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CN107530443A - 工程化的位点特异性抗体和使用方法 - Google Patents

工程化的位点特异性抗体和使用方法 Download PDF

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CN107530443A
CN107530443A CN201680026026.0A CN201680026026A CN107530443A CN 107530443 A CN107530443 A CN 107530443A CN 201680026026 A CN201680026026 A CN 201680026026A CN 107530443 A CN107530443 A CN 107530443A
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CN
China
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antibody
engineered antibody
cysteine residues
engineered
seq
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CN201680026026.0A
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D.刘
V.N.西索迪亚
J.梁
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AbbVie Stemcentrx LLC
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Stemcentrx inc
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Abstract

提供了新型抗体药物缀合物(ADC)以及使用此类ADC来治疗增殖性病症的方法。

Description

工程化的位点特异性抗体和使用方法
相关申请的交叉引用
要求2015年3月4日提交的美国临时申请号62/128,424的优先权，将其通过引用以其全文结合于此。
序列表
本申请含有一份已经以ASCII格式经EFS-Web递交的序列表并且该序列表通过引用以其全文结合于此。创建于2016年3月3日的所述ASCII副本名称为“sc0004pct_030316.txt”并且大小是554KB(567,402字节)。
技术领域
本申请通常涉及包含具有缀合至细胞毒素的一个或多个未配对半胱氨酸残基的位点特异性抗体或其免疫反应性片段的新型化合物，并且涉及其用于治疗或预防癌症及其任何复发或转移的用途。
背景技术
许多常用的癌症治疗剂由于其不能选择性地靶向增殖性肿瘤细胞而倾向于引起显著的毒性。而这些传统的化学治疗剂非特异性地起作用，并且经常与肿瘤细胞一起损伤或消除正常增殖的健康组织。这种非预期的细胞毒性常常会限制患者可以忍受的剂量或方案，从而有效地限制了药剂的治疗指数。因此，已作出许多尝试从而以不同的成功程度将细胞毒性治疗剂靶向肿瘤部位。一个有希望的研究领域涉及使用抗体将细胞毒性剂引导到肿瘤，以提供治疗有效的局部药物浓度。
就此而言，长期以来已经认识到，使用与所选细胞毒性剂缀合的靶向单克隆抗体(“mAb”)提供了将相对高水平的此类细胞毒性有效载荷直接递送到肿瘤部位，同时减少正常组织对其的暴露。虽然在实验室或临床前环境中广泛探索了这种抗体药物缀合物(“ADC”)的用途，但其在临床中的实际应用受到更多限制。在某些情形中，这些限制是将弱的或无效的毒素与不能充分选择性地或未能有效地和肿瘤缔合的肿瘤靶向分子相组合的结果。在其他情况下，分子构建体在给予时被证明是不稳定的，或者从血流中清除太快而不能以治疗上显著的浓度在肿瘤部位积聚。尽管这种不稳定性可以是接头选择或缀合程序的结果，但也可以是毒性有效载荷对靶向抗体过载(即，药物与抗体比例或“DAR”太高)的结果，从而在药物制剂中产生不稳定的缀合物质。在某些情况下，无论是来自设计还是来自不稳定的DAR种类，构建体不稳定性都导致不可接受的非特异性毒性，因为有效的细胞毒性有效载荷从药物缀合物中过早浸出，并在身体尝试清除未靶定的有效载荷时在注射部位或关键器官中累积。这样，联邦药物管理局迄今已经批准了相对较少的ADC，尽管目前有几种此类化合物正在进行临床试验。因此，仍然需要展现有利的治疗指数的稳定的、相对均匀的抗体药物缀合物制剂。
发明内容
这些和其他目的是通过本发明提供，在广义上，本发明针对提供改善的展现有利的药物代谢动力学和药效特性的位点特异性抗体和缀合物的新型方法、化合物、组合物及制品。本发明提供的益处可广泛地适用于抗体治疗和诊断领域，并且可以和与各种靶标反应的抗体结合使用。如以下将详细论述的，所披露的位点特异性缀合物包含具有一个或多个未配对半胱氨酸的工程化抗体构建体，其可以使用新型选择性还原技术优先缀合至治疗性或诊断性有效载荷。当与常规缀合制剂相比时，这种位点特异性缀合物制剂相对稳定，并且对于平均DAR分布和有效载荷位置是基本均匀的。如所附实例所示，所披露的位点特异性缀合物制剂的稳定性和均匀性(关于平均DAR分布和有效载荷定位)提供了有助于改善的治疗指数的有利毒性特征。
在一个实施例中，本发明针对包含一个或多个未配对半胱氨酸残基的位点特异性工程化抗体。本领域技术人员将理解，根据此处传授，未配对半胱氨酸残基提供了药学活性部分的选择性的和受控的缀合以产生工程化缀合物。
在另一个实施例中，本发明针对包含至少一个未配对半胱氨酸残基的位点特异性工程化IgG1同种型抗体。在一些实施例中，与重链/重链链间残基相反，该一个或多个未配对半胱氨酸残基将包含重/轻链链间残基。在其他实施例中，未配对半胱氨酸残基将由链内二硫键(或“链内二硫桥”)产生。
在另一个实施例中，本发明提供工程化抗体，其中包含位点特异性工程化抗体的轻链的C214残基(根据Kabat的EU索引编号)被另一残基取代或缺失。在另一个实施例中，本发明提供工程化抗体，其中包含工程化抗体的重链的C220残基(根据Kabat的EU索引编号)被另一残基取代或缺失。
在其他所选实施例中，工程化抗体将包含一个或多个未配对半胱氨酸残基，其中该一个或多个未配对半胱氨酸残基不是天然链间二硫键半胱氨酸。本发明的又其他方面针对包含一个或多个未配对半胱氨酸残基的工程化抗体，其中该一个或多个未配对半胱氨酸残基不包括形成天然链间二硫键的半胱氨酸。在某些其他方面，未配对半胱氨酸将不包括天然半胱氨酸。
在所选实施例中，未配对半胱氨酸将存在于抗体轻链的CL结构域中，并且在某些方面将存在于CL结构域的C末端区域中。在其他所选实施例中，游离半胱氨酸残基将并入抗体轻链恒定区的暴露环结构之一中。在这些实施例中，游离半胱氨酸残基将被定位(通过并入或取代)在残基121-128、残基182-191或残基201-213(Kabat编号)。在其他优选实施例中，游离半胱氨酸残基将包含(通过并入或取代)CL区的β片层上的暴露残基。
在某些所选方面，本发明的位点特异性抗体将包含含至少一个非天然半胱氨酸的轻链恒定区。在此类实施例中，轻链恒定区可以包含含至少一个非天然半胱氨酸的κ轻链恒定区或含至少一个非天然半胱氨酸的λ轻链恒定区。再其他实施例将包含在残基位置122、190、206、208、210、211、212或213处包含至少一个非天然半胱氨酸的κ轻链恒定区。在其他优选实施例中，位点特异性工程化抗体将包含重链和轻链，其中轻链包含具有选自下组的氨基酸序列的轻链恒定区，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:550、SEQ ID NO:551、SEQ IDNO:552、SEQ ID NO:553、SEQ ID NO:554、SEQ ID NO:555、SEQ ID NO:556、SEQ ID NO:557、SEQ ID NO:558、SEQ ID NO:559、SEQ ID NO:560、SEQ ID NO:561、SEQ ID NO:562、SEQ IDNO:563和SEQ ID NO:564。
在其他实施例中，工程化抗体将包含位于抗体重链上的未配对半胱氨酸残基。在又其他实施例中，游离半胱氨酸残基将位于CH1结构域内。在再其他实施例中，游离半胱氨酸残基将位于CH2结构域中。在又其他实施例中，游离半胱氨酸残基将位于CH3结构域中。
在优选的实施例中，位点特异性工程化抗体将与存在于肿瘤发生细胞上的抗原性标记物发生免疫特异性反应。因此，在特别优选的实施例中，本发明针对包含一个或多个未配对半胱氨酸残基的工程化抗体，其中该工程化抗体与选自下组的决定簇发生免疫特异性反应，该组由以下各项组成：DLL3、SEZ6和CD324，其各自已知为肿瘤标记物。
在相关实施例中，位点特异性抗体用于制造工程化缀合物，其中该一个或多个游离半胱氨酸与治疗剂或诊断剂缀合。就此而言，本发明包含具有下式的抗体药物缀合物：
Ab-[L-D]n或其药学上可接受的盐，其中
Ab包括包含一个或多个未配对半胱氨酸残基的抗体，其中该一个或多个未配对半胱氨酸残基不包含形成天然链间二硫键的半胱氨酸；
L包括任选的接头；
D包括药物；并且
n是从约1到约12的整数。
除了上述抗体药物缀合物之外，本发明还提供通常包含所披露的ADC的药物组合物和使用此类ADC来诊断或治疗患者中的病症(包括癌症)的方法。在特别优选的实施例中，工程化抗体或缀合物将与选自下组的决定簇缔合，该组由以下各项组成：DLL3、SEZ6和CD324。
在相关实施例中，本发明针对杀灭肿瘤细胞或肿瘤发生细胞、降低其频率或抑制其增殖的方法，该方法包括用本发明的位点特异性ADC处理所述肿瘤细胞或肿瘤发生细胞。在相关实施例中，本发明提供了治疗癌症的方法，该方法包括向受试者给予包含本发明的位点特异性缀合物的药物组合物。
在另一个实施例中，本发明包括制备本发明的抗体药物缀合物的方法，该方法包括以下步骤:
a)提供包含一个或多个未配对半胱氨酸残基的工程化抗体，其中该一个或多个未配对半胱氨酸残基不包含形成天然链间二硫键的半胱氨酸；
b)选择性地还原该工程化抗体；并且
c)将该选择性地还原的工程化抗体与药物缀合。
在相关的优选实施例中，选择性地还原抗体的步骤包括使抗体与稳定剂接触的步骤。在又另一个实施例中，该方法还可以包括使抗体与温和还原剂接触的步骤。
如所指示的，此类缀合物可用于治疗、管理、改善或预防增殖性病症或其复发或进展。本发明的所选实施例提供了此类位点特异性缀合物的用途，用于恶性肿瘤的免疫治疗性治疗，优选地包括肿瘤起始细胞的频率的降低。所披露的ADC可以单独或联合多种抗癌化合物使用，这些抗癌化合物如化学治疗剂或免疫治疗剂(例如治疗性抗体)或生物反应修饰剂。在其他所选实施例中，可以组合使用两种或更多种离散的位点特异性抗体药物缀合物以提供增强的抗赘生效果。
除以上论述的治疗用途外，还应理解的是，本发明的工程化缀合物可以用于对病症并且特别是增殖性病症进行检测、诊断或分类。它们还可以用于这些病症的预后和/或治疗诊断。在一些实施例中，这些位点特异性缀合物可以给予该受试者并且在体内进行检测或监测。本领域的普通技术人员将理解，这些调节剂可以用如以下所披露的效应物、标记物或报告子进行标记或与其缔合，并且使用多种标准技术(例如，MRI、CAT扫描、PET扫描等)中的任一种进行检测。
因此，在一些实施例中，本发明将包括一种在体内诊断、检测或监测有需要的受试者的增殖性病症的方法，该方法包括给予一种工程化缀合物的步骤。
在其他情况下，这些缀合物可以被用于一种使用本领域认可的程序(例如，免疫组织化学或“IHC”)的体外诊断环境中。因此，一个优选的实施例包括一种诊断有需要的受试者的增殖性病症的方法，该方法包括以下步骤：
a.从所述受试者获得一份组织样品；
b.使该组织样品与至少一种位点特异性缀合物接触；并且
c.对与该样品缔合的位点特异性缀合物进行检测或定量。
这些方法可以结合本申请容易地分辨，并且可以容易地使用一般可用的商业技术，如自动读板器、专用报告子系统等进行。在所选实施例中，该工程化缀合物将与该样品中存在的肿瘤保持细胞(即，癌症干细胞)缔合。在其他优选的实施例中，该检测或定量步骤将包含癌症干细胞频率的一种降低，这可以如在此所描述进行监测。
本发明还提供使用此处披露的位点特异性缀合物的试剂盒或装置和相关方法，以及此处披露的工程化缀合物的药物组合物，其可用于治疗增殖性病症如癌症。为此，本发明优选地提供一种用于治疗此类病症的制品，该制品包含含有一种位点特异性抗体药物缀合物的容器及有关使用该缀合物治疗、减轻或预防增殖性病症或者其进展或复发的指导材料。在所选实施例中，这些装置和相关方法将包括接触至少一个循环的肿瘤细胞的步骤。
前述是一种概述并因此，在必要时，含有简化、概括及细节的省略；因此，本领域的普通技术人员将理解，该概述只是说明性的并且不旨在以任何方式限制。在此描述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题内容的其他方面、特征及优势将于在此所陈述的传授内容而变得显而易见。提供的概述以一种简化的形式介绍了众多观念的一种选择，以下在详细说明中将对其作进一步描述。这一概述不旨在鉴定所要求的主题内容的关键特征或基本特征，也不旨在被用作确定所主张的主题内容的范围一种辅助手段。
附图说明
图1是显示链内和链间二硫键的人类IgG1抗体的结构的描绘。
图2A和2B以表格形式提供了与所披露的如此处实例中所述进行分离、克隆和工程化的抗体药物缀合物相容的多种人源化示例性DLL3抗体的轻链可变区和重链可变区的连续氨基酸序列(SEQ ID NO:519-528)。
图3A和3B以表格形式提供了与所披露的如此处实例中所述进行分离、克隆和工程化的抗体药物缀合物相容的多种人源化示例性SEZ6抗体的轻链可变区和重链可变区的连续氨基酸序列(SEQ ID NO:170-199)。
图4以表格形式描绘了与所披露的如此处实例中所述进行分离、克隆和工程化的抗体药物缀合物相容的鼠类和人源化示例性CD324抗体的轻链可变区和重链可变区的连续氨基酸序列(SEQ ID NO:529-532)。
图5A和5B提供了根据本传授产生的示例性位点特异性抗DLL3抗体的轻链和重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:507-512)。
图6A和6B提供了根据本传授产生的示例性位点特异性抗SEZ6抗体的轻链和重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:513-518)。
图7描绘了根据本传授产生的示例性CD324ss3位点特异性抗体的轻链和重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:543-544)。
图8显示了如在此所陈述制造的天然和位点特异性构建体的结合特性。
图9是描绘将工程化抗体与细胞毒素缀合的过程的示意图。
图10A和10B是显示使用RP-HPLC测定的使用还原剂缀合的位点特异性抗体轻链和重链的缀合百分比的图示。
图11A和11B是显示使用HIC测定的使用还原剂缀合的位点特异性抗体构建体的DAR分布的图示。
图12A和12B显示了使用RP-HPLC测定的使用稳定剂或还原剂缀合的位点特异性抗体轻链和重链的缀合百分比。
图13A和13B是显示使用HIC测定的使用稳定剂或还原剂缀合的位点特异性抗体构建体的DAR分布的图示。
图14A和14B显示了使用HIC测定的使用稳定剂和/或温和还原剂缀合的位点特异性抗体构建体的DAR分布。
图15描绘了使用HIC测定的使用各种稳定剂缀合的位点特异性抗体构建体的DAR分布。
图16描绘了可用于制造根据本传授产生的位点特异性抗体的示例性轻链恒定区(SEQ ID NO:502、503和550-564)的氨基酸序列。
图17提供了显示使用HIC测定的各种选择性缀合的位点特异性抗体构建体的DAR分布的图示。
图18显示了使用RP-HPLC测定的衍生自各种选择性缀合的位点特异性抗体构建体的抗体轻链和重链的缀合百分比。
图19示出了使用HIC测定的各种选择性缀合的位点特异性抗体构建体的DAR分布。
图20描绘了使用RP-HPLC测定的衍生自各种选择性缀合的位点特异性抗体构建体的抗体轻链和重链的缀合百分比。
图21显示了使用HIC测定的各种选择性缀合的位点特异性抗体构建体的DAR分布。
图22描绘了使用RP-HPLC测定的衍生自各种选择性缀合的位点特异性抗体构建体的抗体轻链和重链的缀合百分比。
图23显示了使用HIC测定的各种选择性缀合的位点特异性抗体构建体的DAR分布。
图24显示了使用RP-HPLC测定的衍生自各种选择性缀合的位点特异性抗体构建体的抗体轻链和重链的缀合百分比。
图25示出了使用HIC测定的各种选择性缀合的位点特异性抗体构建体的DAR分布。
图26示出了位点特异性卡奇霉素缀合物体在体外杀灭DLL3+细胞的能力。
图27显示了位点特异性多拉司他汀缀合物在体外杀灭DLL3+细胞的能力。
具体实施方式
I.介绍
尽管可以按许多不同的方式实施本发明，但在此披露了其具体的说明性实施例，这些实施例举例说明了本发明的原理。应当强调的是，本发明不限于所说明的这些具体的实施例。另外，在此使用的任何章节标题只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题内容。最后，除非另外指出，否则出于本披露的目的，所有鉴定序列登录号都可以见于NCBI参考序列(RefSeq)数据库和/或NCBI GenBank档案序列数据库。
最初重要的是注意到，本发明的位点特异性抗体和位点特异性缀合物不限于任何特定的靶标或抗原。相反，由于可以将任何现有抗体或可如在此所述产生的任何抗体转化为位点特异性抗体，本发明赋予的优点是广泛适用的，并且可以与任何靶抗原(或决定簇)结合使用。更具体地，通过使用未配对半胱氨酸缀合位点和选择性还原它们而赋予的有益特性(例如，增强的缀合物稳定性和降低的非特异性毒性)广泛地适用于治疗性和诊断性抗体，而与具体靶标无关。因此，虽然某些非限制性决定簇已被用于解释和证明本发明的益处的目的，但是它们对其范围绝不是限制性的。
无论如何，应当理解，已经发现本发明的位点特异性抗体缀合物展现有利的特征，使得它们特别适合用作治疗性化合物和组合物。就此而言，在此所述的缀合物与被发现与各种增殖性病症相关并被证明是有效治疗靶标的决定簇免疫特异性地反应。另外，在某些优选实施例中，本发明的构建体提供了从通过分子工程技术获得的一个或多个破碎的天然二硫键衍生的特定半胱氨酸位置处的选择性缀合。在其他优选的实施例中，并且如将在以下更详细论述的，未配对或游离半胱氨酸可以被工程化到存在于所选抗体或其免疫反应性片段中的任何残基位点中(即，这些位点不需要破坏天然存在的天然二硫键)。
无论是在预先选择的位点引入游离半胱氨酸还是破坏天然二硫键，在此所述抗体的工程化提供了允许药物抗体比例(“DAR”)在很大程度上被精确固定从而产生DAR基本均匀的制剂的调节化学计量缀合。此外，所披露的位点特异性构建体进一步提供了就有效载荷在抗体上的位置来说基本均匀的制剂。使用如在此所述的稳定剂的工程化构建体的选择性缀合增加了希望的DAR种类百分比，并且与制造的未配对或游离半胱氨酸位点一起赋予了缀合稳定性和均匀性，这降低由细胞毒素的偶然浸出引起的非特异性毒性。通过游离半胱氨酸的选择性缀合和制剂的相对均匀性(缀合位置和DAR两者)提供的这种毒性降低也提供增强的治疗指数，其允许在肿瘤部位增加细胞毒素有效载荷水平。另外，可以任选地使用各种色谱方法纯化得到的位点特异性缀合物，以提供高度均匀的位点特异性缀合物制剂，其包含大于75％、80％、85％、90％或甚至95％的所希望的DAR种类(例如DAR＝2)。通过限制可能增加毒性的不想要的较高DAR缀合物杂质(其可能相对不稳定)，这种缀合物均匀性可进一步增加所披露制剂的治疗指数。
应当理解，所披露的工程化缀合物制剂展现的有利特性至少部分地基于特异性引导缀合的能力，并且在缀合位置和绝对DAR方面上大大限制所制造的缀合物。与大多数常规ADC制剂不同，本发明不完全依赖于抗体的部分或全部还原以提供随机缀合位点和相对不受控制的DAR种类的产生。相反，本发明通过工程化靶向抗体来破坏一个或多个天然存在的(即，“天然”)链间或链内二硫键或者在任何位置引入半胱氨酸残基来提供一个或多个预定的未配对(或游离)半胱氨酸位点。为此，应当理解，在所选实施例中，可以使用标准分子工程技术将半胱氨酸残基沿着抗体(或其免疫反应性片段)重链或轻链的任何位置并入或附加到其上。在其他优选实施例中，天然二硫键的破坏可以与引入非天然半胱氨酸(其然后将包含游离半胱氨酸)组合实现，然后可以将其用作缀合位点。
关于引入或添加一个或多个半胱氨酸残基以提供游离半胱氨酸(与破坏天然存在或天然二硫键或桥相反)，本领域技术人员可以容易地辨别抗体或抗体片段上的一个或多个相容位置。注意，在本发明中，术语“二硫键”和“二硫桥”是等效的，并且可以互换使用，除非上下文另有规定。因此，在某些实施例中，游离或未配对半胱氨酸将不包含天然链间二硫键半胱氨酸，而是通过在非天然位置引入半胱氨酸残基或通过破坏链内二硫键来提供。在所选实施例中，所披露的工程化抗体将包含一个或多个未配对半胱氨酸残基，其中该一个或多个未配对半胱氨酸残基不包含形成天然链间二硫键的半胱氨酸。通过举例，包含IgG1工程化抗体的这些实施例在轻链上的位置C214或重链的位置C220、C226或C229(全部Kabat编号)处不包含游离半胱氨酸残基(总体参见图1)。当然，天然存在或天然二硫键的位置对于所有类别(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)和所有亚类(即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)的抗体来说是众所周知的，并且在每个情形中，本领域技术人员将容易辨别形成天然链间二硫键的那些半胱氨酸。
在其他所选实施例中，一个或多个未配对半胱氨酸残基可以被引入重链中。更具体地，取决于所希望的DAR、抗体构建体、所选择的有效载荷和抗体靶，一个或多个未配对半胱氨酸残基可以位于CH1结构域、CH2结构域或CH3结构域或其任何组合中。在其他优选的实施例中，半胱氨酸残基可以被引入到κ或λCL结构域中，并且在特别优选的实施例中可以引入CL结构域的c末端区域。在每个情形中，邻近半胱氨酸插入位点的其他氨基酸残基可以被改变、去除或取代，以促进分子稳定性、缀合效率或为有效载荷(一旦附接)提供保护环境。在具体实施例中，取代的残基出现在抗体的任何可接近位点处。通过用半胱氨酸取代这些表面残基，从而反应性硫醇基团被定位在抗体上容易接近的位置，并且可以如在此进一步描述的那样被选择性地还原。
因此，如在此所使用的，术语“游离半胱氨酸”或“未配对半胱氨酸”可以互换使用，除非上下文另有规定，并且应意指抗体的任何半胱氨酸成分，无论是天然存在还是使用分子工程技术特异性地并入所选残基位置的，并且在正常生理条件下不与相同抗体中的另一个半胱氨酸结合。因此，在某些优选实施例中，游离半胱氨酸可以包含天然存在的半胱氨酸，其天然链间或链内二硫键配偶体已经被取代、消除或以其他方式改变以在生理条件下破坏天然存在的二硫键，从而使未配对半胱氨酸适合于位点特异性缀合。在其他优选实施例中，游离或未配对半胱氨酸将包含半胱氨酸残基，其选择性地位于抗体重链或轻链氨基酸序列内的预定位点。可以理解，在缀合之前，游离或未配对半胱氨酸可以作为硫醇(经还原的半胱氨酸)、作为封端半胱氨酸(经氧化的)或作为非天然分子内二硫键(经氧化的)存在，与存在于相同抗体上的另一个游离半胱氨酸一起，这取决于该系统的氧化态。如以下更详细论述的，该抗体构建体的温和还原将提供可用于位点特异性缀合的硫醇。在特别优选的实施例中，游离或未配对半胱氨酸(无论是天然存在的或并入的)将经受选择性还原和随后的缀合以提供所披露的均匀DAR组合物。
更具体地，然后可以使用此处披露的新技术选择性地还原所得游离半胱氨酸，而基本上不破坏完整的天然二硫键，以便主要在所选择的半胱氨酸位点提供反应性硫醇。然后这些制备的硫醇经受与所披露的药物-接头化合物的定向缀合，而没有实质上非特异的缀合。也就是说，此处披露的工程化构建体和任选地选择性还原技术很大程度上消除毒素有效载荷的非特异性随机缀合。值得注意的是，这提供了在靶向抗体上的DAR种类分布和缀合位置两者基本均匀的制剂。如以下所论述的，消除DAR相对较高的污染物本身可以降低非特异性毒性并扩大制剂的治疗指数。此外，这种选择性允许有效载荷大部分位于特别有利的预定位置(例如轻链恒定区的末端区域)，其中有效载荷某种程度上被保护直到其到达肿瘤，而一旦到达靶标就被适当地呈现并被处理。因此，用以促进特定有效载荷定位的工程化抗体的设计也可用于降低所披露制剂的非特异性毒性。最后，选择性地和可重复地引导抗体缀合的能力大大简化了所得组合物的表征，从而促进药物开发。
如以下所论述和实例中所示的，这些预定的游离半胱氨酸位点的产生可以使用本领域公认的分子工程技术实现，在抗体的预选位点引入半胱氨酸或者去除、改变或替换二硫键的构成半胱氨酸残基中的一个。使用这些技术，本领域技术人员将理解，可以将任何抗体类别或同种型工程化以展现能够根据本发明选择性缀合的一个或多个游离半胱氨酸。此外，所选择的抗体可以根据希望的DAR进行工程改造以特异性展现1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或甚至12个游离半胱氨酸。更优选地，所选择的抗体将被工程化以含有2或4个游离半胱氨酸，并且甚至更优选含有2个游离半胱氨酸。还将理解，游离半胱氨酸可定位于工程化抗体中，以便于将选择的细胞毒素递送至靶，同时降低非特异性毒性。在这方面，包含IgG1抗体的本发明的所选实施例将有效载荷定位于CH1结构域上，并且更优选地定位在结构域的C末端。在其他优选实施例中，构建体将被工程化以将有效载荷定位在轻链恒定区上，更优选在恒定区的C末端。在又其他所选方面，可以将构建体工程化以选择性地将有效载荷定位于CH2或CH3结构域上。
值得注意的是，通过使用以下所陈述的新型稳定剂来选择性地还原构建体也可以促进限制有效载荷与工程化游离半胱氨酸的缀合。如在此所使用的“选择性还原”将意指将工程化构建物暴露于还原游离半胱氨酸(从而提供反应性硫醇)而不实质上破坏完整天然二硫键的还原条件。总体而言，可以使用提供所希望的硫醇而不破坏完整的二硫键的任何还原剂或其组合来实现选择性还原。在某些优选实施例中，并且如以下实例中所陈述，可以使用稳定剂和温和还原条件进行选择性还原，以制备用于缀合的工程化构建体。如在此更详细论述的，相容的稳定剂通常有利于游离半胱氨酸的还原，并允许希望的缀合在较不严格的还原条件下进行。这允许绝大多数天然二硫键保持完整，并显著减少非特异性缀合的量，从而限制不希望的污染物和潜在的毒性。相对温和的还原条件可以通过使用多种系统来实现，但优选地包含使用含硫醇化合物。应当理解，鉴于本披露，本领域技术人员可以容易地衍生相容还原系统。
II.决定簇
本领域技术人员将理解，工程化抗体或缀合物可以由任何特异性识别任何相关决定簇或与之缔合的抗体产生。如在此所使用，“决定簇”意指与特定细胞、细胞群或组织可鉴定地缔合或在其中或其上特别发现的任何可检测的性状、特性、标记物或因子。决定簇可以是形态性的、功能性的或生物化学性的，并且通常是表型。在某些优选实施例中，该决定簇是针对其物理结构和/或化学组成进行了修饰的一种蛋白质或由特定细胞类型或由细胞在某些条件下(例如在该细胞周期的特定点期间或在特定小生境中的细胞)有差别地表达(上调或下调)的一种蛋白质。为了本发明的目的，决定簇优选包含细胞表面抗原或一种或多种由异常细胞差异表达的蛋白质，如通过化学修饰、呈递形式(例如剪接变体)、时间或量所证明的。在某些实施例中，决定簇可以包含SEZ6、DLL3或CD324蛋白，或它们的任何变体、同工型或家族成员及其特定结构域、区域或表位。“免疫原性决定簇”或“抗原决定簇”或“免疫原”或“抗原”意指当引入免疫活性动物时可刺激免疫应答，并被免疫应答产生的抗体识别的多肽的任何片段、区域或结构域。此处涵盖的决定簇可以通过其存在(阳性决定簇)或不存在(阴性决定簇)鉴定细胞、细胞亚群或组织(例如肿瘤)。
如在此所论述和以下实例中所陈述，本发明的所选实施例可以包含来自鼠类抗体的完全或部分可变区，其免疫特异性结合所选择的决定簇，并且可被认为是“来源”抗体。在这些实施例中，本发明所涵盖的抗体可以通过来源抗体的恒定区或表位结合氨基酸序列的任选修饰从这种“来源”抗体衍生。在一个实施例中，如果来源抗体中所选择的氨基酸通过缺失、突变、取代、整合或组合改变，则抗体是从来源抗体“衍生的”。在另一个实施例中，“衍生”抗体是其中来源抗体(例如，一个或多个CDR或整个可变区)的片段与受体抗体序列组合或并入其中以提供衍生抗体(例如嵌合、CDR移植的或人源化抗体)。值得注意的是，这些衍生抗体可以包含本发明的位点特异性抗体，其中例如供体抗体的抗原结合区域与包含一个或多个未配对半胱氨酸的恒定区相缔合。这些““衍生”(例如，嵌合、人源化或位点特异性构建体)抗体可以出于各种原因使用标准分子生物学技术产生，例如以便提供游离半胱氨酸；改善对决定簇的亲和力；改善细胞培养的产量和产率；降低体内的免疫原性；减少毒性；促进活性部分的缀合；或产生多特异性抗体。此类抗体也可以通过化学手段或翻译后修饰来修饰成熟分子(例如糖基化模式或聚乙二醇化)而衍生自来源抗体。当然，应当理解，来源抗体(例如，鼠类抗体)可以被工程化以提供所希望的缀合位点，而不经受抗体结构的进一步修饰。
此外，必须强调的是，在此所陈述的位点特异性缀合技术通常可适用于抗体治疗或诊断领域，并且可与任何现有的抗体或可产生的任何抗体一起使用，而与抗体靶标无关。在本文上下文中，以下陈述了用于证明本发明提供的益处的某些非限制性决定簇。
CD324(也称为E-钙粘蛋白、上皮钙粘蛋白或CDH1)是钙粘蛋白的经典亚家族成员，并且因此是介导同型(即，上皮-上皮)细胞间粘附的钙依赖性细胞间粘附糖蛋白。CD324的细胞内部分与细胞内的各种蛋白相互作用，包括α-连环蛋白、β-连环蛋白和p120，其本身与细胞骨架的肌动蛋白丝相互作用(Perez-Moreno等人，2003)。CD324被认为充当细胞粘附机制和细胞骨架之间的桥梁，并为细胞提供将它们定向在诸如分层上皮的组织中的罗盘。关于癌症的发展，CD324的表达紊乱是肿瘤发生和转移的早期和晚期阶段的主要事件之一。导致结构改变的CD324蛋白或完全丧失CD324表达的CDH1的灭活种系突变已经与胃癌、乳腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌和卵巢癌关联。长期以来，与低分化的肿瘤相比，分化良好的肿瘤展现CD324/连环蛋白的强染色模式。因此，CD324已经被病理学家用作重要预后标记物以通过免疫组织化学诊断不同种类的癌症。关于CD324在为细胞提供机械支持、调节细胞定位和运动性表型以及其与细胞分化状态的联系方面的功能作用的报道使得CD324成为抗癌疗法开发的非常有意义的靶标。CD324基因被转录并剪接成4815 bp成熟mRNA转录物，其具有编码882个氨基酸的前蛋白质(包括信号肽)的开放阅读框。CD324直系同源物在不同物种之间保守，并且钙粘蛋白家族的各种成员之间的序列同源性通常较高。CD324蛋白由约110个氨基酸的四个细胞外钙粘蛋白重复(EC1-EC4)、与其他钙粘蛋白重复较不密切相关的膜近端细胞外结构域(EC5)、跨膜结构域和高度保守的细胞内结构域(其可以进一步细分为近膜结构域(JMD)和高度磷酸化的β-连环蛋白结合结构域(CBD))组成。钙离子在钙粘蛋白的EC重复之间的位置处结合，赋予这些蛋白质的细胞外部分刚性的棒状结构。
SEZ6(又称为癫痫相关的6同系物)是一种最初克隆自用惊厥剂戊四唑(pentylentetrazole)处理的小鼠大脑皮质衍生的细胞的I型跨膜蛋白(清水-西川(Shimizu-Nishikawa)，1995；PMID:7723619)。SEZ6具有两个同工型，编码994个氨基酸蛋白质(NP849191)的约4210个碱基(NM178860)之一和编码993个氨基酸蛋白质(NP_001092105)的约4194个碱基(NM_001098635)之一。这些差异仅在其ECD中的最后10个氨基酸残基中。SEZ6具有另外两个家庭成员：SEZ6L和SEZ6L2。术语“SEZ6家族”是指SEZ6、SEZ6L、SEZ6L2及其各种同工型。成熟的SEZ6蛋白由一系列结构性结构域组成：一个胞质结构域、一个跨膜结构域和一个胞外结构域，该胞外结构域包含一个独特的N末端结构域、随后是两个交替的Sushi和CUB样结构域以及三个另外的串联Sushi结构域重复序列。已经将人类SEZ6基因中的突变与热性癫痫相联系，热性癫痫是一种与体温升高和儿童中最常见类型的癫痫有关的一种惊厥(Yu等人,2007,PMID:17086543)。由同源性和序列分析所鉴定的SEZ6蛋白质的结构模块分析表明在信号传导、细胞间通讯以及神经发育中的可能作用。抗SEZ6人源化抗体如下所述产生自从用SEZ6抗原免疫的小鼠中分离的抗体。
如以下实例中所陈述，本发明的工程化缀合物的特别优选的决定簇包含SEZ6、CD324和DLL3。DLL3(又称为δ样配体3或SCDO1)是Notch DSL配体的δ样家族的一个成员。代表性DLL3蛋白直系同源物包括但不限于，人类(登记号NP_058637和NP_982353)、黑猩猩(登记号XP_003316395)、小鼠(登记号NP_031892)及大鼠(登记号NP_446118)。在人类中，DLL3基因由位于染色体19ql3上跨9.5kBp的8个外显子组成。在最后一个外显子内的替代性剪接产生两种加工的转录物，一个为2389个碱基(登记号NM_016941)并且一个为2052个碱基(登记号NM_203486)。前一转录物编码一种618个氨基酸的蛋白质(登录号NP_058637)，而后者编码一种587个氨基酸的蛋白质(登录号NP_982353)。DLL3的这两种蛋白质同工型在其细胞外结构域和其跨膜结构域内共有总计100％一致性，不同之处仅在于，更长的同工型含有在该蛋白质的羧基末端处含32个另外的残基的一个延长的细胞质尾。
总体而言，DSL配体由一系列结构的结构域构成：一个独特的N末端结构域，随后为一个保守的DSL结构域、多个串联的表皮生长因子(EGF)样重复序列、一个跨膜结构域，及一个在配体间不高度保守而是含有多个赖氨酸残基的细胞质结构域，这些赖氨酸残基是被独特E3泛素连接酶泛素化的潜在位点。DSL结构域是一种简并EGF结构域，它是与Notch受体相互作用必需的但非充分的。另外地，大多数DSL配体的前两个EGF样重复序列含有一种更小的蛋白质序列基序，称为DOS结构域，当活化Notch信号传导时，该基序与该DSL结构域协作地相互作用。
DLL3蛋白的胞外区包含6个EGF样结构域、单个DSL结构域和N末端结构域。总体而言，这些EGF结构域被识别为出现在约氨基酸残基216-249(结构域1)、274-310(结构域2)、312-351(结构域3)、353-389(结构域4)、391-427(结构域5)及429-465(结构域6)处，其中DSL结构域在hDLL3的约氨基酸残基176-215处并且N末端结构域在约氨基酸残基27-175处。DSL结构域和N末端结构域包含由不同氨基酸序列定义的DLL3蛋白的部分。应注意，出于本披露的目的，对应的EGF样结构域可以称为EGF1到EGF6，其中EGF1最接近该蛋白质的N末端部分。就该蛋白质的结构组成来说，本发明的一个重要方面是可以产生、制造、工程化或选择所披露的DLL3抗体，从而使其与所选结构域、基序或表位反应。在某些情形中，这些位点特异性抗体可以取决于其主要作用模式而提供增强的反应性和/或功效。
与本发明相容并且可用作来源抗体的DLL3抗体披露在关于本披露的抗体通过引用结合于此的PCT申请号US 2013/0027391中。
更总体而言，通过任选修饰来源抗体的表位结合氨基酸序列和引入位点特异性游离半胱氨酸残基，本发明涵盖的工程化抗体可以衍生自“来源”抗体。在一个实施例中，如果来源抗体中所选择的氨基酸通过缺失、突变、取代、整合或组合改变以产生包含至少一个游离半胱氨酸残基的工程化抗体，则工程化抗体“衍生自”来源抗体。在另一个实施例中，“衍生”抗体是其中来源抗体(例如一个或多个CDR)的片段与包含一个或多个游离半胱氨酸残基的受体抗体序列组合或并入其中以提供衍生抗体(例如，嵌合或人源化抗体)。这些“衍生”抗体可以由于各种原因产生，例如以便改善对靶标的亲和力；改善细胞培养的产量和产率；降低体内的免疫原性；减少毒性；促进活性部分的缀合；或产生多特异性抗体。最重要的是，它们提供一个或多个药学活性部分的位点特异性缀合。除了分子工程之外，此类抗体也可以通过化学手段或翻译后修饰来修饰成熟分子(例如糖基化模式或聚乙二醇化)而衍生自来源抗体。
虽然本发明总体针对能够特异性结合决定簇的任何工程化抗体，工程化的抗SEZ6、工程化的抗DLL3和工程化的抗CD324抗体用作本发明的实施例的说明性实例。
III.细胞结合剂
1.抗体结构
如以上暗指的，本发明的特别优选的实施例包含所披露的与处于位点特异性抗体或其免疫反应性片段形式的细胞结合剂的缀合物，该细胞结合剂优先与所选决定簇上的一个或多个表位缔合。就此而言，包括接受的命名和编号系统的抗体及其位点特异性变体及其衍生物已经广泛地描述于例如Abbas等人(2010),Cellular and Molecular Immunology(6th Ed.),W.B.Saunders Company[细胞和分子免疫学(第6版),W.B.桑德公司]；或Murphey等人(2011),Janeway 's Immunobiology(8thEd.),Garland Science[简氏免疫生物学(第8版),加兰德科学]。
注意，为了本申请的目的，应理解，术语“调节剂”和“抗体”可互换使用，除非上下文另有规定。类似地，为了论述目的，本发明的实施例可以根据一个决定簇或另一个来实施。然而，除非上下文另有规定或要求，否则这些名称仅仅是为了说明的目的，而不是对所描述的一般概念或本发明的范围的限制。因此，术语“抗DLL3缀合物”和“DLL3缀合物”或简称“缀合物”均指在此所陈述的位点特异性缀合物，并且可互换使用，除非上下文另有规定。
“抗体”或“完整抗体”典型是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两个重(H)多肽链和两个轻(L)多肽链的Y型四聚蛋白。人类轻链包含可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)，其中恒定结构域可以容易地基于氨基酸序列和基因座被归类为κ或λ。每个重链包含一个可变结构域(VH)和恒定区，在IgG、IgA和IgD的情形中，其包含三个称为CH1、CH2和CH3的结构域(IgM和IgE具有第四结构域CH4)。在IgG、IgA和IgD类别中，CH1和CH2结构域被柔性铰链区域分离，该铰链区域是可变长度(通常在IgG中从约10至约60个氨基酸)的富含脯氨酸和半胱氨酸的区段。轻链和重链中的可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接到恒定结构域，并且重链也具有约10个另外的氨基酸的“D”区。每类抗体进一步包含由配对半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。
免疫球蛋白分子中有两种天然二硫桥或键：链间和链内二硫键。链内二硫键的位置和数量根据免疫球蛋白类别和种类而变化。虽然本发明不限于抗体的任何特定类别或亚类，但IgG1免疫球蛋白仅用于说明目的。链间二硫键位于免疫球蛋白的表面，可溶于溶剂，并且通常相对容易被还原。在人类IgG1同种型中，有四个链间二硫键，一个从每个重链到轻链，并且两个在重链之间。链间二硫键不是链缔合所必需的。众所周知，重链的富含半胱氨酸的IgG1铰链区域通常被保持为三部分：上铰链、芯铰链和下铰链。本领域技术人员将理解，IgG1铰链区域在重链中含有半胱氨酸，其包含链间二硫键(两个重/重、两个重/轻)，其提供促进Fab移动的结构灵活性。
IgG1的轻链和重链之间的链间二硫键形成于κ或λ轻链的C214和重链的上部铰链区中的C220之间(图1)。重链之间的链间二硫键位于位置C226和C229(下文所有根据Kabat等人，按照EU索引编号)。
如在此使用的，术语“抗体”可以广义地解释并且包括多克隆抗体(polyclonalantibody)、多克隆抗体(multiclonal antibody)、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体及灵长类化抗体、CDR移植的抗体、人类抗体、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗独特型抗体、合成抗体(包括突变蛋白及其变体)；免疫特异性抗体片段，如Fd、Fab、F(ab')2、F(ab')片段、单链片段(例如ScFv和ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc融合物和其他修饰，及任何其他免疫活性分子，只要它展现与DLL3决定簇的优先缔合或结合即可。另外，除非上下文约束另外规定，否则该术语另外包含抗体的所有类别(即，IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有亚类(即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。典型地，对应于不同类别的抗体的重链恒定结构域对应地由相应的小写希腊字母α、δ、ε、γ及μ表示。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以被分配到两种明显相异的类型之一，称为κ和λ。
在所选实施例中并如以下更详细地论述的，CL结构域可以包含展现游离半胱氨酸的κCL结构域。在其他实施例中，来源抗体可以包含展现游离半胱氨酸的λCL结构域。由于所有人类IgGCL结构域的序列是众所周知的，本领域技术人员可以容易地根据本披露分析λ和κ序列，并采用它来提供相容的抗体构建体。类似地，为了解释和证明的目的，以下论述和附加的实例将主要突出IgG1型抗体。与轻链恒定区一样，来自不同同种型(IgM、IgD、IgE、IgA)和亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)的重链恒定结构域序列是公知的和表征的。因此，本领域技术人员可以容易地利用包含任何同种型或亚类的抗体和如此处传授的与披露的药物的各缀合物，以提供本发明的位点特异性抗体药物缀合物。
抗体的可变结构域显示出从一种抗体到另一种抗体的氨基酸组成的显著变化，并且主要负责抗原识别和结合。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的IgG抗体具有两个结合位点(即它是二价的)。VH和VL结构域包含具有极端变异性的三个区域，其被称为高变区，或更通常地，由称为框架区(FR)的四个较少可变区框架化和分离的互补决定区(CDR)。VH和VL区域之间的非共价缔合形成Fv片段(对于“片段变量”)，其含有抗体的两个抗原结合位点之一。可以通过基因工程获得的ScFv片段(对于单链片段变量)在单个多肽链中缔合由肽接头分离的抗体VH和VL区域。
如在此所使用，氨基酸与每个结构域、框架区和CDR的分配可以根据由Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th Ed.),US Dept.ofHealth and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242[具有免疫学兴趣的蛋白的序列(第5版),美国健康与人类服务部,,PHS,NIH,NIH公开号91-3242]；Chothia等人,1987,PMID:3681981；Chothia等人,1989,PMID:2687698；MacCallum等人,1996,PMID:8876650；或Dubel编(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies,3rd Ed.,Wily-VCHVerlag GmbH and Co or AbM(Oxford Molecular/MSI Pharmacopia)[治疗性抗体手册,第3版,德国威利出版公司或AbM(牛津大学分子/MSI药典)]提供的编号方案之一，除非另有注解。以下示出了包含由Kabat、Chothia、MacCallum(也称为Contact)定义的CDR的氨基酸残基和从阿拜斯(Abysis)网站数据库(下文)获得的AbM。
表1
Kabat Chothia MacCallum AbM
VHCDR1 31-35 26-32 30-35 26-35
VHCDR2 50-65 52-56 47-58 50-58
VHCDR3 95-102 95-102 93-101 95-102
VLCDR1 24-34 24-34 30-36 24-34
VLCDR2 50-56 50-56 46-55 50-56
VLCDR3 89-97 89-97 89-96 89-97
抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(如以上所示出的，例如Kabat编号系统)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。用于鉴定这些区域的方法描述于Kontermann和Dubel编,Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001[抗体工程,施普林格,纽约州纽约,2001]和Dinarello等人,Current Protocolsin Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000[当前免疫学方案,约翰·威利父子出版公司,新泽西州霍博肯市,2000]中。抗体序列的示例性数据库描述于“阿拜斯”网站(www.bioinf.org.uk/abs)(由A.C.Martin在英国伦敦的伦敦大学生物化学和分子生物学学院维护)和VBASE2网站(www.vbase2.org)中，并可通过其进行访问，如Retter等人,Nucl Acids Res,33(Database issue):D671-D674(2005)[核酸研究,33(数据库发行号):D671-D674(2005)]所述的。
优选地，使用阿拜斯数据库(Abysis database)分析这些序列，其将来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据进行整合。参见Andrew C.R.Martin博士的书，章节Protein Sequence and Structure Analysisof Antibody Variable Domains[抗体可变区的蛋白质序列和结构分析].于AntibodyEngineering Lab Manual[抗体工程实验室手册](Ed.:Duebel,S.and Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13:978-3540413547[编辑:Duebel,S.和Kontermann,R.,斯普林格出版社,海德堡],ISBN-13:978-3540413547]，也可在网站bioinforg.uk/abs上获得)。阿拜斯数据库网站还包括已经开发用于鉴定可以根据此处的传授内容使用的CDR的一般规则。除非另有说明，此处陈述的所有CDR均根据Kabat等人的阿拜斯数据库网站衍生。
对于本发明中论述的重链恒定区氨基酸位置，编号是根据Edelman等人,1969,Proc,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]63(1):78-85中首先描述的EU索引，描述了骨髓瘤蛋白质Eu的氨基酸序列，据报道它是第一个测序的人类IgG1。Edelman的EU索引也在Kabat等人,1991(同上)中陈述。因此，“如Kabat中陈述的EU索引”或“Kabat的EU索引”或“根据Kabat的EU索引”或简称“EU索引”在重链上下文中是指基于如Kabat等人,1991(同上)所陈述的Edelman等人的人类IgG1Eu抗体的残基编号系统。用于轻链恒定区氨基酸序列的编号系统类似地在Kabat等人,1991中陈述。
与本发明相容的示例性野生型κB1和IgG1重链恒定区氨基酸序列在所附序列表中分别陈述为SEQ ID NO:403和404。类似地，示例性野生型λCL轻链恒定区在所附序列表中陈述为SEQ ID NO:504。本领域技术人员将理解，如在此所披露工程化以提供未配对半胱氨酸的轻链恒定区序列(例如参见SEQ ID NO:502、503、505、506和550-564)可以使用标准分子生物学技术与轻链可变区连接。然后将这些工程化的轻链与野生型或工程化的重链配对，以提供可并入本发明的抗体缀合物中的全长抗体。就此而言，SEQ ID NO:502、503、505和506优选与野生型IgG1重链(例如包含SEQ ID NO:404的那些)配对，以在重链上提供游离半胱氨酸，而包含SEQ ID NOS:550-564的轻链优选与工程化重链(例如，包含已被工程化以缺失或替代C220的SEQ ID NO:500和501的那些)配对，以在轻链上提供游离半胱氨酸。当然，在希望多于两个游离半胱氨酸/抗体的情况下，包含SEQ ID NO:550-564所陈述的CL结构域的轻链可以与位置220处具有半胱氨酸的野生型重链(例如，SEQ ID NO:404)配对。
无论如何，本发明的位点特异性抗体或免疫球蛋白可以包含或衍生自特异性识别任何决定簇或与其免疫特异性缔合的任何抗体。如在此所使用，“决定簇”或“靶标”意指与特定细胞、细胞群或组织可鉴定地缔合或在其中或其上特别发现的任何可检测的性状、特性、标记物或因子。决定簇或靶标可以是形态性的、功能性的或生物化学性的，并且优选是表型。在某些优选实施例中，决定簇是由特定细胞类型或由细胞在某些条件下(例如在该细胞周期的特定时间期间或在特定小生境中的细胞)有差别地表达(过表达或低表达)的蛋白质。为了本发明的目的，决定簇优选在异常癌细胞上差异表达，并且可以包含特定蛋白质(例如，CD324、SEZ6或DLL3)或其任何剪接变体、同工型或家族成员，或者其特异性结构域、区域或表位。“抗原”、“免疫原性决定簇”、“抗原决定簇”或“免疫原”意指当引入免疫活性动物时可刺激免疫反应，并被由动物的免疫反应产生的抗体识别的任何蛋白质或其任何片段、区域、结构域或表位。可使用在此涵盖的决定簇的存在或不存在来鉴定细胞、细胞亚群或组织(例如肿瘤、肿瘤发生细胞或CSC)。
如以下实例中所陈述，本发明的所选实施例包含免疫特异性结合SEZ6的鼠类抗体，其可以被认为是“来源”抗体。在其他实施例中，本发明所涵盖的抗体可以通过来源抗体的恒定区(即，提供位点特异性抗体)或表位结合氨基酸序列的任选修饰从这种“来源”抗体衍生。在一个实施例中，如果来源抗体中所选择的氨基酸通过缺失、突变、取代、整合或组合改变，则抗体是从来源抗体“衍生的”。在另一个实施例中，“衍生”抗体是其中来源抗体(例如，一个或多个CDR或整个可变区)的片段与受体抗体序列组合或并入其中以提供衍生抗体(例如嵌合、CDR移植的或人源化抗体)。这些“衍生”(例如，人源化或CDR移植的)抗体可以由于不同原因使用标准分子生物学技术产生，例如以便改善对决定簇的亲和力；改善细胞培养的产量和产率；降低体内的免疫原性；减少毒性；促进活性部分的缀合；或产生多特异性抗体。此类抗体也可以通过化学手段或翻译后修饰来修饰成熟分子(例如糖基化模式或聚乙二醇化)而衍生自来源抗体。当然，如在此广泛论述的，这些衍生的抗体可以进一步工程化以提供包含一个或多个游离半胱氨酸的所希望的位点特异性抗体。
在本发明的上下文中，应当理解，衍生自所附序列表(抗SEZ6抗体)中所陈述的鼠类可变区氨基酸序列的任何所披露的轻链和重链CDR都可以与受体抗体组合或重排以提供根据本传授内容的优化的抗人类SEZ6(例如人源化或嵌合抗hSEZ6)位点特异性抗体。也就是说，一个或多个衍生自或获得自所附序列表(SEQ ID NO:20-169一起)中陈述的连续轻链可变区氨基酸序列的CDR可以并入位点特异性构建体中，并且在特别优选的实施例中，并入与一个或多个SEZ6同工型或家族成员免疫特异性缔合的CDR移植的或人源化位点特异性抗体中。这些人源化调节剂的“衍生”轻链可变区和重链可变区氨基酸序列的实例关于抗DLL3抗体(SEQ ID NO:519-528)也在图2A和2B中陈述，关于抗SEZ6抗体(SEQ ID NO:170-199)在图3A和3B中陈述，并且关于抗CD324抗体(SEQ ID NO:531和532)在图4中陈述。
在图2A和2B、3A和3B及4所示，注释的CDR和框架序列按照Kabat使用专有的阿拜斯数据库进行定义。然而，如在此所论述，本领域的普通技术人员可以容易地对如由Kabat等人、Chothia等人、ABM或MacCallum等人关于所附序列表中所陈述的每一对应重链和轻链序列所定义的CDR进行定义、鉴定、衍生化和/或计数。因此，通过所有这些命名法定义的主题CDR和包含CDR的抗体各自明确地包括在本发明的范围内。更广泛地，术语“可变区CDR氨基酸残基”或更简单地“CDR”包括如使用如以上所陈述的基于任何序列或结构的方法所鉴定的CDR中的氨基酸。在本上下文中，关于图3A和3B中的示例性人源化抗体的Kabat CDR在所附序列表中提供为SEQ ID NO:405-470。
本发明的另一方面包含获得自或衍生自以下各项的位点特异性抗SEZ6抗体：SC17.1、SC17.2、SC17.3、SC17.4、SC17.8、SC17.9、SC17.10、SC17.11、SC17.14、SC17.15、SC17.16、SC17.17、SC17.18、SC17.19、SC17.22、SC17.24、SC17.27、SC17.28、SC17.29、SC17.30、SC17.32、SC17.34、SC17.35、SC17.36、SC17.38、SC17.39、SC17.40、SC17.41、SC17.42、SC17.45、SC17.46、SC17.47、SC17.49、SC17.50、SC17.53、SC17.54、SC17.56、SC17.57、SC17.59、SC17.61、SC17.63、SC17.71、SC17.72、SC17.74、SC17.76、SC17.77、SC17.79、SC17.81、SC17.82、SC17.84、SC17.85、SC17.87、SC17.89、SC17.90、SC17.91、SC17.93、SC17.95、SC17.97、SC17.99、SC17.102、SC17.114、SC17.115、SC17.120、SC17121、SC17.122、SC17.140、SC17.151、SC17.156、SC17.161、SC17.166、SC17.187、SC17.191、SC17.193、SC17.199以及SC17.200；或任何以上鉴定的抗体，或其嵌合或人源化形式。在其他实施例中，本发明的ADC将包含具有来自任何前述调节剂的一个或多个CDR，例如一个、二个、三个、四个、五个或六个CDR的SEZ6抗体。注释的序列表为每个上述抗SEZ6抗体提供重链可变区和轻链可变区的单独的SEQ ID NO。
2.位点特异性抗体
基于本披露，本领域技术人员可以容易地制造如在此所述的工程化构建体。如在此所使用，“工程化抗体”、“工程化构建体”或“位点特异性抗体”意指如下抗体或其免疫反应性片段，其中重链或轻链中的至少一个氨基酸被并入、缺失、改变或取代(优选被另一个氨基酸)以提供至少一个游离半胱氨酸。类似地，“工程化缀合物”或“位点特异性缀合物”应该保持意指包含工程化抗体和与未配对或游离半胱氨酸缀合的至少一种细胞毒素的抗体药物缀合物。如上所论述，由破坏天然二硫桥或由向氨基酸序列引入或添加半胱氨酸，并入、缺失、改变或变位可以产生游离半胱氨酸。因此，在某些实施例中，未配对半胱氨酸残基将包含未配对的链内残基。在其他优选实施例中，游离半胱氨酸残基将包含未配对的链间半胱氨酸残基。工程化抗体可以是不同同种型，例如IgG、IgE、IgA或IgD；并且在那些类别内，抗体可以是不同亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。关于这些IgG构建体，抗体的轻链可以包含κ或λ同种型，其各自并入C214，或如SEQ ID NO:550-564所陈述，CL结构域的另一个位置，在每个情形中，可能由于IgG1重链中缺少C220残基而未配对。
在所选实施例中，工程化抗体包含链内或链间半胱氨酸残基的至少一个氨基酸缺失或取代。如在此所使用的“链间半胱氨酸残基”意指参与抗体的轻链和重链之间或抗体的两个重链之间的天然二硫键的半胱氨酸残基，而链内半胱氨酸残基是在相同重链或轻链中与另一个半胱氨酸天然配对的。在一个实施例中，链间半胱氨酸残基的缺失或取代参与轻链和重链之间的二硫键的形成。在另一个实施例中，半胱氨酸残基的缺失或取代参与两个重链之间的二硫键。在典型的实施例中，由于抗体的互补结构，其中轻链与重链的VH和CH1结构域配对，并且其中一个重链的CH2和CH3结构域与互补重链的CH2和CH3结构域配对，轻链或重链中单个半胱氨酸的突变或缺失将导致工程化抗体中两个未配对半胱氨酸残基。
在一些实施例中，链间半胱氨酸残基缺失。在其他实施例中，链间半胱氨酸取代另一个氨基酸(例如，天然存在的氨基酸)。例如，氨基酸取代可导致链间半胱氨酸被中性(例如丝氨酸，苏氨酸或甘氨酸)或亲水性(例如甲硫氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸)残基替换。在一个特别优选的实施例中，链间半胱氨酸被丝氨酸替换。
在本发明涵盖的一些实施例中，半胱氨酸残基的缺失或取代在轻链(κ或λ)上，从而在重链上留下游离半胱氨酸(例如SEQ ID NO:404中的C220)。在其他实施例中，半胱氨酸残基的缺失或取代在重链上，在轻链恒定区上留下游离半胱氨酸(例如参见SEQ ID NO:403、504和550-564)。图1描绘了示例性IgG1/κ抗体中天然或天然存在的链间和链内二硫键(或桥)中涉及的半胱氨酸。如前所述在每个情形中，恒定区的氨基酸残基根据Kabat基于EU索引进行编号。如图9中的示例性实施例所示，完整抗体的轻链或重链中的单个半胱氨酸的缺失或取代导致具有两个未配对半胱氨酸残基的工程化抗体。
在特别优选的实施例中，IgG轻链(κ或λ)的第214位的半胱氨酸(C214)缺失或被取代。在另一个优选的实施例中，IgG重链上的位置220处的半胱氨酸(C220)缺失或被取代。在另外的实施例中，重链上位置226或位置229处的半胱氨酸缺失或被取代。在一个实施例中，重链上的C220被丝氨酸取代(C220S)，以在轻链中提供所希望的游离半胱氨酸。在另一个实施例中，轻链中的C214被丝氨酸取代(C214S)，以在重链中提供所希望的游离半胱氨酸。如实例6-8提供的这种位置工程化构建体分别如下，使用示例性抗DLL3抗体SC16.56显示在图5A和5B中，使用示例性抗SEZ6抗体SC17.200显示在图6A和6B中，并且关于示例性抗CD324抗体SC10.17显示在图7中。所附序列表(SEQ ID NO:537-542)中还提供了示例性抗SEZ6抗体SC17.17的另外的实例。
示例性构建体的总结紧接着显示在下表2中，其中所有编号均根据Kabat，并且WT代表“野生型”或无改变的天然恒定区序列。应当理解，表2所示的具体取代(例如，C220S)仅是说明性的，并且提供所希望的游离半胱氨酸的任何相容残基(例如，天然或非天然氨基酸)替代地可以被取代(例如，C220G或C220A)。注意，虽然许多参考序列通常衍生自κCL，但也可以如在此所陈述使用包含C214的示例性λ轻链来提供所希望的游离半胱氨酸。此外，如在此所使用的，德尔塔(Δ)应指定氨基酸残基的缺失(例如，C214Δ指示位置214的半胱氨酸已缺失)。
表2
如某些实施例中所陈述的，该游离半胱氨酸被引入或添加到包含该抗体重链或轻链的氨基酸序列中。在这些实施例中包括某些非半胱氨酸残基突变或被半胱氨酸取代以提供所希望的游离半胱氨酸的情况。在以下实例中所陈述的所选实施例中，游离半胱氨酸残基将并入抗体轻链恒定区的暴露环结构之一中。在这些实施例中，游离半胱氨酸残基将被定位(通过并入或取代)在残基121-128、残基182-191或残基201-213(Kabat编号)。在其他优选实施例中，游离半胱氨酸残基将包含(通过并入或取代)CL区的β片层上的暴露残基。在又其他实施例中，游离半胱氨酸残基将位于CH1结构域内。在再其他实施例中，游离半胱氨酸残基将位于CH2结构域中。在又其他实施例中，游离半胱氨酸残基将位于CH3结构域中。在再其他优选实施例中，任何一个或多个以下残基可以被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可能包含游离半胱氨酸的其他相容位置包括(根据EU编号)：41、88、116、120、171、282或375。重要的是强调，不管游离半胱氨酸的定位如何，每个包含引入或取代的半胱氨酸残基的这种构建体(包括上述每个构建体)可以如在此所陈述选择性缀合，并且明确地包括在本发明的范围内。
如在此所披露的，以所定义的位点和化学计量的药物荷载产生抗体-药物缀合物的策略广泛地适用于其他抗体，因为其主要涉及抗体的保守恒定结构域的工程化。由于抗体的每个类别和亚类的氨基酸序列和天然二硫键均已得到充分证明，本领域技术人员可以容易地制造不同抗体的工程化构建体，而无需过多的实验，因此，这些构建体被明确地涵盖在本发明的范围内。
3.抗体产生
a.多克隆抗体
在不同宿主动物(包括兔、小鼠、大鼠等)中多克隆抗体的产生是本领域中众所周知的。在一些实施例中，含有多克隆抗体的血清是通过对该动物进行抽血或将其处死来获得的。该血清可以呈从该动物获得的形式用于研究目的，或在替代方案中，这些抗体可以部分地或完全地纯化以提供免疫球蛋白部分或均匀抗体制剂。
简单地说，用一种免疫原(例如，可溶性DLL3或sDLL3)对所选动物进行免疫接种，该免疫原可以例如包含所选同工型、结构域和/或肽，或者表达DLL3或其免疫反应性片段的活细胞或细胞制剂。取决于接种的物种，可以用于增加免疫反应的本领域已知的佐剂包括但不限于，弗氏(Freund's)(完全和不完全)佐剂；矿物凝胶，如氢氧化铝；表面活性物质，如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇类、聚阴离子类、肽类、油乳液类、匙孔血蓝蛋白类、二硝基苯酚；及潜在地有用的人用佐剂，如BCG(卡介苗(bacille Calmette-Guerin))和短小棒杆菌。这些佐剂可以通过以一种局部沉积物隔绝抗原来保护其免于快速分散，或它们可以含有多种刺激宿主分泌因子的物质，这些因子是巨噬细胞和免疫系统的其他组分的趋化因子。优选地，免疫接种方案将涉及在一段预定的时间内，扩散开的所选免疫原的两次或更多次给予。
通过举例，可以对DLL3蛋白的氨基酸序列进行分析以选择DLL3蛋白的特定区域用于产生抗体。例如，使用DLL3氨基酸序列的疏水性和亲水性分析来鉴定该DLL3结构中的亲水性区域。DLL3蛋白中显示免疫原性结构的区域，以及其他区域和结构域，可以使用本领域中已知的不同其他方法，如周-法斯曼(Chou-Fasman)、加纳-罗伯森(Garnier-Robson)、凯特-多利特(Kyte-Doolittle)、艾森伯格(Eisenberg)、卡普拉斯-斯图尔兹(Karplus-Schultz)或詹姆森-沃尔夫(Jameson-Wolf)分析容易地鉴定。平均柔性轮廓可以使用BhaskaranR.,Ponnuswamy P.K.,1988,Int.J.Pept.ProteinRes.[国际肽研究杂志]32:242-255的方法产生。β-转角轮廓可以使用Deleage,G.,Roux B.,1987,ProteinEngineering[蛋白质工程]1:289-294的方法产生。因此，通过这些程序或方法鉴定的每一DLL3区域、结构域或基序都在本发明的范围内并且可以经过分离或工程化以提供免疫原，从而产生多种包含所希望的特性的调节剂。用于产生DLL3抗体的优选方法是借助于在此提供的实例进一步说明。用以制备用作免疫原的蛋白质或多肽的方法是本领域中众所周知的。本领域中也众所周知用于制备蛋白质与载体(如BSA、KLH或其他载体蛋白)的免疫原性缀合物的方法。在一些情况下，使用了使用例如碳化二亚胺试剂进行的定向缀合；在其他情况下，连接试剂是有效的。如本领域中所了解，DLL3免疫原的给予经常是通过在一段适合的时期内并且使用适合的佐剂进行注射来进行。在免疫接种方案中，抗体滴度可以如以下实例中所描述来取得以确定抗体形成的适合性。
b.单克隆抗体
此外，本发明还涵盖单克隆抗体的使用。如本领域中所知，术语“单克隆抗体”(或mAb)是指从基本均匀的抗体群获得的一种抗体，即，构成该群体的个别抗体除可能以微量存在的可能的突变(例如，天然存在的突变)外是一致的。在某些实施例中，此类单克隆抗体包括包含与抗原结合或缔合的多肽序列的一种抗体，其中该抗原结合多肽序列是通过一种方法获得的，该方法包括从多个多肽序列中选择单个靶结合多肽序列。
更总体而言，并且如在此的实例所陈述的，单克隆抗体可以使用本领域中已知的多种技术制备，包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物(例如，)或其中某一组合。举例来说，可以使用杂交瘤以及本领域认可的生物化学和遗传工程技术来产生单克隆抗体，如以下各项中更详细地描述：An,Zhigiang(编)Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic,John Wiley and Sons,1sted.[治疗性单克隆抗体：从工作台到诊所,约翰威立公司,第1版]2009；Shire等人(编)Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing,SpringerScience+Business Media LLC,1sted.[当前单克隆抗体开发和制造的趋势,施普林格科学+商业媒体公司,第1版]2010；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2nd ed.[抗体技术实验指南,冷泉港实验室出版社,第2版]1988；Hammerling等人:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)[单克隆抗体及T细胞杂交瘤563-681(纽约爱思唯尔,1981)]，这些文献各自通过引用以其全文结合于此。应当了解的是，所选结合序列可以进一步改变，例如以改善对于靶的亲和力，使靶结合序列人源化，改善它在细胞培养物中的产量，降低其体内免疫原性，产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的抗体。如以下实例中所陈述，提供了与本发明相容的鼠类单克隆抗体。
c.嵌合和人源化抗体
在另一个实施例中，本发明的抗体可以包含嵌合抗体，这些抗体衍生自来自至少两种不同物种或抗体类别的共价接合的蛋白质区段。术语“嵌合”抗体是针对这样的构建体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源，而这个或这些链的剩余部分与源自另一物种的或属于另一个抗体类别或亚类的抗体、以及这类抗体的片段中的相应序列一致或同源(U.S.P.N.4,816,567；Morrison等人,1984,PMID:6436822)。
在一个实施例中，嵌合抗体可以包含鼠类VH和VL氨基酸序列及衍生自人类来源的恒定区，例如如下述的人源化抗体。在一些实施例中，这些抗体可以是“CDR移植”的，其中该抗体包含来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的一个或多个CDR，而该(这些)抗体链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源。对于用于人类中，所选啮齿动物CDR(例如鼠CDR)可以移植到人类抗体中，替代该人类抗体的一个或多个天然存在的CDR。这些构建体一般具有以下益处：提供全强度的抗体功能(例如，补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))，同时减少了受试者对该抗体的不想要的免疫应答。
与该CDR移植的抗体类似的是“人源化”抗体。如在此所使用，非人类抗体(例如，鼠类)的“人源化”形式是包含了衍生自一种或多种非人类免疫球蛋白的氨基酸序列的嵌合抗体。在一个实施例中，人源化抗体是这样一种人类免疫球蛋白(接受者或受体抗体)，其中来自接受者的一个或多个CDR的残基经来自如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物等非人类物种(供体抗体)的一个或多个CDR的残基替代。在某些优选实施例中，该人类免疫球蛋白可变结构中的一个或多个FR中的残基被来自供体抗体的相应非人类残基替代，从而帮助维持移植的CDR的适当三维构型，并藉此改善亲和力。这可以被称为“回复突变”的引入。另外，人源化抗体可以包含在接受者抗体中或在供体抗体中未发现的残基，以例如进一步精制抗体性能。与本发明相容的人源化抗DLL3抗体在以下的实例3中提供，得到图2A和2B所示的人源化轻链和重链氨基酸序列。根据实例4提供人源化的抗SEZ6抗体，得到图3A和3B所示的人源化轻链和重链氨基酸序列，而按照实例5提供人源化抗CD324抗体，其具有图4所示的相应序列。图5A和5B、6A和6B及7分别显示了三种抗原的位点特异性示例性人源化抗体重链和轻链注释氨基酸序列。
可以使用不同来源来确定在人源化抗体中使用哪些人类序列。此类来源包括例如以下中所披露的人类种系序列：Tomlinson,I.A.等人(1992)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]227:776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today[今日免疫学]16:237-242；Chothia,D.等人(1992)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]227:799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBOJ[欧洲分子生物学学会杂志]14:4628-4638；V-BASE名录(VBASE2–瑞特(Retter)等人,Nucleic Acid Res.[核酸研究]33；671-674,2005)，其提供了人类免疫球蛋白可变区序列的一个全面名录(由Tomlinson,I.A.等人汇编,MRC Centre for ProteinEngineering,Cambridge,UK[MRC蛋白质工程中心,英国剑桥])；或例如在美国专利号6,300,064中所述的共有人类FR。
CDR移植和人源化抗体描述于例如U.S.P.N.6,180,370和5,693,762中。有关进一步细节，参见例如，Jones等人,1986,PMID:3713831)；及U.S.P.N.6,982,321和7,087,409。
另一种方法称为“人类工程化(humaneering)”，它描述于例如U.S.P.N.2005/0008625中。在另一个实施例中，非人类抗体可以通过WO 98/52976和WO 00/34317中所披露的方法特定地缺失人类T细胞表位或“去免疫”来进行修饰。
如以上在所选实施例中所论述的，人源化或CDR移植的抗体重链或轻链可变区氨基酸残基中至少60％、65％、70％、75％或80％将对应于接受者人类序列的那些。在其他实施例中，这些人源化抗体可变区残基中至少83％、85％、87％或90％将对应于接受者人类序列的那些。在另一个优选的实施例中，大于95％的每个人源化抗体可变区将对应于具有受体人类序列的那些。
人源化抗体可变区与人类受体可变区的序列一致性或同源性可以如先前论述的那样测定，并且如果这样测量，优选共享至少60％或65％的序列一致性，更优选至少70％、75％、80％、85％或90％的序列一致性，甚至更优选至少93％、95％、98％或99％的序列一致性。优选地，不一致的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是一个氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。总体而言，保守氨基酸取代不会实质上改变一种蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情形中，序列一致性百分比或相似性程度可以向上调整以校正该取代的保守性质。
d.人类抗体
在另一个实施例中，这些抗体可以包含完全人类抗体。术语“人类抗体”是指这样一种抗体，它具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的一个氨基酸序列和/或已经使用任何用于制备人类抗体的技术来产生。
人类抗体可以使用本领域中已知的不同技术产生。一项技术是噬菌体展示，其中在噬菌体上合成(优选地人类)抗体的文库，用所关注抗原或其抗体结合部分对该文库进行筛选，并且分离出结合该抗原的噬菌体，由此可以获得免疫反应性片段。用于制备并筛选这些文库的方法是本领域中众所周知的并且用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的(例如，法玛西亚重组噬菌体抗体系统(Pharmacia Recombinant Phage AntibodySystem)，目录号27-9400-01；及斯特塔杰(Stratagene)的SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。还存在其他方法和试剂可以用于产生并筛选抗体呈现文库(参见例如，U.S.P.N.5,223,409；PCT公开号WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；及Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:7978-7982(1991))。
在一个实施例中，可以通过对如以上制备的重组的组合抗体文库进行筛选来分离重组人类抗体。在一个实施例中，该文库是使用由从B细胞分离的mRNA制备的人类VL和VHcDNA产生的一种scFv噬菌体展示文库。
由天然文库(自然或合成的)产生的抗体可以具有适度亲和力(Ka为约106到107M-1)，但也可以如本领域中所描述，通过构建第二文库并从其中再选择，在体外模拟亲和力成熟。例如，可以在体外通过使用易错聚合酶随机引入突变(报导于梁(Leung)等人,Technique[技术],1:11-15(1989)中)。另外地，可以通过在所选个别Fv克隆中，例如使用以带有跨所关注CDR的随机序列的引物进行的PCR使一个或多个CDR随机突变，并针对更高亲和力的克隆进行筛选来进行亲和力成熟。WO 9607754描述了一种用于在免疫球蛋白轻链的CDR中诱导诱变以建立轻链基因文库的方法。另一种有效的方法是将通过噬菌体展示所选择的VH或VL结构域与自未免疫接种的供体获得的天然存在的V结构域变体谱系重组并在若干轮链重新改组中针对更高亲和力进行筛选，如Marks等人,Biotechnol.[生物技术],10:779-783(1992)中所描述。这一技术允许产生解离常数KD(koff/kon)为约10-9M或更低的抗体和抗体片段。
在其他实施例中，可以采用类似的程序，使用多个包含在表面上表达结合对的真核细胞(例如酵母)的文库。参见，例如U.S.P.N.7,700,302和U.S.S.N.12/404,059。在一个实施例中，人类抗体选自一个噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人类抗体(Vaughan等人,Nature Biotechnology[自然-生物技术]14:309-314(1996):Sheets等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]95:6157-6162(1998))。在其他实施例中，人类结合对可以从在如酵母等真核细胞中产生的组合抗体文库分离。参见，例如U.S.P.N.7,700,302。这些技术有利地允许进行大量候选调节剂的筛选并且提供对候选序列的相对容易的操作(例如，通过亲和力成熟或重组改组)。
还可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物中来制备人类抗体，这些转基因动物例如为已经使内源免疫球蛋白基因部分地或完全地失活并且引入了人类免疫球蛋白基因的小鼠。在激发之后，观察到人类抗体的产生，这在所有方面都紧密地类似于在人类中所见，包括基因重排、组装及抗体谱系。这一方法描述于例如U.S.P.N.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；及关于技术的U.S.P.N.6,075,181和6,150,584；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.[国际免疫学评述]13:65-93(1995)中。作为替代方案，可以经由产生针对靶抗原的抗体的人类B淋巴细胞(这些B淋巴细胞可以从罹患赘生性病症的个体回收或可以已经在体外进行免疫接种)进行永生化来制备人类抗体。参见，例如Cole等人,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy[单克隆抗体和癌症疗法],AlanR.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,J.Immunol[免疫学杂志],147(1):86-95(1991)；及U.S.P.N.5,750,373。
4.抗体的重组产生
可以使用从抗体产生细胞和重组技术获得的遗传物质来产生或修饰位点特异性抗体及其片段(参见例如Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology vol.152 Academic Press,Inc.,San Diego,CA[分子克隆技术指南,酶学方法第152卷,学术出版公司,圣地亚哥,加州]；Sambrook和Russell(编)(2000)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Ed.),NY,Cold Spring HarborLaboratory Press[分子克隆:实验室手册(第3版),纽约,冷泉港实验室出版社]；Ausubel等人(2002)Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods fromCurrent Protocols in Molecular Biology,Wiley,John and Sons,Inc.[精编分子生物学实验指南:当代分子生物学实验指南的方法概要,约翰威立公司](补充到2006)；和U.S.P.N.7,709,611)。
更具体地，本发明的另一方面涉及编码本发明的位点特异性抗体的工程化核酸分子。核酸可以存在于全细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本上纯的形式中。当通过标准技术(包括碱/SDS处理，CsCl条带，柱色谱，琼脂糖凝胶电泳和本领域众所周知的其他)从其他细胞成分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)纯化时，核酸是“分离的”或“呈现为基本上纯的”。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或可以不含有内含子序列。更总体而言，如在此所使用的术语“核酸”包括基因组DNA、cDNA、RNA及其人工变体(例如，肽核酸)，不管是单链还是双链的。在优选的实施例中，核酸是cDNA分子。
可以使用标准分子生物学技术获得和操纵本发明的核酸。对于杂交瘤表达的抗体(例如，由如以下进一步描述的携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA(例如，参见实例1)。对于从免疫球蛋白基因文库(例如使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可以从文库中回收编码抗体的核酸。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，编码VL或VH编码DNA片段可操作地连接到编码另一种蛋白质的另一个DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头。如本上下文中使用的术语“可操作地连接”旨在意指连接两个DNA片段，使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保留在框架内。
编码VH区的分离的DNA可通过将VH编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可操作地连接而转化为全长重链基因，该DNA分子可以或可以不被如在此描述的工程化。人类重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242[免疫感兴趣的蛋白质序列,第五版,美国卫生与公共服务部,NIH公开号91-3242])，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1或IgG4恒定区。如以下更详细地论述的，与此处传授内容相容的示例性IgG1恒定区在所附序列表中陈述为SEQ ID NO:404，相容工程化IgG1恒定区在SEQ IDNO:500和501中陈述。对于Fab片段重链基因，VH编码DNA可以可操作地连接到仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
通过将VL编码DNA与编码轻链恒定区(CL)的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242[免疫感兴趣的蛋白质序列,第五版,美国卫生与公共服务部,NIH公开号91-3242])，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选是κ恒定区。在这方面，示例性的相容的κ轻链恒定区在所附序列表中陈述为SEQ ID NO:403，而相容的λ轻链恒定区在SEQ ID NO:504中陈述。κ和λ轻链区域的相容工程化版本分别显示在SEQ ID NO:502、503和550-564与505、506中。
本发明还提供了包含可以可操作地连接到启动子的上述核酸(参见例如WO 86/05807；WO 89/01036；和U.S.P.N.5,122,464)和真核分泌途径的其他转录调节和加工控制元件的载体。本发明还提供了携带那些载体和宿主表达系统的宿主细胞。
如在此所使用，术语“宿主表达系统”包括可被工程化以产生本发明的核酸或多肽和抗体的任何种类的细胞系统。这种宿主表达系统包括但不限于用重组噬菌体DNA或质粒DNA转化或转染的微生物(例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)；用重组酵母表达载体转染的酵母(例如酵母属)；或具有重组表达构建体的哺乳动物细胞(例如，COS、CHO-S、HEK-293T、3T3细胞)，构建体含有来源于哺乳动物细胞或病毒基因组的启动子(例如，腺病毒晚期启动子)。宿主细胞可用两个表达载体共转染，例如编码重链衍生的多肽的第一载体和编码轻链衍生的多肽的第二载体。
转化哺乳动物细胞的方法是本领域中众所周知的。参见例如，U.S.P.N.4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455。宿主细胞也可以被工程化以允许产生具有不同特征的抗原结合分子(例如经修饰的糖形式或具有GnTIII活性的蛋白质)。
对于长期高产率产生重组蛋白来说，稳定表达是优选的。因此，稳定地表达所选抗体的细胞系可以使用标准的本领域认可的技术进行工程化，并形成本发明的一部分。除使用含有病毒复制起点的表达载体外，可以用通过适当表达控制元件(例如启动子或增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸位点等)和可选择标记物控制的DNA来转化宿主细胞。可以使用本领域中众所周知的任何选择系统，包括谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)，该系统提供了一种用于在某些条件下增强表达的有效方法。GS系统全部或部分与U.S.P.N.5,591,639和5,879,936联合论述。开发稳定细胞系的另一个优选的表达系统是FreedomTMCHO-SKit(生命技术公司(LifeTechnologies))。
一旦本发明的抗体通过重组表达或所任何其他披露技术产生，则可以通过本领域已知的方法纯化或分离，这意味着其被鉴定并从其天然环境中分离和/或回收并从来自会干扰抗体的缀合或者诊断或治疗用途的污染物分离。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。
可以使用不同的本领域认可的技术，例如离子交换和尺寸排阻色谱、透析、渗滤和亲和色谱，特别是蛋白A或蛋白G亲和色谱，来纯化这些分离的制剂。
5.抗体片段和衍生物
a.片段
无论选择何种形式的位点特异性抗体(例如，嵌合、人源化等形式)来实行本发明，应理解的是，其免疫反应性片段都可以根据在此的传授内容使用。“抗体片段”包含完整抗体的至少一部分。如在此所使用，术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段，并且术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体(包含至少一个游离半胱氨酸)中与所选抗原或其免疫原性决定簇免疫特异性结合或反应，或与衍生这些片段的完整抗体竞争特异性抗原结合的多肽片段。
示例性位点特异性片段包括：VL、VH、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体片段、微型双功能抗体、线性抗体、单链抗体分子及由抗体片段形成的多特异性抗体。此外，活性位点特异性片段包含该抗体中保持它与抗原/底物或受体相互作用的能力并且以类似于完整抗体的方式(不过可能具有略微降低的效率)对其进行修饰的一部分。
在其他实施例中，位点特异性抗体片段是包含Fc区并且保持当存在于完整抗体中时通常与Fc区相关的至少一种生物功能(如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能及补体结合)的抗体片段。在一个实施例中，位点特异性抗体片段是具有的体内半衰期实质上类似于完整抗体的一种单价抗体。例如，此类抗体片段可以包含一个连接到能够赋予该片段体内稳定性的Fc序列(包含至少一个游离半胱氨酸)的抗原结合臂。
如本领域的普通技术人员将充分认识到的，片段可以通过分子工程或经由化学或酶处理(如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)完整或完全抗体或抗体链，或者通过重组手段获得。有关抗体片段的更详细说明，参见例如，Fundamental Immunology[基础免疫学],W.E.Paul编,Raven Press,N.Y.[纽约瑞文出版社](1999)。
b.多价抗体
在一个实施例中，本发明的位点特异性缀合物可以是单价或多价(例如二价、三价等)的。如在此所使用，术语“价态”是指与一种抗体缔合的潜在靶结合位点的数目。每一靶结合位点特异性结合一个靶分子或在靶分子上的特定位置或基因座。当一种抗体是单价时，该分子的每个结合位点将特异性结合到单一抗原位置或表位。当一种抗体包含超过一个靶结合位点(多价)时，每个靶结合位点可以特异性结合相同或不同的分子(例如，可以结合到不同的配体或不同的抗原，或在同一抗原上的不同表位或位置)。参见例如，U.S.P.N.2009/0130105。在每一情形中，这些结合位点中至少一个将包含与一种DLL3同工型缔合的表位、基序或结构域。
在一个实施例中，这些调节剂是双特异性抗体，其中两条链具有不同的特异性，如Millstein等人,1983,Nature[自然],305:537-539中所描述。其他实施例包括具有另外的特异性的抗体，如三特异性抗体。其他更复杂的可相容多特异性构建体及其制造方法陈述于U.S.P.N.2009/0155255，以及WO 94/04690；Suresh等人,1986,Methods in Enzymology[酶学方法],121:210；及WO 96/27011中。
如以上暗指的，多价抗体可以免疫特异性结合到所希望的靶分子的不同表位或可以免疫特异性结合到靶分子以及异源表位，如异源多肽或固体支撑材料。尽管抗DLL3抗体的优选实施例仅结合两个抗原(即，双特异性抗体)，但本发明也涵盖具有另外的特异性的抗体，如三特异性抗体。双特异性抗体还包括交联或“异种缀合”抗体。举例来说，在该异种缀合物中的一种抗体可以偶合到抗生物素蛋白，另一种偶合到生物素。已经例如提出这些抗体使免疫系统细胞靶向不想要的细胞(U.S.P.N.4,676,980)，并且用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。异种缀合抗体可以使用任何常规的交联方法制备。适合的交联剂以及多种交联技术是本领域中众所周知的，并且披露于U.S.P.N.4,676,980中。
在又其他实施例中，使用本领域的普通技术人员众所周知的方法，将具有希望的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列(如包含铰链区、CH2和/或CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域)融合。
c.Fc区修饰
除对于以上陈述的所披露的位点特异性缀合物(包括产生游离半胱氨酸的那些)的可变区或结合区的不同修饰、取代、添加或缺失以外，本领域的普通技术人员应理解的是，所选本发明的实施例还可以包含恒定区(即，Fc区)的取代或修饰。更明确地说，预期本发明的位点特异性抗体可以尤其含有一个或多个另外的氨基酸残基取代、突变和/或修饰，它们产生一种具有优选的特征的化合物，这些特征包括但不限于：改变的药物动力学、增加的血清半衰期、增加的结合亲和力、降低的免疫原性、增加的产量、改变的与Fc受体(FcR)的Fc配体结合、增强或减弱的“ADCC”(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)或“CDC”(补体依赖性细胞毒性)活性、改变的糖基化和/或二硫键及修饰的结合特异性。就此而言，应理解的是，这些Fc变体可以有利地用于增强所披露的调节剂的有效抗赘生特性。
为此，本发明的某些实施例可以包含Fc区的取代或修饰(除了产生游离半胱氨酸所需的那些)，例如一个或多个氨基酸残基的添加、取代、突变和/或修饰，以产生一种具有增强的或优选的Fc效应功能的化合物。举例来说，涉及Fc结构域与Fc受体(例如，FcγRI、FcγRIIA和B、FcγRIII及FcRn)之间的相互作用的氨基酸残基的变化可以导致细胞毒性增加和/或药物动力学改变，如血清半衰期增加(参见例如，Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol[疫学年鉴]9:457-92(1991)；Capel等人Immunomethods[免疫方法]4:25-34(1994)；及deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.[实验与临床医学杂志]126:330-41(1995)，各自通过引用结合于此)。
在所选实施例中，具有增加的体内半衰期的抗体可以通过对鉴定为涉及Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基进行修饰(例如，取代、缺失或添加)来产生(参见例如，国际公开号WO 97/34631；WO 04/029207；U.S.P.N.6,737,056和U.S.P.N.2003/0190311)。就这些实施例来说，Fc变体可以在哺乳动物，优选人类中提供超过5天、超过10天、超过15天、优选超过20天、超过25天、超过30天、超过35天、超过40天、超过45天、超过2个月、超过3个月、超过4个月或超过5个月的半衰期。半衰期的增加引起更高的血清滴度，由此使抗体给予的频率降低和/或使有待给予的抗体的浓度降低。可以例如在表达人类FcRn的转基因小鼠或转染的人类细胞系中，或在给予了具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中，对人类FcRn高亲和力结合多肽在体内与人类FcRn的结合及血清半衰期进行检验。WO 2000/42072描述了与FcRn的结合改善或减少的抗体变体。也参见例如，Shields等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]9(2):6591-6604(2001)。
在其他实施例中，Fc改变可以引起ADCC或CDC活性的增强或减弱。如本领域中所知，CDC是指在补体存在下靶细胞的溶解，并且ADCC是指一种细胞毒性形式，其中结合到存在于某些细胞毒性细胞(例如，自然杀手细胞、中性粒细胞及巨噬细胞)上的FcR的分泌型Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合到带有抗原的靶细胞并且随后用细胞毒素杀灭靶细胞。在本发明的上下文中，提供了具有“改变的”FcR结合亲和力的抗体变体，如与亲本或未修饰抗体或与包含天然序列FcR的抗体相比较，它具有增强或减少的结合。呈现出减少的结合的这些变体可以具有极少或没有可感知的结合，例如与天然序列相比较，0-20％结合到FcR，例如，如通过本领域中众所周知的技术所测定。在其他实施例中，如与天然免疫球蛋白Fc结构域相比较，该变体将展现增强的结合。应理解的是，这些类型的Fc变体可以有利地用于增强所披露的抗体的有效抗赘生特性。在又其他实施例中，这些改变引起结合亲和力的增加、免疫原性的降低、产量增加、糖基化和/或二硫键(例如，对于缀合位点)改变、结合特异性修饰、胞噬作用增加，和/或细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)下调等。
d.改变的糖基化
再其他实施例包含一种或多种工程化糖型，例如，包含改变的糖基化模式或改变的共价附接到该蛋白质(例如，在Fc结构域中)的碳水化合物的组成的DLL3位点特异性抗体。参见例如Shields,R.L.等人(2002),J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:26733-26740。工程化糖型可以用于多种目的，包括但不限于，增强或减弱效应功能、增加调节剂对靶标的亲和力或促进调节剂的产生。在希望降低效应功能的某些实施例中，该分子可以工程化成表达一种去糖基化的形式。可以引起一个或多个可变区框架糖基化位点的消除以藉此消除该位点处的糖基化的取代是众所周知的(参见例如，U.S.P.N.5,714,350和6,350,861)。相反地，可以通过在一个或多个另外的糖基化位点中进行工程化来赋予含Fc分子增强的效应功能或改善的结合。
其他实施例包括一种具有改变的糖基化组成的Fc变体，如具有减少的岩藻糖基残基量的低岩藻糖基化抗体或具有增加的对分GlcNAc结构的抗体。已证明这些改变的糖基化模式可增加抗体的ADCC能力。工程化的糖型可以通过本领域的普通技术人员已知的任何方法产生，例如，通过使用工程化或变体表达株、通过与一种或多种酶(例如，N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTI11))共表达、通过在不同生物体或来自不同生物体的细胞系中表达一种包含Fc区的分子、或通过在表达了包含Fc区的分子之后对碳水化合物进行修饰(参见例如，WO2012/117002)。
e.另外的加工
这些位点特异性抗体或缀合物可以在产生期间或之后有差别地进行修饰，例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、以已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解裂解、连接到抗体分子或其他细胞配体等。众多化学修饰中的任一种可以通过已知技术进行，包括但不限于，通过溴化氰进行特异性化学裂解、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4、乙酰化、甲酰化、氧化、还原、在衣霉素存在下进行代谢合成等。
本发明还涵盖不同的翻译后修饰，包括例如N连接或O连接的碳水化合物链、N末端或C末端加工、化学部分附接到氨基酸主链、N连接或O连接的碳水化合物链的化学修饰，及由原核宿主细胞表达引起的N末端甲硫氨酸残基的添加或缺失。另外，这些修饰剂还可以用如酶标记、荧光标记、放射性同位素标记或亲和标记等可检测标记进行修饰，以允许该修饰剂的检测和分离。
6.位点特异性抗体特征
不管如何获得位点特异性缀合物或该位点特异性缀合物呈现何种以上提到的形式，所披露的抗体的不同实施例都可以展现某些特征。在所选实施例中，可以针对有利的特性，包括例如稳固生长、高抗体产量及如以下更详细地论述的所希望的位点特异性抗体特征，对抗体产生细胞(例如，杂交瘤或酵母集落)进行选择、克隆并且进一步筛选。在其他情形中，可以通过选择用于接种动物的特定抗原(例如，特定DLL3同工型)或靶抗原的免疫反应性片段来赋予或影响该抗体的特征。在再其他实施例中，所选抗体可以如以上所描述进行工程化以增强或精制免疫化学特征，如亲和力或药物动力学。
a.中和抗体
在某些实施例中，这些缀合物将包含“中和”抗体或者其衍生物或片段。也就是说，本发明可以包含多个抗体分子，这些抗体分子结合特定结构域、基序或表位并且能够使例如DLL3的生物活性阻断、降低或抑制。更总体而言，术语“中和抗体”是指与靶分子或配体结合或相互作用并且防止该靶分子与结合配偶体(如受体或底物)结合或缔合，藉此中断另外将由这些分子的相互作用引起的生物反应的一种抗体。
应理解的是，可以使用本领域中已知的竞争性结合检验来评估抗体或其免疫功能片段或衍生物的结合和特异性。就本发明来说，当如例如通过Notch受体活性或在体外竞争性结合检验中所测量，过量的抗体使结合到DLL3的结合配偶体的量减少至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多时，抗体或片段将被视作抑制或减少DLL3与结合配偶体或底物的结合。在针对例如DLL3的抗体的情形中，中和抗体或拮抗剂将优选使Notch受体活性变化至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多。应理解的是，这一修饰的活性可以使用本领域认可的技术直接地测量，或可以通过改变的活性的下游影响(例如，瘤发生、细胞存活或Notch反应性基因的活化或抑制)来测量。优选地，抗体中和DLL3活性的能力是通过抑制DLL3与Notch受体的结合或通过评估它减轻DLL3介导的Notch信号传导的阻遏的能力来评估。
b.内化抗体
有证据证明，许多可相容决定簇保持与肿瘤发生细胞表面的缔合，藉此允许所披露的位点特异性缀合物的定位和内化。在优选实施例中，这些调节剂将与在内化之后杀灭细胞的一种或多种药物缔合或缀合(通过工程化的一个或多个游离半胱氨酸位点)。在特别优选的实施例中，位点特异性缀合物将包含内化ADC。
如在此所使用，“内化”的调节剂是在结合到所缔合的抗原或受体之后被细胞吸收(以及任何有效载荷)的调节剂。如将理解的，在所选实施例中，内化抗体可以包含抗体片段及其衍生物，以及包含约2的DAR的抗体缀合物。内化可以在体外或体内发生。对于治疗应用，内化将优选在有需要的受试者中在体内发生。内化的位点特异性抗体缀合物的数量可以足以或适于杀灭抗原表达细胞，尤其是抗原表达癌症干细胞。取决于有效载荷或位点特异性抗体缀合物(作为整体)的效力，在一些情况下，将单个工程化抗体分子吸收到细胞中足以杀灭该抗体所结合的靶细胞。例如，某些药物高度有效以致缀合到抗体的数分子毒素的内化就足以杀灭肿瘤细胞。抗体在结合到哺乳动物细胞之后是否内化可以通过不同的领域认可检验来测定，包括Fab-Zap和Mab-Zab检验(高级靶向系统公司(Advanced TargetingSystems)，Kit-48)。检测一种抗体是否内化到细胞中的方法也描述于U.S.P.N.7,619,068中，该案通过引用以其全文结合于此。
c.耗竭抗体
在其他实施例中，这些位点特异性缀合物将包含耗竭抗体或其衍生物或片段。术语“耗竭”抗体是指优选地与在细胞表面之上或附近的抗原结合或缔合并且诱导、促进或引起该细胞的死亡或消除(例如，通过CDC、ADCC或引入细胞毒性剂)的一种抗体。在优选实施例中，所选耗竭抗体将与一种药物缔合或缀合。
优选地，耗竭抗体将能够使预定的细胞群中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％或99％的DLL3表达细胞去除、失能、消除或杀灭。在一些实施例中，该细胞群可以包含富集、分割、纯化或分离的肿瘤保持细胞。在其他实施例中，该细胞群可以包含完整肿瘤样品或异种肿瘤提取物，它们包含癌症干细胞。本领域的普通技术人员应理解，可以使用标准生物化学技术，根据在此的传授内容对肿瘤发生细胞或肿瘤保持细胞的耗竭进行监测并定量。
d.分仓和表位定位
还应理解的是，所披露的位点特异性抗体缀合物将与由所选靶或其片段呈现的离散的表位或免疫原性决定簇缔合或结合。在某些实施例中，表位或免疫原性决定簇包括化学活性表面分子群，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施例中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。因此，如在此所使用，术语“表位”包括能够特异性结合到免疫球蛋白或T细胞受体，或以其他方式与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。在某些实施例中，当一种抗体优先地识别它在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原时，认为它与抗原特异性结合(或免疫特异性结合或反应)。在优选实施例中，当平衡解离常数(KD)小于或等于10-6M或更低，或等于10-7M时，更优选地当平衡解离常数小于或等于10- 8M，并且甚至更优选地当解离常数小于或等于10-9M时，认为抗体特异性结合抗原。
更直接地，术语“表位”是以其常用的生物化学含义使用并且是指靶抗原的能够被特定抗体调节剂识别并特异性结合的部分。当该抗原为一种多肽(如DLL3)时，表位一般可以由通过蛋白质的三级折叠而并置的连续氨基酸和不连续氨基酸形成(“构象表位”)。在此类构象表位中，相互作用的点横过蛋白质上彼此线性地分开的氨基酸残基发生。由连续氨基酸形成的表位(有时称为“线性”或“连续”表位)在蛋白质变性之后典型地保留，而通过三级折叠形成的表位在蛋白质变性之后典型地丧失。在任何情形中，抗体表位典型地在独特的空间构象中包括至少3个并且更通常，至少5个或8-10个氨基酸。
就这一点来说，应理解的是，在某些实施例中，表位可以与例如DLL3蛋白的一个或多个区域、结构域或基序缔合或驻留在该一个或多个区域、结构域或基序中。如在此更详细地论述的，DLL3蛋白的细胞外区域包含一系列一般认可的结构域，包含六个EGF样结构域和DSL结构域。出于本披露的目的，术语“结构域”将根据它一般认可的意义使用并且将被视作是指在蛋白质内展现显著的二级结构含量的一种可鉴定或可确定的保守结构实体。在许多情形中，具有共同功能的同源结构域通常将显示出序列相似性并且在许多全异的蛋白质中发现(例如，EGF样结构域被报导在至少471种不同蛋白质中发现)。类似地，本领域认可的术语“基序”将根据其常用的意义使用并且一般应当指蛋白质中典型地十到二十个连续氨基酸残基的一个短的保守区域。如通篇所论述，所选实施例包含与DLL3特定区域、结构域或基序内的一个表位缔合或结合的位点特异性抗体。
如PCT/US 14/17810中更详细论述的，由示例性位点特异性抗体缀合物结合的人类DLL3的特别优选表位紧接着如下表3所陈述。
表3
抗体克隆 表位 SEQ ID NO:
SC16.23 Q93，P94，G95，A96，P97 3
SC16.34 G203，R205，P206 4
SC16.56 G203，R205，P206 4
遵循相似的推理思路，针对所选择的抗体测定SEZ6抗原表位。在这方面，并且如关于其结合于此的PCT/US 2013/027476中所陈述的，本发明的位点特异性抗SEZ6缀合物可以包含特异性结合到SEZ6蛋白上的表位的抗体，其中该表位包含选自下组的氨基酸残基，该组由以下各项组成：(i)残基R762、L764、Q777、I779、D781和Q782；(ii)残基R342和K389以及(iii)残基T352、S353和H375。
在任何情形中，一旦在抗原上确定了所希望的表位，就有可能例如通过使用本发明中所描述的技术，用包含该表位的肽进行免疫接种来产生针对该表位的抗体。作为替代方案，在该发现过程期间，抗体的产生和表征可以阐明有关位于特定结构域或基序中的所希望的表位的信息。从这一信息，然后有可能针对结合到同一表位竞争性筛选抗体。实现这一点的一种方法是进行进行竞争研究以发现彼此竞争性结合的抗体，即，竞争与该抗原的结合的抗体。基于交叉竞争对于抗体进行分仓的高通量方法描述于WO 03/48731中。本领域熟知分仓或结构域水平或表位定位的其他方法，包含抗体竞争或在酵母上进行抗原片段表达。
如在此所使用，术语“分仓”是指基于抗原结合特征和竞争而对于抗体进行分组或分类而使用的方法。尽管这些传授内容可用于对本发明的调节剂进行定义并分类，但这些结合不总是与表位直接地相关并且表位结合的这些初始确定可以通过如在此所描述的其他本领域认可的方法进一步精制并确定。然而，应理解，将抗体调节剂凭经验分配到个别分仓提供了可以指示所披露的调节剂的治疗潜力的信息。
更具体地说，可以通过使用本领域中已知并且在此的实例中所陈述的方法确定所选参考抗体(或其片段)是否与第二测试抗体(即，在同一分仓中)结合相同的表位或交叉竞争结合。在一个实施例中，参考抗体调节剂在饱和条件下与DLL3抗原缔合，并且然后，使用标准免疫化学技术测定第二或测试抗体调节剂结合到DLL3的能力。如果该测试抗体能够与参考抗DLL3抗体同时实质上结合到DLL3，那么该第二或测试抗体结合到与一次或参考抗体不同的表位。然而，如果该测试抗体不能够同时实质上结合到DLL3，那么该测试抗体结合到相同表位、重叠表位或与一次抗体所结合的表位紧密邻近(至少在空间上)的表位。也就是说，该测试抗体竞争抗原结合并且与参考抗体处于相同分仓中。
当用于所披露的抗体的上下文中时，术语“竞争”或“竞争抗体”意指如通过一种检验所测定的抗体之间的竞争，在该检验中，测试抗体或免疫功能片段在测试时阻止或抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合。典型地，此类检验涉及使用结合到固体表面或带有未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白这些中的任一种的细胞的纯化抗原(例如，DLL3或其结构域或片段)。竞争性抑制是通过在测试免疫球蛋白存在下，测定结合到固体表面或细胞的标记的量来测量。通常，该测试免疫球蛋白是以过量存在和/或允许首先结合。通过竞争检验(竞争抗体)鉴定的抗体包括结合到与参考抗体相同的表位的抗体及结合到与参考抗体所结合的表位足够地邻近以致发生空间位阻的相邻表位的抗体。有关用于测定竞争性结合的方法的其他细节提供于在此的实例中。通常，当竞争抗体过量存在时，它将使参考抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些情况下，结合被抑制至少80％、85％、90％、95％或97％，或更多。
相反地，当参考抗体结合时，它将优选地使随后添加的测试抗体(即，DLL3调节剂)的结合抑制至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些情况下，测试抗体的结合被抑制至少80％、85％、90％、95％或97％，或更多。
就本发明来说并且如结合于此的PCT/US 14/17810中关于抗DLL3抗体分仓所陈述，已经确定(经由表面等离子共振或生物层干涉法)的是，DLL3的细胞外结构域通过竞争性结合确定至少九个分仓，在此称为“分仓A”到“分仓I”。已知通过调节剂分仓技术所提供的解决方案，相信这九个分仓包含存在于DLL3蛋白的细胞外区域中的大多数分仓。
就这一点来说，并且如本领域中已知，所希望的分仓或竞争性结合数据可以使用固相直接或间接放射性免疫检验(RIA)、固相直接或间接酶免疫检验(EIA或ELISA)、夹心竞争检验、BiacoreTM2000系统(即，表面等离子共振-GE医疗集团(GE Healthcare))、分析仪(即，生物层干涉法-福特生物有限公司(ForteBio,Inc.))或流式细胞法获得。如在此所使用，术语“表面等离子共振”是指一种光学现象，它允许通过检测生物传感器矩阵内蛋白质浓度的改变来分析实时特异性相互作用。术语“生物层干涉法”是指分析从以下两个表面反射的白光的干涉图案的一种光学分析技术：生物传感器尖端上固定的蛋白质层和内部参考层。结合到生物传感器尖端的分子数量的任何改变都引起可以实时测量的干涉图案的转变。在特别优选的实施例中，该分析(无论是表面等离子共振、生物层干涉法还是流式细胞术)是使用Biacore或ForteBio仪器或流式细胞仪(例如，FACSAria II)进行的，如本领域已知的。
为了进一步表征所披露的DLL3抗体修饰剂所缔合或结合的表位，使用Cochran等人(J Immunol Methods.[免疫方法杂志]287(1-2):147-158(2004)，通过引用结合于此)所描述的方案的修饰方案来进行结构域水平的表位定位。简单地说，在酵母表面上对包含特定氨基酸序列的DLL3的个别结构域进行表达并且通过流式细胞术测定每一DLL3抗体的结合。
其他可相容的表位定位技术包括丙氨酸扫描突变体、肽印迹(Reineke(2004)Methods Mol Biol[分子生物学方法]248:443-63)(通过引用以其全文特定地结合于此)或肽裂解分析。此外，可以采用如表位切除、表位提取及抗原的化学修饰等方法(Tomer(2000)Protein Science[蛋白质科学]9:487-496)(通过引用以其全文特定地结合于此)。在其他实施例中，修饰辅助的谱分析(MAP)，又称为基于抗原结构的抗体谱分析(ASAP)提供了这样一种方法，该方法根据每一抗体与化学或酶促修饰的抗原表面的结合谱的相似性对针对相同抗原的大量单克隆抗体(mAb)进行分类(U.S.P.N.2004/0101920，通过引用以其全文特定地结合于此)。每一类别可以反映与另一类别所代表的表位明显不同或部分地重叠的独特表位。这一技术允许对遗传上一致的抗体进行快速过滤，由此表征可以集中在遗传上相异的抗体。应理解的是，可以使用MAP将本发明的hDLL3抗体调节剂分选到结合不同表位的抗体组中。
可用于改变固定的抗原的结构的试剂包括多种酶，如蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Asp-N、胰凝乳蛋白酶等)。可用于改变固定的抗原的结构的试剂还可以是化学试剂，如琥珀酰亚胺基酯及其衍生物、含伯胺化合物、肼及碳酰肼、游离氨基酸等。
抗原蛋白可以固定在生物传感器芯片表面或聚苯乙烯珠粒上。后者可以用例如一种检验(如多重LUMINEXTM检测检验(路明克斯公司(Luminex Corp.))进行加工。由于LUMINEX能够以多达100种不同类型的珠粒处理多重分析，故LUMINEX提供了几乎无限的具有不同修饰的抗原表面，使得经生物传感器检验进行抗体表位谱分析的解决方案得以改善。
e.结合亲和力
除表位特异性外，所披露的位点特异性抗体可以使用如例如结合亲和力等物理特征来表征。就此而言，本发明另外涵盖了对一种或多种决定簇同工型具有高结合亲和力或在全抗体情形中对于决定簇家族的超过一个成员具有高结合亲和力的抗体的使用。如在此所使用，针对IgG抗体的术语“高亲和力”是指针对靶标具有10-8M或更小、更优选地10-9M或更小或者甚至更优选地10-10M或更小的KD的抗体抗原。然而，“高亲和力”结合对于其他抗体同种型可以变化。例如，针对IgM同种型的“高亲和性”结合是指具有10-7M或更小、更优选地10-8M或更小、甚至更优选地10-9M或更小的KD的抗体抗原。
如在此所使用，术语“KD”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。当解离常数KD(koff/kon)≤10-7M时，本发明的抗体被认为免疫特异性地结合其靶抗原。当KD≤5 x 10-9M时，该抗体以高亲和力特异性地结合抗原，并且当KD≤5 x 10-10M时以极高亲和力特异性地结合抗原。在本发明的一个实施例中，该抗体具有≤10-9M的KD及约1 x 10-4/sec的解离速率。在本发明的一个实施例中，解离速率<1 x 10-5/sec。在本发明的其他实施例中，这些抗体将以介于约10-7M与10-10M之间的KD结合到DLL3，并且在又另一实施例中，它将以KD≤2 x10-10M结合。本发明的再其他所选实施例包含具有的解离常数或KD(koff/kon)小于10-2M、小于5 x 10-2M、小于10-3M、小于5 x 10-3M、小于10-4M、小于5 x 10-4M、小于10-5M、小于5 x 10-5M、小于10-6M、小于5 x 10-6M、小于10-7M、小于5 x 10-7M、小于10-8M、小于5 x 10-8M、小于10-9M、小于5 x 10-9M、小于10-10M、小于5 x 10-10M、小于10-11M、小于5 x 10-11M、小于10-12M、小于5x 10-12M、小于10-13M、小于5 x 10-13M、小于10-14M、小于5 x 10-14M、小于10-15M或小于5 x10-15M的抗体。
在具体实施例中，免疫特异性地结合到DLL3的本发明抗体具有的缔合速率常数或kon(或ka)速率((Ab)+抗原(Ag)k on←Ab-Ag)为至少105M-ls-l、至少2 x 105M-ls-l、至少5 x105M-ls-l、至少106M-ls-l、至少5 x 106M-ls-l、至少107M-ls-l、至少5 x 107M-ls-l或至少108M-ls-l。
在另一个实施例中，免疫特异性地结合到DLL3的本发明抗体具有的解离速率常数或koff(或kd)速率((Ab)+抗原(Ag)k off←Ab-Ag)小于10-1s-1、小于5 x 10-1s-1、小于10-2s-1、小于5 x 10-2s-1、小于10-3s-1、小于5 x 10-3s-1、小于10-4s-1、小于5 x 10-4s-1、小于10-5s-1、小于5 x 10-5s-1、小于10-6s-1、小于5 x 10-6s-1、小于10-7s-1、小于5 x 10-7s-1、小于10-8s-1、小于5 x 10-8s-1、小于10-9s-1、小于5 x 10-9s-1或小于10-10s-1。
在本发明的其他所选实施例中，抗体具有的亲和力常数或Ka(kon/koff)将为至少102M-1、至少5 x 102M-1、至少103M-1、至少5 x 103M-1、至少104M-1、至少5 x 104M-1、至少105M-1、至少5 x 105M-1、至少106M-1、至少5 x 106M-1、至少107M-1、至少5 x 107M-1、至少108M-1、至少5 x 108M-1、至少109M-1、至少5 x 109M-1、至少1010M-1、至少5 x 1010M-1、至少1011M-1、至少5x 1011M-1、至少1012M-1、至少5 x 1012M-1、至少1013M-1、至少5 x 1013M-1、至少1014M-1、至少5 x1014M-1、至少1015M-1或至少5 x 1015M-1。
除以上提到的调节剂特征外，本发明的抗体可以使用包括例如热稳定性(即，熔融温度；Tm)和等电点在内的另外的物理特征进一步表征。(参见例如，Bjellqvist等人,1993,Electrophoresis[电泳]14:1023；Vermeer等人,2000,Biophys.J.[生物物理学杂志]78:394-404；Vermeer等人,2000,Biophys.J.[生物物理学杂志]79:2150-2154，各自通过引用结合于此)。
IV.位点特异性缀合物
本发明的位点特异性缀合物可以用于向靶位置(例如肿瘤发生细胞)递送细胞毒素或其他有效载荷。如在此所使用的，术语“药物”或“弹头”可以互换使用，并且将意指如下所述的生物上有活性或可检测的分子或药物，包括抗癌剂。“有效载荷”可以包含与任选的接头化合物组合的药物或“弹头”。缀合物上的“弹头”可以包含肽、蛋白质或在体内代谢为活性剂的前药、聚合物、核酸分子、小分子、结合剂、模拟剂、合成药物、无机分子、有机分子及放射性同位素。在有利的实施例中，所披露的ADC将在释放和激活弹头之前将结合的有效载荷以相对不反应的无毒状态引导到靶位点。弹头的靶向释放优选通过有效载荷和ADC制剂的相对均匀的组合物的稳定缀合(例如通过工程化抗体上的一个或多个半胱氨酸)来实现，其使经缀合的毒性物质最少化。与药物相偶联，一旦接头被设计为在已经递送到肿瘤部位时大大释放弹头，则本发明的缀合物可以显著减少不希望的非特异性毒性。这有利地在肿瘤部位提供相对高水平的活性细胞毒素，同时使非靶向细胞和组织的暴露最小化，从而当与常规药物缀合物相比时提供增强的治疗指数。
就此而言，术语“工程化缀合物”或“位点特异性缀合物”或简称“缀合物”将被广义地使用，并且保持意指包含通过一个或多个游离半胱氨酸与所披露的靶向部分相缔合的生物学上有活性或可检测分子或药物的任何位点特异性构建体。因此，应当理解，虽然本发明的一些实施例包含并入治疗部分(例如细胞毒素)的有效载荷，但是并入诊断剂和生物相容性修饰剂的有效载荷可从所披露的缀合物提供的靶向释放中受益。因此，针对示例性治疗有效载荷的任何披露也适用于包含如在此所论述的诊断剂或生物相容性修饰物的有效载荷，除非上下文另有规定。所选有效载荷可以与该抗体共价或非共价连接，并且至少部分取决于用于实现该缀合的方法而展现不同的化学计量的摩尔比率。
基本上可以使用本领域认可的技术与常规抗体中的半胱氨酸残基连接的任何有效载荷可以使用此处披露的新技术与本发明的工程化构建体的游离半胱氨酸相缔合。
更具体地，一旦本发明披露的位点特异性抗体已经根据此处的传授内容产生和/或制造和选择，则它们可以与如下所述一个或多个药物活性或诊断部分或生物相容性修饰剂连接、融合、缀合或以其他方式相缔合。就此而言，应当理解，除非上下文另有规定，本发明的位点特异性缀合物可以由下式表示：
Ab-[L-D]n或其药学上可接受的盐，其中
a)Ab包括含一个或多个未配对半胱氨酸残基的抗体，其中该一个或多个未配对半胱氨酸残基不包含形成天然链间二硫键的半胱氨酸；
b)L包括任选的接头；
c)D包括药物；并且
d)n是从约1到约12的整数。
本领域技术人员将理解，根据上述公式的位点特异性缀合物可以使用许多不同的接头和药物制造，并且制造或缀合方法将根据组分的选择而变化。因此，与位点特异性抗体的一个或多个反应性半胱氨酸上的硫醇反应的任何药物或药物接头化合物与此处的传授内容相容。类似地，允许所选择的药物与工程化抗体的位点特异性缀合的任何反应条件都在本发明的范围内。尽管如此，本发明的特别优选实施例包含使用稳定剂与如在此所述和以下实例中所陈述的温和还原剂组合的药物或药物接头的选择性缀合。这种反应条件倾向于提供更均匀的制剂，其具有较少的非特异性缀合和污染物以及相应较少的毒性。
与此处传授内容相容的示例性有效载荷如下所示:
1.治疗剂
如所指示的，本发明的位点特异性抗体可以与作为治疗部分的药学活性部分或药物缀合、连接或融合或以其他方式缔合，药物如抗癌剂，包括但不限于细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化学治疗剂、放射性治疗剂、靶向性抗癌剂、生物反应修饰剂、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、抗转移剂和免疫治疗剂。
示例性抗癌剂(包括同系物及其衍生物)包含1-脱氢睾酮、安曲霉素、放线菌素D、博来霉素、卡奇霉素、秋水仙素、环磷酰胺、细胞松弛素B、更生霉素(以前称为放线菌素)、二羟基炭疽菌、二酮、多卡米新、埃米汀、表柔比星、溴化乙锭、依托泊苷、糖皮质激素、短杆菌肽D、利多卡因、美登木素生物碱如DM-1和DM-4(免疫原)、光辉霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、紫杉醇、普罗卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、替尼膦苷、丁卡因及以上任一项的药学上可接受的盐或溶剂合物、酸或衍生物。
其他的可相容细胞毒素包含多拉司他汀和奥立抑素(auristatin)，包括单甲基奥立抑素E(MMAE)和单甲基奥立抑素F(MMAF)(赛特基因公司(Seattle Genetics))；鹅膏菌素，如α-鹅膏菌素、β-鹅膏菌素、γ-鹅膏菌素或ε-鹅膏菌素(海德伯格制药公司(Heidelberg Pharma))；DNA小沟结合剂，如倍癌霉素衍生物(信达加公司(Syntarga))；烷化剂，如经修饰的或二聚吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C以及顺二氯二氨合铂(II)(DDP)顺铂)；剪接抑制剂，如米亚霉素(meayamycin)类似物或衍生物(例如FR901464，如U.S.P.N.7,825,267中所陈述)；小管结合剂，如埃博霉素类似物和微管蛋白抑制剂(tubulysin)；紫杉醇；及DNA损伤剂，如卡奇霉素和埃斯波霉素；抗代谢物，如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷及5-氟尿嘧啶氨烯咪胺；抗有丝分裂剂，如长春花碱和长春新碱；以及蒽环类，如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星；以及以上任一项的药学上可接受的盐或溶剂化物、酸或衍生物。
在一个实施例中，本发明的抗体可以与抗CD3结合分子缔合以募集细胞毒性T细胞并且使其靶向肿瘤发生细胞(百特技术公司(BiTE technology)；参见例如，Fuhrmann等人(2010)Annual Meeting of AACR Abstract No.5625[美国癌症研究学会年会摘要,第5625期])。
在另外的实施例中，本发明的工程化缀合物可以包含使用合适的接头缀合的治疗性放射性同位素。可以与这些实施例可相容的示例性放射性同位素包括但不限于，碘(131I、125I、123I、121I,)、碳(14C)、铜(62Cu、64Cu、67Cu)、硫(35S)、镭(223Ra)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、l11In,)、铋(212Bi、213Bi)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、89Zr、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、117Sn、225Ac、76Br以及211At。其他放射性核素也可用作诊断和治疗剂，尤其是在60到4,000keV能量范围内的那些。
在某些实施例中，本发明的ADC可包含PBD及其药学上可接受的盐或溶剂合物、酸或衍生物，作为弹头。PBD是烷化剂，烷化剂通过共价结合到小沟中的DNA并抑制核酸合成来发挥抗肿瘤活性。已经显示PBD具有有效的抗肿瘤特性，同时展现出最少的骨髓抑制。与本发明可相容的PBD可以使用若干类型接头(例如包含一个顺丁烯二酰亚胺基部分并带有一个游离硫氢基的肽基接头)连接到抗体，并且在某些实施例中呈二聚物形式(即，PBD二聚物)。可以缀合到所披露的抗体的可相容的PBD(和任选的接头)描述于例如U.S.P.N.6,362,331、7,049,311、7,189,710、7,429,658、7,407,951、7,741,319、7,557,099、8,034,808、8,163,736、2011/0256157以及PCT文件WO 2011/130613、WO 2011/128650、WO 2011/130616、WO 2014/057073和WO 2014/057074。
在其他所选实施例中，本发明的位点特异性ADC将缀合至细胞毒性苯并二氮杂卓衍生物弹头。可以与披露的抗体缀合的相容性苯并二氮杂卓衍生物(和任选的接头)描述于例如U.S.P.N.8,426,402和PCT申请WO 2012/128868和WO 2014/031566中。与上述PBD一样，相容性苯并二氮杂卓衍生物被认为在DNA的小沟中结合并抑制核酸合成。据报道，这些化合物具有有效的抗肿瘤特性，并且因此特别适用于本发明的ADC。
除了上述试剂之外，本发明的抗体还可以与生物反应修饰剂缀合。例如，在一些实施例中，药物部分可以是具有所希望的生物活性的多肽。这些蛋白质可以包括例如一种毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒素A、豹蛙酶(或另一种细胞毒性RNA酶)、绿脓杆菌外毒素、霍乱毒素、白喉毒素；一种凋亡剂，如肿瘤坏死因子(例如TNF-α或TNF-β)、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤溶酶原活化物、AIM I(WO 97/33899)、AIM II(WO 97/34911)、Fas配体(Takahashi等人,1994,PMID:7826947)及VEGI(WO 99/23105))、血栓剂、抗血管生成剂(例如，血管抑素或内皮抑素)、淋巴因子(例如，白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或生长因子(例如，生长激素(GH))。
2.诊断剂或检测剂
在其他优选实施例中，将本发明的位点特异性抗体，或其片段或衍生物缀合到一种诊断或可检测试剂、标记物或报告子，它可以例如为一种生物分子(例如肽或核苷酸)、小分子、荧光团或放射性同位素。标记的抗体可以用于监测过度增殖性病症的发生或发展，或作为一种临床测试程序的一部分，以确定一种包括所披露的抗体的特定疗法(即，治疗诊断剂)的功效或确定治疗的未来过程。这些标记物或报告子也可以用于纯化所选抗体、用于抗体分析学(例如表位结合或抗体分仓)、分开或分离肿瘤发生细胞，或用于临床前程序或毒理学研究中。
此类诊断和/或检测可以通过将调节剂与可检测物质偶合实现，这些可检测物质包括但不限于，不同酶，包含例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，如但不限于，抗生蛋白链菌素生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，如但不限于，伞酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料，如但不限于，鲁米诺；生物发光材料，如但不限于，荧光素酶、虫荧光素及水母发光蛋白；放射性材料，如但不限于，碘(131I、125I、123I、121I,)、碳(14C)、sulfur(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、111In,)和锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、molybdenum(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、89Zr、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn以及117Tin；以及使用不同正电子发射断层扫描的正电子发射金属、非放射性顺磁性金属离子，及放射性标记或缀合到特定放射性同位素的分子。在这些实施例中，适当的检测方法是本领域中众所周知的并且是容易地从众多商业来源可获得的。
如以上所指示，在其他实施例中，可以将位点特异性抗体或其片段与标记物序列或化合物(如肽或荧光团)融合或缀合以促进纯化或诊断或分析程序，如免疫组织化学、生物层干涉法、表面等离子共振、流式细胞术、竞争性ELISA、FAC等。在优选实施例中，该标记物包含一种his标签，如由pQE载体(凯杰公司(Qiagen))等提供的那些，其中有许多是可商购的。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于，血球凝集素“HA”标签，该标签对应于衍生自流感血球凝集素蛋白的表位(Wilson等人,1984,Cell[细胞]37:767)；及“flag”标签(U.S.P.N.4,703,004)。
3.生物可相容修饰剂
在所选实施例中，必要时，本发明的工程化抗体可以与生物可相容修饰剂缀合，这些修饰剂可以用于调整、改变、改善或缓和抗体特征。例如，可以通过附接相对较高分子量的聚合物分子(如可商购的聚乙二醇(PEG)或类似的生物可相容聚合物)来产生具有增加的体内半衰期的抗体或融合构建体。本领域的普通技术人员应理解，获得的PEG可以呈许多不同的分子量和分子构象，这些可以经过选择以赋予该抗体特定特性(例如，可以定制半衰期)。PEG可以在存在或不存在多官能接头情况下，通过PEG与所述抗体或抗体片段的N末端或C末端位点特异性缀合或经由赖氨酸残基上存在的ε-氨基附接到抗体或抗体片段或衍生物。可以使用使生物活性的损失最少的线性或分支聚合物衍生化。缀合程度可以通过SDS-PAGE和质谱法密切监测以确保PEG分子与抗体的最佳缀合。可以通过例如尺寸排除或离子交换色谱来从抗体PEG缀合物中分离未反应的PEG。以一种类似的方式，可以将所披露的抗体缀合到白蛋白，以便使该抗体或抗体片段在体内更稳定或具有更长的体内半衰期。这些技术是本领域中众所周知的，参见例如，WO 93/15199、WO 93/15200及WO 01/77137；及EP 0413,622。其他生物可相容缀合物对于普通技术人员是显而易见的并且可以容易地根据在此的传授内容鉴定。
4.接头化合物
与上述有效载荷一样，许多接头化合物与本发明相容并且可以成功地与此处的传授内容组合使用以提供所披露的位点特异性缀合物。在广义上，接头仅需要与游离半胱氨酸提供的反应性硫醇和选择的药物化合物共价结合。然而，在其他实施例中，相容性接头可以在包括任何取代基的任何可接近的位置共价结合所选择的药物。因此，与工程化抗体的一个或多个游离半胱氨酸反应并可用于提供本发明相对稳定的位点特异性缀合物的任何接头与此处的传授内容相容。
关于有效结合选择性地还原的游离半胱氨酸，许多本领域认可的化合物利用了硫醇的良好亲核性，并且因此可用作相容性接头的部分。游离半胱氨酸缀合反应包括但不限于硫醇-马来酰亚胺、硫醇-卤代(酰卤)、硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-乙烯基砜、硫醇-双砜、硫醇-硫代磺酸酯、硫醇-吡啶基二硫化物和硫醇-对氟反应。如在此进一步论述并在以下实例中所示，硫醇-马来酰亚胺生物缀合是最广泛使用的方法之一，归因于其快速反应速率和温和的缀合条件。该方法的一个问题是反-迈克尔反应和来自抗体或其他靶蛋白的马来酰亚胺连接的有效载荷损失或转移到等离子体中的其他蛋白质(例如人类血清白蛋白)的可能性。然而，使用如在此所陈述的选择性还原和位点特异性抗体可用于稳定缀合物并减少这种不希望的转移。硫醇-酰卤反应提供了不能进行反-迈克尔反应并因此更稳定的生物缀合物。然而，与基于马来酰亚胺的缀合相比，硫醇-卤化物反应通常具有较慢的反应速率，并且因此效率不高。硫醇-吡啶基二硫化物反应是另一种流行的生物缀合途径。吡啶基二硫化物与游离硫醇进行快速交换，得到混合二硫化物和吡啶-2-硫酮的释放。混合二硫化物可以在释放有效载荷的还原性细胞环境中被裂解。在生物缀合中获得更多关注的其他方法是硫醇-乙烯基砜和硫醇-双砜反应，其中每一种都与此处的传授内容相容并且明确地包括在本发明的范围内。
关于相容性接头，并入所披露的ADC中的化合物优选是细胞外稳定的，防止ADC分子的聚集并保持ADC在水性介质中和单体状态下易于溶解。在运输或传递到细胞中之前，抗体-药物缀合物优选地为可溶的并且保持完整，即，该抗体保持连接到药物部分。虽然这些接头在靶细胞外是稳定的，它们被设计成在细胞内部以某一有效速率裂解或降解。因此，一种有效的接头将：(i)维持该抗体的特异性结合特性；(ii)允许该缀合物或药物部分的细胞内传递；(iii)保持稳定和完整(即，未裂解或降解)，直到该缀合物已经被传递或运输到其靶位点；并且(iv)维持药物部分的细胞毒性、杀细胞作用或细胞生长抑制作用。如所附实例中更详细地论述，ADC的稳定性可以通过标准分析技术，如质谱法、疏水作用色谱(HIC)、HPLC及分离/分析技术LC/MS来测量。如上所陈述，抗体与药物部分的共价附接需要该接头具有两个反应性官能团，即，在反应性的意义上为二价的。可用于附接两个或更多个功能性或生物活性部分(如MMAE和位点特异性抗体)的二价接头试剂是已知的，并且提供其所得缀合物的方法已经加以描述。
与本发明相容的接头可以广泛地分类为可裂解和不可裂解的接头。可裂解的接头(可以包括酸不稳定接头、蛋白酶可裂解接头和二硫化物接头)利用靶细胞的内化和内体-溶酶体途径的裂解。细胞毒素的释放和活化依赖于促进酸不稳定化学键(如腙或肟)裂解的内体/溶酶体酸性区室。如果将溶酶体特异性蛋白酶裂解位点工程化成接头，则细胞毒素将在其细胞内靶标附近释放。可替代地，含有混合二硫化物的接头提供了细胞毒性有效载荷在细胞内释放的方法，因为它们在细胞的还原环境(而不是血流中的富氧环境)中被选择性地裂解。相比之下，含有酰胺连接的聚乙二醇或烷基间隔物的相容性不可裂解的接头在靶细胞内的抗体药物缀合物的溶酶体降解期间释放有毒的有效载荷。在某些方面，接头的选择将取决于在位点特异性缀合物中使用的具体药物。
因此，本发明的某些实施例包含通过裂解剂可裂解的一种接头，该接头存在于细胞内环境中(例如，在溶酶体或核内体或细胞凹陷内)。该接头可以例如为一种肽基接头，它被细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于，溶酶体或核内体蛋白酶)裂解。在一些实施例中，该肽基接头为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。裂解剂可以包括组织蛋白酶B和D及纤溶酶，已知它们各自水解二肽药物衍生物，引起靶细胞内部活性药物的释放。通过硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B可裂解的示例性肽基接头是包含Phe-Leu的肽，因为已经发现组织蛋白酶-B在癌组织中高度表达。此类接头的其他实例描述于例如关于此类接头通过引用结合于此的U.S.P.N.6,214,345。在一个特别优选的实施例，由细胞内蛋白酶可裂解的肽基接头为Val-Cit接头、Val-Ala接头或Phe-Lys接头，如U.S.P.N.6,214,345中所描述。使用该治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一个优势是当缀合时典型地衰减，并且该缀合物的血清稳定性典型地高。
在其他实施例中，可裂解接头是pH敏感性的，即，对在某些pH值下水解敏感。典型地，该pH敏感性接头在酸性条件下可水解。例如，可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定性接头(例如，腙、肟、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺-乌头酰胺、原酸酯、乙缩醛、缩酮等)(参见例如，5,122,368；5,824,805；5,622,929)。这些接头在中性pH条件(如在血液中的那些)下相对稳定，但在低于pH5.5或5.0(近似为溶酶体的pH值)下不稳定。
在又其他实施例中，该接头在还原条件下为可裂解的(例如，二硫化物接头)。本领域中已知多种二硫化物接头，包括例如，可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)及SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)形成的那些。在又其他特定实施例中，该接头是一种丙二酸酯接头(Johnson等人,1995,Anticancer Res.[抗癌研究]15:1387-93)、顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基接头(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.[生物有机化学与医药化学]3(10):1299-1304)，或3'-N-酰胺类似物(Lau等人,1995,Bioorg-Med-Chem.[生物有机化学与医药化学]3(10):1305-12)。
在特别优选的实施例中(陈述于U.S.P.N.2011/0256157中，关于这些接头结合于此)，可相容肽基接头将包含：
其中星号指示与该药物的连接点，CBA是位点特异性抗体，L1是一种接头，A是一种将L1连接到该位点特异性抗体上的未配对半胱氨酸的连接基团，L2是一个共价键或连同-OC(＝O)-一起形成一种自分解型接头，并且L1或L2是一种可裂解接头。
L1优选为该可裂解接头，并且可以被视为用于活化该接头以进行裂解的引发剂。
当存在时，L1和L2的性质可以变化极大。这些基团是基于其裂解特征选择，这些特征可以通过传递该缀合物的位点处的条件规定。在酶作用下裂解的那些接头是优选的，不过也可以使用通过pH值(例如，酸或碱不稳定的)、温度改变或在照射时(例如，光不稳定的)而可裂解的接头。在还原或氧化条件下可裂解的接头也可以用于本发明中。
L1可以包含一个连续的氨基酸序列。该氨基酸序列可以是酶裂解的靶底物，藉此允许该药物释放。
在一个实施例中，L1是通过酶作用可裂解的。在一个实施例中，该酶是一种酯酶或一种肽酶。
在一个实施例中，L1包含一种二肽。该二肽可以表示为-NH-X1-X2-CO-，其中-NH-和-CO-对应地表示氨基酸基团X1和X2的N末端和C末端。该二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸的任何组合。在该接头为一种组织蛋白酶不稳定性接头的情况下，该二肽可以为组织蛋白酶介导的裂解的作用位点。
另外地，对于具有羧基或氨基侧链官能团的那些氨基酸，对应地例如Glu和Lys，CO和NH可以表示该侧链的官能团。
在一个实施例中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-、-Val-Cit-、-Phe-Cit-、-Leu-Cit-、-Ile-Cit-、-Phe-Arg-及-Trp-Cit-，其中Cit为瓜氨酸。
优选地，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-及-Val-Cit-。
最优选地，二肽NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-为-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
在一个实施例中，L2是存在的并且连同-C(＝O)O-形成一种自分解型接头。在一个实施例中，L2为酶活性的一种底物，藉此允许该药物释放。
在一个实施例中，在L1在酶作用下可裂解并且L2存在的情况下，该酶将L1与L2之间的键裂解。
L1和L2，当存在时，可以通过选自以下各项的键连接：
-C(＝O)NH-、-C(＝O)O-、-NHC(＝O)-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-及-NHC(＝O)NH-。
L1中连接到L1的氨基可以是氨基酸的N末端，或可以衍生自氨基酸侧链的氨基，例如赖氨酸氨基酸侧链。
L1中连接到L2的羧基可以是氨基酸的C末端，或可以衍生自氨基酸侧链的羧基，例如谷氨酸氨基酸侧链。
L1中连接到L2的羟基可以衍生自氨基酸侧链的羟基，例如丝氨酸氨基酸侧链。
术语“氨基酸侧链”包括见于以下各项中的那些基团：(i)天然存在的氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸及缬氨酸；(ii)微量氨基酸，如鸟氨酸和瓜氨酸；(iii)非天然氨基酸、β-氨基酸、天然氨基酸的合成类似物和衍生物；及(iv)其所有对映异构体、非对映异构体、富集异构体、同位素标记(例如，2H、3H、14C、15N)、被保护形式及外消旋混合物。
在一个实施例中，-C(＝O)O-和L2一起形成以下基团：
其中星号指示与药物或细胞毒性剂位置的附接点，波浪线指示与接头L1的附接点，Y为-N(H)-、-O-、-C(＝O)N(H)-或-C(＝O)O-，并且n为0到3。亚苯基环任选地被一个、两个或三个如在此所描述的取代基取代。在一个实施例中，该亚苯基任选地被卤代、NO2、R或OR取代。
在一个实施例中，Y是NH。
在一个实施例中，n是0或1。优选地，n为0。
在Y为NH并且n为0时，自分解型接头可以称为对氨基苯甲基羰基接头(PABC)。
在另一个特别优选实施例中，该接头可包括自分解型接头且二肽一起形成基团-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，该基团图解于下：
其中星号指示与所选细胞毒性部分的附接点，并且波浪线指示与可缀合到该抗体的接头(例如间隔基-抗体结合区段)的其余部分的附接点。在酶促裂解该二肽之后，当远端位点活化时，该自分解型接头将允许完全释放被保护的化合物(即，细胞毒素)，沿以下所示的线进行：
其中L*是包含现在裂解的肽基单元的连接子的其余部分的活化形式。药物的完全释放确保它们将保持所希望的毒性活性。
在一个实施例中，A是一个共价键。因此，L1与细胞结合剂直接地连接。例如，在L1包含连续氨基酸序列的情况下，该序列的N末端可以直接地连接到游离半胱氨酸。
在另一个实施例中，A是间隔基。因此，L1与细胞结合剂间接地连接。
L1与A可以通过选自以下各项的键连接：
-C(＝O)NH-、-C(＝O)O-、-NHC(＝O)-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-及-NHC(＝O)NH-。
如将在以下更详细论述并在以下实例10-13中陈述的，本发明的药物接头将与游离半胱氨酸上的活性硫醇亲核试剂连接。为此，游离半胱氨酸位点特异性抗体可以通过用不同还原剂如DTT或TCEP或如在此所陈述的温和还原剂进行处理而与接头试剂缀合反应。
优选地，该接头含有一个亲电子官能团以与该调节剂上的亲核官能团反应。在抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；及(iv)糖羟基或氨基，其中该抗体为糖基化的。胺、硫醇及羟基是亲核性的并且能够与连接子部分和连接子试剂上的亲电子基团反应形成共价键，这些连接子部分和连接子试剂包括：(i)顺丁烯二酰亚胺基；(ii)活化的二硫化物；(iii)活性酯，如NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯、HOBt(N-羟基苯并三唑)酯、卤代甲酸酯及酸卤化物；(iv)烷基和苯甲基卤化物，如卤代乙酰胺；及(v)醛、酮、羧基，并且其中有一些举例说明如下：
在特别优选的实施例中，位点特异性抗体和药物-接头部分之间的连接是通过工程化抗体的游离半胱氨酸的硫醇残基和存在于接头上的末端马来酰亚胺基团进行。在这些实施例中，细胞结合剂和药物-接头之间的连接如下：
其中星号指示与药物-接头的其余部分的附接点，并且波浪线指示与工程化抗体的其余部分的附接点。在该实施例中，S原子优选衍生自游离半胱氨酸抗体。关于其他相容性接头，结合部分包含可与活化的硫醇反应以提供所希望的位点特异性缀合物的末端碘乙酰胺。该接头的优选缀合程序与其他实施例中所发现的和以下实例中所陈述的包含选择性还原的马来酰亚胺结合基团的优选缀合程序略有不同。在任何情况下，鉴于本披露内容，本领域技术人员可以容易地将所披露的每一药物-接头化合物与相容性位点特异性抗体缀合。
5.缀合
如上所论述，由本发明提供的缀合物制剂展现增强的稳定性和基本均匀性，至少部分地归因于提供一个或多个工程化游离半胱氨酸位点和/或在此所陈述的新型缀合程序。不同于完全或部分地还原每个链内或链间抗体二硫键以提供缀合位点的常规缀合方法，本发明有利地提供某些制备的游离半胱氨酸位点的选择性还原和药物-接头向着此的引导。由工程化位点促进的缀合特异性和伴随的选择性还原允许在所希望的位置的高百分比的定点缀合。值得注意的是，这些缀合位点中的一些(例如存在于轻链恒定区的末端区域中的那些)典型难以在与其他游离半胱氨酸交叉反应时有效缀合。然而，通过分子工程和选择性还原所得的游离半胱氨酸，可以获得有效的缀合速率，其显著减少不想要的高DAR污染物和非特异性毒性。更总体而言，工程化构建体和披露的包含选择性还原的新型缀合方法显然提供了具有改善的药代动力学和/或药效动力学和潜在地改善的治疗指数的ADC制剂。
在这方面，位点特异性构建体存在一个或多个游离半胱氨酸，其在还原时包含亲核的且能够反应与接头部分(例如上文所披露的那些)上的亲电子基团形成共价键的硫醇基团。本发明优选的抗体将具有可还原的未配对的链间或链内半胱氨酸，即提供这种亲核基团的半胱氨酸。在其他优选的实施例中，未配对或游离的半胱氨酸将由引入或添加到抗体重链或轻链中的半胱氨酸残基提供。因此，在某些优选实施例中，还原的游离半胱氨酸的游离巯基与所披露的药物-接头的末端马来酰亚胺基或卤代乙酰胺基团的反应将提供所希望的缀合。在这个情形中并且如以下实例10和11所陈述，抗体的游离半胱氨酸可以通过用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或(三(2-羧乙基)膦(TCEP)进行处理而与接头试剂缀合反应。因此，每个游离半胱氨酸因此将在理论上呈现活性硫醇亲核试剂。虽然这些试剂是相容的，但是应当理解，可以使用本领域技术人员已知的不同反应、条件和试剂来实现位点特异性抗体的缀合。
相反，本发明人已经发现，可以选择性地还原工程化抗体的游离半胱氨酸以提供增强的定点缀合和不想要的潜在毒性污染物的减少。更具体地，已经发现“稳定剂”如精氨酸可以调节蛋白质中分子内和分子间相互作用，并且可以与选择的还原剂(优选相对温和的)联合使用来选择性地还原游离半胱氨酸并促进如此处所陈述的位点特异性缀合。如在此所使用，术语“选择性还原”或“选择性地还原”可以互换使用，并且意指还原一个或多个游离半胱氨酸，而基本上不破坏工程化抗体中存在的天然二硫键。在所选实施例中，这可以由某些还原剂实现。在其他优选实施例中，工程化构建体的选择性还原将包含与还原剂(包括温和还原剂)组合使用稳定剂。应当理解，术语“选择性缀合”意指已经选择性地还原的工程化抗体与在此所述的细胞毒素的缀合。在这方面并且如实例12-13所证明的，这种稳定剂与还原剂的组合使用可以显著改善位点特异性缀合的效率，如通过抗体重链和轻链上缀合的程度和该制剂的DAR分布测定的。
虽然不希望受任何特定理论的束缚，但是这种稳定剂可以调节静电微环境和/或调节所希望的缀合位点处的构象变化，从而允许相对温和的还原剂(其不会实质上还原完整的天然二硫键)以促进所希望的游离半胱氨酸位点处的缀合。已知此类试剂(例如某些氨基酸)形成盐桥(通过氢键和静电相互作用)，并且可以此方式调节蛋白质-蛋白质的相互作用，以赋予稳定效果，这可能导致有利的构象变化和/或可能减少不利的蛋白质-蛋白质相互作用。此外，这些试剂可以抑制还原后不希望的分子内(和分子间)半胱氨酸键的形成，从而促进所希望的缀合反应，其中工程化位点特异性半胱氨酸与药物结合(优选经由接头)。由于反应条件不能显著还原完整的天然二硫键，所以缀合反应自然地被驱动到游离半胱氨酸上的相对较少的反应性硫醇(例如，优选2个游离硫醇)。如这里所暗指的，这显著地降低了如在此所陈述制造的缀合物制剂中非特异性缀合和相应杂质的水平。
在所选实施例中，与本发明相容的稳定剂通常将包含具有至少一个具有碱性pKa的胺部分的化合物。在某些实施例中，胺部分将包含伯胺，而在其他优选实施例中，胺部分将包含仲胺。在再其他优选实施例中，胺部分将包含叔胺。在其他所选实施例中，胺部分将包含氨基酸，而在其他相容的实施例中，胺部分将包含氨基酸侧链。在又其他实施例中，胺部分将包含蛋白质氨基酸。在再其他实施例中，胺部分包含非蛋白质的氨基酸。在特别优选的实施例中，相容性稳定剂可以包含精氨酸、赖氨酸、脯氨酸和半胱氨酸。此外，相容性稳定剂可以包括胍和具有碱性pKa的含氮杂环。
在某些实施例中，相容性稳定剂包含具有至少一个pKa大于约7.5的胺部分的化合物，在其他实施例中，主题胺部分将具有大于约8.0的pKa，在又其他实施例中，胺部分将具有大于约8.5的pKa，并且在再其他实施例中，稳定剂将包含具有大于约9.0的pKa的胺部分。其他优选的实施例将包含稳定剂，其中胺部分将具有大于约9.5的pKa，而某些其他实施例将包含展现至少一个pKa大于约10.0的胺部分的稳定剂。在再其他优选实施例中，稳定剂将包含具有pKa大于约10.5的胺部分的化合物，在其他实施例中，稳定剂将包含具有pKa大于约11.0的胺部分的化合物，而在再其他实施例中，稳定剂将包含pKa大于约11.5的胺部分。在又其他实施例中，稳定剂将包含具有pKa大于约12.0的胺部分的化合物，而在再其他实施例中，稳定剂将包含pKa大于约12.5的胺部分。本领域技术人员将理解，可以使用标准技术容易地计算或确定相关的pKa，并用于确定使用所选化合物作为稳定剂的适用性。
显示在与某些还原剂组合时，所披露的稳定剂在靶向缀合到游离位点特异性半胱氨酸上是特别有效的。为了本发明的目的，相容性还原剂可以包括任何化合物，其产生用于缀合的还原的游离位点特异性半胱氨酸，而不显著地破坏工程化抗体天然二硫键。在由选择的稳定剂和还原剂的组合提供的这种条件下，活化的药物接头在很大程度上限于结合所希望的游离位点特异性半胱氨酸位点。特别优选以相对低浓度使用的相对温和的还原剂以提供温和的条件。如在此所使用，术语“温和还原剂”或“温和还原条件”应保持为意指在一个或多个游离半胱氨酸位点提供硫醇而基本上不破坏工程化抗体中存在的天然二硫键的还原剂(任选在稳定剂存在下)引起的任何试剂或状态。也就是说，温和还原剂或条件能够有效还原游离半胱氨酸(提供硫醇)，而不会显著破坏蛋白质的天然二硫键。所希望的还原条件可以由许多基于巯基的化合物提供，这些化合物建立了用于选择性缀合的适当环境。在优选的实施例中，温和还原剂可以包含具有一个或多个游离硫醇的化合物，而在特别优选的实施例中，温和还原剂将包含具有单个游离硫醇的化合物。与本发明相容的还原剂的非限制性实例包含谷胱甘肽、正乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、2-氨基乙烷-1-硫醇和2-羟基乙烷-1-硫醇。
应当理解，上面陈述的选择性还原方法在与游离半胱氨酸的靶向缀合上特别有效。在这方面，可以通过不同的本领域接受的技术来确定缀合到位点特异性抗体中的希望靶位点的程度(在此定义为“缀合效率”)。可以通过评估在靶缀合位点(在本发明中为轻链的c末端上的游离半胱氨酸)上相对于所有含油缀合位点的缀合百分比，来确定药物与抗体的位点特异性缀合的效率。在某些实施例中，此处的方法提供了将药物有效地缀合到包含游离半胱氨酸的抗体。在一些实施例中，缀合效率是至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高，如通过靶缀合相对于所有其他缀合位点的百分比所测量的。
还应当理解，能够缀合的工程化抗体可以含有游离的半胱氨酸残基，其含有当产生或储存该抗体时被封闭或封端的巯基基团。这些封端包括蛋白质、肽、离子和与巯基基团相互作用并防止或抑制缀合物形成的其他材料，在一些情形中，未缀合的工程化抗体可以包含在相同或不同抗体上结合其他游离半胱氨酸的游离半胱氨酸。如实例所论述，这种交叉反应性在制造程序中可导致不同污染物。在一些实施例中，工程化抗体可能在缀合反应之前需要脱封端。在具体实施例中，此处的抗体是未封端的并显示能够缀合的游离巯基基团，在具体实施例中，此处的抗体经受不干扰天然存在的二硫键或使其重排的脱封端反应，应当理解，在大多数情形中在正常还原反应(还原或选择性还原)期间将发生脱封端反应。
6.DAR分布和纯化
本发明的优点之一是产生包含严密剪裁的DAR分布的相对均匀的缀合物制剂的能力。就此而言，所披露的构建体和/或选择性缀合以药物和工程化抗体之间的化学计量比提供样品内的ADC物质的均匀性。如上所简单论述，术语“药物与抗体比”或“DAR”是指药物与位点特异性抗体的摩尔比。在一些实施例中，缀合物制剂相对于其DAR分布基本上可以是均匀的，这意味着在该制剂内是具有相对于荷载位点(即游离半胱氨酸)也一致的特定DAR(例如，2或4的DAR)的位点特异性ADC的主要种类。在本发明的某些实施例中，可以通过使用位点特异性抗体或选择性组合来实现所希望的均匀性。在其他优选实施例中，可以通过使用与选择性还原组合的位点特异性构建体来实现希望的均匀性。在又其他特别优选的实施例中，可以使用分析或制备色谱技术进一步纯化制剂。在这些实施例的每一个中，可以使用本领域已知的不同技术来分析ADC样品的均匀性，包括但不限于SDS-PAGE、HPLC(例如尺寸排阻HPLC、RP-HPLC、HIC-HPLC等)或毛细管电泳。
关于ADC制剂的纯化，应当理解，可以使用标准药物制备方法来获得所希望的纯度。如以下实例中所证明的，液相色谱法如反相(RP)和疏水相互作用色谱(HIC)可以通过药物荷载值分离混合物中的化合物。在某些情形中，混合模式色谱(MMC)也可用于分离具有特定载药量的物质。更总体而言，一旦去除了不溶性污染物，就可以使用标准技术，如例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析及亲和色谱法对该调节剂制剂进行进一步纯化，其中亲和色谱法特别值得关注。就此而言，蛋白A可用于纯化基于人类IgG1、IgG2或IgG4重链的抗体，而蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人类IgG3。取决于有待回收的抗体或缀合物，也可使用其他用于蛋白质纯化的技术，如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、在二氧化硅上进行色谱法、在肝素上进行的色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行的琼脂糖凝胶色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE及硫酸铵沉淀。
就此而言，所披露的位点特异性缀合物及其制备物可以包含不同化学计量摩尔比的药物和抗体部分，这取决于工程化构建体的构型，并且至少部分地基于用于实现缀合的方法。取决于多少和哪些链间和链内二硫键被破坏，理论药物荷载可能相对较高，但归因于聚集体和其他污染物，实际的限制如游离半胱氨酸交叉反应性将限制包含这种DAR的均匀制剂的产生。也就是说，较高的药物荷载，例如>6，可能导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶性、毒性或丧失细胞通透性。鉴于这些问题，本发明提供的实际药物荷载范围可以是每个工程化缀合物1至12个药物，即其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个药物共价连接到每一位点特异性抗体(例如，对于IgG1，其他抗体可能具有取决于二硫键数量的不同荷载能力)。所选实施例将包含其中1、2、3、4、5、6、7或8个药物共价连接到每一位点特异性抗体的工程化缀合物。更优选地，本发明的组合物的DAR将为约2、4或6，并且在特别优选的实施例中，DAR将包含约2。
尽管本发明提供相对高水平的均匀性，所披露的组合物实际上包含与一系列药物化合物(1至8，在IgG1的情形中)的混合工程化缀合物。因此，所披露的ADC组合物包括缀合物的混合物，其中大部分构成抗体与一个或多个药物部分共价连接，并且(尽管具有选择性还原的缀合特异性)，其中药物部分可以通过不同硫醇基团附接到抗体上。也就是说，在缀合之后，本发明的ADC组合物将包含不同浓度的与不同载药量的缀合物(例如，每一IgG1抗体1至8个药物)的混合物(连同主要由游离半胱氨酸交叉反应性引起的某些反应污染物)。使用选择性还原和制造后纯化，缀合组合物可以被驱动到其中它们大部分含有单个主要的希望的ADC种类(例如，2的药物荷载)和相对低水平的其他ADC种类(例如，1、4、6等的药物荷载)的位置。平均DAR值表示关于组合物作为整体(即，所有ADC种类一起)的药物荷载的加权平均值。由于所采用的量化方法的固有不确定性和在商业环境中完全去除非主要的ADC种类的难度，可接受的DAR值或规格通常表示为平均值、范围或分布(即，2+/-0.5的平均DAR)。优选地，在药物环境中使用包含在该范围(即1.5至2.5)内的测量平均DAR的组合物。
因此，在某些优选实施例中，本发明将包含平均DAR为1、2、3、4、5、6、7或8+/-0.5的组合物。在其他优选实施例中，本发明将包含2、4、6或8+/-0.5的平均DAR。最后，在所选优选实施例中，本发明将包含2+/-0.5的平均DAR。应当理解，在某些优选实施例中，范围或偏差可以小于0.4。因此，在其他实施例中，这些组合物将包含1、2、3、4、5、6、7或8各自+/-0.3的平均DAR，2、4、6或8+/-0.3的平均DAR，甚至更优选2或4+/-0.3的平均DAR，或甚至2+/-0.3的平均DAR。在其他实施例中，IgG1缀合物组合物优选包含1、2、3、4、5、6、7或8各自+/-0.4的平均DAR和相对较低水平(即，小于30％)的非主要的ADC种类。在其他优选实施例中，ADC组合物将包含2、4、6或8各自+/-0.4的平均DAR与相对较低水平(<30％)的非主要的ADC种类。在特别优选实施例中，ADC组合物将包含2+/-0.4的平均DAR与相对较低水平(<30％)的非主要的ADC种类。在又其他实施例中，当针对其他DAR种类测量时，主要的ADC种类(例如，2的DAR)将以大于70％的浓度、大于75％的浓度、大于80％的浓度、大于85％的浓度、大于90％的浓度、大于93％的浓度、大于95％的浓度或甚至大于97％的浓度存在。
在再其他实施例中，本发明的工程化缀合物组合物将包含在1至12范围内的DAR。这些实施例可以包含具有在1至3范围内的平均DAR，在2至4范围内的平均DAR，在3至5范围内的平均DAR，在4至6范围内的平均DAR，在5到7范围内的平均DAR，在6到8范围内的平均DAR，在7到9范围内的平均DAR，在8到10范围内的平均DAR，在9至11范围内的平均DAR，或在10至12范围内的平均DAR的组合物。优选地，组合物将具有在1至3范围内的平均DAR或在3至5范围内的平均DAR。
如以下实例中详述的，可以通过常规手段如UV-Vis分光光度法、反相HPLC、HIC、质谱、ELISA和电泳，来表征来自缀合反应的ADC的制剂中的药物/抗体分布。也可以确定依据药物/抗体的ADC定量分布。通过ELISA，可以确定ADC的特定制剂中药物/抗体的平均值。然而，通过抗体-抗原结合和ELISA检测限制不能辨别药物/抗体分布。此外，用于检测抗体-药物缀合物的ELISA测定不能确定药物部分附接到抗体的位置，例如重链或轻链片段或特定氨基酸残基残基。
V.药物制剂和治疗应用
1.配制物和给药途径
取决于位点特异性缀合物的形式、预定的传递模式、所治疗或监测的疾病及众多其他变量，必要时，可以使用本领域认可的技术对本发明的组合物进行配制。在一些实施例中，本发明的治疗组合物可以纯形式或与极少量另外的组分一起给与，而其他可以任选地配制成含有适合的药学上可接受的载体，这些载体包含本领域众所周知的赋形剂和佐剂(参见例如，Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacy with Factsand Comparisons:Drugfacts Plus,20th ed.[雷氏制药科学与实践及药物事实与比较：药物事实,第20版](2003)；Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,7th ed.,Lippencott Williams and Wilkins[药物剂型与药物传递系统,第7版,利平科特威廉姆斯与威尔金斯](2004)；Kibbe等人,Handbook of PharmaceuticalExcipients,3rd ed.,Pharmaceutical Press[药物赋形剂手册,第3版,医药出版社](2000))。不同的药学上可接受的载体，包括媒剂、佐剂及稀释剂，都容易从众多商业来源获得。另外，也可获得药学上可接受的辅助物质的分类，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、稳定剂、润湿剂等。某些非限制性示例性载体包括生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。
更明确地说，应理解的是，在一些实施例中，本发明的治疗性组合物可以纯形式或与极少量另外的组分一起给予。相反地，本发明的位点特异性ADC可以任选地配制成含有适合的药学上可接受的载体，这些载体包含赋形剂和佐剂，它们使本领域众所周知的并且是相对呈惰性的物质，这些物质有助该缀合物的给予或帮助将活性化合物加工成在药学上经过优化以传递到作用部位的制剂。例如，赋形剂可以提供形式或稠度或充当稀释剂以改善ADC的药物动力学或稳定性。适合的赋形剂或添加剂包括但不限于，稳定剂、润湿剂及乳化剂、用于改变摩尔渗透压浓度的盐、囊封剂、缓冲剂及皮肤渗透增强剂。在某些优选实施例中，提供的这些药物组合物可以呈冻干形式并且在给药之前于例如缓冲生理盐水中重构。这种重构的组合物优选静脉内给予。
用于全身给药的所披露的ADC可以被配制用于肠、肠胃外或局部给药。事实上，可以同时使用全部三种类型的配制物来实现活性成分的全身给药。赋形剂以及供肠胃外和非肠胃外药物传递的配制物陈述于Remington,The Science and Practice of Pharmacy20th Ed.Mack Publishing(2000)[雷氏制药科学与实践第20版,默克出版公司(2000)]中。用于肠胃外给药的适合配制物包括呈水溶性形式(例如水溶性盐)的活性化合物的水溶液。此外，适当时，可以给予用于油性注射悬浮液的活性化合物的悬浮液。适合的亲脂性溶剂或媒剂包括脂肪油，例如己基取代的聚(丙交酯)、芝麻油或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酸酯)。水性注射悬浮液可以含有使该悬浮液的粘度增加的物质并且包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。任选地，该悬浮液还可以含有稳定剂。也可以使用脂质体将供传递的试剂囊封于细胞中。
用于肠给药的适合配制物包括硬或软明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、悬浮液、糖浆或吸入剂及其控制释放形式。
适用于胃肠外给药(例如通过注射)的配制物包括水性或非水性、等渗、无热原的无菌液体(例如溶液、悬浮液)，其中活性成分溶解、悬浮或以其他方式提供(例如，在脂质体或其他微粒中)。这些液体可以另外含有其他药学上可接受的成分，例如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂和使配制物与预期的受体的血液(或其他相关的体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。用于这种配制物的合适的等渗载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸林格氏注射液。
用于胃肠外给药(例如静脉内注射)的相容配制物将包含从约10μg/ml至约100mg/ml的ADC浓度。在某些选择的实施例中，ADC浓度将包含20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300、μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml或1mg/ml。在其他优选实施例中，ADC浓度将包含2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mg/ml、16mg/ml、18mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。
总体而言，包含位点特异性ADC的本发明的化合物和组合物可以通过不同途径在体内给予有需要的受试者，包括但不限于，口服、静脉内、动脉内、皮下、肠胃外、鼻内、肌肉内、颅内、心脏内、室内、气管内、口腔、直肠、腹膜内、皮内、局部、透皮及胸内，或以其他方式通过植入或吸入给予。主题组合物可以被配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、灌肠剂、注射液、吸入剂和气溶胶。适合的配制物和给药途径可以根据预定的应用和治疗方案选择。在特别优选的实施例中，本发明的化合物将在静脉内递送。
2.剂量
类似地，特定的剂量方案，即，剂量、时程及重复，将取决于特定的个体和该个体的病史，以及经验考虑，如药物动力学(例如半衰期、清除率等)。给药频率可以在疗法的过程内确定并调整，并且是基于减少增殖性或肿瘤发生细胞的数量、维持这些赘生性细胞的减少、减少赘生性细胞的增殖或延迟转移的发生。在其他实施例中，所给予的剂量可以经过调整或衰减以管理潜在副作用和/或毒性。作为替代方案，主题治疗性组合物的持续的连续释放配制物可以是适当的。
本领域技术人员将理解，缀合化合物和包含该缀合化合物的组合物的适当剂量可以随病人而变化。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将依赖于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性，给药途径，给药时间，化合物排泄速率，治疗持续时间，其他组合使用的药物、化合物和/或材料，病状的严重性，以及患者的物种、性别、年龄、体重、病状、总体健康状况和先前病史。化合物的量和给药途径最终将由医师、兽医或临床医生决定，尽管通常将选择剂量以在作用部位达到局部浓度，其达到所希望的效果而不引起实质上危害性的或有害的副作用。
总体而言，本发明的位点特异性ADC可以在不同范围内给予。这些包括约5μg/kg体重至约100mg/kg体重/剂量；约50μg/kg体重至约5mg/kg体重/剂量；约100μg/kg体重至约10mg/kg体重/剂量。其他范围包括每剂每千克体重约100μg到每千克体重约20mg，和每剂每千克体重约0.5mg到每千克体重约20mg。在某些实施例中，该剂量为每千克体重至少约100μg、每千克体重至少约250μg、每千克体重至少约750μg、每千克体重至少约3mg、每千克体重至少约5mg、每千克体重至少约10mg。
在所选实施例中，这些位点特异性ADC将以每剂每千克体重约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg给予(优选静脉内)。其他实施例将包含在约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000μg/kg体重/剂量给予ADC。在其他优选实施例中，所披露的缀合物将以2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.58、9或10mg/kg给予。在再其他实施例中，这些缀合物可以按每剂每千克体重12、14、16、18或20mg给予。在又其他实施例中，这些缀合物将以每剂每千克体重25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100mg给予。根据此处的传授内容，本领域的普通技术人员可以基于临床前动物研究、临床观察结果以及标准医疗和生物化学技术及测量容易地确定不同位点特异性ADC的适当剂量。在特别优选的实施例中，这些缀合物剂量将在一段时间内静脉内给予。另外，这些剂量可以在一段确定的治疗过程内多次给予。
其他给药方案可以根据体表面积(BSA)计算值判定，如U.S.P.N.7,744,877中所披露。如众所周知的，BSA是使用患者的身高和体重进行计算并且提供了如通过他或他的体表面积所表示的受试者的体格的量度。在某些实施例中，这些缀合物可以按从1mg/m2到800mg/m2、从50mg/m2到500mg/m2的剂量并且按100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2或450mg/m2的剂量给予。还应理解的是，可以使用本领域认可的并且凭经验的技术来确定适当剂量。
无论如何，所披露的缀合物优选按需要以提供有益治疗指数的方式给予受试者。给药频率的确定可以由本领域的普通技术人员(如主治医师)基于以下考虑来作出：所治疗的病症、所治疗的受试者的年龄、所治疗的病症的严重程度、所治疗的受试者的一般健康状态等。总体而言，DLL3缀合物的有效剂量给予受试者一次或多次。更明确地说，该ADC的有效剂量是一个月一次、一个月超过一次或一个月不到一次给予受试者。在某些实施例中，该DLL3 ADC的有效剂量可以给予多次，包括持续至少一个月、至少六个月、至少一年、至少两年的时间或若干年的时间。在又其他实施例中，所披露的调节剂的给药之间可以间隔若干天(2、3、4、5、6或7)、若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干月(1、2、3、4、5、6、7或8)，或甚至一年或若干年。
在某些优选实施例中，涉及缀合调节剂的治疗过程将包含在一段数周或数月时间内多剂所选药品。更具体地说，本发明的缀合调节剂可以每天、每两天、每四天、每周、每十天、每两周、每三周、每个月、每六周、每两个月、每十周或每三个月一次给予。就此而言，应理解的是，基于患者反应和临床实践，这些剂量可以改变或该时间间隔可以调整。
对用于已经提供一次或多次给药的个体中所披露的治疗性组合物的剂量和方案也可以凭经验确定。举例来说，可以给个体递增剂量的如在此所描述制造的治疗性组合物。在所选实施例中，对应地基于凭经验确定或观察的副作用或毒性，可以使该剂量逐渐增加或减少或衰减。为了评估所选组合物的功效，可以如先前所描述，跟踪特定疾病、病症或病状的标记物。对于癌症，这些包括经由触诊或目测观察来直接测量肿瘤大小、通过x射线或其他成像技术来间接测量肿瘤大小；如通过直接肿瘤活检和肿瘤样品的显微镜检查所评估的改善；间接肿瘤标记物(例如，对于前列腺癌的PSA)根据在此描述的方法鉴定的肿瘤发生抗原的测量；疼痛或麻痹的减少；言语、视力、呼吸或与肿瘤相关的其他能力丧失的改善；食欲增加；或如通过公认的测试所测量的生活质量增加或存活期延长。本领域的普通技术人员应清楚的是，该剂量将取决于个体、赘生性病状的类型、赘生性病状的阶段、该赘生性病状是否已经开始转移到个体中的其他位置以及过去和当前所使用的治疗而变化。
3.组合疗法
根据本发明，组合疗法可以特别适用于减少或抑制不想要的赘生性细胞增殖，减少癌症的发生，减少或预防癌症的复发，或者减少或预防癌症的扩散或转移。在这些情形中，本发明的ADC可以通过去除CSC而充当敏化剂或化学敏化剂，这些试剂将以其他方式支持并且维持肿块并藉此允许更有效地使用当前的医疗标准减瘤剂或抗癌剂。也就是说，在某些实施例中，所披露的ADC可以提供一种增强的作用(例如，加和性或协同性)，由此加强了另一种给予的治疗剂的作用模式。在本发明的上下文中，“组合疗法”应当在广义上解释并且仅仅是指一种位点特异性ADC和一种或多种抗癌剂的给予，这些抗癌剂包括但不限于，细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化学治疗剂、放射疗法及放射治疗剂、靶向性抗癌剂(包括单克隆抗体和小分子实体)、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、放射疗法以及抗转移剂和免疫治疗剂，包括特异性和非特异性方法。
这些组合的结果无需为当分开地进行每种治疗(例如ADC和抗癌剂)时所观察的作用的加和。尽管至少加和作用一般是所希望的，但超出单一疗法之一的任何增加的抗肿瘤作用都是有益的。另外，本发明不需要组合治疗展现出协同作用。然而，本领域的普通技术人员应理解，在包含优选实施例的某些所选组合情况下，可以观察到协同作用。
在实行组合疗法时，可以向受试者以单一组合物形式或以两种或更多种相异的组合物形式使用相同或不同给药途径同时地给予缀合物和抗癌剂。作为替代方案，该ADC可以在抗癌剂治疗之前或之后以例如从数分钟到数周范围内的时间间隔给予。每次传递之间的时间段使得该抗癌剂和缀合物能够对该肿瘤发挥组合作用。在至少一个实施例中，抗癌剂与ADC是彼此间隔在约5分钟到约两周内给予。在又其他实施例中，该ADC与该抗癌剂的给药之间可以间隔若干天(2、3、4、5、6或7)、若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干月(1、2、3、4、5、6、7或8)。
组合疗法可以给予一次、两次或至少持续一段时间，直到该病状得到治疗、减轻或治愈。在一些实施例中，该组合疗法给予多次，例如从每日三次到每六个月一次。给药可以按时程进行，如每日三次、每日两次、每日一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每个月一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次，或者可以经由微型泵连续地给予。该组合疗法可以经由如先前所述的任何途径给予。该组合疗法可以在远离肿瘤部位的部位处给予。
在一个实施例中，位点特异性ADC是与一种或多种抗癌剂组合给予有需要的受试者，持续一个较短的治疗周期。本发明还涵盖分成若干部分给药的不连续给药或每日剂量。该缀合物和抗癌剂可以在隔日或隔周可互换地给与；或提供了一系列抗体治疗之后可以是一次或多次的抗癌剂疗法治疗。在任何情况下，如本领域的普通技术人员所了解，化学治疗剂和所披露的缀合物的适当剂量一般大约为将在临床疗法中已经采用的那些，其中这些化学治疗剂是单独或与其他化学治疗剂组合给予。
在另一个优选实施例中，本发明的位点特异性缀合物可以用于维持疗法中以在该疾病最初出现之后降低或消除肿瘤复发的几率。优选地，该病症将经过治疗并且最初的肿块消除、减小或以其他方式改善，由此该患者是无症状的或得到缓和。此时，可以给予该受试者药学上有效量的所披露的缀合物一次或多次，即使是使用标准诊断程序存在极少或无疾病指征。在一些实施例中，这些ADC将根据一个有规律的时程经一段时间给予，如每周、每两周、每月、每六周、每两个月、每三个月、每六个月或每年。鉴于在此的传授内容，本领域的普通技术人员可以容易地确定出用以减少疾病复发的可能性的有利剂量和给药方案。另外，取决于患者反应以及临床和诊断参数，这些治疗可以持续一段数周、数月、数年或甚至无限的时间。
在又另一个优选实施例中，本发明的ADC可以用于预防或作为一种辅助疗法以预防或降低在减瘤程序之后肿瘤转移的可能性。如本披露中所使用，“减瘤程序”是在广义上定义并且应当意指任何消除、减少、治疗或改善肿瘤或肿瘤增殖的程序、技术或方法。示例性减瘤剂包括但不限于，手术、放射治疗(即，射束放射)、化学疗法、免疫疗法或切除。在本领域的普通技术人员根据本披露容易地确定的适当时间，所披露的ADC可以如通过临床、诊断或治疗诊断程序所提出来给予，以减少肿瘤转移。这些缀合物可以按如使用标准技术所测定的药学上有效的剂量给予一次或多次。优选地，该给药方案将伴随适当的诊断或监测技术以允许对其进行修饰。
本发明的又其他实施例包含向无症状但有发生增殖性病症的风险的受试者给予所披露的缀合物。也就是说，本发明的缀合物可以在真正预防意义上使用并且提供给经过检查或测试并且具有一个或多个所述风险因素(例如，染色体组指征、家族史、体内或体外测试结果等)但尚未显现赘瘤的患者。在这些情形中，本领域普通技术人将能够通过凭经验观察或通过公认的临床实践来确定有效的给药方案。
4.抗癌剂
术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可以用于治疗细胞增殖性病症(如癌症)的任何药剂，并且包括但不限于，细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化学治疗剂、放射疗法及放射治疗剂、靶向性抗癌剂、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、放射疗法以及抗转移剂和免疫治疗剂。应理解的是，在所选实施例中，如以上所论述，这些抗癌剂可以包含缀合物并且可以在给药之前与所披露的位点特异性抗体缔合。更具体地，在某些实施例中，选择的抗癌剂将被连接到工程化抗体的未配对半胱氨酸以提供如在此所陈述的工程化缀合物。因此，这种工程化缀合物被明确地预期为在本发明的范围内。在其他实施例中，所披露的抗癌剂将与包含如上所陈述的不同治疗剂的位点特异性缀合物组合给予。
如在此所使用，术语“细胞毒性剂”意指对细胞有毒并且降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的一种物质。在某些实施例中，该物质是一种衍生自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于，以下各项的小分子毒素或酶活性毒素：细菌(例如白喉毒素、绿脓杆菌内毒素和外毒素、葡萄球菌肠毒素A)、真菌(例如，α-帚曲菌素、局限曲菌素)、植物(例如，相思豆毒素、篦麻毒素、葫莲根毒蛋白、槲寄生素、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草毒素、白树毒素、苦瓜毒素、天花粉毒素、大麦毒素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、米特格林(mitegellin)、局限曲菌素、酚霉素、新霉素及单端孢霉烯族毒素)或动物(例如，细胞毒性RNA酶，如细胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或变体)。
出于本发明的目的，“化学治疗剂”包含非特异性降低或抑制癌症细胞的生长、增殖和/或存活的一种化合物(例如，细胞毒性剂或细胞生长抑制剂)。这些化学试剂经常针对细胞生长或分裂必需的细胞内过程，并且因此针对一般迅速生长并且分裂的细胞特别有效。举例来说，长春新碱使微管蛋白解聚合，并由此抑制细胞进入有丝分裂。总体而言，化学治疗剂可以包括抑制或设计成抑制癌细胞或可能变为癌细胞或产生肿瘤发生子代(例如TIC)的细胞的任何化学试剂。这些试剂例如在如CHOP或FOLFIRI等方案中经常组合给予并且经常是最有效的。
可以与本发明的位点特异性缀合物组合使用(作为位点特异性缀合物的一个组分或处于未缀合状态)的抗癌剂的实例包括但不限于：烷化剂、磺酸烷酯、氮丙啶、乙烯亚胺及甲基三聚氰胺、多聚乙酰、喜树碱、苔藓抑素、海绵他汀、CC1065、念珠藻环肽、多拉司他汀、倍癌霉素、伊斯罗宾、水鬼蕉碱、萨克丁特(sarcodictyin)、海绵素、氮芥、抗生素、烯二炔抗生素、达内霉素、双膦酸酯、埃斯波霉素、色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、左柔比星；抗代谢物，埃罗替尼、威罗菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗肾上腺素、叶酸补充剂(如甲酰四氢叶酸)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯特布斯(bestrabucil)、比生群、伊达曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌、依氟鸟氨酸、依利醋铵、埃博霉素、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、罗尼达宁(lonidainine)、美登木素生物碱、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、尼曲瑞林(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、比柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙肼、丙卡巴肼、多糖复合物(JHS自然产品公司(JHS Natural Products)，俄勒冈州尤金(Eugene,OR))、雷佐生；根瘤菌素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A、漆斑菌素A及蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；盖克托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷、苯丁酸氮芥；吉西他宾；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物、长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；西罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)、拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸；视黄醇；卡培他滨；康普瑞汀；亚叶酸；奥沙利铂；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A的抑制剂，这些抑制剂减少细胞增殖；及以上任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括用于调控或抑制对于肿瘤的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂，抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，这些抑制剂调控肾上腺中雌激素的产生，及抗雄激素；以及曲沙他滨(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、核糖酶，如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞宾和埃斯波霉素，及以上任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
特别优选的抗癌剂包含商业上或临床上可用的化合物，例如埃罗替尼(基因技术公司(Genentech)/OSI制药公司(OSI Pharm.))、多西他赛(赛诺菲-安万特(Sanofi-Aventis))、5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CAS号51-21-8)、吉西他滨(礼来公司(Lilly))、PD-0325901(CAS号391210-10-9，辉瑞公司)、顺铂(顺式二胺，二氯铂(II)、CAS号15663-27-1)、卡铂(CAS号41575-94-4)、紫杉醇(百时美施贵宝肿瘤学(Bristol-Myers Squibb Oncology)、新泽西州普林斯顿)、曲妥珠单抗(基因技术公司)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，CAS号85622-93-1， 先灵葆雅公司(ScheringPlough))、他莫昔芬((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺， )和多柔比星另外的商业上或临床上可用的抗癌剂包含奥沙利铂(赛诺菲公司(Sanofi))、硼替佐米(千禧制药公司(Millennium Pharm.))、索坦(sutent)(SU11248，辉瑞公司)、来曲唑(诺华公司(Novartis))、甲磺酸伊马替尼(诺华公司)、XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，数组生物制药公司(Array BioPharma)，阿斯利康公司)、SF-1126(PI3K抑制剂，萨马福尔制药公司(Semafore Pharmaceuticals))、BEZ-235(PI3K抑制剂，诺华公司)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)、PTK787/ZK222584(诺华公司)、氟维司群(阿斯利康公司)、亚叶酸(醛叶酸)、雷帕霉素(西罗莫司，惠氏公司)、拉帕替尼(GSK572016，葛兰素史克公司(Glaxo Smith Kline))、氯那法尼(lonafarnib)(SARAS ARTM，SCH 66336，先灵葆雅公司)、索拉非尼(BAY43-9006，拜耳实验室)、吉非替尼(阿斯利康公司)、伊立替康(CPT-11，辉瑞公司)、替吡法尼(ZARESTRATM，强生公司(Johnson and Johnson))、ABRAXAETM(不含克列莫佛)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒配制物(美国制药合作伙伴(American Pharmaceutical Partners)，伊利诺伊绍姆堡(Schaumberg，II))、凡德他尼(rINN，ZD6474，阿斯利康公司)、氯醌、AG1478、AG1571(SU 5271；苏根公司(Sugen))、替西罗莫司(惠氏公司)、帕唑帕尼(葛兰素史克公司)、坎磷酰胺(泰力克公司(Telik))、噻替派和环磷酰胺()、长春瑞滨卡培他滨(罗氏公司)、他莫昔芬(包括柠檬酸他莫昔芬)、(柠檬酸托他米芬)、(醋酸甲地孕酮)、(依西美坦，辉瑞公司)、甲霜灵、法多唑、(伏氯唑(vorozole))、(来曲唑；诺华公司)和(阿那曲唑；阿斯利康公司)。
在其他实施例中，本发明的位点特异性缀合物可以与目前临床试验中或可商购的多种抗体(或免疫治疗剂)中的任一种组合使用。为此，所披露的缀合物可以与选自下组的抗体组合使用，该组由以下各项组成：阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿托珠单抗、阿仑单抗、阿妥莫单抗、阿托昔单抗、马安那莫单抗、阿西莫单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝伐单抗、比伐珠单抗、比纳托单抗、布妥昔单抗、坎妥珠单抗、卡妥索单抗、西妥昔单抗、西他珠单抗、西妥木单抗、利伐珠单抗(clivatuzumab)、坎妥木单抗(conatumumab)、达妥木单抗(daratumumab)、曲兹妥单抗(drozitumab)、杜利妥单抗(duligotumab)、杜昔妥单抗(dusigitumab)、地莫单抗、达西珠单抗、多妥珠单抗(dalotuzumab)、依美昔单抗、艾妥珠单抗(elotuzumab)、恩脱昔单抗(ensituximab)、厄妥索单抗、达珠单抗、法妥珠单抗(farletuzumab)、拉妥珠单抗(ficlatuzumab)、费妥木单抗(figitumumab)、法伏妥单抗(flanvotumab)、弗妥昔单抗(futuximab)、加尼妥单抗(ganitumab)、吉妥珠单抗、吉瑞昔单抗、来巴妥单抗(glembatumumab)、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、麦妥珠单抗(imgatuzumab)、印妥昔单抗(indatuximab)、伊珠单抗、英妥木单抗、伊匹单抗、伊妥木单抗、拉贝珠单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、洛伐珠单抗(lorvotuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、曼妥木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗、米妥珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫妥木单抗(moxetumomab)、那妥单抗(narnatumab)、那莫单抗、尼妥木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗、若莫单抗(nofetumomabn)、卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗、奥拉妥单抗(olaratumab)、昂妥珠单抗(onartuzumab)、奥妥珠单抗(oportuzumab)、瑞戈伏单抗(oregovomab)、盘尼图单抗、帕图珠单抗(parsatuzumab)、帕托单抗(patritumab)、盘图莫单抗(pemtumomab)、帕妥珠单抗、平妥单抗、普托木单抗、拉妥木单抗(racotumomab)、雷莫芦单抗、拉图单抗(radretumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗、罗妥木单抗、沙妥莫单抗、昔洛珠单抗、司妥昔单抗、司妥佐单抗(simtuzumab)、索利图单抗(solitomab)、他妥珠单抗(tacatuzumab)、他妥莫单抗(taplitumomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替普莫单抗(teprotumumab)、加珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、托卡珠单抗(tucotuzumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、沃妥珠单抗(vorsetuzumab)、沃图莫单抗(votumumab)、扎鲁木单抗、CC49、3F8及其组合。
再其他特别优选的实施例将包含在测试中使用抗体或被批准用于癌症疗法，包括但不限于，利妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥单抗、阿仑单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、盘尼图单抗、雷莫芦单抗、奥法木单抗、伊匹单抗及布妥昔单抗。本领域的普通技术人员将能够容易地鉴定与在此的传授内容相容的另外的抗癌剂。
5.放射疗法
本发明还提供了位点特异性缀合物与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内诱导DNA损伤的任何机制，如γ照射、X射线、UV照射、微波、电子发射等)的组合。还涵盖了使用放射性同位素向肿瘤细胞的定向传递的组合疗法，并且所披露的缀合物可以与一种靶向性抗癌剂或其他靶向手段联合使用。典型地，放射疗法是以脉冲方式经一段从约1到约2周的时间给予。该放射疗法可以给予患有头颈癌的受试者，持续约6到7周。任选地，该放射疗法可以按单次剂量或按多次连续剂量给予。
VI.适应症
应理解的是，本发明的ADC可以用于治疗、预防、管理或抑制任何增殖性病症的发生或复发。因此，不管是单独还是与抗癌剂或放射疗法组合给予，本发明的ADC特别适用于总体上治疗患者或受试者的赘生性病状，这些病状可以包括良性或恶性肿瘤(例如肾上腺、肝、肾、膀胱、乳房、胃、卵巢、结肠直肠、前列腺、胰腺、肺、甲状腺、肝脏、子宫颈、子宫内膜、食道及子宫癌瘤；肉瘤；成胶质细胞瘤；及不同的头颈肿瘤)；白血病和淋巴系统恶性疾病；其他病症，如神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑及其他腺体、巨噬细胞、上皮、基质及囊胚腔病症；以及发炎性、血管生成性、免疫性病症和由病原体引起的病症。明确地说，供治疗的关键靶标是赘生性病状(包含实体肿瘤)，不过血液系统恶性肿瘤在本发明的范围内。
如在此使用的在治疗病状上下文中的术语“治疗”通常涉及治疗和疗法，无论是对人或动物(例如在兽医应用中)，其中实现了一些希望的治疗效果，例如对病状进展的抑制，并且包括进展速度的下降、进展速度的停止、病状的消退、病状的改善和病状的治愈。还包括作为预防措施(即预防、防止)的治疗。
如在此所用的，术语“治疗有效量”涉及如下量的活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂型，其对于产生一些希望的治疗效果是有效的，当根据希望的治疗方案给药时与合理的益处/风险相称。
类似地，如在此所用的，术语“预防有效量”涉及如下量的活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂型，其对于产生一些希望的预防效果是有效的，当根据希望的治疗方案给药时与合理的益处/风险相称。
更具体地说，经历根据本发明的治疗的赘生性病状可以选自下组，该组包括但不限于，肾上腺肿瘤、AIDS相关癌症、蜂窝状软部肉瘤、星形细胞肿瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌瘤和移行细胞癌瘤)、骨癌(釉质上皮瘤、动脉瘤状骨囊肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑和脊髓癌、转移性脑肿瘤、乳癌、颈动脉体瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、肾嫌色细胞癌瘤、肾透明细胞癌瘤、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维性组织细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肿瘤(Ewing's tumor)、骨外粘液样软骨肉瘤、骨纤维生成不良、骨纤维异常增殖症、胆囊和胆管癌、妊娠滋养细胞病、生殖细胞肿瘤、头颈癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、肾癌(肾母细胞瘤、乳头状肾细胞癌瘤)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪性肿瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪性肿瘤、肝癌(肝母细胞瘤、肝细胞癌瘤)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌瘤、腺癌、鳞状细胞癌瘤、大细胞癌瘤等)、髓母细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌瘤、甲状旁腺肿瘤、儿科癌症、周围神经鞘膜瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑素瘤(posterious unveal melanoma)、罕见血液性病症、肾转移性癌、横纹肌样肿瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌瘤、胸腺瘤、甲状腺转移性癌症及子宫癌(子宫颈癌、子宫内膜癌瘤及平滑肌瘤)。
在某些优选实施例中，该增殖性病症将包含一种实体肿瘤，包括但不限于，肾上腺、肝、肾、膀胱、乳房、胃、卵巢、子宫颈、子宫、食道、结肠直肠、前列腺、胰腺、肺(小细胞和非小细胞)、甲状腺肿瘤、癌瘤、肉瘤、成胶质细胞瘤及不同的头颈肿瘤。在其他优选实施例中，并且如以下实例中所示，所披露的ADC在治疗小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)(例如鳞状细胞非小细胞肺癌或鳞状细胞小细胞肺癌)方面尤其有效。在一个实施例中，肺癌是难治性、复发性或对基于铂的试剂(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂、拓扑替康)和/或紫杉烷(例如多西他赛、紫杉醇、洛他赛或卡巴他赛)具有抗性的。
在特别优选的实施例中，所披露的ADC可用于治疗小细胞肺癌。关于这些实施例，缀合调节剂可以给予展现出局限期疾病的患者。在其他实施例中，所披露的ADC将给予展现出扩散期疾病的患者。在其他优选实施例中，所披露的ADC将给予难治性患者(即，在完成最初疗程期间或不久之后复发的那些)或复发的小细胞肺癌患者。再其他实施例包含将所披露的ADC给予敏感性患者(即，复发在主要疗法之后超过2-3个月的那些)。在每个情形中，应当理解，取决于所选给药方案和临床症状，可以将相容性ADC与其他抗癌剂组合使用。
如以上所论述，所披露的ADC可以另外用于预防、治疗或诊断具有神经内分泌特征或表型的肿瘤，包括神经内分泌肿瘤。起于弥散性内分泌系统的真性或经典神经内分泌肿瘤(NET)相对罕见，并且每100,000个人有2-5个人发生，但具有高度侵袭性。神经内分泌肿瘤发生于肾、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宫颈及子宫内膜)、胃肠道(结肠、胃)、甲状腺(髓样甲状腺癌)及肺(小细胞肺癌瘤和大细胞神经内分泌癌瘤)中。这些肿瘤可以分泌若干激素，包括血清素和/或嗜铬粒蛋白A，这些激素可以引起称为类癌瘤综合症的衰竭性症状。这些肿瘤可以通过阳性免疫组织化学标记物表示，如神经元特异性烯醇化酶(NSE，又称为γ烯醇化酶，基因符号＝ENO2)、CD56(或NCAM1)、嗜铬粒蛋白A(CHGA)及突触素(SYP)；或通过已知展现升高的表达的基因表示，如ASCL1。不幸的是，传统的化学疗法在治疗NET方面不是特别有效，并且肝转移是一种常见的结果。
尽管所披露的ADC可以有利地用于治疗神经内分泌肿瘤，但它们也可以用于治疗、预防或诊断假神经内分泌肿瘤(pNET)，这些肿瘤在基因型或表型上模拟、类似经典神经内分泌肿瘤或展现与其共同的性状。假神经内分泌肿瘤或具有神经内分泌特征的肿瘤是由弥散神经内分泌系统的细胞或由神经内分泌分化级联已经在癌发生过程期间异常地再活化的细胞引起的肿瘤。这些pNET常常与传统上确定的神经内分泌肿瘤共有某些表型或生物化学特征，包括产生多种生物活性胺、神经递质及肽激素的子集的能力。在组织学上，这些肿瘤(NET和pNET)共有一种共同的外观，经常显示出极少的单纯细胞病理学细胞质和圆形到椭圆形点彩核的密集地连接的小细胞。出于本发明的目的，可以用于确定神经内分泌和假神经内分泌肿瘤的常常表达的组织标记物或遗传标记物包括但不限于，嗜铬粒蛋白A、CD56、突触素、PGP9.5、ASCL1及神经元特异性烯醇化酶(NSE)。
因此，本发明的ADC可以有益地用于治疗假神经内分泌肿瘤和经典神经内分泌肿瘤。就此而言，这些ADC可以如在此所描述而用于治疗在肾、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宫颈及子宫内膜)、胃肠道(结肠、胃)、甲状腺(髓样甲状腺癌)及肺(小细胞肺癌瘤和大细胞神经内分泌癌瘤)中发生的神经内分泌肿瘤(NET和pNET)。另外，本发明的ADC可以用于对表达一种或多种标记物的肿瘤进行治疗，这些标记物选自下组，该组由以下各项组成：NSE、CD56、突触素、嗜铬粒蛋白A、ASCL1及PGP9.5(UCHL1)。也就是说，本发明可以用于治疗一位罹患肿瘤的受试者，该肿瘤为NSE+或CD56+或PGP9.5+或ASCL1+或SYP+或CHGA+，或其某一组合。
就血液系统恶性肿瘤来说，还应理解的是，本发明的化合物和方法可以特别有效地治疗多种B细胞淋巴瘤，包括低级别/NHL滤泡细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥散性大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中等级别/滤泡性NHL、中等级别弥散性NHL、高级别免疫母细胞性NHL、高级别淋巴母细胞性NHL、高级别小型无裂隙细胞NHL、大包块病NHL、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)、淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥散性大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)(BL)、AIDS相关淋巴瘤、单核细胞性B细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病、小淋巴细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥散性大细胞淋巴瘤、弥散性小无裂隙细胞淋巴瘤、大细胞免疫母细胞淋巴母细胞瘤、小无裂隙淋巴瘤、伯基特氏和非伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤，主要是大细胞；滤泡性，主要是小无裂隙细胞；及滤泡性、混合小无裂隙细胞和大细胞淋巴瘤。参见Gaidono等人,“Lymphomas[淋巴瘤]”,IN CANCER:PRINCIPLES and PRACTICE OF ONCOLOGY[在癌症中:肿瘤学原理与实践],第2卷:2131-2145(DeVita等人编,第5版1997)。本领域的普通技术人员应当清楚的是，这些淋巴瘤由于分类系统的改变而经常会具有不同的名称，并且患有以不同名称分类的淋巴瘤的患者也可以从本发明的组合治疗方案获益。
本发明还提供了出现良性或癌前肿瘤的受试者的防治性或预防性治疗。除DLL3相关病症外，相信任何特别类型的肿瘤或增殖性病症不应当被排除在使用本发明进行的治疗外。然而，肿瘤细胞的类型可能与组合使用第二治疗剂，特别是化学治疗剂和靶向性抗癌剂的本发明相关。
优选地，有待治疗的“受试者”或“患者”将为人类，不过如在此所使用，这些术语明确地被视作包含任何物种，包括所有哺乳动物。因此，受试者/患者可以是动物、哺乳动物、胎盘哺乳动物、有袋动物(例如袋鼠、袋熊)、单孔类动物(monotreme)(例如鸭嘴兽)、啮齿类动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠类(例如小鼠)、兔形目动物(例如兔子)、鸟类(例如鸟)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、猪科动物(例如猪)、羊科动物(例如绵羊)、牛科动物(例如奶牛)、灵长类动物、猿类动物(例如猴或猿)、猴(例如绒猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人类。
VII.诊断和筛选
1.诊断
本发明提供了用于检测、诊断或监测增殖性病症的体外和体内方法以及筛选来自患者的细胞以鉴定肿瘤细胞(包括肿瘤发生细胞)的方法。这些方法包括鉴定一位患有癌症的个体以治疗或监测癌症的发展，包含使该患者或从患者获得的样品(在体内或体外)与如在此所描述的抗体接触并且检测经结合抗体或样品中游离靶分子的存在或不存在，或缔合水平。在一些实施例中，该抗体将包含一种可检测标记或报告子分子，如在此所描述。
在一些实施例中，该抗体与样品中特定细胞的缔合可表示，该样品可能含有肿瘤发生细胞，藉此指示该患有癌症的个体可以用如在此所描述的抗体有效地治疗。
可以通过多种测定法分析样品，例如放射免疫测定、酶免疫测定(例如ELISA)、竞争结合测定、荧光免疫测定、免疫印迹测定、蛋白质印迹分析和流式细胞术测定。如本领域的普通技术人员所知，可相容的体内治疗诊断或诊断检验可以包含本领域认可的成像或监测技术，例如磁共振成像、计算机断层扫描(例如CAT扫描)、正电子断层扫描(例如PET扫描)、放射线照相术、超声波等。
在特别优选的实施例中，本发明的抗体可用于检测和定量患者样品(例如血浆或血液)中特定决定簇(例如，SEZ6、DLL3或CD324)的水平，其转而可以用于检测、诊断或监测与相关决定簇相关的增殖性病症。在相关实施例中，本发明的抗体可以用于在体内或体外对循环肿瘤细胞进行检测、监测和/或定量(WO 2012/0128801)。在再其他实施例中，循环肿瘤细胞可以包含肿瘤发生细胞。
在本发明的某些实施例中，可以在疗法或方案之前，使用所披露的抗体对受试者或来自受试者的样品中肿瘤发生细胞进行评估或表征，以确立一个基线。在其他实例中，可从衍生自经过治疗的受试者的样品评估肿瘤发生细胞。
2.筛选
在某些实施例中，这些抗体可用于筛选样品，以鉴定通过与决定簇相互作用而改变肿瘤细胞的功能或活性的化合物或试剂(例如，用于治疗增殖性疾病的药物)。在一个实施例中，系统或方法包括表达某一决定簇(例如SEZ6、DLL3或CD324)的肿瘤细胞和化合物或药剂(例如药物)，其中所述细胞和化合物或药剂彼此接触。在这些实施例中，可能已经使用所披露的抗体对主题细胞进行鉴定、监测和/或富集。
在又另一个实施例中，方法包括直接或间接地使肿瘤细胞与测试剂或化合物接触，并确定该测试剂或化合物是否调节与决定簇相关的肿瘤细胞的活性或功能，例如，细胞形态或生活力的变化、标记物的表达、分化或去分化、细胞呼吸、线粒体活性、膜完整性、成熟、增殖、生活力、凋亡或细胞死亡。直接相互作用的一个实例是物理相互作用，而间接相互作用包括例如组合物对中间分子的作用，而这又作用于参考实体(例如，细胞或细胞培养物)。
筛选方法包括高通量筛选，其可以包括例如在培养皿、管、烧瓶、转瓶或板上定位或放置(任选地在预定位置)细胞阵列(例如微阵列)。高通量机械或人工处理方法可以在较短时间段内探查化学相互作用并且确定许多基因的表达水平。已经开发了利用分子信号(例如通过荧光团或微阵列)的技术和以非常快的速率处理信息的自动化分析。可以筛选的文库包括例如，小分子文库、噬菌体展示文库、完全人类抗体酵母呈现文库(艾迪玛公司(Adimab,LLC))、siRNA文库及腺病毒转染载体。
VIII.制品
还提供了包含一个或多个容器的药物包装和试剂盒，这些容器包含一次或多次剂量的位点特异性ADC。在某些实施例中，提供了一种单位剂量，其中该单位剂量含有一种预定量的组合物，该组合物包含例如一种抗DLL3缀合物，存在或不存在一种或多种另外的药剂。对于其他实施例中，此类单位剂量是供应于一次性使用的注射用预填充注射器中。在再其他实施例中，单位剂量中所含的组合物可包含盐水、蔗糖等；缓冲液，如磷酸盐等；和/或配制在稳定和有效的pH范围内。作为替代方案，在某些实施例中，提供的缀合物组合物可以呈一种冻干粉末形式，该粉末可以在添加适当的液体(例如无菌水或盐溶液)之后重构。在某些优选实施例中，该组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于，蔗糖和精氨酸。在该一个(多个)容器上或与其相联的任何标记指示，所装的缀合物组合物被用于治疗所选的赘生性疾病病状。
本发明还提供了用于制造单次剂量或多次剂量的位点特异性缀合物给药单元及任选地一种或多种抗癌剂的试剂盒。该试剂盒包含一个容器及在该容器上或与其相联的标记或药品说明书。适合的容器包括例如，瓶子、小瓶、注射器等。这些容器可以由多种材料形成，如玻璃或塑料，并且含有药学有效量的呈缀合或未缀合形式的所披露的缀合物。在其他优选实施例中，该一个(多个)容器包含一种无菌存取口(例如，该容器可以是一种静脉内溶液袋或具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。这些试剂盒一般会在一个适合容器中含有工程化缀合物的药学上可接受的配制物，并且在相同或不同容器中任选地含有一种或多种抗癌剂。这些试剂盒还可以含有其他药学上可接受的配制物，用于诊断或组合疗法。举例来说，除本发明的位点特异性缀合物外，这些试剂盒还可以含有多种抗癌剂(如化学治疗剂或放射治疗剂)；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向性抗癌剂；细胞毒性剂；和/或其他抗癌剂中的任一种或多种。
更具体地说，这些试剂盒可以具有单一容器，该容器含有所披露的ADC，存在或不存在另外的组分，或它们可以对于每一希望的试剂具有相异的容器。在提供组合治疗剂供缀合的情况下，可以按摩尔当量组合或一种组分多于另一种的方式预混合单一溶液。作为替代方案，该试剂盒中的缀合物和任何任选的抗癌剂在给予患者之前，可以分开地维持在相异的容器中。这些试剂盒还可以包含第二/第三容器构件用于容纳无菌、药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂(如抑菌性注射用水(BWFI))、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、林格氏溶液及右旋糖溶液。
当该试剂盒的组分是以一种或多种液体溶液形式提供时，该液体溶液优选为一种水溶液或盐溶液，其中无菌水溶液是特别优选的。然而，该试剂盒的组分可以呈干燥粉末形式提供。当以干燥粉末形式提供试剂或组分时，该粉末可以通过添加适合溶剂来重构。预想的是，该溶剂也可以提供于另一个容器中。
如以上简短地指示，这些试剂盒还可以含有一种将该抗体缀合物和任何任选的组分给予动物或患者的构件，例如，一个或多个针、静脉注射袋或注射器，或甚至是眼滴管、移液管或其他此类装置，由该装置，可以将配制物注射或引入动物中或施用到身体的患病区域。本发明的试剂盒还典型地包括一种用于容纳小瓶或此类装置及其他组分的紧密封闭的构件以供商业销售，如例如注射或吹塑的塑料容器，在其中放置并且保持所希望的小瓶和其他装置。任何标记或药品说明书都指示，工程化缀合物组合物被用于治疗癌症，例如小细胞肺癌。
在其他优选实施例中，本发明的缀合物可以与可用于预防或治疗增殖性病症的诊断或治疗器件联合使用或包含这些预防或治疗器件。举例来说，在一个优选实施例中，本发明的化合物和组合物可以与某些诊断器件或仪器组合，这些器件或仪器可以用于对涉及增殖性病症的病因或表现的细胞或标记化合物进行检测、监测、定量或分型。对于所选实施例，这些标记化合物可以包含NSE、CD56、突触素、嗜铬粒蛋白A及PGP9.5。
在特别优选的实施例中，这些器件可以用于在体内或体外对循环肿瘤细胞进行检测、监测和/或定量(参见例如WO 2012/0128801，通过引用结合于此)。在再其他优选实施例中，并且如以上所论述，这些循环肿瘤细胞可以包含癌症干细胞。
IX.其他
除非在此另外定义，否则结合本发明使用的科技术语应当具有本领域的普通技术人员通常所了解的意义。另外，除非上下文另外需要，否则单数形式的术语应当包括复数形式并且复数形式的术语应当包括单数形式。更具体地说，除非上下文另外清楚地规定，否则如本说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个(种)”(a/an)和“该”包括复数个参照物。因此，举例来说，提到“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提到“一个细胞”包括细胞的混合物等。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和这些端点之间的所有点。因此，2.0到3.0的范围包括2.0、3.0及2.0与3.0之间的所有点。
总体而言，与在此所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学及杂交学结合使用的命名法是本领域中众所周知并且常用的那些。除非另外指示，否则本发明的方法和技术一般是根据本领域中众所周知的常规方法并且如本说明书全篇所引用并且论述的不同通用和更特定的参考文献中所描述来进行。参见例如，Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,6th ed.,W.B.Saunders Company[细胞与分子免疫学,第6版,W.B.桑德公司](2010)；Sambrook J.和Russell D.MolecularCloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.[分子克隆实验指南,第3版,冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港](2000)；Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John and Sons,Inc.[精编分子生物学实验指南:当代分子生物学实验指南的方法概要,约翰威立公司](2002)；Harlow和Lane Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.[使用抗体:技术实验指南,冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港](1998)；及Coligan等人,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John and Sons,Inc.[精编蛋白质科学实验指南,约翰威立公司](2003)。酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明，如本领域中通常所实现或如在此所描述进行的。与在此所描述的分析化学、合成有机化学以及医学化学和药物化学结合使用的命名法及其实验室程序和技术是本领域中众所周知并且常用的那些。另外，在此使用的任何章节标题只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题内容。
如在此所使用，肿瘤细胞类型缩写如下：腺癌(Adeno)、肾上腺癌(AD)、乳腺癌(BR)、雌激素受体阳性乳腺癌(BR-ER+)、雌激素受体阴性乳腺癌(BR-ER-)、孕酮受体阳性乳腺癌(BR-PR+)、孕酮受体阴性乳腺(BR-PR-)、ERb2/Neu阳性乳腺癌(BR-ERB2/Neu+)、Her2阳性乳腺癌(BR-Her2+)、低密封蛋白(claudin-low)乳腺癌(BR-CLDN-lo)、三阴性乳腺癌(BR-TNBC)、结肠直肠癌(CR)、子宫内膜癌(EM)、胃癌(GA)、头颈癌(HN)、肾癌(KDY)、大细胞神经内分泌癌(LCNEC)、肝癌(LIV)、淋巴结癌(LN)、肺癌(LU)、肺类癌(LU-CAR)、肺梭形细胞癌(LU-SPC)、黑色素瘤(MEL)、非小细胞肺(NSCLC)、卵巢癌(OV)、卵巢浆液癌(OV-S)、卵巢乳头状浆液癌(OV-PS)、卵巢恶性混合中胚层肿瘤(OV-MMMT)、卵巢粘液癌(OV-MUC)、卵巢透明细胞癌(OV-CC)、神经内分泌肿瘤(NET)、胰腺癌(PA)、前列腺癌(PR)、鳞状细胞癌(SCC)、小细胞肺癌(SCLC)和皮肤衍生肿瘤(SK)。
X.参考文献
除非在此援引的全部专利、专利申请、和出版物、和以电子方式可获得的材料(包括，例如，核苷酸序列提交，例如GenBank和RefSeq；和氨基酸序列提交，例如SwissProt、PIR、PRF、PDB；以及来自GenBank和RefSeq中经注释的编码区的翻译)的完整披露内容通过引用结合，而不管短语“通过引用结合”是否相关于特定参考文献使用。以上的详细说明和后面的实例仅是出于清晰理解的目的而给出的。不应理解为由此构成任何不必要的限制。本发明不限于所显示和描述的具体细节。由权利要求书限定的本发明包括对于本领域技术人员而言显而易见的变化。在此使用的任何章节标题只是出于组织的目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
XI.序列表内容
附加到本申请的是包含多个核酸和氨基酸序列的序列表。下表4提供了所包括的序列的内容。
表4
实例
通过参照以下实例将更容易地了解由此总体上描述的本发明，这些实例是通过说明方式提供并且并非旨在成为本发明的限制。这些实例不旨在表示以下实验是所进行的全部或唯一实验。
实例1
抗DLL3抗体的产生
如下产生抗DLL3鼠类抗体。在第一次免疫接种活动中，用等体积的或明矾佐剂乳化的人类DLL3-fc蛋白(hDLL3-Fc)接种三只小鼠(以下品系中各一只：Balb/c，CD-1，FVB)。hDLL3-Fc融合构建体购自艾迪珀国际公司(Adipogen International)(目录号AG-40A-0113)。在TiterMax中以每只小鼠10μg hDLL3-Fc的乳剂进行初次免疫。然后在明矾佐剂中以每只小鼠5μg hDLL3-Fc两周一次地对小鼠进行加强免疫。在融合前的最终注射是在PBS中以每只小鼠5μg hDLL3-Fc。
在第二次免疫接种活动中，将六只小鼠(以下品系中各两只：Balb/c，CD-1，FVB)用等体积的或明矾佐剂乳化的人类DLL3-His蛋白(hDLL3-His)接种。从工程化为过表达hDLL3-His的CHO-S细胞的上清液纯化出重组hDLL3-His蛋白。在TiterMax中以每只小鼠10μghDLL3-His的乳剂进行初次免疫。然后在明矾佐剂中以每只小鼠5μg hDLL3-His两周一次地对小鼠进行加强免疫。最终注射是用工程化为过表达hDLL3的2 x 105个HEK-293T细胞。
使用固相ELISA测定，针对人类DLL3特异性小鼠IgG抗体来筛选小鼠血清。超过背景的阳性信号指示了DLL3特异性抗体。简单地说，用含0.5μg/ml重组DLL3-His的ELISA涂布缓冲液涂布96孔板(VWR国际公司(VWR International)，目录号610744)过夜。用含有0.02％(v/v)吐温(Tween)20的PBS洗涤之后，在室温(RT)下，用200μL/孔含3％(w/v)BSA的PBS阻断这些孔1小时。对小鼠血清进行滴定(1:100、1:200、1:400及1:800)并将其以50μL/孔添加到DLL3涂布的板中，并在RT下孵育1小时。洗涤这些板，并且然后在RT下，将其与50μL/孔在3％BSA-PBS或含2％FCS的PBS中以1:10,000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG一起孵育1小时。再对这些板进行洗涤，并且在RT下，添加40μL/孔TMB底物溶液(赛默科技公司(Thermo Scientific)34028)，保持15分钟。显色之后，添加等体积的2NH2SO4以停止底物显色并且通过分光光度计在OD 450下分析这些板。
将血清阳性的经过免疫接种的小鼠处死，并且解剖引流淋巴结(腿弯部、腹股沟以及髂骨肌)并且将其用作抗体产生细胞的来源。使用BTX Hybrimmune系统(BTX哈佛装置公司(BTX Harvard Apparatus))，将B细胞的细胞悬浮液(来自hDLL3-Fc免疫小鼠的约229×106个细胞和来自hDLL3-His免疫小鼠的510×106个细胞)与非分泌性P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞以1:1的比例融合。将细胞重新悬浮在由补充有以下项的DMEM培养基组成的杂交瘤选择培养基中：重氮丝氨酸、15％胎儿克隆I血清、10％BM Condimed(罗氏应用科技公司(Roche Applied Sciences))、1mM非必需氨基酸、1mM HEPES，100IU青霉素-链霉素、和50μM2-巯基乙醇，并在四个T225烧瓶(每个烧瓶100mL选择培养基)中培养。将烧瓶置于含有5％CO2和95％空气的加湿的37℃培养箱中持续6至7天。
在融合后的第六或七天，从烧瓶中收集杂交瘤文库细胞，并在200μL补充的杂交瘤选择培养基(如上所述)中以每孔一个细胞(使用FACS Aria I细胞分选仪)铺在64个Falcon96孔板和48个96孔板中，以用于hDLL3-His免疫接种活动。文库的其余部分储存在液氮中。
将杂交瘤培养10天，并使用如下进行的流式细胞术针对hDLL3特异性抗体来筛选上清液。以每孔1×105个工程化为过表达人类DLL3、小鼠DLL3(用染料预染色)或食蟹猴DLL3(用Dylight800预染色)的HEK-293T细胞与25μL杂交瘤上清液孵育30分钟。将细胞用PBS/2％FCS洗涤，并且然后用每个样品25μL的DyeLight 649标记的山羊抗小鼠IgG以1:300特异性二次稀释于PBS/2％FCS中的Fc片段进行孵育。15分钟孵育后，将细胞用PBS/2％FCS洗涤两次，并用DAPI重新悬浮于PBS/2％FCS中，并通过流式细胞仪对超过用同种型对照抗体染色的细胞的荧光的荧光进行分析。将剩余的未使用的杂交瘤文库细胞在液氮中冷冻以用于将来的文库测试和筛选。
hDLL3-His免疫接种活动产生约50种鼠类抗hDLL3抗体，而hDLL3-Fc免疫接种活动产生约90种鼠类抗hDLL3抗体。
实例2
抗DLL3抗体的序列
基于前述，选出以明显较高亲和力结合固定的人类DLL3或h293-hDLL3细胞的多种示例性的相异的单克隆抗体用于测序并进一步分析。来自实例1中产生的选择的单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区的序列分析证实，许多具有新型互补决定区，并且经常显示出新型VDJ安排。
将表达所希望的抗体的最初选择的杂交瘤细胞在试剂(Plus RNA纯化系统，生命科技公司(Life Technologies))中裂解以制备编码抗体的RNA。将104和105个之间的细胞重新悬浮在1mL Trizol中，并在加入200μL氯仿后剧烈振荡。然后，在4℃下将样品离心10分钟，并且将水相转移到一个新鲜的微量离心管中，并且添加等体积的70％乙醇。将样品装载在RNeasy Mini旋转柱上，置于2mL收集管中，并按照制造商的说明进行处理。将总RNA通过洗脱提取，直接用100μL无RNA酶的水转移到旋转柱膜上。通过以3μL在1％琼脂糖凝胶中进行分级分离来测定RNA制剂的质量，之后在-80℃下储存待用。
使用了包含32种被设计成靶向完整小鼠VH谱系的小鼠特异性前导序列引物的5’引物混合物，以及对所有小鼠Ig同种型具有特异性的3'小鼠Cγ引物来对每个杂交瘤的Ig重链的可变区进行扩增。类似地，使用包含三十二种被设计成扩增每个Vκ小鼠家族的5'Vκ前导序列的引物混合物与对小鼠κ恒定区具有特异性的单个反向引物的组合来对κ轻链进行扩增并测序。对于含有λ轻链的抗体，使用三个5'VL前导序列与对小鼠λ恒定区具有特异性的一个反向引物的组合进行扩增。如下使用凯杰One Step RT-PCR试剂盒从100ng总RNA扩增VH和VL转录物。对每个杂交瘤执行总计八次RT-PCR反应：四次针对Vκ轻链并且四次针对Vγ重链。PCR反应混合物包括3μL RNA、0.5μL的100μM重链或κ轻链引物(通过集成数据技术公司(Integrated Data Technologies)定制合成)、5μL的5 x RT-PCR缓冲液、1μL dNTP、1μL含有反转录酶和DNA聚合酶的酶混合物及0.4μL核糖核酸酶抑制剂RNasin(1个单位)。热循环仪程序为RT步骤50℃30分钟、95℃15分钟，然后30个循环(95℃30秒，48℃30秒，72℃1分钟)。然后在72℃下最后孵育10分钟。
使用与上述用于扩增可变区的相同的特异性可变区引物对提取的PCR产物进行测序。为了制备用于直接DNA测序的PCR产物，根据制造商的方案，使用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(凯杰公司)对其进行纯化。使用50μL无菌水从离心柱中洗脱出DNA，并且然后直接地从两条链进行测序(MCLAB)。
使用IMGT序列分析工具(http://www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html)分析选择的核苷酸序列，以鉴定具有最高序列同源性的种系V、D和J基因成员。通过使用专有抗体序列数据库将VH和VL基因与小鼠种系数据库进行比对，将这些衍生序列与IgV-和J-区的已知种系DNA序列进行比较。
鼠类重链可变区和轻链可变区的衍生序列以所附序列表提供，并以注释形式提供于PCT/US 14/17810中，关于此类序列将该文献通过引用结合于此。
实例3
人类抗DLL3抗体的产生
使用根据实例1(称为SC16.13，SC16.15，SC16.25，SC16.34和SC16.56)产生的某些鼠类抗体来衍生包含接枝到人类受体抗体中的鼠类CDR的人源化抗体。在优选实施例中，本实例中描述的人源化重链可变区和轻链可变区可并入如下所述的所披露的位点特异性缀合物中。
在这方面，如下将鼠类抗体通过专有计算机辅助CDR移植方法(阿拜斯数据库，UCL商业公司(UCL Business))和标准分子工程技术的协助进行人源化。如实例2所述从杂交瘤中提取总RNA并进行扩增。从衍生的核酸序列获得关于鼠类抗体的VH和VL链的V、D和J基因区段的数据。基于人类种系抗体序列的框架序列和CDR经典结构与选择的鼠类抗体的框架序列和CDR之间的最高同源性，选择和/或设计人类框架区。出于分析的目的，将氨基酸分配到每个CDR结构域是根据Kabat等人的编号进行。一旦选择了人类受体可变区框架并与鼠类CDR组合，则合成生成整合的重链可变区和轻链可变区序列(集成DNA技术公司(IntegratedDNA Technologies))，其包含合适的限制性位点。
然后将人源化可变区表达为工程化全长重链和轻链的组分，以提供如在此所述的位点特异性抗体。更具体地，如下使用本领域认可的技术产生人源化抗DLL3工程化抗体。使用以下限制性位点设计对于抗体VH和VL链的前导序列具有特异性的引物组：用于VH片段的AgeI和XhoI，以及用于VL片段的XmaI和DraIII。将PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司)纯化，然后用限制酶AgeI和XhoI消化VH片段，用XmaI和DraIII消化VL片段。将VH和VL消化的PCR产物分别纯化并连接到人类IgG1重链恒定区表达载体或κCL人类轻链恒定区表达载体中。如以下详细论述的，重链和/或轻链恒定区可以被工程化以在组装的抗体上呈现位点特异性缀合位点。
连接反应是如下用200U T4-DNA连接酶(新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs))、7.5μL消化并且纯化的基因特异性PCR产物及25ng线性化载体DNA进行，总体积10μM。经由在42℃下热休克，用3μL连接产物对感受态大肠杆菌DH10B细菌(生命技术公司)进行转化，并且将其以100μg/mL的浓度铺板到氨比西林板上。在纯化和消化扩增的连接产物后，将VH片段克隆入pEE6.4HuIgG1表达载体(龙沙公司(Lonza))的AgeI-XhoI限制性位点中，并且将VL片段克隆到pEE12.4Hu-κ表达载体(龙沙公司)的XmaI-DraIII限制性位点中，其中HuIgG1和/或Hu-κ表达载体可以包含天然或工程化的恒定区。
通过用pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-κ表达载体共转染HEK-293T细胞来表达人源化抗体。在转染之前，将HEK-293T细胞在标准条件下在补充有10％热灭活FCS、100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素G的杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)中150mm板中培养。对于瞬时转染，使细胞生长达80％汇合率。将pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-κ载体DNA各12.5μg加入到1.5mLOpti-MEM中的50μLHEK-293T转染试剂中。将混合物在室温下孵育30分钟并铺板。转染后三至六天收获上清液。将含有重组人源化抗体的培养物上清液通过以800xg离心10分钟从细胞碎片中清除并储存在4℃。通过MabSelect SuRe Protein A亲和色谱(GE生命科学公司(GE Life Sciences))纯化重组人源化抗体。对于较大规模的抗体表达，在1L体积中将CHO-S细胞瞬时转染，以2.2e6个细胞/mL接种。聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂。抗体表达7-10天后，通过离心从细胞碎片中清除含有重组抗体的培养上清液，并通过MabSelect SuReProtein A亲和色谱纯化。
对于每个人源化DLL3抗体，所选择的人类受体可变区的遗传组成紧接着在下表5中显示。表5中描绘的序列对应于图2A和2B中关于主题克隆所陈述的注释的重链和轻链序列。应注意，图2A和2B中陈述的互补决定区和框架区是遵照Kabat等人(同上)使用阿拜斯数据库(阿拜斯数据库，UCL商业公司(UCL Business))的专有版本所定义。
更具体地说，下表5中的条目对应于SEQ ID NOS:519和524(hSC16.13)、SEQ IDNOS:520和525(hSC16.15)、SEQ ID NOS:521和526(hSC16.25)、SEQ ID NOS:522和527(hSC16.34)以及SEQ ID NOS:523和528(hSC16.56)所陈述的连续可变区序列。除了遗传组成外，表5显示，在这些选择的实施例中，为了维持所选择的抗体的有利结合特性，无框架改变或回复突变是必要的。当然，在其他CDR移植的构建体中，应当理解，此类框架改变或回复突变可以是令人希望的，并且同样明确地被认为在本发明的范围内。
表5
尽管在框架区没有改变残基，但在人源化克隆之一(hSC16.13)中，将突变引入重链CDR2以解决稳定性问题。评估抗体与修饰的CDR的结合亲和力，以确保其等同于相应的鼠类抗体。
在通过CDR移植使所有所选抗体人源化之后，对所得轻链可变区和重链可变区氨基酸序列进行分析以确定它们关于鼠类供体和人类受体轻链可变区和重链可变区的同源性。紧接着下表6中显示的结果揭露，这些人源化构建体关于人类受体序列始终展现出比鼠类供体序列更高的同源性。更明确地说，与人源化抗体和供体杂交瘤蛋白质序列的同源性(74％-83％)相比较，鼠类重链可变区和轻链可变区显示与最紧密匹配的人类种系基因类似的总体同源性百分比(85％-93％)。
表6
在测试时，这些衍生的人源化构建体各自展现出与鼠类亲本抗体所显示的那些大致相当的有利的结合特征。
实例4
抗SEZ6抗体的产生和人源化
SEZ6抗原是通过使用标准分子技术将人类SEZ6蛋白的ECD部分融合至人类IgG2Fc结构域产生。在PCT/US 2013/0027391中提供了对SEZ6抗原的生产的更详细的描述，关于此将该文献通过引用结合于此。接种六只雌性小鼠之后，基本如实例1所述产生了生产抗体的杂交瘤。如先前论述的，筛选杂交瘤，并从感兴趣的那些获得遗传材料。基本上如实例2所述，测定抗SEZ6抗体的重链可变区和轻链可变区的序列。
使用与前面实例中所示出相似的技术，将许多抗SEZ6鼠类抗体人源化。基于关于功能性人类种系基因的序列和结构相似性来选择重链和轻链的人类框架。就此而言，通过将小鼠经典CDR结构与具有相同经典结构的人类候选物相比较来评价结构相似性，如Chothia等人(同上文)中所描述。
更明确地说，在计算机辅助的CDR移植分析(阿拜斯数据库、UCL商业公司(UCLBusiness Plc.)和标准分子工程技术的帮助下，使十一种鼠类抗体SC17.16、SC17.17、SC17.24、SC17.28、SC17.34、SC17.46、SC17.151、SC17.155、SC17.156、SC17.161以及SC17.200人源化以提供hSC17.16、hSC17.17、hSC17.24、hSC17.28、hSC17.34、hSC17.46、hSC17.151、hSC17.155、hSC17.156、hSC17.161以及hSC17.200调节剂。基于与主题小鼠框架序列的最高序列同源性和其经典结构对可变区的人类框架区进行选择。出于人源化分析的目的，将氨基酸分配到每个CDR结构域是根据Kabat等人的编号(同上文)。
从核苷酸序列信息，获得有关主题鼠类抗体的重链和轻链的V、D及J基因区段的数据。基于这些序列数据，设计出对这些抗体的Ig VH和VK轻链的前导序列具有特异性的新引物集进行重组单克隆抗体的克隆。随后，将V-(D)-J序列与小鼠Ig生殖系序列相比对。所得到的该十一种人源化构建体中每一种的基因安排显示于下表7中。
表7
列于表7中的人源化抗体对应于图3A和3B中所陈述的注释的轻链可变区和重链可变区序列(SEQ ID NO:170-199)。轻链可变区和重链可变区的对应的核酸序列陈述于所附序列表中。表7进一步证明，维持这些结合调节剂的有利特性需要极少的框架变化。就这一点来说，仅在重链可变区的三个中做出框架变化或回复突变，并且在轻链可变区中仅采取两个框架修饰。
应注意，对于一些人源化轻链可变区和重链可变区(例如hSC17.200、hSC17.155和hSC17.161)，在CDR中引入保守氨基酸突变以解决稳定性顾虑同时维持抗原结合。在每个情形中，发现这些抗体与修饰的CDR的结合亲和力等价于对应的嵌合或鼠类抗体。九种示例性人源化变体链(轻链和重链)的序列列于图3A和3B的结尾(SEQ ID NOS:192–199)，其中它们保留人源化母链的名称(例如hSC17.200vL1、hSC17.155vH1-6和hSC17.161vH1),带有注释用于指示它们已经被改变。
在通过CDR移植使所有所选抗体人源化之后，对所得轻链可变区和重链可变区氨基酸序列进行分析以确定它们关于鼠类供体和人类受体轻链可变区和重链可变区的同源性。下表8中显示的结果揭露，这些人源化构建体关于人类受体序列一致地展现出比鼠类供体序列更高的同源性。更具体地说，与人源化可变区序列和供体杂交瘤蛋白质序列的同源性(74％-89％)相比较，人源化重链可变区和轻链可变区总体上显示与最紧密匹配的人类种系基因的更高的百分比同源性(84％-95％)。
表8
在测试时，这些人源化构建体各自展现出与鼠类亲本抗体所显示的那些大致相当的有利的结合特征(数据未示出)。
实例5
人源化的抗CD324抗体的产生
基本上如实例1-3中所述产生抗CD324人源化抗体。在PCT/US 2013/25356中提供了CD324抗原和相应抗体的产生的更详细的描述，关于此将该文献通过引用结合于此。接种六只雌性小鼠之后，基本如实例1所述产生了生产抗体的杂交瘤。如先前论述的，筛选杂交瘤，并从感兴趣的那些获得遗传材料。基本上如实例2所述，测定抗SEZ6抗体的重链可变区和轻链可变区的序列。
图4显示示例性抗CD324鼠类抗体SC10.17的轻链可变区(SEQ ID NO:529)和重链可变区(SEQ ID NO:530)的连续氨基酸序列。在所附的序列表中提供了对应于鼠类重链和轻链的核酸序列(SEQ ID NO:531和532)。来自抗CD324抗体的SC10.17和其他相容性轻链可变区和重链可变区的序列显示在PCT/US 2013/25356中，关于这些序列将该文献结合于此。
基本上如上述实例3所述，使用标准分子工程技术将SC10.17抗CD324鼠类抗体人源化。使用Kabat编号，图4表示使用如阿拜斯数据库测定的鼠类亲本抗体以及衍生的人源化构建体的重链和轻链的CDR和框架区。图4的审阅显示了鼠类重链和轻链CDR转移到人类受体分子，其中在CDR中只有微小变化。更具体地，图4显示了示例性人源化抗CD324抗体(称为hSC10.17)的轻链(SEQ ID NO:531)和重链(SEQ ID NO:532)的氨基酸序列。正如亲本鼠类抗体，相应的核酸序列在所附序列表(SEQ ID NO:535和536)中陈述。与鼠类供体序列相比，hSC10.17的轻链可变区和重链可变区与人类供体序列的轻链可变区和重链可变区展现更高的同源性(数据未显示)。
实例6
位点特异性抗DLL3抗体的制造
构建了四种工程化的人类IgG1/κ抗DLL3位点特异性抗体。四种工程化抗体中的两种包含天然轻链恒定区并且在重链中具有突变，其中在重链的上部铰链区中的、与轻链中的半胱氨酸214形成链间二硫键的半胱氨酸220(C220)被丝氨酸取代(C220S)或去除(C220Δ)。剩余的两个工程化抗体包含天然重链恒定区和突变轻链，其中轻链的半胱氨酸214被丝氨酸取代(C214S)或去除(C214Δ)。当组装时，重链和轻链形成包含适合于与治疗剂缀合的两个游离半胱氨酸的抗体。每个示例性hSC16.56构建体的重抗体链和轻抗体链的氨基酸序列示于图5A和5B中，而紧接着下表9总结了改变。关于图5A和5B，反应性(或游离)半胱氨酸加下划线，突变残基(在ss1和ss4中)对于重链在位置220处且对于轻链在位置214处也加下划线。除非另有说明，恒定区残基的所有编号均根据Kabat等人所述的EU编号方案。
表9
工程化抗体如下产生。
将编码如实例3中所述衍生的人源化抗DLL3抗体hSC16.56轻链(SEQ ID NO:507)或重链(SEQ ID NO:508)的表达载体用作PCR扩增和定点突变的模板。根据制造商的说明，使用Quick-系统(安捷伦科技)进行定点突变。
对于两个重链突变体，将编码hSC16.56的突变体C220S或C220Δ重链的载体与hSC16.56的天然IgG1κ轻链共转染于CHO-S细胞中，并使用哺乳动物瞬时表达系统表达。将含有C220S或C220Δ突变体的工程化抗DLL3位点特异性抗体分别称为hSC16.56ss1(SEQ IDNO:509和507)或hSC16.56ss2(SEQ ID NO:510和507)。
对于两个轻链突变体，将编码hSC16.56的突变体C214S或C214Δ轻链的载体与hSC16.56的天然IgG1重链共转染于CHO-S细胞中，并使用哺乳动物瞬时表达系统表达。使用蛋白A色谱(MabSelect SuRe)纯化工程化抗体，并将其储存在合适的缓冲液中。将含有C214S或C214Δ突变体的工程化抗DLL3位点特异性抗体分别称为hSC16.56ss3(SEQ ID NO:508和511)或hSC16.56ss4(SEQ ID NO:508和512)。
通过SDS-PAGE表征工程化的抗DLL3抗体，以证实已经产生了正确的突变体。在存在和不存在还原剂如DTT(二硫苏糖醇)的情况下，在来自生命技术公司的预制10％Tris-甘氨酸微型凝胶上进行SDS-PAGE。电泳后，用胶体考马斯溶液对凝胶进行染色(数据未显示)。
观察到两个重链(HC)突变体hSC16.56ss1(C220S)和hSC16.56ss2(C220Δ)、以及两个轻链(LC)突变体hSC16.56ss3(C214S)和hSC16.56ss4(C214Δ)的条带图。在还原条件下，对于每种抗体，观察到对应于游离LC和游离HC的两个条带。这种图是还原条件下IgG分子的典型图。在非还原条件下，四种工程化抗体(hSC16.56ss1-hSC16.56ss4)展现与天然IgG分子不同的条带图，指示在HC和LC之间不存在二硫键。所有四个突变体展现对应于HC-HC二聚体的约98kD的条带。在LC上具有缺失或突变的突变体(hSC16.56ss3和hSC16.56ss4)展现对应于游离LC的约24kD的单个条带。在重链上含有缺失或突变的工程化抗体(hSC16.56ss1和hSC16.56ss2)具有对应于游离LC的模糊条带和对应于LC-LC二聚体的约48kD的显著条带。由于每个轻链的c末端的游离半胱氨酸，预期在ss1和ss2构建体的情况下形成一定量的LC-LC物质。
实例7
位点特异性抗SEZ6抗体的制造
使用人源化抗体hSC17.200作为起点，基本上如实例6所述构建了四种工程化的人类IgG1/κ抗SEZ6位点特异性抗体。四种工程化抗体中的两种包含天然轻链恒定区并且在重链中具有突变，其中在重链的上部铰链区中的、与轻链中的半胱氨酸214形成链间二硫键的半胱氨酸220(C220)被丝氨酸取代(C220S)或去除(C220Δ)。剩余的两个工程化抗体包含天然重链恒定区和突变轻链，其中轻链的半胱氨酸214被丝氨酸取代(C214S)或去除(C214Δ)。当组装时，重链和轻链形成包含适合于与治疗剂缀合的两个游离半胱氨酸的抗体。每个示例性hSC17.200构建体的重抗体链和轻抗体链的氨基酸序列示于图6A和6B中，而紧接着下表10总结了改变。关于图6A和6B，反应性半胱氨酸加下划线，突变残基(在ss1和ss4中)对于重链在位置220处且对于轻链在位置214处加下划线。除非另有说明，恒定区残基的所有编号均根据Kabat等人所述的EU编号方案。
表10
将包含位点特异性工程化hSC17.200抗体的重链和轻链的表达载体引入CHO或293细胞中，然后将这些细胞用于产生如在此所述的位点特异性抗体。
除了hSC17.200位点特异性抗体之外，hSC17.17抗体可以按基本上相同的方式产生和表达。示例性的hSC17.17位点特异性抗体将如紧接着陈述的下表11中总结的，全长重链和轻链氨基酸序列由如所指示的所附序列表中包括。
表11
实例8
位点特异性抗CD324抗体的制造
构建了四种工程化的人类IgG1/κ抗CD324位点特异性抗体。四种工程化抗体中的两种包含天然轻链并且在重链中具有突变，其中在重链的上部铰链区中的、与轻链中的半胱氨酸214形成链间二硫键的半胱氨酸220(C220)被丝氨酸取代(C220S)或去除(C220Δ)。剩余的两个工程化抗体包含天然重链和突变轻链，其中轻链的半胱氨酸214被丝氨酸取代(C214S，参见图7)或去除(C214Δ)。工程化抗体如下产生。
使用编码包含适当可变区(SEQ ID NO:531和532)的人源化抗CD324 hSC17.10抗体轻链或重链的表达载体作为PCR扩增和定点突变的模板。根据制造商的说明，使用Quick-系统(安捷伦科技)进行定点突变。
对于两个重链突变体，将编码hSC10.17的突变体C220S或C220Δ重链的载体与hSC10.17的天然IgG1κ轻链共转染于CHO-S细胞中，并使用哺乳动物瞬时表达系统表达。含有C220S或C220Δ突变体的工程化抗CD324位点特异性抗体分别称为SC10.17ss1或SC10.17ss2。
对于两个轻链突变体，将编码hSC10.17的突变体C214S或C214Δ轻链的载体与hSC10.17的天然IgG1重链共转染于CHO-S细胞中，并使用哺乳动物瞬时表达系统表达。使用蛋白A色谱(MabSelectSure蛋白A树脂)纯化工程化抗体，并将其储存在合适的缓冲液中。含有C214S或C214Δ突变体的工程化抗CD324位点特异性抗体分别称为SC10.17ss3或SC10.17ss4。
hSC10.17ss3的完整天然重链的氨基酸序列在图7中示为SEQ ID NO:543，而完整工程化轻链的氨基酸序列在同一图中示为SEQ ID NO:544。κ轻链中的C214S(Kabat编号)位置由*表示，重链位置220处的游离半胱氨酸(也是根据Kabat编号的EU索引)也由*表示。
实例9
位点特异性构建体保留结合特征
通过ELISA测定筛选如先前实例中所述制备的位点特异性抗DLL3抗体，以确定它们是否与DLL3纯化蛋白结合。将亲本天然抗体用作对照，并且与位点特异性抗DLL3抗体一起运行。用与辣根过氧化物酶(HRP)结合的单克隆抗体(mAb)报告抗体(南方生物技术公司(Southern Biotech)，目录号SB9052-05)检测抗体与DLL3的结合，所述报告抗体结合存在于人类IgG1分子上的表位。HRP与其底物四甲基联苯胺(TMB)反应。水解的TMB的量和与DLL3结合的测试抗体的量成正比。
将ELISA板用PBS中的1μg/ml纯化的DLL3涂覆并在4℃下孵育过夜。通过洗涤除去过量的蛋白质，并且用含有0.05％tween 20(PBST)的PBS中的2％(w/v)BSA(200μL/孔)将孔在室温下阻断1小时。洗涤之后，将100μL/孔连续稀释的抗体或ADC在室温下添加在PBST中持续1小时。将板再次洗涤，并且将0.5ug/ml的100μL/孔的适当的报告抗体在室温下添加在PBST中持续1小时。再次洗涤之后，通过在室温下添加100μL/孔的TMB底物溶液(赛默科技公司(Thermo Scientific))持续15分钟来使板显色。添加等体积的2MH2SO4以使底物显色停止。然后通过分光光度计在OD 450下分析样品。
ELISA的结果作为结合曲线示于图8中。数据的综述证实，将重链CH1结构域工程化以在轻链恒定区上提供游离半胱氨酸并不会不利地影响抗体与靶抗原的结合。用各种位点特异性构建体进行的类似测定(数据未示出)显示将轻链恒定区或CH1区工程化以提供游离半胱氨酸对所得抗体或ADC的结合特征几乎没有影响。
实例10
位点特异性抗SEZ6 ADC的缀合
进行位点特异性抗体缀合，其中工程化的抗SEZ6抗体(如实例7中描述的那些)经由valcit接头与硫醇反应性单甲基奥立抑素E(vcMMAE，参见例如U.S.P.N.7659241)缀合。位点特异性缀合产生具有降低的异质性和种类复杂性的ADC群体。如上所讨论，包含均匀组合物的ADC的同源群体可以对稳定性、药代动力学、聚集和最终的安全特征具有有利的影响。
更具体地说，构建工程化的人类IgG1/κ抗SEZ6抗体，其中与轻链形成链间二硫键的重链(C220)上铰链区中的半胱氨酸被丝氨酸(C220S)取代，得到具有可以缀合细胞毒素的两个未配对半胱氨酸的抗体(hSC17.200ss1)。整个工程化重链的氨基酸序列作为SEQ IDNO:515示于图6A中，而整个轻链的氨基酸序列作为SEQ ID NO:513示于同一图中。重链中的C220S(根据Kabat的EU索引)位置以粗体和下划线表示，κ轻链的位置214(再次根据Kabat编号)处的游离半胱氨酸同样如此。
hSC17.200S以三个不同阶段与vcMMAE缀合；还原步骤、再氧化步骤和缀合步骤。该过程的示意图可见于图9中。
通过添加40摩尔当量的水中的10mM DTT将hSC17.200S完全还原。允许还原反应在室温下进行过夜(>12h)。然后使用30kd膜(Millipore Amicon Ultra)和10个体积的交换缓冲液等效物将还原的抗体缓冲液交换到Tris pH 7.5缓冲液中。然后通过添加4.5摩尔当量的二甲基乙酰胺(DMA)中的10mM脱氢抗坏血酸(DHAA)再氧化还原的hSC17.200S。允许再氧化反应在室温下进行60分钟。然后通过每摩尔来自DMA中的vcMMAE的10mM储备溶液的游离硫醇添加1.2摩尔的vcMMAE而使再氧化的抗体缀合。缀合之前添加另外的DMA，使得反应混合物中DMA的终浓度为大约6％v/v。允许缀合进行最少30分钟，之后通过添加1.2摩尔过量的N-乙酰基半胱氨酸(NAC)(来自在水中制备的10mM储备溶液)将反应淬灭。20分钟的最少淬灭时间之后，通过添加4％v/v的0.5M乙酸将pH调节至5.5±0.3。无菌过滤和最终配制之前，将缀合的hSC17.200SvcMMAE使用10kDa膜和共计10个体积的缓冲液交换通过恒量渗滤而渗滤到20mM组氨酸氯(pH6.0)中。所得ADC展现出和缀合的天然SC17.200抗体可比的与SEZ6抗原的结合和相对较高百分比的DAR＝2化合物。
实例11
位点特异性抗体的缀合
与包含vcMMAE的接头-药物缀合之前，使用DTT将如以上实例6和7所述制备的位点特异性抗体(hSC16.56ss1和hSC17.200ss1)完全还原或使用TCEP(三(2-羧乙基)膦)将所述抗体部分还原。
该过程的示意图同样可见于图9中。这个构建体的靶标缀合位点是每个轻链恒定区上未配对半胱氨酸(C214)。可以使用能追踪轻链上的中靶缀合与重链上的脱靶缀合的反相HPLC(RP-HPLC)测定来监测缀合效率(中靶和脱靶缀合)。疏水相互作用色谱(HIC)测定可以用于监测药物抗体比率种类(DAR)的分布。在这个实例中，希望的产物是如通过反相色谱确定的轻链(中靶)上最大缀合且使过缀合的(DAR>2)种类最小化同时使DAR＝2种类最大化的ADC。
可以通过添加40摩尔当量的10mM DTT将hSC16.56ss1或hSC17.200ss1的不同制剂完全还原或通过添加2.6摩尔当量的10mM TCEP将所述制剂部分还原。
使用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)和10个体积的交换缓冲液等效物缓冲液交换到Tris pH 7.5缓冲液中之前，将用l0mM DTT还原的样品在室温下还原过夜(>12h)。然后通过添加4.0摩尔当量的二甲基乙酰胺(DMA)中的10mM脱氢抗坏血酸(DHAA)再氧化所得完全还原的制剂。当样品的游离硫醇浓度(每抗体的游离硫醇数目，如通过埃尔曼(Ellman)方法测量的)在1.9和2.3之间时，使抗体的游离半胱氨酸与MMAE细胞毒素经由马来酰亚胺基接头在室温下缀合最少30分钟。然后使用在水中制备的10mM储备溶液，通过添加1.2摩尔过量的N-乙酰基-半胱氨酸(NAC)来淬灭反应。20分钟的最少淬灭时间之后，通过添加0.5M乙酸将pH调节至6.0。然后使用30kDa膜通过渗滤将抗体-MMAE的各种缀合制剂缓冲液交换到20mM组氨酸氯(pH6.0)中。
将用10mMTCEP部分还原的样品在室温下还原最少90分钟。当样品的游离硫醇浓度在1.9和2.3之间时，使部分还原的抗体与MMAE再次经由马来酰亚胺基接头在室温下缀合最少30分钟。然后通过添加1.2摩尔过量的来自在水中制备的10mM储备溶液的NAC来淬灭反应。20分钟的最少淬灭时间之后，通过添加0.5M乙酸将pH调节至6.0。然后使用30kDa膜通过渗滤将缀合的抗体-MMAE的制剂缓冲液交换到20mM组氨酸氯(pH6.0)中。
使用RP-HPLC分析最终的抗体-药物制剂(DTT还原的和TCEP还原的两者)以量化重链与轻链缀合位点，以确定hSC16.56ss1-MMAE(图10A)或hSC17.200ss1-MMAE(图10B)的中靶轻链缀合的百分比。该分析采用Aeris WIDEPORE 3.6 μMeta C4柱(菲罗门公司(Phenomenex))，水中的0.1％v/v TFA作为流动相A，90％v/v乙腈中的0.1％v/v TFA作为流动相B。分析之前将样品用DTT完全还原，然后注射到柱上，在柱上在10分钟内施加30％-50％的流动相B梯度。收集214nm下的UV信号并且然后将其用于计算重链和轻链缀合的程度。
更具体地说，在使用DTT和TCEP缀合的hSC16.56ss1-MMAE和hSC17.200ss1-MMAE中的重链和轻链之间的有效载荷的分布示于图10A和10B中。通过将先前建立的峰(轻链、轻链+1种药物、重链、重链+1种药物、重链+2种药物等)的RP-HPLC曲线下的面积积分并且分别计算每条链的％缀合来进行重链和轻链上的缀合百分比。如整个说明书所讨论的，本发明的所选实施例包含有利于将有效载荷放置在轻链上的缀合程序。
还使用HIC分析相同的制剂以确定hSC16.56ss1-MMAE(图11A)和hSC17.200ss1-MMAE(图11B)的DAR＝2种类相对于不需要的DAR>2种类的量。在此方面，使用PolyPROPYL A3μm柱(PolyLC公司)进行HIC，水中的1.5M硫酸铵和25mM磷酸钾作为流动相A，并且水中的0.25％w/v CHAPS和25mM磷酸钾作为流动相B。将样品直接注射到柱上，在柱上在15分钟内施加0-100％的流动相B梯度。收集280nm下的UV信号，并且分析未缀合的抗体和较高DAR种类的色谱图。通过将先前建立的峰(DAR＝0、DAR＝1、DAR＝2、DAR＝4等)的HIC曲线下面积积分并且计算每个峰的％来进行DAR计算。使用DTT和TCEP缀合的hSC16.56ss1-MMAE和hSC17.200ss1-MMAE中的所得DAR分布分别示于图11A和11B中。
如通过HIC确定的hSC16位点特异性缀合物制剂的DAR分布表明，DTT/DHAA完全还原和再氧化方法产生约60％的DAR＝2种类，而典型的部分TCEP还原方法产生约50％的DAR＝2。完全还原和再氧化方法也产生更高的不想要的DAR>2种类(20％-25％)，而部分TCEP还原方法产生10％-15％的DAR>2(图11A和11B)。需注意，虽然TCEP部分还原具有较低水平的DAR>2种类，但是DAR＝2百分比仅为50％。在TCEP体系中抬高％DAR＝2种类将导致不需要的DAR>2种类的相应增加。DTT/DHAA全还原样品的高DAR种类的增加可归因于重链上较高的脱靶缀合，如通过RP-HPLC所示的(图10A和10B)，这是由于当还原驱动力增加时铰链区半胱氨酸残基的非特异性还原。因此，虽然所披露的位点特异性构建体提供了相对于天然抗体的改进的DAR和较少的不需要的较高DAR杂质，但是常规的还原方法产生至少一些在与预期工程化位点不同的半胱氨酸残基上包含细胞毒性剂的非特异性缀合物。
实例12
使用选择性还原方法缀合工程化的抗体
为了进一步改进终产物的缀合特异性和均匀性，在与包含MMAE的接头-药物缀合之前，使用包含稳定剂(例如L-精氨酸)和温和还原剂(例如谷胱甘肽)的新颖方法选择性还原如实例6和7所述制备的位点特异性抗体。如上所讨论，选择性缀合以少量的非特异性缀合优先地将细胞毒素缀合在游离半胱氨酸上。
根据实例6和7，hSC16.56ss1构建体的靶标缀合是每条轻链上未配对半胱氨酸。为了与这些工程化位点直接缀合，在含有1ML-精氨酸/5mM谷胱甘肽、还原(GSH)/5mM EDTA(pH8.0)的缓冲液中，将hSC16.56ss1和hSC17.200ss1的制剂在室温下部分还原最少一小时。另外，作为对照，在1M L-精氨酸/5mM EDTA(pH8.0)和20mM Tris/3.2mM EDTA/5mM GSH(pH8.2)缓冲液中分开地孵育每种抗体制剂。然后将所有制剂使用30kDa膜(MilliporeAmicon Ultra)缓冲液交换到20mM Tris/3.2mM EDTA(pH 8.2)缓冲液中。所得部分还原的制剂(对于在精氨酸和谷胱甘肽中一起孵育的样品)具有1.9和2.3之间的游离硫醇浓度，并且然后使所有制剂在室温下经由马来酰亚胺基接头与MMAE缀合最少30分钟。然后使用在水中制备的10mM储备溶液，通过添加1.2摩尔过量的NAC来淬灭反应。20分钟的最少淬灭时间之后，通过添加0.5M乙酸将pH调节至6.0。然后使用30kDa膜通过渗滤将抗体-MMAE的各种缀合制剂渗滤到20mM组氨酸氯(pH6.0)中。
如先前所讨论的使用RP-HPLC分析最终的抗体-药物制剂以量化重链与轻链缀合位点，以确定中靶轻链缀合的百分比(图12A和12B)。还使用疏水相互作用色谱分析样品，以确定DAR＝2种类相对于不需要的DAR>2种类的量(图13A和13B)。出于比较目的，在先前实例中获得的DTT/DHAA和TCEP还原的样品的结果被包括在图12和13中。EDTA/GSH对照的HIC分析示于图14A和14B中，它们被示出在选择性还原的样品旁边。
图12和13总结了与标准的完全或部分还原过程相比，使用选择性还原过程还原的抗体的HICDAR分布和％缀合的轻链(如实例10和11所述)。选择性缀合方法与工程化的构建体组合的益处是显而易见的，导致希望的轻链缀合位点的优异选择性(图12A和12B)并提供60％-75％的平均DAR＝2水平同时将不需要的DAR>2种类保持在低于10％(图13A和13B)。示于图12和13中的结果证明，选择性还原驱动该反应以提供比标准的部分或完全还原方法更高水平的DAR＝2和更少的不希望的DAR>2种类。示于图14A和14B中的对照程序证明，在不存在稳定剂(例如L-精氨酸)的情况下，温和还原剂(例如GSH)不能影响希望的缀合。
这些数据证明，选择性还原提供了优于常规的部分和完全还原缀合方法的优势。当新颖选择性还原程序与被工程化为提供未配对的(或游离的)半胱氨酸残基的抗体结合使用时尤其如此。与稳定剂组合的温和还原(即选择性还原)产生稳定的游离硫醇，其容易地与与各种接头-药物缀合，而DHAA再氧化是时间敏感的并且TCEP还原不如此成功，特别是对于本文所述的工程化构建体。
实例13
用不同体系的选择性还原
为了进一步证明使用稳定剂和还原剂的各种组合的选择性还原的优势，在缀合之前使用不同稳定剂(例如L-赖氨酸)与不同温和还原剂(例如N-乙酰基-半胱氨酸或NAC)组合选择性还原hSC16.56ss1。
使用三种不同的缓冲液体系选择性还原hSC16.56ss1的三种制剂中的每者：(1)1ML-精氨酸/6mM GSH/5mM EDTA，pH 8.0；(2)1ML-精氨酸/l0mM NAC/5mM EDTA，pH8.0；和(3)1ML-赖氨酸/5mM GSH/5mM EDTA，pH 8.0。另外，作为对照，在20mM Tris/5mM EDTA/10mMNAC(pH8.0)和20mM Tris/3.2mM EDTA/5mM GSH(pH8.2)缓冲液中分开地孵育抗体制剂。将所有制剂在室温下孵育最少一小时，并且然后使用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)通过渗滤缓冲液交换到20mM Tris/3.2mM EDTA(pH8.2)缓冲液中。然后使所得选择性还原的制剂(其被发现具有1.7与2.4之间的游离硫醇浓度)经由马来酰亚胺基接头与MMAE缀合。允许缀合反应在室温下进行最少30分钟之后，使用10mM储备溶液通过添加1.2摩尔过量的NAC将反应淬灭。20分钟的最少淬灭时间之后，通过添加0.5M乙酸将pH调节至6.0。然后使用30kDa膜通过渗滤将抗体-MMAE的各种缀合制剂缓冲液交换到20mM组氨酸氯(pH 6.0)中。然后使用疏水相互作用色谱分析最终抗体-药物制剂以确定DAR分布(图15)。
所采用的三种不同选择性还原体系(Arg/GSH、Lys/GSH和Arg/NAC)的如通过HIC确定的DAR分布显示出相似的结果。更具体地说，不同制剂的DAR＝2水平是60％-65％，并且所有选择性还原体系和接头-药物组合的高DAR种类(DAR>2)保持在低于20％，表明对轻链恒定区的工程化半胱氨酸残基的高选择性。再次，如先前在实例12中所示，单独的温和还原剂(例如GSH或NAC)不能提供足够的缀合选择性，而稳定剂的添加导致显著改善。
实例14
位点特异性缀合物保留结合特征
筛选如先前实例中所述制备的位点特异性抗DLL3 ADC，以确定它们是否与DLL3纯化蛋白结合。代表性筛选测定是ELISA测定，基本上如下所述进行。ELISA用于选择保留结合特征的工程化抗体。
以缀合和非缀合形式使用亲本非工程化抗体作为对照，并且与位点特异性抗DLL3抗体和抗DLL3抗体药物缀合物一起运行。用与辣根过氧化物酶(HRP)结合的单克隆抗体(mAb)报告抗体(南方生物技术公司(Southern Biotech)，目录号SB9052-05)检测抗体与DLL3的结合，所述报告抗体结合存在于人类IgG1分子上的表位。使用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体检测ADC(位点特异性的或常规的)与DLL3的结合，所述抗体与ADC上的药物或药物接头结合。HRP与其底物四甲基联苯胺(TMB)反应。水解的TMB的量和与DLL3结合的测试品的量成正比。
将ELISA板用PBS中的1μg/ml纯化的DLL3涂覆并在4℃下孵育过夜。通过洗涤除去过量的蛋白质，并且用含有0.05％tween 20(PBST)的PBS中的2％(w/v)BSA(200μL/孔)将孔在室温下阻断1小时。洗涤之后，将100μL/孔连续稀释的抗体或ADC在室温下添加在PBST中持续1小时。将板再次洗涤，并且将0.5ug/ml的100μL/孔的适当的报告抗体在室温下添加在PBST中持续1小时。再次洗涤之后，通过在室温下添加100μL/孔的TMB底物溶液(赛默科技公司(Thermo Scientific))持续15分钟来使板显色。添加等体积的2M H2SO4以使底物显色停止。然后通过分光光度计在OD 450下分析样品。
实例15
位点特异性缀合物的体外细胞毒性
进行测定以证实位点特异性缀合物在体外有效地杀灭表达人类DLL3抗原的细胞的能力。例如，可以使用测定来测量抗DLL3位点特异性缀合物杀灭被工程化为表达人类DLL3的HEK293T细胞的能力。在这个测定中，杀灭需要ADC(位点特异性的或对照)与细胞表面上的其DLL3靶标结合，随后内化ADC。在内化后，接头(例如，如上所述的Val-Ala蛋白酶可裂解接头)被裂解并且释放细胞内的细胞毒素，导致细胞死亡。使用测量作为细胞活力的替代物的ATP含量的CellTiter-Glo试剂测量细胞死亡。
基本上如下进行代表性测定。在添加抗体药物缀合物前一天，将细胞铺板到96孔组织培养物处理的板中，在补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM(DMEM完全培养基)中每孔500个细胞。铺板后24小时，将细胞用连续稀释的SCAb-细胞毒素对照或SCAbss1-细胞毒素在DMEM完全培养基中处理。将细胞在处理后培养96小时，之后根据制造商的说明书使用Cell(普洛麦格公司(Promega))枚举活细胞数目。
实例16
位点特异性缀合物在血清中的稳定性
为了证明由本发明的位点特异性缀合物提供的改进的稳定性，使选择的缀合物在体外长时间暴露于人类血清。随时间测量ADC的降解。例如，基本上如下进行代表性测定。
将SCAb ADC和SCAbss1 ADC(各自包含相同的细胞毒素)添加到商购的人类血清(生物再生公司(Bioreclamation))中，并且在37℃、5％CO2下长时间孵育。在添加后0、24、48、96和168小时收集样品，并且使用夹心ELISA测量稳定性，以测量总抗体含量和ADC水平。
关于总抗体含量的测量，ELISA被配置为检测缀合的和未缀合的SCAb或SCAbss1抗体两者。这个测定采用一对抗独特型抗体，其特异性捕获并检测具有或不具有缀合细胞毒素的SCAb和SCAbss1。在机械上，使用MSD Technology Platform(其使用电化学发光来提高灵敏度和线性度)(中尺度诊断有限责任公司(Meso Scale Diagnostics,LLC))进行测定。
为此，将MSD高结合板在4℃下用2ug/mL捕获抗独特型(ID-16)抗体涂覆过夜。第二天，将板用PBST(PBS+0.05％Tween20)洗涤并用PBST中的150uL3％BSA阻断。将25uL血清样品连同ADC标准曲线添加到板中并允许在室温下孵育2小时。孵育之后，将板用PBST洗涤并且将0.5ug/mL的25uL磺基标记的检测抗独特型(ID-36)抗体添加到每个孔中并在室温下孵育1小时。然后将板洗涤并且每孔添加150uL lx MSD读取缓冲液并用MSD读取器读出。数据以最初添加到人类血清中的总ADC的百分比用图表表示。
除监测总抗体浓度之外，还在收集的样品上进行ELISA测定，以确定剩余的抗体药物缀合物的水平。也就是说，该测定法使用通常如上刚刚所述的ELISA方法测量完整的SCAb-细胞毒素和SCAbss1-细胞毒素的水平。然而，不同于先前的ELISA测定，这个ELISA量化与一个或多个细胞毒素分子缀合的SCAb或SCAbss1抗体，但不能确定实际存在于检测到的ADC上的细胞毒素分子的数目。不同于总抗体测定，这个测定使用抗独特型mAb和抗细胞毒素特异性mAb的组合，并且无法检测未缀合的SCAb抗体。
这个ELISA测定使用MSD Technology Platform来生成数据，并且基本上如下进行代表性测定。将MSD标准结合板在4℃下用4ug/mL抗细胞毒素特异性mAb涂覆过夜。第二天，将板用PBST(PBS+0.05％Tween20)洗涤并用PBST中的150uL3％BSA阻断。将25uL血清样品连同ADC标准曲线和QC样品添加到板中并允许在室温下孵育2小时。孵育之后，将板用PBST洗涤并且将0.5ug/mL的25uL磺基标记的检测抗独特型抗体(ID-36)添加到每个孔中并在室温下孵育1小时。然后将板洗涤并且每孔添加150uL lX MSD读取缓冲液并用MSD读取器读出。分析数据以选择显示最小ADC降解的ADC，以便避免由游离细胞毒素引起的非特异性毒性和治疗指数的相应降低。
实例17
位点特异性缀合物在血清中的白蛋白转移
通过常规ADC，已经注意到血清中的白蛋白可以浸出缀合的细胞毒素，从而增加非特异性细胞毒性。为了确定由白蛋白转移介导的位点特异性ADC降解的量，开发了ELISA测定以测量血清中的暴露于SCAb-细胞毒素和SCAbss1-细胞毒素的白蛋白-细胞毒素(hAlb-细胞毒素)的量。这个ELISA使用抗细胞毒素特异性mAb捕获hAlb-细胞毒素，并且使用抗人类白蛋白mAb作为检测抗体。因为游离ADC将与hAlb-细胞毒素竞争，所以血清样品在测试之前会耗尽ADC。从hAlb-细胞毒素标准曲线外推量化。与先前的实例一起，这个测定使用MSDTechnology Platform来生成数据。基本上如下进行代表性测定。
最初，将血清样品用SCAb-细胞毒素或SCAbssl-细胞毒素与相关对照一起接种至终浓度为10μg。与先前的实例一样，在添加后0、24、48、96和168小时取样。将MSD标准结合板在4℃下用4ug/mL抗细胞毒素特异性mAb涂覆过夜。第二天，将板用PBST(PBS+0.05％Tween20)洗涤并在室温下用25uL MSD Diluent2+0.05％Tween-20阻断30分钟。将血清样品以1:10稀释在MSD Diluent2+0.1％Tween-20(lO uL血清+90uL稀释液)中并在涡旋振荡器上用20uLGE的MabSelect SuRe ProteinA树脂孵育1小时。通过抗独特型抗体耗尽完整的SCAb-细胞毒素或SCAbssl-细胞毒素之后，使用96孔3M滤板从树脂中分离样品。然后将25uL的耗尽的血清样品连同hAlb-6.5标准曲线一起添加到阻断板中并在室温下孵育1小时。孵育之后，将板用PBST洗涤并且添加稀释于MSD Diluent3+0.05％Tween-20中的25uL的lug/mL磺基标记的抗人类白蛋白mAb(Abeam ab10241)。然后将板孵育1小时，用PBST洗涤，并用150uL 1X MSD读取缓冲液读出。分析数据以选择显示出最小白蛋白转移率的ADC。
实例18
位点特异性构建体证实体内功效
进行体内实验以确认本文所述的位点特异性构建体的细胞杀灭能力。为此，基本上如下在携带皮下患者来源的异种移植物(PDX)小细胞肺癌(SCLC)肿瘤的免疫受损的NODSCID小鼠中测试如先前实例所述制备的位点特异性DLL3 ADC的体内治疗效果。在三种不同SCLC模型中测试抗DLL3-细胞毒素缀合物(SCAb-ADC)、HIC纯化的抗DLL3-细胞毒素缀合物(SCAb-ADCD2)和HIC纯化的位点特异性抗DLL3-细胞毒素缀合物(SCAbssl-ADCD2)中的每者。
SCLC-PDX系(LU129、LU64和LU117)各自作为解离的细胞接种物被注射在乳腺脂肪垫区附近的皮肤下，并用卡尺每周测量(椭球体积＝a×b2/2，其中a是椭圆的长直径，并且b是短直径)。肿瘤生长至平均尺寸200mm3(范围，100-300mm3)之后，将小鼠随机分到具有相同肿瘤体积平均值的处理组(n＝5只小鼠/组)中。将小鼠用含有运载体(无菌水中的5％葡萄糖)、对照人类IgG1ADC(IgG-ADC；1mg/kg)或SCAb-ADC制剂(0.75-1.5mg/kg)的单剂量(100μL)经由腹膜内注射进行处理，通过每周肿瘤体积(如上用卡尺)和重量测量值评估治疗效果。单独的小鼠或处理组的终点标准包括健康评估(任何疾病征兆)、体重减轻(从研究开始体重减轻超过20％)和肿瘤负荷(肿瘤体积>1000mm3)。通过每周肿瘤体积测量值(mm3)监测功效，直到组达到大约800-1000mm3的平均值。将肿瘤体积计算为处理组中所有小鼠的平均值与标准误差均值，并且相对于自初次处理的时间(天)进行绘图。处理结果被描绘为每个处理组5只小鼠的平均肿瘤体积与标准误差均值(SEM)。
在携带SCLC PDX-LU129、PDX-LU64或PDX-LU117的小鼠中评估通过每抗体含有2个药物分子的分子种类的HIC纯化(在两种制剂中)使用常规的(SCAb-细胞毒素或SCAb-ADCD2)或位点特异性的策略(SCAbss1-ADCD2)缀合的结合DLL3的ADC。分析结果以评估结合DLL3的ADC的HIC纯化和/或位点特异性缀合对治疗效果的影响。
实例19
位点特异性缀合物展现出降低的毒性
为了进一步扩大所披露的缀合物制剂的治疗指数，进行研究以记录它们的毒性特征。具体地说，进行这些研究以选择耐受性更好(例如，相同数目的剂量没有死亡、皮肤毒性的发生率降低、骨髓毒性降低、淋巴组织调查结果的严重性降低等)的抗DLL3位点特异性缀合物。值得注意地，毒性的降低显著提高治疗指数，因为它在肿瘤部位提供显著更高的给药和相应的更高的细胞毒素局部浓度。基本上如下进行代表性测定。
将DAR2纯化位点特异性ADC(SCAbssl-ADCD2)的毒性与常规缀合物(SCAb-ADC)或其DAR2纯化版本的毒性进行比较。每种制剂包含相同的细胞毒素。使用食蟹猴作为测试体系来进行研究。记录并比较存活、临床征象、体重、食物消耗、临床病理学(血液学、凝血、临床化学和尿分析)、毒代动力学、肉眼尸检调查结果、器官重量和组织病理学检查。
实例20
工程化的位点特异性缀合物
除以上实例中制备和表征的位点特异性抗体之外，还制备了包含引入的半胱氨酸或修饰的半胱氨酸近端残基的几种示例性工程化构建体。更具体地说，根据本发明以几种不同方式修饰κ CL区，以提供工程化的抗体和缀合物。在此方面，将每个CL结构域与识别DLL3的对照VL结构域相关联，并且使轻链与包含C220S取代的修饰的抗DLL3重链配对。修饰的CL结构域的序列示于图16中(SEQ ID NO:502、503和550-564)连同野生型κ CL(SEQ IDNO:403)，其中改变的/引入的残基被加下划线。尽管使用κCL用于示范目的，但是应理解的是可以如本文所述的容易地选择和工程化相容的λCL以提供本发明的工程化抗体。在任何情况下，在这个实施例中的所有编号是根据EU编号方案。
取决于并入的突变的类型，对CL结构域的修饰通常属于三个类别之一。第一类并入另外的或修饰的负电荷，以便模拟或增强选择性还原的正效应。在此方面，ss5含有E213D突变，而ss6包含在亲本轻链的E213和C214之间插入另外的谷氨酸。
第二类在κ恒定区的与亲本C214残基邻近且溶剂暴露的柔性环上并入替代位点。所有这些构建体都具有C214S突变或C214缺失，以便有效地将缀合的半胱氨酸位点从C214移动到轻链上的其他位置。这包括位置182和191之间的区域，对其而言ss10(K190C C214S)是代表性构建体。这还可以包括位置121和128之间的区域，对其而言ss9(D122C C214S)是代表性构建体。这还可以包括位置210和213之间的区域，由ss13(N210C C214S)、ss14(R211C C214S)、ss15(G212C C214S)、ss16(E213C C214S)和ss19(G212C，缺失E213-C214)表示。
第三类证明在与亲本C214残基邻近的κ恒定区的Ig折叠的β片层上的暴露残基提供潜在的游离半胱氨酸位点，如本文所讨论的。在这样的实施例中，优先地消除C214或用丝氨酸取代以除去潜在竞争的半胱氨酸，ss11(T206C C214S)和ss12(S208C C214S)是这个第三类的代表性构建体。
来自三个类别的策略组合也可以进一步改进工程构建体并增强位点特异性缀合。例如，ss7(E213C C214E)和ss8(G212C C214缺失)将来自C末端带负电荷的残基的类别1的策略与来自用于位点特异性缀合的半胱氨酸新位置的类别2的策略组合。几种构建体将C末端残基的截短与来自三个类别中一个或多个的策略组合。ss17(R211C G212Δ，E213Δ，C214Δ)采用与C214位点不同的位置中的半胱氨酸以及半胱氨酸的C末端侧上残基的截短的类别2，以产生缀合用的C-末端半胱氨酸。ss18(R211C，G212E，E213-C214Δ)采用位置211中的半胱氨酸的类别2、C末端谷氨酸残基的类别1以及剩余C末端截短的组合。
上述轻链恒定区突变的概述示于下表12中。
表12
使用Quikchange诱变试剂盒(Stratagene公司)或通过定制的基因合成(IDT)制备包含所选VL的所有轻链构建体。如先前所述，将这些轻链构建体克隆到表达载体中并且与所选重链载体共转染到CHO-S细胞中。在此方面，将100μg总载体DNA添加到Opti-MEM中的300μgPEI转染试剂中，并且将混合物在室温下孵育10min，之后添加到细胞中。在转染之后六至八天收获包含组装的位点特异性构建体的上清液。
如上所述，将包含改变的κ CL(仅包含缺失的或取代的天然半胱氨酸)的轻链(SEQID NO:502和503)与包含具有C220残基的野生型恒定区的重链(例如，SEQ ID NO:404)共表达，以提供在抗体重链上包含两个未配对半胱氨酸的抗体。相反地，将包含图16中描述的剩余CL构建体的轻链(SEQ ID NO:550-564)与缺失C220残基的重链(例如，SEQ ID NO:500和501)共表达，以提供在轻链的CL结构域中的两个游离半胱氨酸。总体参见上表2。在任何情况下，通过在800xg下离心10min清除含有重组抗体的培养物上清液中的细胞碎片。然后用Protein A珠纯化重组抗体，并在4℃下储存直到使用。
实例21
工程化的位点特异性缀合物
为了进一步证明新颖方法对选择性还原工程化的游离半胱氨酸残基的有用性，在与包含末端马来酰亚胺基基团的接头-药物缀合之前，将如实例20所述构建的各种位点特异性抗体(SC16ss5、SC16ss6、SC16ss8、SC16ss11、SC16ss14和SC16ss17)选择性还原。
在含有1ML-精氨酸/5mM谷胱甘肽、还原(GSH)/5mM EDTA(pH 8.0)的缓冲液中，将SC16ss5、SC16ss6、SC16ss8、Sc16ss11、SC16ss14和SC16ss17的制剂在室温下部分还原最少一小时。然后将所有制剂使用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)缓冲液交换到20mMTris/3.2mM EDTA(pH 8.2)缓冲液中。然后使所得部分还原的制剂在室温下与LD6.5(PBD)缀合最少30分钟。然后使用在水中制备的10mM储备溶液，通过添加1.2摩尔过量的NAC来淬灭反应。20分钟的最少淬灭时间之后，通过添加0.5M乙酸将pH调节至6.0。然后使用30kDa膜通过渗滤将ADC的各种缀合制剂渗滤到20mM组氨酸氯(His CI)pH 6.0中。
使用疏水相互作用色谱(HIC)分析最终的抗体-药物制剂，以确定DAR＝2种类相对于不需要的DAR>2种类的量(图17)。结果清楚地显示了选择性还原过程对具有未配对半胱氨酸残基的多种位点特异性抗体的适用性。每个所选工程化抗体的DAR＝2缀合的程度大于或等于60％，展现出使用这样的构建体提供ADC的优势。
实例22
工程化的位点特异性抗体的选择性缀合
为了进一步证明本发明的终产物的缀合特异性和均匀性，在与包含末端马来酰亚胺基基团的接头-药物缀合之前，使用包含稳定剂(例如L-精氨酸)和温和还原剂(例如谷胱甘肽)的新颖方法选择性还原如实例20所述制备的位点特异性抗体。
如实例20所述，SC16ss5-19构建体中每者的靶标缀合是每条轻链上未配对半胱氨酸。为了与这些工程化位点直接缀合，在含有1ML-精氨酸/5mM谷胱甘肽、还原(GSH)/5mMEDTA(pH8.0)的缓冲液中，将hSC16ss5-19的制剂在室温下部分还原最少一小时。然后将所有制剂使用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)缓冲液交换到20mM Tris/3.2mM EDTA(pH8.2)缓冲液中。所得部分还原的制剂具有1.9和2.3之间的游离硫醇浓度，并且然后使所有制剂在室温下经由马来酰亚胺基基团与药物接头缀合最少30分钟。然后使用在水中制备的10mM储备溶液，通过添加1.2摩尔过量的NAC来淬灭反应。20分钟的最少淬灭时间之后，通过添加0.5M乙酸将pH调节至6.0。然后使用30kDa膜通过渗滤将各种缀合制剂渗滤到20mM组氨酸氯(pH6.0)中。
使用RP-HPLC分析最终的抗体-药物制剂以量化重链与轻链缀合位点，以确定中靶轻链缀合的百分比(图18)。还使用疏水相互作用色谱分析样品，以确定DAR＝2种类相对于不需要的DAR>2种类的量(图19)。
如图19所示，ss5、ss8、ss14、ss17和ss18构建体提供了大于60％的DAR＝2水平，同时将不需要的DAR>2种类保持在低于20％。这些构建体还提供了最高的希望的轻链缀合(>70％)，如图18所示。构建体ss15和ss16提供了最低水平的DAR2种类并且在RP-UPLC上没有解析，而构建体ss12和ss19提供了最低的轻链缀合(<40％)并且在缓冲液交换期间表现出不稳定性，从而降低总产量和DAR。这样的结果进一步证实了使用所选工程化构建实现的有效且均匀的缀合。
实例23
工程化的位点特异性抗体与MMAE的选择性缀合
为了进一步改进终产物的缀合特异性和均匀性，在与包含MMAE的接头-药物缀合之前，使用稳定剂(例如L-精氨酸)和温和还原剂(例如谷胱甘肽)选择性还原如实例20所述制备的几种所选位点特异性抗体。
如实例20所述，hSC16ss5-19构建体中每者的靶标缀合是每条轻链上未配对半胱氨酸。为了与这些工程化位点直接缀合，在含有1ML-精氨酸/5mM谷胱甘肽、还原(GSH)/5mMEDTA(pH8.0)的缓冲液中，将ss5、ss6、ss8、ss14、ss17、ss18和ss19的制剂在室温下部分还原最少一小时。然后将所有制剂使用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)缓冲液交换到20mM Tris/3.2mM EDTA(pH 8.2)缓冲液中。所得部分还原的制剂具有1.9和2.3之间的游离硫醇浓度，并且然后使所有制剂在室温下经由马来酰亚胺基接头与MMAE缀合最少30分钟。然后使用在水中制备的10mM储备溶液，通过添加1.2摩尔过量的NAC来淬灭反应。20分钟的最少淬灭时间之后，通过添加0.5M乙酸将pH调节至6.0。然后使用30kDa膜通过渗滤将抗体-PBD的各种缀合制剂渗滤到20mM组氨酸氯(pH6.0)中。
使用RP-HPLC分析最终的抗体-药物制剂以量化重链与轻链缀合位点，以确定中靶轻链缀合的百分比(图20)。还使用疏水相互作用色谱分析样品，以确定DAR＝2种类相对于不需要的DAR>2种类的量(图21)。
如图21所示，ss14、ss17和ss18构建体提供了大于/等于60％的DAR＝2水平，同时将不需要的DAR>2种类保持在低于20％。如图20所示，ss8、ss17、ss18和ss19都显示出在RP-HPLC上可接受的分辨率。在这4种构建体中，ss17和ss18提供了最高水平的希望的轻链缀合(80％)，与先前实例中用这些构建体获得的数据相关。这再次证明可以选择性地还原工程化构建体以提供具有有效治疗指数的高度均匀的组合物。
实例24
工程化的位点特异性抗体与卡奇霉素的选择性缀合
为了展现出本发明的多功能性，在与包含卡奇霉素的接头-药物缀合之前，使用稳定剂(例如L-精氨酸)和温和还原剂(例如谷胱甘肽)选择性还原如实例20所述制备的位点特异性抗体。
如实例20所述，SC16ss5-19构建体中每者的靶标缀合是每条轻链上未配对半胱氨酸。为了与这些工程化位点直接缀合，在含有1ML-精氨酸/6mM谷胱甘肽、还原(GSH)/5mMEDTA(pH8.0)的缓冲液中，将ss5、ss6、ss8、ss14、ss17和ss18的制剂在室温下部分还原最少90分钟。然后将所有制剂使用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)缓冲液交换到20mMTris/3.2mM EDTA(pH7)缓冲液中。所得部分还原的制剂具有1.1和2.0之间的游离硫醇浓度，并且然后使所有制剂在室温下经由马来酰亚胺基接头与卡奇霉素过夜缀合最少12小时。然后使用在水中制备的10mM储备溶液，通过添加1.2摩尔过量的NAC来淬灭反应。20分钟的最少淬灭时间之后，通过添加0.5M乙酸将pH调节至6.0。然后使用30kDa膜通过渗滤将抗体-卡奇霉素的各种缀合制剂渗滤到20mM组氨酸氯(pH6.0)中。
使用RP-HPLC分析最终的抗体-药物制剂以量化重链与轻链缀合位点，以确定中靶轻链缀合的百分比(图22)。还使用疏水相互作用色谱分析样品，以确定DAR＝2种类相对于不需要的DAR>2种类的量(图23)。
如图23所示，ss5构建体提供了大于75％的DAR＝2水平，同时将不需要的DAR>2种类保持在低于10％。如图22所示，ss5、ss6、ss8、ss17和ss18都显示出在RP-HPLC上可接受的分辨率。在这5种构建体中，ss5提供了最高水平的希望的轻链缀合(79％)，与先前实例中用这个构建体获得的数据相关。这再次证明可以选择性地还原工程化构建体以提供具有有效治疗指数的高度均匀的组合物。
实例25
工程化的位点特异性抗体与多拉司他汀的选择性缀合
为了进一步说明与本发明相容的宽范围的细胞毒性剂，在与包含多拉司他汀的接头-药物缀合之前，使用稳定剂(例如L-精氨酸)和温和还原剂(例如谷胱甘肽)选择性还原如实例20所述制备的位点特异性抗体。
如实例20所述，SC16ss5-19构建体中每者的靶标缀合是每条轻链上未配对半胱氨酸。为了与这些工程化位点直接缀合，在含有1ML-精氨酸/8mM谷胱甘肽、还原(GSH)/5mMEDTA(pH8.0)的缓冲液中，将ss5、ss6、ss8、ss14、ss17和ss18的制剂在室温下部分还原最少90分钟。然后将所有制剂使用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)缓冲液交换到20mMTris/3.2mM EDTA(pH7)缓冲液中。所得部分还原的制剂具有1.6和2.3之间的游离硫醇浓度，并且然后使所有制剂在室温下经由马来酰亚胺基接头与多拉司他汀缀合最少60分钟。然后使用在水中制备的10mM储备溶液，通过添加1.2摩尔过量的NAC来淬灭反应。20分钟的最少淬灭时间之后，通过添加0.5M乙酸将pH调节至6.0。然后使用30kDa膜通过渗滤将抗体-多拉司他汀的各种缀合制剂渗滤到20mM组氨酸氯(pH6.0)中。
使用RP-HPLC分析最终的抗体-药物制剂以量化重链与轻链缀合位点，以确定中靶轻链缀合的百分比(图24)。还使用疏水相互作用色谱分析样品，以确定DAR＝2种类相对于不需要的DAR>2种类的量(图25)。
如图25所示，ss6构建体提供了大于85％的DAR＝2水平，同时将不需要的DAR>2种类保持在低于5％。如图24所示，ss5、ss6、ss8、ss14、ss17和ss18都显示出在RP-HPLC上可接受的分辨率。在这6种构建体中，ss5和ss6提供了最高水平的希望的轻链缀合(>80％)，与先前实例中用这些构建体获得的数据相关。这再次证明可以选择性地还原工程化构建体以提供具有有效治疗指数的高度均匀的组合物。
实例26
位点特异性缀合物在体外有效地杀灭DLL3+细胞
鉴于上述成功的缀合，进行测定以证实位点特异性缀合物在体外有效地杀灭表达人类DLL3抗原的细胞的能力。更具体地说，测试包含卡奇霉素或多拉司他汀的所选位点特异性ADC以获得其在体外杀灭DLL3+细胞的能力。为此，使DLL3+293细胞暴露于包含SC16.ssl、SC16ss5、SC16ss14和SC16ss18的卡奇霉素位点特异性缀合物以及包含SC16.ss1、SC16ss5和Sc16ss6的多拉司他汀位点特异性缀合物。卡奇霉素缀合物结果示于图26中，而多拉司他汀缀合物的结果示于图27中。
为了进行测定，将过表达hDLL3的HEK-293T细胞的单细胞悬浮液以500个细胞/孔铺板到BD Tissue Culture板(BD生物科学公司(BD Biosciences))中。一天后，将不同浓度的纯化的hSC16.56位点特异性ADC添加到培养物中。将细胞孵育96小时。孵育之后，根据制造商的说明书使用(普洛麦格公司)枚举活细胞。将使用含有未处理细胞的培养物的原始发光计数设为100％参考值，并且将所有其他计数计算为参考值的百分比。
图26的综述显示当与IgG1对照卡奇霉素缀合物相比时，四种DLL3位点特异性卡奇霉素缀合物(SC16.ss1、SC16ss5、SC16ss14和SC16ss18)有效地有效地杀灭DLL3+细胞。类似地，图27图解地说明多拉司他汀DLL3+位点特异性缀合物(SC16.ss1、SC16ss5和SC16ss6与包含两批不同多拉司他汀毒素的SC16ss1)以比IgG1位点特异性多拉司他汀对照显著低的浓度杀灭DLL3+细胞。
一起考虑，呈现于图26和27中的结果最终证明了具有不同缀合位点和不同毒素的多种位点特异性缀合物特异性地介导内化和向表达所选决定簇的细胞递送细胞毒弹头的能力。这些结果表明，所披露的位点特异性缀合物在临床环境中可以有效地用作靶向疗法。
本领域的普通技术人员应进一步理解的是，在不脱离其精神或中心属性的情况下本发明能以其他特定形式实施。由于本发明的前述描述仅仅披露了其示例性实施例，应理解的是，其他变化被考虑为在本发明的范围之内。因此，本发明并不局限于在本文已经详细描述的具体实施例。相反，应当参考所附权利要求书用于指示本发明的范围和内容。

Claims (31)

1.一种包含一个或多个未配对半胱氨酸残基的工程化抗体，其中该一个或多个未配对半胱氨酸残基不包含形成天然链间二硫键的半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的工程化抗体，其中该工程化抗体包括IgG1抗体。
3.根据权利要求1或2所述的工程化抗体，其中该工程化抗体包含CL结构域，并且该CL结构域包含κCL结构域。
4.根据权利要求1或2所述的工程化抗体，其中该工程化抗体包含CL结构域，并且该CL结构域包含λCL结构域。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化抗体，其中该工程化抗体包括单克隆抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的工程化抗体，其中该工程化抗体包含人源化抗体或CDR移植的抗体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的工程化抗体，其中该工程化抗体包含两个未配对半胱氨酸残基。
8.根据权利要求7所述的工程化抗体，其包含两条轻链，其中每条轻链包含该两个未配对半胱氨酸残基之一。
9.根据权利要求8所述的工程化抗体，其中该两个未配对半胱氨酸残基中的每一个存在于这些轻链的CL结构域中。
10.如权利要求8所述的工程化抗体，其中该两个未配对半胱氨酸残基中的每一个存在于这些轻链的CL结构域的C末端区域中。
11.如权利要求8所述的工程化抗体，其中该两个未配对半胱氨酸残基中的每一个位于该CL结构域的暴露的环结构中。
12.如权利要求8所述的工程化抗体，其中两个未配对半胱氨酸残基中的每一个位于选自该CL结构域的残基121-128、残基182-191或残基201-213中任一个的位置处，其中这些残基根据Kabat进行编号。
13.如权利要求8所述的工程化抗体，其中该抗体轻链包含具有选自下组的氨基酸序列的CL，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:550、SEQ ID NO:551、SEQ ID NO:552、SEQ ID NO:553、SEQ ID NO:554、SEQ ID NO:555、SEQ ID NO:556、SEQ ID NO:557、SEQ ID NO:558、SEQID NO:559、SEQ ID NO:560、SEQ ID NO:561、SEQ ID NO:562、SEQ ID NO:563和SEQ ID NO:564。
14.如权利要求7所述的工程化抗体，其包含两条重链，其中每条重链包含该两个未配对半胱氨酸残基之一。
15.如权利要求14所述的工程化抗体，其中该两个未配对半胱氨酸残基中的每一个位于选自下组的抗体结构域内，该组由以下各项组成：CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的工程化抗体，其另外包含与该一个或多个未配对半胱氨酸残基缀合的药物。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的工程化抗体，其中该工程化抗体与选自下组的决定簇反应，该组由以下各项组成：DLL3、SEZ6和CD324。
18.一种具有下式的抗体药物缀合物：
Ab-[L-D]n或其药学上可接受的盐，其中
a)Ab包括含一个或多个未配对半胱氨酸残基的工程化抗体，
其中该一个或多个未配对半胱氨酸残基不包含形成天然链间二硫键的半胱氨酸；
b)L包括任选的接头；
c)D包括药物；并且
n是从约1到约12的整数。
19.如权利要求18所述的抗体药物缀合物，其中该工程化抗体包括单克隆抗体。
20.如权利要求18或19所述的抗体药物缀合物，其中该工程化抗体包括人源化抗体或CDR移植的抗体。
21.如权利要求18至20中任一项所述的抗体药物缀合物，其中该工程化抗体包含两个未配对半胱氨酸残基。
22.根据权利要求21所述的抗体药物缀合物，其中该工程化抗体包含两条轻链，并且其中每条轻链包含该两个未配对半胱氨酸残基之一。
23.根据权利要求22所述的抗体药物缀合物，其中所述未配对半胱氨酸中的每一个存在于这些轻链的CL结构域中。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的抗体药物缀合物，其中该药物包括选自下组的细胞毒素，该组由以下各项组成：多拉司他汀、奥立抑素、卡奇霉素、美登木素生物碱和吡咯并苯并二氮杂卓。
25.一种药物组合物，其包含如权利要求1至17中任一项所述的工程化抗体或如权利要求18至24中任一项所述的抗体药物缀合物；以及药学上可接受的载体。
26.一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向所述受试者给予如权利要求25所述的药物组合物。
27.一种制备抗体药物缀合物的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供包含一个或多个未配对半胱氨酸残基的工程化抗体，其中该一个或多个未配对半胱氨酸残基不包含形成天然链间二硫键的半胱氨酸；
b)选择性地还原该工程化抗体；并且
c)将该选择性地还原的工程化抗体与药物缀合。
28.如权利要求27所述的方法，其中选择性地还原该工程化抗体的该步骤包括将该工程化抗体与稳定剂接触的步骤。
29.如权利要求27所述的方法，其中该一个或多个未配对半胱氨酸残基位于CL结构域中。
30.如权利要求27所述的方法，其中该一个或多个未配对半胱氨酸残基包括一个或多个引入的半胱氨酸残基或一个或多个取代的半胱氨酸残基。
31.一种包含一个或多个未配对半胱氨酸残基的工程化抗体，其中该一个或多个未配对半胱氨酸残基不是天然链间二硫键半胱氨酸。
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