安慰剂)样品将不被分析。
游离抗人BMP6Ab浓度将以μg/mL表示。所有低于LLOQ的浓度或缺失的数据将在浓度数据列表中标记。低于LLOQ的浓度将仅在浓度数据的汇总统计中被视为零。在PK参数的计算中不会考虑它们。
测定游离抗人BMP6Ab后残留的PK样品可用于探索性评估或其它生物分析目的(例如不同地点之间的交叉检查、稳定性评估)。
使用Phoenix WinNonlin(6.2或更高版本)的非房室方法，确定以下药代动力学参数(如果可行)：基于血清浓度-时间数据的Cmax、tmax、AUC(0-t)、AUC(0-tlast)、Cmax/D和AUC/D。线性梯形规则用于AUC计算。结合人BMP6的抗体或抗原结合片段的终末半衰期(t1/2)，如果可行，也根据该数据进行估算。
其它评估
免疫原性
ELISA测定试验将用于检测抗人BMP6抗体。免疫原性分析后剩余的IG样品可用于探索性评估或其它生物分析目的(例如，不同地点之间的交叉检查)。
探索性评估
生物标志物是正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的客观测量和评价指标(Biomarkers Definitions Working Group 2001)。
BMP6-hepcidin通路如下：肝细胞中BMP6信号传导是诱导hepcidin表达、抑制肠细胞铁吸收和巨噬细胞铁输出所必需的。BMP6中和抗体，作为降hepcidin治疗，通过降低EPO需求并增加达到目标Hgb水平的患者数量，应有益于患有铁限制性贫血的患者。
基于以上描述的生物学、探索性生物标志物评估包括但不限于hepcidin(使用LC-MS测定试验测量)。
额外的探索性评估可以调查骨吸收标记物的潜在作用、以及了解炎症(作为促成作用机制的因素)。
探索性目标如下：
·评估hepcidin水平与若干关键测量值如ERI和铁指数之间的关系；
·纵向研究主要和次要终点和探索性生物标志物之间的动力学；
·评估药物遗传学；
·评估免疫原性
在不同的时间点收集样品。
在中央实验室手册中提供关于样品收集、编号、处理和装运的更多详细信息。
DNA
探索性DNA研究计划作为本研究的一部分，其目的是鉴定如下遗传因素，所述遗传因素可能(1)与患有功能性缺铁性贫血的促红细胞生成素治疗的长期血液透析患者相关，(2)预测对抗人BMP6Ab治疗的反应，或(3)预测副作用的遗传倾向。
此外，最近在基因分型技术中的进展使得全基因组方法成为可能。全基因组方法也可以在如上所述的这些研究的限制范围内进行。
可溶性生物标志物
hepcidin作为潜在的PD/生物标志物，在血浆中进行定量。
测定试验的详细描述包括在生物分析数据的报告中。
其它生物标志物
可以使用无假说平台(Hypothesis-free platform)来了解疾病异质性、作用模式和/或分层标记物的潜在鉴定。在各个时间点收集免疫原性(IG)样品。通过测量识别抗人BMP6抗体的抗体来评估抗人BMP6Ab的免疫原性。
参考文献
Fukuma S,Yamaguchi T,Hashimoto S等人(2012)Erythropoiesis-stimulatingagent responsiveness and mortality in hemodialysis patients:results from acohort study from the dialysis registry in Japan.Am J Kidney Dis；59(1):p.108-16；
Kilpatrick RD,Critchlow CW,Fishbane S等人(2008)Greater epoetin alfaresponsiveness is associated with improved survival in hemodialysispatients.Clin J Am Soc Nephrol；2008.3(4):1077-83；
Lopez-Gomez JM,Portoles JM,and Aljama P(2008),Factors that conditionthe response to erythropoietin in patients on hemodialysis and their relationto mortality.Kidney Int Suppl；(111):S75-81；
Meynard D,Kautz L,Darnaud V等人(2009)Lack of the bone morphogeneticprotein BMP6induces massive iron overload.Nat Genet；41(4):478-81；
Saliem S,Patenaude V,Abenhaim HA(2015)Pregnancy outcomes among renaltransplant recipients and patients with end-stage renal disease on dialysis.JPerinat Med(Epub ahead of print)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25719292；
Suttorp MM,Hoekstra T,Rotmans JI等人(2013)Erythropoiesis-stimulatingagent resistance and mortality in hemodialysis and peritoneal dialysispatients.BMC Nephrol；14(1):200；
Zaritsky J,Young B,Gales B,等人(2010)Reduction of serum hepcidin byhemodialysis in pediatric and adult patients.Clin J Am Soc Nephrol；5(6):1010-14。
除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
除非另有说明，如本领域技术人员所了解的，未详细描述的所有方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式执行和已经执行。例如再次参考本文提及的标准手册和一般背景技术以及其中引用的其它参考文献。除非另有说明，本文引用的每个参考文献通过整体引用并入本文。
本发明的权利要求是非限制性的，并在下面提供。
虽然本文已经详细公开了特定方面和权利要求，但是这仅为了举例说明的目的通过示例的方式进行，并不旨在对所附权利要求的范围进行限制，或对任何相应的未来申请的权利要求的主题进行限制。特别地，本发明人考虑，在不脱离由权利要求限定的本公开的精神和范围的情况下，可以对本公开进行各种替换、改变和修改。对于具有本文所述方面的知识的本领域普通技术人员而言，选择核酸起始材料、目的克隆或文库类型是常规问题。其它方面、优点和修改被认为在所附权利要求的范围内。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验来确定本文所述的本发明特定方面的许多等同物。这样的等同物旨在被所附权利要求所涵盖。在后续提交的相应申请中重新撰写的权利要求范围可由各国专利法的限制引起，不应被解释为放弃权利要求的主题。
Figure IDA0001382481450000011
Figure IDA0001382481450000021
Figure IDA0001382481450000031
Figure IDA0001382481450000041
Figure IDA0001382481450000051
Figure IDA0001382481450000061
Figure IDA0001382481450000071
Figure IDA0001382481450000081
Figure IDA0001382481450000091
Figure IDA0001382481450000101
Figure IDA0001382481450000111
Figure IDA0001382481450000121
Figure IDA0001382481450000131
Figure IDA0001382481450000141
Figure IDA0001382481450000151
Figure IDA0001382481450000161
Figure IDA0001382481450000171
Figure IDA0001382481450000181
Figure IDA0001382481450000191
Figure IDA0001382481450000201
Figure IDA0001382481450000211
Figure IDA0001382481450000221
Figure IDA0001382481450000231
Figure IDA0001382481450000241
Figure IDA0001382481450000251
Figure IDA0001382481450000261
Figure IDA0001382481450000271
Figure IDA0001382481450000281
Figure IDA0001382481450000291
Figure IDA0001382481450000301

Claims (57)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP6并且包含：
(a) 分别为SEQ ID NO：69、70和71的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：79、80和81的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列;或
(b) 分别为SEQ ID NO：72、73和74的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：82、83和84的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO：75的VH序列。
3.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO：85的VL序列。
4.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
SEQ ID NO：75的VH序列和SEQ ID NO：85的VL序列。
5.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO：77的重链序列。
6.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO：87的轻链序列。
7.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
SEQ ID NO：77的重链序列和SEQ ID NO：87的轻链序列。
8.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或抗原结合片段包含选自IgM和IgG的支架。
9.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或抗原结合片段是IgM或IgG，其中所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
10.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或抗原结合片段选自：单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体或Fab。
11.根据权利要求10所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述单链抗体是scFv。
12.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或抗原结合片段是免疫缀合物的组分。
13.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其具有通过Fc区的突变而改变的效应子功能。
14.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物适于皮下施用或静脉内施用。
16.根据权利要求14所述的组合物，其包含另外的治疗剂。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述另外的治疗剂降低BMP6的活性。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述另外的治疗剂是siRNA、抗体或其抗原结合片段、或小分子。
19.根据权利要求16所述的组合物，其中所述另外的治疗剂是红细胞生成刺激剂（ESA）或铁。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述另外的治疗剂是红细胞生成刺激剂（ESA）。
21.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-13中任一项所述的结合人BMP6的分离的抗体或其抗原结合片段的序列。
22.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-13中任一项所述的结合人BMP6的抗体或其抗原结合片段的VH和VL序列的序列。
23.一种分离的多核苷酸，其包含编码人BMP6抗体或其抗原结合片段的VH和VL序列的序列，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a) 分别为SEQ ID NO：69、70和71的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：79、80和81的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列;或
(b) 分别为SEQ ID NO：72、73和74的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，和分别为SEQ ID NO：82、83和84的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
24.根据权利要求23所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码所述BMP6抗体或其抗原结合片段的重链和轻链，所述多核苷酸包含以下任意的序列：
(a)SEQ ID NO：78的重链序列;
(b)SEQ ID NO：76的VH序列;
(c)SEQ ID NO：88的轻链序列;或
(d)SEQ ID NO：86的VL序列。
25.一种载体，其包含权利要求21所述的多核苷酸。
26.一种载体，其包含权利要求22所述的多核苷酸。
27.一种载体，其包含权利要求23或24所述的多核苷酸。
28.一种宿主细胞，其包含权利要求21所述的多核苷酸或权利要求25所述的载体。
29.一种宿主细胞，其包含权利要求22所述的多核苷酸或权利要求26所述的载体。
30.一种宿主细胞，其包含权利要求23或24所述的多核苷酸或权利要求27所述的载体。
31.根据权利要求28所述的宿主细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。
32.权利要求29所述的宿主细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。
33.权利要求30所述的宿主细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。
34.权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或包含权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的组合物在制备用于在患者中治疗与增加的BMP6活性相关的疾病或疾患的药物中的用途。
35.权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或包含权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的组合物在制备用于在患者中治疗BMP6相关疾病或疾患的药物中的用途。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述患者具有贫血。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述贫血是慢性疾病的贫血（ACD）、慢性肾脏疾病（CKD）贫血、癌症贫血、炎症贫血、红细胞生成刺激剂（ESA）抗性贫血、铁限制性贫血、或功能性缺铁性贫血。
38.根据权利要求37所述的用途，其中所述贫血是功能性缺铁性贫血。
39.根据权利要求35所述的用途，其中所述患者是长期血液透析患者。
40.根据权利要求35所述的用途，其中所述患者已经施用或正在施用红细胞生成刺激剂（ESA）。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述ESA是促红细胞生成素（EPO）。
42.权利要求35所述的用途，其中所述用途还包括在所述患者中提高血清铁水平、转铁蛋白饱和度（TAST）、网织红细胞血红蛋白含量（CHr）、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白或血细胞比容。
43.权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或包含权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的组合物在制备用于在患者中治疗hepcidin相关疾病的药物中的用途。
44.根据权利要求43所述的用途，其中hepcidin的活性或水平降低至少50%。
45.权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或包含权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的组合物在制备用于在患者中治疗贫血的药物中的用途。
46.权利要求45所述的用途，其中所述用途还包括增加或维持所述患者中的血红蛋白水平。
47.根据权利要求46所述的用途，其中所述用途还包括，相对于没有使用权利要求1-13中任一项所述的抗体或抗原结合片段或包含权利要求1-13中任一项所述的抗体或抗原结合片段的组合物时的EPO剂量需求和/或铁剂量需求，降低患者的铁剂量需求、降低患者的EPO剂量需求、或降低患者的铁剂量需求和患者的EPO剂量需求。
48.根据权利要求45所述的用途，其中所述贫血是与慢性疾病相关的贫血。
49.根据权利要求45所述的用途，其中所述贫血是功能性缺铁性贫血。
50.根据权利要求45所述的用途，其中所述患者正在或已经用红细胞生成刺激剂（ESA）治疗。
51.根据权利要求50所述的用途，其中ESA是促红细胞生成素（EPO）。
52.根据权利要求45所述的用途，其中所述贫血是EPO低反应性贫血。
53.根据权利要求45所述的用途，其中所述贫血是铁限制性贫血。
54.根据权利要求45所述的用途，其中所述患者是长期血液透析的患者。
55.根据权利要求45所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段以0.01mg/kg至15mg/kg的剂量施用。
56.根据权利要求45所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段用于静脉内或皮下施用。
57.根据权利要求56所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段用于皮下施用。
CN201580076468.1A 2014-12-19 2015-12-18 靶向bmp6抗体的组合物和方法 Active CN107531783B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462094716P 2014-12-19 2014-12-19
US62/094,716 2014-12-19
US201562181803P 2015-06-19 2015-06-19
US62/181,803 2015-06-19
PCT/IB2015/059797 WO2016098079A2 (en) 2014-12-19 2015-12-18 Compositions and methods for antibodies targeting bmp6

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107531783A CN107531783A (zh) 2018-01-02
CN107531783B true CN107531783B (zh) 2021-11-02

Family

ID=55069038

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580076468.1A Active CN107531783B (zh) 2014-12-19 2015-12-18 靶向bmp6抗体的组合物和方法

Country Status (26)

Country Link
US (3) US9862764B2 (zh)
EP (1) EP3233913B1 (zh)
JP (2) JP6802796B2 (zh)
KR (1) KR20170089010A (zh)
CN (1) CN107531783B (zh)
AU (2) AU2015365373C1 (zh)
BR (1) BR112017012954A2 (zh)
CA (1) CA2970869A1 (zh)
CL (1) CL2017001461A1 (zh)
CO (1) CO2017005941A2 (zh)
CR (1) CR20170262A (zh)
EC (1) ECSP17045736A (zh)
ES (1) ES2957214T3 (zh)
GT (1) GT201700131A (zh)
IL (1) IL252966B (zh)
JO (1) JO3791B1 (zh)
MX (1) MX2017008191A (zh)
MY (1) MY183779A (zh)
PE (1) PE20170916A1 (zh)
PH (1) PH12017501077A1 (zh)
SG (1) SG11201704634SA (zh)
TN (1) TN2017000242A1 (zh)
TW (1) TWI714545B (zh)
UY (1) UY36449A (zh)
WO (1) WO2016098079A2 (zh)
ZA (1) ZA201703897B (zh)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY36449A (es) * 2014-12-19 2016-07-29 Novartis Ag Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a bmp6
KR102709681B1 (ko) 2015-07-31 2024-09-26 메디뮨 리미티드 헵시딘 매개 장애의 치료 방법
GB2550114A (en) * 2016-05-03 2017-11-15 Kymab Ltd Methods, regimens, combinations & antagonists
JP7231411B2 (ja) * 2016-06-15 2023-03-01 ノバルティス アーゲー 骨形成タンパク質６（ｂｍｐ６）の阻害剤を使用して疾患を処置する方法
TWI850514B (zh) 2017-02-01 2024-08-01 耶魯大學 心臟衰竭及心腎症候群之精準治療
EP3415527A1 (de) 2017-06-14 2018-12-19 Technische Universität Dresden Verwendung der extrazellulären domäne des transferrinrezeptor 2 zur diagnostik und behandlung von primär und sekundär sklerosierenden erkrankungen
CA3087699A1 (en) 2018-01-05 2019-07-11 Corvidia Therapeutics, Inc. Methods for treating il-6 mediated inflammation without immunosuppression
EP3806885A2 (en) 2018-06-13 2021-04-21 Kymab Limited Antagonists and agonists of the transferrin receptor-2 for use in the treatment of diseases of the bone
GB201815629D0 (en) * 2018-09-25 2018-11-07 Kymab Ltd Antagonists
EP3870286A1 (en) 2018-10-23 2021-09-01 Scholar Rock, Inc. Rgmc-selective inhibitors and use thereof
EP3870181B1 (en) 2018-10-26 2024-08-14 Keros Therapeutics, Inc. Crystal forms of an alk2 inhibitor
US20220251184A1 (en) * 2019-06-12 2022-08-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to bone morphogenetic protein 6
CA3166328A1 (en) 2020-01-11 2021-07-15 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
WO2021222875A1 (en) * 2020-04-30 2021-11-04 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using alk2 inhibitors
WO2022204581A2 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
WO2022256723A2 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and therapeutic use thereof
WO2024187051A1 (en) 2023-03-07 2024-09-12 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors for use for treating resistant or unresponsive cancer in patients

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102215869A (zh) * 2008-11-13 2011-10-12 通用医疗公司 用于通过调整bmp-6来调节铁稳态的方法和组合物

Family Cites Families (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
JPS60500673A (ja) 1983-03-08 1985-05-09 コモンウエルス　セラム　ラボラトリ−ズ　コミツシヨン 抗原活性を有するアミノ酸配列
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5187076A (en) 1986-07-01 1993-02-16 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding BMP-6 proteins
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
EP0623679B1 (en) 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5242813A (en) 1990-10-12 1993-09-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Mouse monoclonal antibodies specific for normal primate tissue, malignant human cultural cell lines human tumors
ATE145428T1 (de) 1990-12-14 1996-12-15 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
ATE188708T1 (de) 1991-08-21 2000-01-15 Novartis Ag Antikörperderivate
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
EP1291360A1 (en) 1991-12-13 2003-03-12 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5610021A (en) 1992-02-21 1997-03-11 Creative Biomolecules, Inc. Compositions and methods for identification and use of soluble complex forms of osteogenic proteins
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
DE69334275D1 (de) 1992-08-21 2009-05-20 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne Leichtkette
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
EP0758452B1 (en) 1994-05-04 2001-11-07 Mount Sinai Hospital Corporation Modulators of cytokines of the tgf-beta superfamily and methods for assaying for same
NZ292124A (en) 1994-07-29 1998-10-28 Smithkline Beecham Plc Il-4 antagonist comprising a fusion of a mutant il-4-antibody fragment
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
AU6094696A (en) 1995-06-05 1996-12-24 Bionebraska, Inc. Lead binding polypeptides and nucleotides coding therefor
ATE279947T1 (de) 1996-03-18 2004-11-15 Univ Texas Immunglobulinähnliche domäne mit erhöhten halbwertszeiten
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
WO1998052976A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
WO1998056906A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Thoegersen Hans Christian Trimerising module
CA2293632C (en) 1997-06-12 2011-11-29 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT2180007E (pt) 1998-04-20 2013-11-25 Roche Glycart Ag Engenharia de glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
CA2359067C (en) 1999-01-15 2017-03-14 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP3031917A1 (en) 1999-04-09 2016-06-15 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
NZ517202A (en) 1999-08-24 2004-05-28 Medarex Inc Human CTLA-4 antibodies and their uses
US20030224501A1 (en) 2000-03-17 2003-12-04 Young Paul E. Bone morphogenic protein polynucleotides, polypeptides, and antibodies
EP2236152B1 (en) 2000-04-12 2014-06-04 Novozymes Biopharma DK A/S Albumin fusion proteins
CN101940189A (zh) 2000-11-30 2011-01-12 米德列斯公司 用于生产人类抗体的转基因转染色体啮齿动物
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
EP1421203A4 (en) 2001-05-17 2005-06-01 Diversa Corp NEW ANTIGEN-BINDING MOLECULES FOR THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, PROPHYLACTIC, ENZYMATIC, INDUSTRIAL AND AGRICULTURAL APPLICATIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND SCREENING THEREOF
EP1443961B1 (en) 2001-10-25 2009-05-06 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
CA2467633C (en) 2001-12-03 2012-03-27 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
US7335478B2 (en) 2002-04-18 2008-02-26 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Reactivation-based molecular interaction sensors
US20030157579A1 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Kalobios, Inc. Molecular sensors activated by disinhibition
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
US7816497B2 (en) 2002-10-30 2010-10-19 University Of Kentucky Compositions and methods for inhibiting drusen complement components C3a and C5a for the treatment of age-related macular degeneration
US20050008625A1 (en) 2003-02-13 2005-01-13 Kalobios, Inc. Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
WO2005069970A2 (en) 2004-01-20 2005-08-04 Kalobios, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
US20060243522A1 (en) 2005-02-14 2006-11-02 Hart Kelly F Portable stepping device
EP1858541B1 (en) 2005-02-16 2012-07-25 The General Hospital Corporation Use of bmp antagonists to regulate hepcidin-mediated iron metabolism and treat iron deficiency
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
PE20071101A1 (es) 2005-08-31 2007-12-21 Amgen Inc Polipeptidos y anticuerpos
SG10201604649SA (en) 2006-06-07 2016-07-28 Bioalliance Cv Antibodies Recognizing A Carbohydrate Containing Epitope On CD-43 And Cea Expressed On Cancer Cells And Methods Using Same
EP2062048A4 (en) 2006-09-12 2009-12-02 Gen Hospital Corp METHODS OF IDENTIFYING COMPOUNDS THAT MODULATE CELL SIGNALING AND METHODS EMPLOYING SUCH COMPOUNDS
US20100209926A1 (en) 2007-09-28 2010-08-19 Stryker Corporation Methods for detecting neutralizing antibodies for bone morphogenetic proteins
US20140086919A1 (en) 2012-09-24 2014-03-27 Herbert Y. Lin Methods and compositons for regulating iron homeostasis by modulation of bmp-6
US20110070242A1 (en) 2009-09-01 2011-03-24 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods for Diagnosing and Treating Iron Dysregulation
US9708379B2 (en) 2011-01-19 2017-07-18 The General Hospital Corporation Compositions for regulating iron homeostasis and methods of using same
WO2012151609A1 (en) 2011-05-06 2012-11-15 Women's And Children's Health Research Institute Inc Method of treatment and prophylaxis of pathologies of the bone
WO2014007198A1 (ja) 2012-07-02 2014-01-09 協和発酵キリン株式会社 抗ｂｍｐ９抗体を有効成分とする、腎性貧血、がん性貧血などの貧血に対する治療剤
US10138868B2 (en) 2012-12-07 2018-11-27 Wobben Properties Gmbh Rotor blade trailing edge
AR093620A1 (es) 2012-12-17 2015-06-10 Lilly Co Eli Anticuerpos bmp-6
US9139648B1 (en) 2014-07-15 2015-09-22 Kymab Limited Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain
UY36449A (es) * 2014-12-19 2016-07-29 Novartis Ag Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a bmp6

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102215869A (zh) * 2008-11-13 2011-10-12 通用医疗公司 用于通过调整bmp-6来调节铁稳态的方法和组合物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A rapid and sensitive bioassay for the simultaneous measurement of multiple bone morphogenetic proteins. Identification and quantification of BMP4, BMP6 and BMP9 in bovine and human serum;Blanca Herrera等;《BMC Cell Biology》;20090319;第1-11页 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2957214T3 (es) 2024-01-15
UY36449A (es) 2016-07-29
CO2017005941A2 (es) 2017-09-11
MX2017008191A (es) 2017-09-13
KR20170089010A (ko) 2017-08-02
US11530261B2 (en) 2022-12-20
AU2015365373C1 (en) 2019-09-05
US20180171005A1 (en) 2018-06-21
WO2016098079A3 (en) 2016-08-18
US10683346B2 (en) 2020-06-16
ECSP17045736A (es) 2019-02-28
CL2017001461A1 (es) 2017-12-22
PH12017501077A1 (en) 2017-11-06
IL252966B (en) 2021-06-30
JP2020182467A (ja) 2020-11-12
US20160176956A1 (en) 2016-06-23
JP2018504893A (ja) 2018-02-22
TW201629097A (zh) 2016-08-16
US9862764B2 (en) 2018-01-09
US20210032321A1 (en) 2021-02-04
PE20170916A1 (es) 2017-07-12
JO3791B1 (ar) 2021-01-31
WO2016098079A2 (en) 2016-06-23
AU2015365373A1 (en) 2017-07-06
TWI714545B (zh) 2021-01-01
EP3233913B1 (en) 2023-08-16
ZA201703897B (en) 2020-08-26
MY183779A (en) 2021-03-15
AU2015365373B2 (en) 2019-02-14
AU2019203368A1 (en) 2019-06-06
GT201700131A (es) 2019-10-10
CN107531783A (zh) 2018-01-02
EP3233913A2 (en) 2017-10-25
SG11201704634SA (en) 2017-07-28
CR20170262A (es) 2017-08-21
BR112017012954A2 (pt) 2018-02-06
IL252966A0 (en) 2017-08-31
CA2970869A1 (en) 2016-06-23
JP6802796B2 (ja) 2020-12-23
TN2017000242A1 (en) 2018-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107531783B (zh) 靶向bmp6抗体的组合物和方法
US10385127B2 (en) Compositions and methods for antibodies targeting EPO
WO2012172495A1 (en) Compositions and methods for antibodies targeting tem8
US11434269B2 (en) Methods for treating disease using inhibitors of bone morphogenetic protein 6 (BMP6)
US10047155B2 (en) Antibodies targeting bone morphogenetic protein 9 (BMP9) and methods therefor
EA039579B1 (ru) Способы и композиции антител, направленных против bmp6

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant