CN107530369A

CN107530369A - 具有生物可逆的二硫基的单核苷酸

Info

Publication number: CN107530369A
Application number: CN201580075770.5A
Authority: CN
Inventors: C.W.布拉肖; S.萨卡穆里; D.刘
Original assignee: Sol Justice Biological Ltd
Current assignee: Sol Justice Biological Ltd
Priority date: 2014-12-10
Filing date: 2015-12-10
Publication date: 2018-01-02
Also published as: EP3229815A4; WO2016094677A2; CA2969733A1; JP2018503606A; WO2016094677A3; EP3229815A2; US20180346505A1

Abstract

本发明特征在于含有与糖键合的核碱基的单核苷酸，该糖具有3'‑碳和5'‑碳，其中所述5'‑碳通过氧原子与磷酸酯基团的磷(V)原子键合，该磷(V)原子(i)通过氧原子键合到二硫生物可逆基团；且(ii)(a)键合到任选取代的氨基、任选取代的烷氧基、任选取代的芳氧基或任选取代的杂芳氧基；或(b)通过氧原子键合到3'‑碳。本发明的特征还在于将单核苷酸递送至细胞的方法和治疗丙型肝炎患者的方法。

Description

具有生物可逆的二硫基的单核苷酸

发明领域

本发明涉及具有生物可逆的二硫基的单核苷酸及其使用方法。

背景

随着替诺福韦、索非布韦和环磷酰胺的批准，用于治疗人类疾病的有机磷酸酯的用途近来有所增加。一些有机磷酸酯的体内活性需要磷酸酯存在一个或多个负电荷。然而，药物化合物中包含负电荷可能降低药物的药理学效果，因为细胞对于某些大小的带负电荷的分子的吸收差。用于提高这样的药物的药理学效果的一个方法中，将磷酸酯的带负电荷的氧原子掩蔽为磷酯或磷酰胺。该方法的挑战在于需要在细胞内快速可靠地暴露有机磷酸酯的氧原子并防止过早的细胞外暴露。实施该方法的尝试主要集中于引入可水解基团。然而，这些实施经常产生显著的缺点，例如需要协同定位能够暴露磷酸酯的酶，暴露反应副产物的毒性，以及由于具有硫酯酶活性的细胞外酯酶而造成的过早暴露。

总而言之，这些问题对药物发现和研究提出了众多挑战。理想的前药和缀合方法应该是合成上适应的，耐受结构多样性，在组织中通用，并且在物种之间一致。

仍然需要涉及掩蔽有机磷酸酯的负电荷的药物递送方法。

发明概述

总体上，本发明提供了掩蔽单核苷酸的方法。

在第一方面，本发明提供了含有与糖键合的核碱基的单核苷酸，该糖具有3'-碳和5'-碳，其中所述5'-碳通过氧原子与磷酸酯基团的磷(V)原子键合，磷(V)原子：

(i)通过氧原子键合到一个且仅一个二硫生物可逆基团；且

(ii)

(a)键合到任选取代的氨基、任选取代的C_1-6烷氧基、任选取代的C_6-14芳氧基或任选取代的C_1-9杂芳氧基；或

(b)通过氧原子键合到3'-碳。

在某些实施方案中，磷酸酯基团可以含有一个且仅一个磷(V)原子。在具体实施方案中，磷(V)原子可以通过氧原子键合到3'-碳。在一些实施方案中，磷(V)原子可以键合到任选取代的氨基、任选取代的C_1-6烷氧基、任选取代的C_6-14芳氧基或任选取代的C_1-9杂芳氧基。特别地，磷(V)原子可以键合到任选取代的氨基或任选取代的C_6-14芳氧基。例如，磷(V)原子可以键合到任选取代的氨基。

在其他实施方案中，二硫生物可逆基团可以具有式(I)的结构：

其中

G是官能帽基(cap group)，

LinkA是分子量大于或等于28Da的连接基，且

X是与磷酸酯基团的氧原子的键。

在其他实施方案中，本发明的单核苷酸可以是式(II)的化合物：

或其药学上可接受的盐或磷非对映异构体，

其中

G是官能帽基；

LinkA是连接基；

B¹是核碱基；

R¹是H、叠氮基、氰基、任选取代的C_1-6烷基、任选取代的C_2-6烯基或任选取代的C_2-6炔基；

R²和R³各自独立地为H、氨基、叠氮基、任选取代的C_1-6烷基、任选取代的C_1-6杂烷基、任选取代的C_2-6烯基、任选取代的C_2-6炔基、卤素、氰基、羟基或任选取代的C_1-6烷氧基；

G¹是任选取代的氨基、任选取代的C_1-6烷氧基、任选取代的C_6-14芳氧基或任选取代的C_1-9杂芳氧基，R⁴是羟基、任选取代的C_1-6烷氧基、任选取代的氨基或叠氮基，或G¹和R⁴结合形成-O-；

R⁵是H、任选取代的C_1-6烷基、任选取代的C_1-6杂烷基、任选取代的C_2-6烯基、任选取代的C_2-6炔基或氰基；

R⁶是H、叠氮基、氰基、卤素、任选取代的C_1-6烷基、任选取代的C_2-6烯基或任选取代的C_2-6炔基；和

R⁷是H或任选取代的C_1-6烷基。

在式(I)或(II)的一些实施方案中，G可以是封闭基团(blocking group)、递送结构域或染料。

在另外的实施方案中，本发明的单核苷酸可以是式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或磷非对映异构体，

其中

G是任选取代的C_3-10烷基，任选取代的C_3-10杂烷基，任选取代的C_6-14芳基或任选取代的C_1-9杂环基；

LinkA包含1、2或3个独立地选自以下的单体：任选取代的C_1-6亚烷基、任选取代的C_1-6亚杂烷基、任选取代的C_6-14亚芳基、任选取代的C_1-9亚杂环基、任选取代的氮杂、O和S；其中LinkA不包含选自O和S的两个相邻原子，并且其中连接到磷酸酯基团的氧原子的单体是任选取代的C_1-6亚烷基；

B¹是核碱基；

G¹是任选取代的氨基、任选取代的C_1-6烷氧基、任选取代的C_6-14芳氧基或任选取代的C_1-9杂芳氧基，R⁴是羟基、任选取代的C_1-6烷氧基、任选取代的氨基或叠氮基，或G¹和R⁴结合形成-O-；和

R⁷是H或任选取代的C_1-6烷基。

在式(II)的一些实施方案中，R¹可以是H；R²可以是任选取代的C_1-6烷基；R³可以是羟基、任选取代的C_1-6烷氧基或卤素(例如，R³是卤素)；R⁵可以是H；R⁶可以是H；和/或R⁷可以是H或Me(例如，R⁷是H)。

在式(II)的其他实施方案中，G¹可以是任选取代的氨基或任选取代的C_6-14芳氧基(例如，G¹是任选取代的氨基)；和/或R⁴可以是羟基。或者，G¹和R⁴可以结合形成-O-。

在式(I)或(II)的具体实施方案中，G可以是递送结构域(例如，G是包括靶向部分、内体逃逸部分(endosomal escape moiety)或细胞穿透肽的递送结构域)。在式(I)或(II)的某些实施方案中，靶向部分可以含有1至10个糖(carbohydrate)。每个糖可以独立地是GalNAc或甘露糖。或者靶向部分可以是脂质。

在式(I)或(II)的另外的实施方案中，G可以是封闭基团，例如任选取代的C_3-10烷基、任选取代的C_3-10杂烷基、任选取代的C_6-14芳基或任选取代的C_1-9杂环基。

在式(I)或(II)的一些实施方案中，LinkA可以含有1、2或3个独立地选自以下的单体：任选取代的C_1-6亚烷基、任选取代的C_1-6亚杂烷基、任选取代的C_6-14亚芳基、任选取代的C_1-9亚杂环基、任选取代的氮杂、O和S；前提是LinkA不包含选自O和S的两个相邻原子，并且其中连接到所述磷酸酯基团的氧原子的单体是任选取代的C_1-6亚烷基。例如，LinkA可以含有1、2或3个独立地选自以下的单体：任选取代的C_1-6亚烷基、任选取代的C_6-14亚芳基和O。特别地，LinkA可以含有1或2个独立地选自以下的单体：任选取代的C_1-6亚烷基和任选取代的C_6-14亚芳基。

在式(II)的某些实施方案中，R³是H、叠氮基、任选取代的C_1-6烷基、任选取代的C_1-6杂烷基、任选取代的C_2-6烯基、任选取代的C_2-6炔基、卤素、氰基、羟基或任选取代的C_1-6烷氧基；和/或R²是任选取代的C_1-6烷基。

在第一方面的另外的实施方案中，单核苷酸可以是

或

或其药学上可接受的盐或磷非对映异构体。

第一方面的单核苷酸还可以是同位素富集的组合物的形式，例如重同位素(例如，¹⁵N)富集。例如，核碱基可以包括同位素富集的环外氨基(例如胞嘧啶)。

在第二方面，本发明提供含有第一方面的单核苷酸或同位素富集的组合物的药物组合物。在第二方面的某些实施方案中，药物组合物含有药学上可接受的载体。

在第三方面，本发明提供将单核苷酸递送至细胞的方法，包括将细胞(例如肝脏细胞(肝细胞))与第一方面的单核苷酸或同位素富集的组合物接触。

在第四方面，本发明提供治疗患有RNA病毒感染(例如丙型肝炎)的受试者(例如，人)的方法，包括向受试者施用第一方面的单核苷酸或同位素富集的组合物。或者，可以将第二方面的药物组合物施用于受试者以治疗该受试者的RNA病毒感染(例如丙型肝炎)。

定义

本文所用的术语“约”表示所述值的±10%的值。

本文所用的术语“烷酰基”表示通过羰基连接到母体分子基团的氢或烷基，例如甲酰基(即甲醛基)、乙酰基、丙酰基、丁酰基和异丁酰基。未取代的烷酰基含有1至7个碳。烷酰基可以是未取代或取代的(如任选取代的C_1-7烷酰基)，如本文对烷基的描述。末端的“-酰基”可以加到本文所定义的另一个基团，例如芳基、环烷基和杂环基，以限定“芳酰基”、“环烷酰基”和“(杂环基)酰基”。这些基团分别表示被芳基、环烷基或杂环基取代的羰基。“芳酰基”、“环烷酰基”和“(杂环基)酰基”可为未取代或取代的，如对“芳基”、“环烷基”或“杂环基”分别所定义的。

本文所用的术语“(C_x1-y1芳基)-C_x2-y2-烷基”表示通过x2至y2个碳原子的亚烷基连接到母体分子基团的x1至y1个碳原子的芳基。示例性的未取代的(C_x1-y1芳基)-C_x2-y2-烷基为7至16个碳。在一些实施方案中，亚烷基和芳基各自可以进一步被1、2、3或4个取代基取代，如本文对于各个基团的定义。“烷基”跟随的其他基团以相同的方式定义，除非另有说明，“烷基”是指C_1-6亚烷基，并且所连接的化学结构如本文所定义。

本文所用的术语“烯基”表示含有一个、两个或三个碳-碳双键的无环单价直链或支链烃基。烯基的非限制性实例包括乙烯基、丙-1-烯基、丙-2-烯基、1-甲基乙烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、1-甲基丙-1-烯基、2-甲基丙-1-烯基和1-甲基丙-2-烯基。烯基可以任选地被取代，如本文对烷基所定义。

本文所用的术语“亚烯基”是指除去一个氢的直链或支链烯基，从而使该基团为二价。亚烯基的非限制性实例包括乙烯-1,1-二基；乙烯-1,2-二基；丙-1-烯-1,1-二基、丙-2-烯-1,1-二基；丙-1-烯-1,2-二基、丙-1-烯-1,3-二基；丙-2-烯-1,1-二基；丙-2-烯-1,2-二基；丁-1-烯-1,1-二基；丁-1-烯-1,2-二基；丁-1-烯-1,3-二基；丁-1-烯-1,4-二基；丁-2-烯-1,1-二基；丁-2-烯-1,2-二基；丁-2-烯-1,3-二基；丁-2-烯-1,4-二基；丁-2-烯-2,3-二基；丁-3-烯-1,1-二基；丁-3-烯-1,2-二基；丁-3-烯-1,3-二基；丁-3-烯-2,3-二基；丁-1,2-二烯-1,1-二基；丁-1,2-二烯-1,3-二基；丁-1,2-二烯-1,4-二基；丁-1,3-二烯-1,1-二基；丁-1,3-二烯-1,2-二基；丁-1,3-二烯-1,3-二基；丁-1,3-二烯-1,4-二基；丁-1,3-二烯-2,3-二基；丁-2,3-二烯-1,1-二基；和丁-2,3-二烯-1,2-二基。亚烯基可以是未取代的或取代的(例如，任选取代的亚烯基)，如对于烷基所述。

本文所用的术语“烷氧基”表示式-OR的化学取代基，其中R是C_1-6烷基，除非另有说明。在一些实施方案中，烷基可以如本文所定义进一步被取代。术语“烷氧基”可以与本文定义的其他术语例如芳基、环烷基或杂环基组合，以限定“芳基烷氧基”、“环烷基烷氧基”和“(杂环基)烷氧基”基团。这些基团分别表示被芳基、环烷基或杂环基取代的烷氧基。“芳基烷氧基”、“环烷基烷氧基”和“(杂环基)烷氧基”中的每个可以为未取代或取代的，如本文对各个单独部分所定义。

本文所用的术语“烷基”是指无环的直链或支链饱和烃基，当未被取代时其具有1至12个碳，除非另有说明。在某些优选的实施方案中，未取代的烷基具有1至6个碳。烷基的实例有甲基；乙基；正丙基和异丙基；正、仲、异、叔丁基；新戊基等，并且可以在化合价允许的情况下任选地被一个、两个、三个取代基或者当烷基具有两个或更多个碳时被四个取代基取代，所述取代基独立地选自：氨基；芳基；芳氧基；叠氮基；环烷基；环烷氧基；环烯基；环炔基；卤素；杂环基；(杂环基)氧基；羟基；硝基；巯基；甲硅烷基；氰基；=O；=S；=NR’，其中R’是H、烷基、芳基或杂环基。每个取代基本身可以是未取代的，或者在化合价允许的情况下被未取代的取代基取代，如本文对于各个基团所定义。

本文所用的术语“烷基氨基”是指具有式-N(R^N1)₂或-NHR^N1的基团，其中R^N1是如本文所定义的烷基。烷基氨基的烷基部分可以任选地被取代，如对烷基所定义。取代的烷基氨基上的每个任选的取代基本身可以是未取代的，或者在化合价允许的情况下被未取代的取代基取代，如本文对于各个基团所定义。

本文所用的术语“亚烷基”是指通过除去至少两个氢原子而衍生自直链或支链饱和烃的饱和二价、三价或四价烃基。如果与不是任选的取代基的一个氮杂基团键合，亚烷基可以是三价的；如果与不是任选的取代基的两个氮杂基团键合，亚烷基可以是三价或四价的。本文定义的亚烷基的化合价不包括该任选的取代基。亚烷基的非限制性实例包括亚甲基、乙烷-1,2-二基、乙烷-1,1-二基、丙烷-1,3-二基、丙烷-1,2-二基、丙烷-1,1-二基、丙烷-2,2-二基、丁烷-1,4-二基、丁烷-1,3-二基、丁烷-1,2-二基、丁烷-1,1-二基、丁烷-2,2-二基和丁烷-2,3-二基。术语“C_x-y亚烷基”表示具有x至y个碳的亚烷基。x的示例性值为1、2、3、4、5和6，y的示例性值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。在一些实施方案中，亚烷基可以进一步被1、2、3或4个取代基取代，如本文对烷基所定义。类似地，当与本文定义的基团的名称结合使用时，前缀“亚”表示如本文所定义的相应一价基团的二价基团。例如，亚烯基、亚炔基、亚芳基、亚芳基烷基(aryl alkylene)、亚环烷基、亚环烷基烷基(cycloalkylalkylene)、亚环烯基、亚杂芳基、亚杂芳基烷基(heteroaryl alkylene)、亚杂环基和亚杂环基烷基(heterocyclyl alkylene)是烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基和杂环基烷基的二价形式。对于亚芳基烷基、亚环烷基烷基、亚杂芳基烷基和亚杂环基烷基，基团中的两个价键可以仅位于非环状部分，或者一个位于环状部分且一个位于非环状部分。

本文所用的术语“烷基硫基”表示式-S-(烷基)的基团。烷基硫基可以如对烷基所定义的那样被任选取代。

本文所用的术语“烷基亚磺酰基”表示式-S(O)-(烷基)的基团。烷基亚磺酰基可以如对烷基所定义的那样被任选取代。

本文所用的术语“烷基磺酰基”表示式-S(O)₂-(烷基)的基团。烷基磺酰基可以如对烷基所定义的那样被任选取代。

本文所用的术语“炔基”表示含有至少一个碳-碳三键的2-6个碳原子的一价直链或支链烃基，例如乙炔基、1-丙炔基等。炔基可以是未取代的或取代的(如任选取代的炔基)，如对烷基所定义的。

本文所用的术语“氨基”表示-N(R^N1)₂或-N(R^N1)C(NR^N1)N(R^N1)₂，其中每个R^N1独立地为H、-OH、-NO₂、-N(R^N2)₂、-SO₂OR^N2、-SO₂R^N2、-SOR^N2、-COOR^N2、N保护基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、芳氧基、环烷基、环烯基、杂烷基或杂环基，并且其中每个R^N2独立地为H、烷基或芳基。在一些实施方案中，氨基是-NH₂或-NHR^N1，其中R^N1独立地是-OH、-SO₂OR^N2、-SO₂R^N2、-SOR^N2、-COOR^N2、烷基或芳基，并且每个R^N2可以是烷基或芳基。当存在时，每个R^N1和R^N2可以独立地是未取代的或如本文所述取代的(例如，任选取代的氨基)。在一些实施方案中，氨基可以是烷基氨基。每个取代基本身可以是未取代的或被本文对各个基团定义的未取代的取代基取代。当氨基是与本发明的单核苷酸的磷(V)原子连接的官能帽基的一部分时，氨基上的任何一个取代基可进一步包括递送结构域、染料或封闭基团。

本文所用的术语“芳基”表示具有一个或两个芳族环的单环、双环或多环碳环系统。芳基可以包括6至14个碳原子(例如6至10个碳原子)。未取代的碳环芳基中的所有原子都是碳原子。碳环芳基的非限制性实例包括苯基、萘基、1,2-二氢萘基、1,2,3,4-四氢萘基、芴基、茚满基、茚基等。芳基可以任选地被一个、两个、三个、四个或五个独立地选自以下的取代基取代：烷基；烯基；炔基；烷氧基；烷基亚磺酰基；烷基硫基；烷基磺酰基；氨基；芳基；芳氧基；叠氮基；环烷基；环烷氧基；环烯基；环炔基；卤素；杂烷基；杂环基；(杂环基)氧基；羟基；硝基；巯基；甲硅烷基；和氰基。每个取代基本身可以是未取代的或被本文对于各个基团所定义的未取代的取代基取代。

本文所用的术语“芳氧基”表示式-OR的化学取代基，其中R是芳基，除非另有说明。在一些实施方案中，芳基可以如本文所定义进一步被取代。

本文所用的术语“氮杂”表示二价-N(R^N1)-基团或三价-N=基团。氮杂基团可以是未取代的，其中R^N1是H或不存在，或被取代，其中R^N1如对“氨基”所定义，除了R^N1不是H。两个氮杂基团可以连接形成“二氮杂”。

本文所用的术语“叠氮基”表示-N₃基团。

本文所用的术语“封闭基团”是指在生理条件下为惰性且具有至少一个碳原子的化学基团。该封闭基团的所述至少一个碳原子与二硫生物可逆基团的-S-S-键合。

本文所用的术语“大体积基团”表示如在本文所定义的任何取代基或取代基组，其中大体积基团的自由基携带一个氢原子或更少(如果该自由基是sp ³-杂化碳)，或不携带氢原子(如果该自由基是sp ²-杂化碳)。该自由基不是sp-杂化碳。大体积基团仅通过碳原子键合至另一个基团。例如，表述“键合至二硫键的大体积基团”、“附接至二硫键的大体积基团”以及“连接至二硫键的大体积基团”指该大体积基团通过碳自由基键合至二硫键。

本文所用的术语“碳环”表示任选取代的C₃-₁₂单环、双环或三环结构，其中可以是芳族或非芳族的环由碳原子形成。碳环结构包括环烷基、环烯基、环炔基和某些芳基。

本文所用的术语“糖”表示包含一个或多个具有至少5个碳原子(可以是直链、支链或环状)的单糖单元的化合物，其中每个碳原子键合有氧、氮或硫原子。因此，术语“糖”包括单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖和多糖。代表性的糖包括糖(sugar)(含有约4-9个单糖单元的单糖、二糖、三糖和寡糖)，和多糖如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。具体的单糖包括C_5-6糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元的糖(例如C_5-6糖)。

本文所用的术语“羰基”表示C(O)基团。包括“羰基”的官能团的实例包括酯、酮、醛、酸酐、酰氯、酰胺、羧酸和羧酸酯/盐。

本文所用的术语“氰基”表示-CN基团。

本文所用的术语“环烯基”是指在环中具有至少一个双键和三至十个碳的非芳族碳环基团(例如C₃-C₁₀环烯基)，除非另有说明。环烯基的非限制性实例包括环丙-1-烯基、环丙-2-烯基、环丁-1-烯基、环丁-1-烯基、环丁-2-烯基、环戊-1-烯基、环戊-2-烯基、环戊-3-烯基、降冰片烯-1-基、降冰片烯-2-基、降冰片烯-5-基和降冰片烯-7-基。环烯基可以是未取代的或如对于环烷基所述取代的(例如，任选取代的环烯基)。

本文所用的术语“环烯基烷基”表示被环烯基取代的烷基，各自如本文所定义。环烯基和烷基部分可以如本文定义的单独基团一样被取代。

本文所用的术语“亚环烯基”是指环中具有至少一个双键和三至十个碳的二价碳环非芳族基团(如C₃-C₁₀亚环烯基)，除非另有说明。亚环烯基的非限制性实例包括环丙-1-烯-1,2-二基；环丙-2-烯-1,1-二基；环丙-2-烯-1,2-二基；环丁-1-烯-1,2-二基；环丁-1-烯-1,3-二基；环丁-1-烯-1,4-二基；环丁-2-烯-1,1-二基；环丁-2-烯-1,4-二基；环戊-1-烯-1,2-二基；环戊-1-烯-1,3-二基；环戊-1-烯-1,4-二基；环戊-1-烯-1,5-二基；环戊-2-烯-1,1-二基；环戊-2-烯-1,4-二基；环戊-2-烯-1,5-二基；环戊-3-烯-1,1-二基；环戊-1,3-二烯-1,2-二基；环戊-1,3-二烯-1,3-二基；环戊-1,3-二烯-1,4-二基；环戊-1,3-二烯-1,5-二基；环戊-1,3-二烯-5,5-二基；降冰片二烯-1,2-二基；降冰片二烯-1,3-二基；降冰片二烯-1,4-二基；降冰片二烯-1,7-二基；降冰片二烯-2,3-二基；降冰片二烯-2,5-二基；降冰片二烯-2,6-二基；降冰片二烯-2,7-二基；和降冰片二烯-7,7-二基。亚环烯基可以是未取代的或取代的(例如，任选取代的亚环烯基)，如对于环烷基所定义。

本文所用的术语“环烷氧基”表示式-OR的化学取代基，其中R是环烷基，除非另有说明。在一些实施方案中，环烷基可以如本文所定义被进一步取代。

除非另有说明，本文所用的术语“环烷基”是指具有3至10个碳的环状烷基(例如C₃-C₁₀环烷基)。环烷基可以是单环或双环的。双环环烷基可以是双环[p.q.0]烷基类型，其中p和q各自独立地为1、2、3、4、5、6或7，条件是p和q之和为2、3、4、5、6、7或8。或者，双环环烷基可以包括桥连的环烷基结构，例如双环[p.q.r]烷基，其中r为1、2或3，p和q各自独立地为1、2、3、4、5或6，条件是p、q和r的和为3、4、5、6、7或8。环烷基可以是螺环基，例如螺[p.q]烷基，其中p和q各自独立地为2、3、4、5、6或7，条件是p和q之和为4、5、6、7、8或9。环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、1-双环[2.2.1.]庚基、2-双环[2.2.1.]庚基、5-双环[2.2.1.]庚基、7-双环[2.2.1.]庚基和十氢化萘基。环烷基可以是未取代的或被一个、两个、三个、四个或五个独立地选自以下的取代基取代的(例如，任选取代的环烷基)：烷基；烯基；炔基；烷氧基；烷基亚磺酰基；烷基硫基；烷基磺酰基；氨基；芳基；芳氧基；叠氮基；环烷基；环烷氧基；环烯基；环炔基；卤素；杂烷基；杂环基；(杂环基)氧基；羟基；硝基；巯基；甲硅烷基；氰基；=O；=S；=NR’，其中R’是H、烷基、芳基或杂环基。每个取代基本身可以是未取代的或被本文对于各个基团所定义的未取代的取代基取代。

本文所用的术语“环烷基烷基”表示被环烷基取代的烷基，各自如本文所定义。环烷基和烷基部分可以被取代，如本文对单独基团所定义。

本文所用的术语“环炔基”是指具有一个碳-碳三键或两个不相邻的碳-碳三键且具有8至10个碳的单价碳环基(例如，C₈-C₁₀环炔基)，除非另有说明。环炔基的非限制性实例包括环辛炔基、环壬炔基、环癸炔基和环癸二炔基。环炔基可以是未取代的或取代的(例如，任选取代的环炔基)，如对环烷基所定义。

本文所用的术语“环炔基烷基”表示被环炔基取代的烷基，各自如本文所定义。环炔基和烷基部分可以被取代，如本文对单独基团所定义。

本文所用的术语“二硫生物可逆基团”表示包含二硫基(-S-S-)的部分。二硫基可以在细胞内主动地被切割，例如通过一种或多种细胞内酶(例如，细胞内还原酶)的作用，或在细胞内被动地被切割，例如通过将该基团暴露于细胞内环境或细胞中存在的条件(例如还原或氧化环境，或与细胞内物质如谷胱甘肽的反应)。

本文所用的术语“内体逃逸部分”表示增强内体内容物释放或允许分子从细胞内隔室(例如内体)逃逸的部分。

本文所用的术语“卤素”表示选自溴、氯、碘和氟的卤素。

本文所用的术语“杂烷基”是指被一个或两个杂原子中断一次；被一个或两个杂原子每次独立地中断两次；被一个或两个杂原子每次独立地中断三次；或被一个或两个杂原子每次独立地中断四次的烷基、烯基或炔基。每个杂原子独立地是O、N或S。在一些实施方案中，杂原子是O或N。无一杂烷基包括两个相邻的氧或硫原子。杂烷基可以是未取代的或取代的(例如，任选取代的杂烷基)。当杂烷基被取代并且取代基与杂原子键合时，取代基根据杂原子的性质和化合价来选择。因此，与杂原子键合的取代基，在化合价允许的情况下，选自=O、-N(R^N2)₂、-SO₂OR^N3、-SO₂R^N2、-SOR^N3、-COOR^N3、N-保护基团、烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基或氰基，其中每个R^N2独立地为H、烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基或杂环基，并且每个R^N3独立地为烷基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基或杂环基。这些取代基中的每一个本身可以是未取代的或被本文对于各个基团所定义的未取代的取代基取代。当杂烷基被取代并且取代基与碳键合时，取代基选自对烷基所述的那些，条件是与杂原子键合的碳原子上的取代基不是Cl、Br或I。可以理解的是，发现碳原子处于杂烷基的末端。

本文所用的术语“杂芳氧基”是指结构-OR，其中R是杂芳基。杂芳氧基可以如对杂环基所定义的那样被任选取代。

本文所用的术语“杂环基”表示具有稠合的或桥连的5-、6-或7-元环的单环、双环、三环或四环环系统，除非另有说明，包含一个、两个、三个或四个独立地选自氮、氧和硫的杂原子。杂环基可以是芳族或非芳族的。非芳族5-元杂环基具有0个或1个双键，非芳族6-和7-元杂环基具有0至2个双键。某些杂环基包括2至12个碳原子。其他这样的基团可以包括至多达9个碳原子。非芳族杂环基包括吡咯啉基、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、高哌啶基、哌嗪基、哒嗪基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、硫代吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、噻唑烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、二氢吲哚基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、吡喃基、二氢吡喃基、二噻唑基等。如果杂环系统具有至少一个芳族共振结构或至少一种芳族互变异构体，则这种结构是芳族杂环基(即杂芳基)。杂芳基的非限制性实例包括苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、呋喃基、咪唑基、吲哚基、异吲唑基、异喹啉基、异噻唑基、异噻唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、嘌呤基、吡咯基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、喹唑啉基、喹啉基、噻二唑基(例如1,3,4-噻二唑)、噻唑基、噻吩基、三唑基、四唑基等。术语“杂环基”还表示具有桥连多环结构的杂环化合物，其中一个或多个碳和/或杂原子桥连单环的两个不相邻的成员，例如奎宁环、莨菪烷或二氮杂双环[2.2.2]辛烷。术语“杂环基”包括双环、三环和四环，其中任何上述杂环稠合于一个、两个或三个碳环，例如芳基环、环己烷环、环己烯环、环戊烷环、环戊烯环或另一单环杂环。稠合杂环基的实例包括1,2,3,5,8,8a-六氢吲嗪；2,3-二氢苯并呋喃；2,3-二氢吲哚；和2,3-二氢苯并噻吩。杂环基可以任选地被一个、两个、三个、四个或五个独立地选自以下的取代基取代：烷基；烯基；炔基；烷氧基；烷基亚磺酰基；烷基硫基；烷基磺酰基；氨基；芳基；芳氧基；叠氮基；环烷基；环烷氧基；环烯基；环炔基；卤素；杂烷基；杂环基；(杂环基)氧基；羟基；硝基；巯基；甲硅烷基；氰基；=O；=S；=NR’，其中R’是H、烷基、芳基或杂环基。每个取代基本身可以是未取代的或被本文对于各个基团所定义的未取代的取代基取代。

本文所用的术语“杂环基烷基”表示被杂环基取代的烷基，各自如本文所定义。杂环基和烷基部分可以被取代，如本文对单独基团所述。

本文所用的术语“(杂环基)氧基”表示式-OR的化学取代基，其中R是杂环基，除非另有说明。在一些实施方案中，杂环基可以如本文所定义被进一步取代。

本文中可互换使用的术语“羟基(hydroxyl)”和“羟基(hydroxy)”表示-OH基团。

本文所用的术语“同位素富集”是指单核苷酸中的组合物含有大于天然存在的丰度的同位素，例如¹⁵N。通常并且取决于同位素，富集了特定同位素的组分可以具有至少5、至少10、至少50、至少500、至少2000、至少3000、至少6000或至少6600的同位素富集因子。当组合物为同位素富集的，化合物优选富集了重质同位素，即具有大于特定元素的天然最丰富的同位素的同位素质量的同位素质量的该特定元素的同位素。

本文使用的术语“同位素富集因子”是指相对于同位素天然存在的丰度，该特定组合物中特定同位素的摩尔百分数。

本文所用的术语“单核苷”代表糖-核碱基化合物。单核苷的非限制性实例见于以下化合物：索非布韦(sofosbuvir)、VX-135、IDX21437、IDX20963、ACH3422、mericitabine、valopicitabine、balapiravir、MK0608、GS-6620、IDX184、IDX19368、INX189、PSI938、PSI661、RS-1389以及WO 2005/003147、WO 2009/067409和WO 2010/108140中公开的那些，其中的单核苷被并入本文。

本文所用的术语“单核苷酸”是指其5'-碳键合到磷酸酯基的单核苷。

本文所用的术语“硝基”表示-NO₂基团。

本文所用的术语“核碱基”表示在核苷的糖的1'位置处的含氮杂环系统。核碱基可以是未修饰的或修饰的。本文所用的“未修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))或嘧啶碱基(例如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U))。修饰的核碱基可以是嘌呤或嘧啶碱基的受保护形式，其中一个或多个氧和/或氮原子被适当的保护基保护或作为前药部分存在。修饰的核碱基可以是嘌呤或嘧啶碱基的O-或N-烷基化形式。修饰的核碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的氮杂和去氮杂修饰。特别地，氮杂修饰包括用氮原子取代嘌呤或嘧啶碱基内的一个或多个碳原子。去氮杂修饰包括用碳原子取代嘌呤或嘧啶碱基内的一个或多个氮原子。在非限制性实例中，嘌呤碱基可以被修饰为包括氮杂和去氮杂修饰形式，从而形成吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪。另外或替代地，嘌呤或嘧啶碱基的修饰可以包括将碱基的不饱和度改变为高于或低于初始碱基的不饱和度。另外或替代地，可以使嘧啶或嘌呤碱基为未取代的或适当地被对芳基或杂环基定义的取代基取代。

本文所用的术语“氧代”表示二价氧原子(例如，氧代的结构可以表示为=O)。

本文所用的术语“Ph”表示苯基。

本文所用的术语“磷酸酯基”是指具有键合至2、3或4个氧原子、任选一个硫原子和任选一个氮原子的磷(V)原子的分子片段，条件是与磷(V)原子键合的原子总数等于4。

本文所用的术语“磷(V)原子”是指形式氧化态(V)的磷原子。在本发明的化合物中，磷(V)原子具有五价，其中两个被=O或=S占据，剩余的三价中的一个或两个键合到单核苷，一价键合到二硫生物可逆基团。磷(V)原子可以是磷酸酯基团的一部分。磷酸酯基团的一个或两个氧原子是单核苷的一部分。

本文所用的术语“生理条件”是指活体哺乳动物细胞(例如肝细胞)内可能存在的条件。生理条件包括约34℃至约43℃(例如约35℃至约42℃)的温度和约6至约8(例如约6.5至约7.8)的水溶液pH。

本文所用的术语“保护基团”表示旨在保护羟基、氨基或羰基以免在化学合成期间参与一种或多种不期望的反应的基团。本文所用的术语“O-保护基团”表示旨在保护羟基或羰基以免在化学合成期间参与一种或多种不期望的反应的基团。本文使用的术语“N-保护基团”表示旨在保护含氮基团(例如氨基或肼)以免在化学合成期间参与一种或多种不期望的反应的基团。通常使用的O-和N-保护基团公开在Greene, “Protective Groups inOrganic Synthesis(有机合成中的保护基团),” 第3版，(John Wiley & Sons, New York,1999)，其通过引用并入本文。示例性的O-和N-保护基团包括烷酰基、芳酰基或氨基甲酰基基团，如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基、邻-硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三-异丙基甲硅烷基氧基甲基、4,4'-二甲氧基三苯甲基、异丁酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、亚胺甲基氨基(formamidino)以及4-硝基苯甲酰基。

用于保护含羰基基团的示例性O-保护基团包括但不限于：缩醛、缩羰基酯(acylal)、1,3-二噻烷、1,3-二噁烷、1,3-二氧戊环以及1,3-二硫戊环。

其他O-保护基团包括但不限于：取代的烷基、芳基和芳基-烷基醚(例如，三苯甲基；甲硫基甲基；甲氧基甲基；苄氧基甲基；甲硅烷氧基甲基；2,2,2,-三氯乙氧基甲基；四氢吡喃基；四氢呋喃基；乙氧基乙基；1-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]乙基；2-三甲基甲硅烷基乙基；叔丁醚；对-氯苯基、对-甲氧基苯基、对-硝基苯基、苄基、对-甲氧基苄基以及硝基苄基)；甲硅烷基醚(例如，三甲基甲硅烷基；三乙基甲硅烷基；三异丙基甲硅烷基；二甲基异丙基甲硅烷基；叔丁基二甲基甲硅烷基；叔丁基二苯基甲硅烷基；三苄基甲硅烷基；三苯基甲硅烷基；以及二苯基甲基甲硅烷基)；碳酸酯基(例如，甲基、甲氧基甲基、9-芴基甲基；乙基；2,2,2-三氯乙基；2-(三甲基甲硅烷基)乙基；乙烯基、烯丙基、硝基苯基；苄基；甲氧基苄基；3,4-二甲氧基苄基；以及硝基苄基)。

其他N-保护基团包括但不限于，手性助剂如保护的或未保护的D、L或D, L-氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等；含磺酰基的基团如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯形成基团如苄氧羰基、对-氯苄氧羰基、对-甲氧基苄氧羰基、对-硝基苄氧羰基、2-硝基苄氧羰基、对-溴苄氧羰基、3,4-二甲氧基苄氧羰基、3,5-二甲氧基苄氧羰基、2,4-二甲氧基苄氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苄氧羰基、3,4,5-三甲氧基苄氧羰基、1-(对-联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2,-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、环戊氧基羰基、金刚烷基氧基羰基、环己氧基羰基、苯硫基羰基等；芳基-烷基基团，如苄基、三苯基甲基、苄氧基甲基等；以及甲硅烷基基团，如三甲基甲硅烷基等。有用的N-保护基团是甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、丙氨酰基、苯磺酰基、苄基、叔丁氧基羰基(Boc)以及苄氧基羰基(Cbz)。

本文所用的术语“甲硅烷基”表示具有结构-SiR'₃的基团，其中每个R'独立地选自H、烷基、芳基、环烷基、环烯基、环炔基、杂烷基和杂环基。甲硅烷基可以是未取代的或取代的(例如，任选取代的甲硅烷基)。当甲硅烷基被取代时，至少一个R'包括至少一个未取代或取代的取代基，所述取代基选自对所讨论的基团定义的那些取代基。在一些实施方案中，每个R'独立地是未取代的烷基或未取代的芳基。

本文所用的术语“受试者”表示人类或非人类动物(例如哺乳动物)。在一些实施方案中，受试者可能患有丙型肝炎，这由合格的专业人员(例如，医生或护士从业者)采用或不采用本领域已知的对来自受试者的样品的实验室测试确定。

本文所用的术语“硫化物”表示二价-S-或=S基团。二硫是-S-S-。

本文所用的术语“靶向部分”表示特异性、共价或非共价结合受体(例如，细胞表面受体)或与给定靶细胞群相关的其他接受部分的任何部分。

本文所用的术语“治疗有效剂量”表示改善、治疗或至少部分阻止疾病或病症(例如丙型肝炎)症状所需的本发明单核苷酸的量。对此用途，有效的量取决于疾病的严重程度以及受试者的体重和一般状态。通常，体外使用的剂量可以为药物组合物的体内施用的有用量提供有用的指导，动物模型可以用于确定治疗特定疾病(例如丙型肝炎)的有效剂量。

本文所用的术语“硫代羰基”表示C(=S)基团。

本文所用的术语“巯基”表示-SH基团。

关于受试者的病症使用的术语“治疗”是指通过向受试者施用治疗剂(例如本发明的单核苷酸)来减少病症的至少一种症状。

本文和所附权利要求中使用的单数形式“一种(a，an)”以及“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“靶向部分”包括多个这样的靶向部分，并且提及“细胞”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种细胞等等。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在所公开的方法和组合物的实践中可以使用与本文所述类似或等同的方法和材料，本文描述了示例性方法、装置和材料。

“包含”、“包括”、“含有”、“具有”、“含”和“有”是可互换的，不是限制性的。

应进一步理解，当各种实施方案的描述使用术语“包括”时，本领域技术人员将理解，在一些具体情况下，可以使用“基本上由...组成”或“由...组成”的表述来替代地描述实施方案。

对于与本公开中明确定义的任何术语相同的本领域存在的任何术语，在所有方面以本公开中所述的术语定义为准。

本发明化合物中的每个位置可以包括以其天然同位素丰度的元素。或者，本发明化合物中的一个或多个位置可以包括富集了天然存在或合成的同位素的元素。例如，包括氢的本发明化合物的一个或多个位置可富集了例如氘或氚。在一些实施方案中，包括碳的本发明化合物的一个或多个位置可富集了例如¹⁴C或¹³C。在其他实施方案中，包括氮的本发明化合物的一个或多个位置可富集了例如¹⁵N。在某些实施方案中，包括氧的本发明化合物的一个或多个位置可富集了例如¹⁸O、¹⁷O或¹⁵O。在具体实施方案中，包括氟的本发明化合物的一个或多个位置可富集了例如¹⁸F。在其他实施方案中，包括碳的本发明化合物的一个或多个位置可富集了例如³²S、³³S、³⁴S、³⁵S或³⁶S。在其他的实施方案中，包括氯的本发明化合物的一个或多个位置可富集了例如³⁵Cl、³⁶Cl或³⁷Cl。

附图简述

图1显示了丙型肝炎病毒(HCV)复制子的结构。HCV复制子包含HCV的5'末端(具有HCV内部核糖体进入位点(IRES)和HCV核心蛋白的前几个氨基酸)，其驱动HCV核心-新霉素磷酸转移酶(Neo^R)融合蛋白的产生。EMCR IRES元件(E-1)控制HCV结构蛋白NS3-NS5的翻译。NS3蛋白切割HCV多聚蛋白以释放HCV复制所需的成熟NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白。复制子的3'末端是HCV的确实的3'NTR。

图2是显示核苷磷酯的小鼠血清稳定性的图。

图3是显示核苷磷酯的大鼠血清稳定性的图。

图4是显示核苷磷酯的人血清稳定性的图。

图5是显示Huh7细胞体外活性核苷三磷酸的细胞内水平的图。

图6是显示原代人肝细胞体外活性核苷三磷酸的细胞内水平的图。

图7是显示从静脉内给予核苷磷酯的大鼠分离的大鼠肝匀浆中的活性核苷三磷酸的细胞内水平的图。

图8是显示从口服核苷磷酯的大鼠分离的大鼠肝匀浆中的活性核苷三磷酸的细胞内水平的图。

详细说明

总体上，本发明涉及掩蔽单核苷酸中的磷酸酯的方法。在本方法中，单核苷酸中磷酸酯基团的负电荷之一用二硫生物可逆基团掩蔽。不受理论的约束，二硫生物可逆基团在细胞内经历快速的硫-硫键切割，因为细胞内介质可比细胞外介质更具还原性。对细胞内还原的依赖可以克服磷酸酯过早的细胞外暴露的挑战。

本发明的单核苷酸相对于其他单核苷酸前药在血清和胃肠液内具有增强的稳定性。此外，本发明的单核苷酸相对于其他单核苷酸前药显示更大的效力。

本发明的特征在于，含有与具有3'-碳和5'-碳的糖键合的核碱基的单核苷酸，其中所述5'-碳通过氧原子与磷酸酯基团的磷(V)原子键合，磷(V)原子(i)通过氧原子键合到二硫生物可逆基团，和(ii)(a)键合到任选取代的氨基、任选取代的烷氧基或任选取代的芳氧基，或(b)通过氧原子键合到3'-碳。

二硫生物可逆基团

包含在本发明的单核苷酸中的二硫生物可逆基团可含有接近-S-S-的大体积基团。包含接近-S-S-的大体积基团可以促进本文所述的本发明的单核苷酸的制备，而不会由于硫-硫键切割而导致材料的显著损失。

二硫生物可逆基团的硫原子可以与磷酸酯基团分开至少2个连续的原子。在一些实施方案中，二硫生物可逆基团的-S-S-可以与磷酸酯基团分开至少3个连续的原子。不受理论的约束，二硫基与磷酸酯基之间的分开允许连接于磷酸酯基团的一部分原子链(例如，-S-(LinkA)-)的挤出和环化，同时在活细胞内硫-硫键切割时释放具有未掩蔽或部分未掩蔽的磷酸酯基团的单核苷酸。

二硫生物可逆基团可以具有式(I)的结构：

其中

G是第一官能帽基，

LinkA是分子量大于或等于28Da的连接基，且

X是与磷酸酯基团的氧原子的键。

LinkA是式(I)或(II)中包含与-O-键合的sp³杂化碳原子的连接基。该结构特征允许LinkA与连接到式(I)或(II)的磷(V)原子的氧原子脱离。LinkA不含选自O和S的两个相邻原子。LinkA可以具有大于或等于28Da(例如，大于或等于56Da)的分子量。LinkA可以具有小于或等于1000Da(例如，小于或等于300Da)的分子量。例如，LinkA的分子量可以为28Da至1000Da(例如，28Da至300Da或56Da至300Da)。在式(I)或(II)中在连接G-S-S-和-O-的链中的LinkA可以包括连在一起的1、2或3个单体。这些单体中的每一个独立地是任选取代的C_1-6亚烷基、任选取代的C_1-6亚杂烷基、任选取代的C_6-14亚芳基、任选取代的C_1-9亚杂环基、任选取代的氮杂、O或S。在式(I)或(II)中连接G-S-S-和-O-的LinkA中的最短原子链可以大于或等于2(例如，大于或等于3，优选大于或等于4)。在式(I)或(II)中连接G-S-S-和-O-的LinkA中的最短原子链可以小于或等于10(例如小于或等于6，优选小于或等于5)。在非限制性实例中，在式(I)或(II)中连接G-S-S-和-O-的LinkA中的最短原子链可以是4或5。LinkA的非限制性实例包括任选取代的C_6-14芳基C_1-6亚烷基，例如亚苯基-亚乙基，和任选取代的C_2-10亚烷基，例如亚丁基。LinkA可以包括接近二硫基团的大体积基团。

官能帽基

官能帽基可以是封闭基团、递送结构域或染料。本发明的官能帽基可以具有一种或多种所需的功能，例如在合成本发明化合物期间保护二硫基以抵抗磷(III)原子的反应性(例如通过包括大体积封闭基团)。所需功能的其他非限制性实例包括：(1)提供递送至特定组织的能力(例如通过包括靶向部分)；(2)提供用于使本发明的单核苷酸被递送到的组织可视化的能力(例如通过包括染料)；(3)增强从细胞内隔室例如内体逃逸的能力(例如通过包括内体逃逸部分)；(4)提高跨膜转运到靶细胞中的效果(例如通过包括细胞穿透肽)。官能帽基也可用于改变单核苷酸的溶解度或生物利用度。该功能可以独立于将本发明的单核苷酸递送到特定组织的能力来实现。官能帽基可以是缀合任何递送结构域之前的中间体。

官能帽基可以通过引入提供每种所需功能的部分来实现这些特征中的一个或多个。所有类型的官能帽基(例如，封闭基团或递送结构域)当与磷(V)原子键合时，掩蔽单核苷磷酸酯的负电荷，其在官能帽基和磷(V)原子之间的键在体内水解时释放。

糖

包含在本发明的单核苷酸中的糖可以是具有至少5个碳原子的单糖，其可以是直链、支链或环状的。特别地，糖可以是核糖或其修饰物，例如2-脱氧核糖、2-甲基核糖、2-甲基-2-脱氧核糖。2-脱氧核糖可以在2位包括卤素(例如F)或任选取代的C_1-6烷氧基(例如甲氧基或甲氧基乙氧基)。

糖可以是式(III)的化合物：

其中，

X¹是与磷酸酯基团的磷(V)原子相连的键；

B¹是与核碱基相连的键；

R²和R³各自独立地为H、氨基、叠氮基、任选取代的C_1-6烷基(例如甲基)、任选取代的C_1-6杂烷基、任选取代的C_2-6烯基、任选取代的C_2-6炔基、卤素(例如F)、氰基、羟基或任选取代的C_1-6烷氧基，

R⁴是羟基、任选取代的C_1-6烷氧基(例如，任选被=O和/或氨基(例如-NH₂)取代的烷氧基)、任选取代的氨基、叠氮基或-O-X²，其中X²是与磷(V)原子相连的键；

R⁶是H、叠氮基、氰基、卤素(例如F)、任选取代的C_1-6烷基、任选取代的C_2-6烯基或任选取代的C_2-6炔基；和

R⁷是H或任选取代的C_1-6烷基(例如Me)。

在某些实施方案中，如果R²和R³中的一个为卤素，另一个不为氨基、羟基或任选取代的C_1-6烷氧基。在其他实施方案中，R²和R³中的至少一个不是H。

本发明的单核苷酸可以具有式(II)的结构：

或其药学上可接受的盐或磷非对映异构体，

其中

G是官能帽基；

LinkA是连接基；

B¹是核碱基；

R²和R³各自独立地为H、氨基、叠氮基、任选取代的C_1-6烷基(例如甲基)、任选取代的C_1-6杂烷基、任选取代的C_2-6烯基、任选取代的C_2-6炔基、卤素(例如F)、氰基、羟基或任选取代的C_1-6烷氧基；

G¹是任选取代的氨基、任选取代的C_1-6烷氧基、任选取代的C_6-14芳氧基或任选取代的C_1-9杂芳氧基，R⁴是羟基、任选取代的C_1-6烷氧基(例如，任选被=O和/或氨基(例如-NH₂)取代的烷氧基)、任选取代的氨基或叠氮基，或G¹和R⁴结合形成-O-；

R⁷是H或任选取代的C_1-6烷基(例如Me)。

核碱基

包含在本发明的单核苷酸中的核碱基可以是修饰的或未修饰的核碱基。未修饰的核碱基可以是嘌呤碱基(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))或嘧啶碱基(例如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U))。修饰的核碱基可以是嘌呤或嘧啶碱基的受保护形式，其中一个或多个氧和/或氮原子被合适的保护基团保护或作为前药部分存在。在非限制性实例中，核碱基可以是尿嘧啶、胞嘧啶、腺苷或鸟苷，或其修饰形式(例如2-氨基-6-烷氧基嘌呤)。

核碱基可以包括富集了比元素的原子量重的同位素的一个或多个位置。例如，核碱基可以包括富集了¹⁵N的氮原子位置。在一些实施方案中，核碱基是具有富集了¹⁵N的环外氨基的胞嘧啶。

本发明的单核苷酸具有模块化结构，其允许分子部分的变化(例如官能帽基的变化，例如包含靶向部分)而不实质性地影响硫-硫键切割机制。在本发明的化合物中包含靶向部分可以降低单核苷酸的药物活性所需的最低有效浓度。例如，通过包括对肝细胞有特异性的靶向部分(例如，GalNAc、甘露糖或脂质)，本发明的化合物即使全身施用(例如，口服、局部或静脉内)，也可以特异性地递送至肝细胞。

本发明的单核苷酸的非限制性实例包括：

或

或其药学上可接受的盐或磷非对映异构体，

其中，

X是F、OH或任选取代的C_1-6烷氧基(例如OMe)；

R是H、OH或任选取代的氨基(例如NMe₂)；

R₀是H或任选取代的C_1-6烷基(例如Me)；

R¹各自独立地是卤素、C_1-6烷基(例如Me)、C_3-8环烷基(例如环戊基)或C_1-9杂环基(例如，C₅杂环基，包括一个杂原子：N、O或S)；

n为0、1、2、3或4；

m为1、2或3；

R²是任选取代的C_1-6烷基(例如苄基或(R)-1-异丙氧基羰基-乙基)；和

B¹是核碱基(例如尿嘧啶、胞嘧啶、腺苷、鸟苷、(2-氨基-6-甲氧基)嘌呤-9-基或(2-氨基-6-乙氧基)嘌呤-9-基)。

在一些实施方案中，m为2。

特别地，本发明的单核苷酸可以是以下化合物之一：

或其药学上可接受的盐或磷非对映异构体，

包括递送结构域的本发明的单核苷酸的非限制性实例如下：

或其药学上可接受的盐或磷非对映异构体。

递送结构域可以是例如靶向部分(例如GalNAc、甘露糖、脂质等)、细胞穿透肽或内体逃逸部分。

封闭基团

包括在本发明化合物中的封闭基团可以具有大于或等于43Da(例如，大于或等于57Da)的分子量。封闭基团可以具有小于或等于10kDa(例如，小于或等于3kDa或小于或等于300Da)的分子量。封闭基团内的结构可能在细胞内生理条件下对自发反应性是惰性的。封闭基团可以含有接近二硫基的大体积基团(例如，封闭基团可以包括支化的任选取代的C_3-10亚烷基(例如，该封闭基团可以是支化的任选取代的C_3-10烷基))，特别是在连接二硫基与磷(V)原子的连接基上缺少接近二硫基的大体积基团的本发明那些单核苷酸中。封闭基团的非限制性实例包括任选取代的C_3-10烷基(例如，t-Bu；2-羟基-1,1-二甲基-乙基和2-二甲基氨基-1,1-二甲基-乙基)。

递送结构域

在本发明的单核苷酸中包含递送结构域可以促进以下的一种或多种：靶向特定组织类型，本发明的单核苷酸的细胞吸收，细胞吸收后细胞内单核苷或单核苷磷酸酯的细胞内释放(例如，从细胞内隔室如内体释放)，以及检测单核苷或单核苷磷酸酯向靶细胞中的递送。因此，递送结构域可以是靶向部分、染料、内体逃逸部分或细胞穿透肽。

靶向部分(例如，细胞外靶向部分)是与给定靶细胞群(例如肝细胞或淋巴细胞)相关的受体或其他接受部分特异性结合或反应性缔合或复合的任何部分。用于肝细胞的靶向部分的非限制性实例包括糖(例如GalNAc或甘露糖)和脂质。用于淋巴细胞的靶向部分的非限制性实例包括抗CD3抗体(例如，otelixizumab、teplizumab和visilizumab)、抗CD4抗体(例如，可得自eBioscience, San Diego, CA的OKT4或RPA-T4)、抗CD8抗体(例如，可得自eBioscience, San Diego, CA的OKT8或SK1)、抗CD16抗体(例如，可得自eBioscience, SanDiego, CA的CB16或B73.1)以及抗CD19抗体(例如，可得自eBioscience, San Diego, CA的HIB19)。用于其他细胞的靶向部分是本领域已知的。本文描述了本发明的一些细胞外靶向部分。在一个实施方案中，靶向部分是受体结合结构域。在另一个实施方案中，靶向部分是或特异性结合于选自以下的蛋白：胰岛素、胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)、IGF2R、胰岛素样生长因子(IGF；如IGF 1或2)、间质上皮转化因子受体(c-met；也称为肝细胞生长因子受体(HGFR))、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)、heregulin、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血小板源性生长因子受体(PDGFR)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TNF-β、叶酸受体(FOLR)、叶酸、铁传递蛋白、铁传递蛋白受体(TfR)、间皮素、Fc受体、c-kit受体、c-kit、整联蛋白(如α4整联蛋白或β-1整联蛋白)、P-选择蛋白、鞘氨醇-1-磷酸酯受体-1(S1PR)、透明质酸受体、白细胞功能抗原-1(LFA-1)、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95 (Fas受体)、CD106(血管细胞粘附分子1 (VCAM1)、CD166 (活化白细胞粘附分子(ALCAM))、CD178 (Fas配体)、CD253 (TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL))、ICOS配体、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12 (基质细胞衍生因子1 (SDF-1))、白介素1 (IL-1)、IL-1ra、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、CTLA-4、MART-1、gp100、MAGE-1、ephrin(Eph)受体、粘膜地址素细胞粘附分子1 (MAdCAM-1)、癌胚抗原(CEA)、Lewis^Y、MUC-1、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、肿瘤抗原125 (CA125)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、TAG-72抗原及其片段。在另外的实施方案中，靶向部分是成红细胞性白血病病毒癌基因同源物(ErbB)受体(例如ErbB1受体；ErbB2受体；ErbB3受体和ErbB4受体)。在其他实施方案中，靶向部分可以选择性地结合脱唾液酸糖蛋白受体、manno受体或叶酸受体。在具体实施方案中，靶向部分含有一种或多种N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、甘露糖或叶酸配体。在某些实施方案中，叶酸配体具有以下结构：

。

靶向部分还可以选自铃蟾肽、胃泌素、胃泌素释放肽、肿瘤生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，以及牛痘病毒生长因子(VVGF)。也可以将非肽基配体用作靶向部分，并且可以包括例如类固醇、糖、维生素和凝集素。靶向部分还可以选自多肽，例如生长激素抑制素(例如具有核心序列环[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys] (SEQ ID NO: 6)且其中例如，生长激素抑制素类似物的C末端是Thr-NH₂的生长激素抑制素)、生长激素抑制素类似物(例如奥曲肽和兰瑞肽)、铃蟾肽、铃蟾肽类似物或抗体，例如单克隆抗体。

内体逃逸部分增强了内体内容物的释放或允许分子从诸如内体的内部细胞隔室逃逸。示例性的内体逃逸部分包括化学治疗剂(例如喹诺酮，例如氯喹)；融合脂质(例如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE))；和聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)；聚(β-氨基酯)；肽或多肽，例如聚精氨酸(例如八精氨酸)和聚赖氨酸(例如八赖氨酸)；质子海绵、病毒衣壳和肽转导结构域，如上所述。例如，融合肽可以衍生自A型流感病毒的M2蛋白；流感病毒血凝素的肽类似物；C型流感病毒的HEF蛋白；线状病毒的跨膜糖蛋白；狂犬病病毒的跨膜糖蛋白；水泡性口炎病毒的跨膜糖蛋白(G)；仙台(Sendai)病毒的融合蛋白；Semliki森林病毒的跨膜糖蛋白；人呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白；麻疹病毒的融合蛋白；新城疫病毒的融合蛋白；绵羊髓鞘脱落病毒的融合蛋白；鼠科白血病病毒的融合蛋白；HTL病毒的融合蛋白；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的融合蛋白。可以用于促进内体逃逸的其他部分描述于Dominska等，Journal of Cell Science, 123(8):1183-1189, 2010。表1中提供了内体逃逸部分的非限制性实例。

细胞穿透肽是促进细胞吸收本发明的单核苷酸的短多肽(例如4至50个氨基酸的多肽)。细胞穿透肽可以含有阳离子肽转导结构域(PTD)，例如TAT或(Arg₈) (Snyder和Dowdy, 2005, Expert Opin. Drug Deliv. 2, 43-51)。PTD可用于递送多种多样的物质(Schwarze等，1999, Science 285, 1569-1572; Eguchi等，2001, J. Biol. Chem. 276,26204-26210；和Koppelhus等，2002, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 12, 51-63)，包括本文所述的单核苷酸。阳离子PTD通过巨胞饮进入细胞，这是所有细胞进行的特定形式的流体相吸收。细胞穿透肽的非限制性实例在表1中提供。

表1

染料

为了使吸收可视化或监测本发明单核苷酸在细胞内的运动的目的，染料可以被包括在官能帽基中(例如，使用光漂白后的荧光恢复(FRAP))。本领域已知的染料可以包括在官能帽基中。可以包括在染料中的有用结构的非限制性实例包括FITC、RD1、别藻蓝蛋白(APC)、aCFTM染料(Biotium, Hayward, CA)、BODIPY (Invitrogen of Life Technologies,Carlsbad, CA)、AlexaFluor® (Invitrogen of Life Technologies, Carlsbad, CA)、DyLight Fluor (Thermo Scientific Pierce Protein Biology Products, Rockford,IL)、ATTO (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany)、FluoProbe (Interchim SA, Motluçon,France)以及Abberior Probes (Abberior GmbH, Göttingen, Germany)。

暴露单核苷酸

不受理论的束缚，本发明的单核苷酸可以通过二硫键的细胞内还原然后进行分子内环化来暴露。磷原子上的其他部分，例如烷氧基或氨基可以通过已知的机制释放，例如酶促机制(例如，通过磷酰胺酶、磷酸二酯酶或一般水解的作用)。在方案1中示出了细胞内二硫键切割且随后释放例如暴露的单核苷酸的一个非限制性实例。

方案1

本发明的单核苷酸的合成

本发明的单核苷酸可以根据本文描述的方法或根据本领域已知的方法制备。方案2中显示了本发明的单核苷酸的合成的非限制性实例。

方案2

在方案2中，HO-Nuc-OR^A是单核苷，其可以是未保护的(例如，R^A是H或任选取代的烷基)或被O-保护基保护。本领域技术人员将认识到，化合物G的合成需要R^A为H。本领域技术人员还将认识到，化合物F的合成允许R^A为本发明范围内的任何基团，包括O-保护基团，如果需要，其可在合成结束时除去。

如方案2所示，化合物A可以与2,2'-二吡啶基二硫化物(PyS-SPy)进行复分解反应，得到混合的二硫中间体，其在用亲电试剂(例如MeOTf)处理后，然后在碱(例如，三烷基胺碱，如Hünig碱(DIEA))存在下用G-SH处理，可以提供化合物B。

化合物B可用于制备本发明的化合物，其包括仅具有一个(例如化合物F)或两个(例如化合物G)化合价键合至单核苷的磷(V)原子。因此，化合物F的制备可以按照以下反应顺序来实现。化合物B可以在碱(例如有机碱，例如吡啶)和新戊酰氯的存在下与亚磷酸反应，以提供化合物C，化合物C在新戊酰氯和碱(例如，吡啶)存在下与化合物D反应可以产生化合物E。化合物C中的反荷离子可以源于反应中使用的碱，或者可以在猝灭时提供。用G¹-H(H连接到杂原子，例如N或O)处理化合物E可以提供化合物F。可以通过使化合物B与化合物D(R^A = H)在碱(例如三烷基胺碱，例如Hünig碱(DIEA))、活化剂(例如4,5-二氰基咪唑)和ClP(NiPr₂)₂存在下反应来制备化合物G。

在上述反应中，可能需要保护反应性官能团(例如羟基、氨基、硫代或羧基)以避免它们不期望地参与反应。这些基团的引入以及引入和除去它们所需的方法是本领域技术人员已知的(例如，Greene，同上)。脱保护步骤可以是合成中的最后步骤，使得保护基团的除去提供了本发明的化合物。以上任何方案中使用的原料可以购买，或通过化学文献中所述的方法或通过使用本领域技术人员已知的方法对其进行适应性修改而制备。执行步骤的顺序可以根据引入的基团和使用的试剂而变化，但对于本领域技术人员来说是显而易见的。

药物组合物

用于本文所述方法的化合物优选配制成药物组合物，用于以适于在体内施用的生物相容形式施用于人受试者。药物组合物通常包括本文所述的化合物和药学上可接受的赋形剂。

对于人类使用，本发明的单核苷酸可以单独施用或与根据预期施用途径和标准药学实践选择的药物载体混合施用。因此，根据本发明使用的药物组合物可以以常规方式配制，使用一种或多种生理学上可接受的载体，其包含促进式(I)或(II)化合物加工成可以在药学上使用的制剂的赋形剂和助剂。

本发明还包括可以含有一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。在制备本发明的药物组合物时，活性成分通常与赋形剂混合，由赋形剂稀释或包封在以例如胶囊、小药囊、纸或其他容器的形式的载体内。当赋形剂用作稀释剂时，其可以是作为活性成分的媒介物、载体或介质的固体、半固体或液体材料(例如生理盐水)。因此，组合物可以是片剂、粉末、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳剂、溶液剂、糖浆剂以及软和硬明胶胶囊的形式。如本领域所知，稀释剂的类型可以根据预期的施用途径而变化。所得组合物可以包括另外的试剂，例如防腐剂。

赋形剂或载体根据施用方式和途径选择。合适的药物载体以及用于药物制剂的药物必需品描述于Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21版,Gennaro, Ed., Lippencott Williams & Wilkins (2005)，这是本领域公知的参考教科书，以及USP/NF(美国药典和国家处方集)。合适的赋形剂的实例是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。制剂可另外包括：润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，例如苯甲酸羟甲酯和羟丙酯；甜味剂；和调味剂。其他示例性赋形剂描述于Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第6版, Rowe等人，Eds., Pharmaceutical Press (2009)。

这些药物组合物可以以常规方式制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法。用于制备制剂的本领域熟知的方法见于例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, Gennaro, Ed.,Lippencott Williams & Wilkins (2005)，以及Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology, J. Swarbrick和J. C. Boylan编辑, 1988-1999, Marcel Dekker, NewYork。适当的制剂取决于所选择的施用途径。这些组合物的制剂和制备对于药物制剂领域的技术人员来说是公知的。在制备制剂时，可以将活性化合物研磨以在与其他成分组合之前提供适当的颗粒尺寸。如果活性化合物基本不溶，则可将其研磨至小于200目的颗粒尺寸。如果活性化合物基本上是水溶性的，则可以通过研磨来调节颗粒尺寸例如约40目以在制剂中提供基本均匀的分布。

剂量

本文所述方法中使用的化合物或其药物组合物的剂量可以根据许多因素而变化，例如化合物的药动学性质；施用方式；接受者的年龄、健康和体重；症状的性质和程度；治疗的频率和同时治疗的类型(如果有的话)；以及待治疗的动物中化合物的清除率。本领域技术人员可以基于上述因素确定适当的剂量。本文所述方法中使用的化合物可以最初以适合的剂量施用，其可以根据临床反应按需要进行调整。通常，本发明的单核苷酸的合适的每日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量通常将取决于上述因素。

本发明的单核苷酸可以以单剂量或多剂量施用于患者。当施用多个剂量时，剂量可以彼此分开例如1-24小时、1-7天、1-4周或1-12个月。化合物可以按照时间表施用，或者化合物可以在没有预定时间表的情况下施用。活性化合物可以例如每天施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次，每2、3、4、5或6天施用一次，每周施用1、2、3、4、5、6或7次，每月施用1、2、3、4、5或6次，或每年施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次。应当理解，对于任何特定的受试者，特定剂量方案应根据个体需要以及施用组合物或监督组合物的施用的人的专业判断随时间进行调整。

虽然主治医师将最终决定适当的量和剂量方案，但本发明的单核苷酸的有效量可以是例如0.05mg至3000mg之间的本文所述的任何化合物的总日剂量。或者，可以使用患者的体重来计算剂量。这样的剂量范围可以包括例如10-1000mg(例如50-800mg)。在一些实施方案中，施用50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000 mg的化合物。

在本发明的方法中，将多个剂量的本发明的单核苷酸施用于患者的时间可以变化。例如，在一些实施方案中，本发明化合物的多个剂量在1-7天；1-12周；或1-3个月的时间内施用于患者。在其他实施方案中，化合物在例如4-11个月或1-30年的时间内施用于患者。在其他实施方案中，在症状发作时向患者施用化合物。在任何这些实施方案中，施用的化合物的量可以在施用的时间段内变化。当每天施用化合物时，可以每天施用例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次。

制剂

确定为能够使用本文所述的任何方法治疗本文所述的任何病症的化合物可以以单位剂量形式与药物可接受的稀释剂、载体或赋形剂施用于患者或动物。用于这种疗法的化合物可以通过医学化学领域中技术人员已知的任何标准技术产生和分离。可以使用常规药学实践来提供合适的制剂或组合物，以向患有发生坏死的疾病的患者施用确定的化合物。施用可能在患者症状出现之前开始。

如本领域技术人员将理解的，根据所选择的施用途径，可将化合物或其药物组合物以多种形式施用于患者。用于本文所述方法的化合物可以例如通过肠内或肠胃外给药施用。肠内给药可以是口服施用途径。肠胃外施用可以包括肌内、静脉内、动脉内、颅内、皮下、眶内、脑室内、脊柱内、鞘内、腹膜内、直肠和局部施用途径。局部施用途径可包括透皮、皮内、鼻内、肺内、口腔和舌下施用途径。根据所选择的施用途径制备药物组合物。肠胃外施用可以在选定的时间段内连续输注。化合物理想地与药学上可接受的载体一起施用。为了治疗本文所述疾病而配制的本文所述化合物的药物制剂也是本发明的一部分。

口服施用制剂

本发明考虑的药物组合物包括配制用于口服施用的那些(“口服剂型”)。口服剂型可以是例如片剂、胶囊、液体溶液或悬浮液、粉末或液体或固体晶体的形式，其含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉(包括马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；造粒和崩解剂(例如，纤维素衍生物，包括微晶纤维素；淀粉，包括马铃薯淀粉；麦芽糖糊精；交联羧甲基纤维素钠；藻酸盐或藻酸)；粘合剂(例如蔗糖、葡萄糖、山梨醇、阿拉伯胶、藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸镁铝、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮或聚乙二醇)；润滑剂、助流剂和抗粘附剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。其他药学上可接受的赋形剂可以是着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂等。

口服施用的制剂也可以提供为咀嚼片；硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合；或软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合，所述油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油。可以使用例如混合器、流化床装置或喷雾干燥设备以常规方式使用上述在片剂和胶囊下提及的成分制备粉剂、颗粒剂和丸剂。

可以构建用于口服的控释组合物来通过控制活性药物的溶解和/或扩散以释放活性药物。可以采用许多策略中的任何一种以获得控制释放和靶向的血浆浓度与时间的关系曲线。在一个实例中，通过适当选择各种制剂参数和成分，包括例如各种类型的控释组合物和涂层来获得控制释放。实例包括单一或多个单位片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳剂、微胶囊、微球、纳米颗粒、贴剂和脂质体。在某些实施方案中，组合物包括可生物降解的、对pH和/或温度敏感的聚合物涂层。

溶解或扩散控制释放可以通过适当地涂覆化合物的片剂、胶囊、丸剂或颗粒制剂或通过将化合物掺入合适的基质中来实现。控释涂层可以包括上述一种或多种涂层物质和/或例如紫胶、蜂蜡、糖蜡(glycowax)、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、硬脂醇、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯、乙基纤维素、丙烯酸树脂、dl-聚乳酸、乙酸丁酸纤维素、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-羟基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝胶、1,3-丁二醇、乙二醇甲基丙烯酸酯和/或聚乙二醇。在控释基质制剂中，基质材料还可以包括例如水合甲基纤维素、巴西棕榈蜡和硬脂醇、卡波普934、硅氧烷、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯和/或卤代碳氟化合物。

本发明的化合物和组合物可以掺入以供口服施用的液体形式包括水溶液、适当调味的糖浆、水或油悬浮液和具有食用油的调味乳液，所述食用油例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油，以及酏剂和类似的药物媒介。

口腔施用制剂

口腔或舌下施用剂量根据需要通常为每单剂量0.1至500mg。在实践中，医师确定最适合个体患者的实际给药方案，并且剂量随特定患者的年龄、体重和反应而变化。上述剂量是平均情况的示例，但是在某些个体情况下，可以使用更高或更低的剂量，并且这些在本发明的范围内。

对于口腔施用，组合物可以采取片剂、锭剂等的形式以常规方式配制。适用于喷雾器和液体喷雾装置和电流体动力学(EHD)气溶胶装置的液体药物制剂通常将包括本发明的单核苷酸与药学上可接受的载体。优选地，药学上可接受的载体是液体，例如醇、水、聚乙二醇或全氟化碳。任选地，可以加入另一种材料以改变本发明化合物的溶液或悬浮液的气溶胶性质。理想地，该材料是液体的，例如醇、二醇、聚乙二醇或脂肪酸。配制适用于气溶胶装置的液体药物溶液或悬浮液的其他方法是本领域技术人员已知的(参见例如Biesalski,美国专利第5,112,598号和Biesalski, 美国专利第5,556,611号, 各自通过引用并入本文)。

经鼻或吸入施用制剂

化合物也可以配制成用于经鼻施用。用于经鼻施用的组合物也可以方便地配制成气溶胶、滴剂、凝胶剂和粉剂。制剂可以以单剂量或多剂量形式提供。在使用滴管或移液管的情况下，可以通过患者施用适当的预定体积的溶液或悬浮液来实现给药。在使用喷雾的情况下，这可以例如通过计量雾化喷雾泵来实现。

化合物还可进一步配制以供气溶胶施用，特别是通过吸入施用在呼吸道中并包括鼻内施用。该化合物通常具有例如大约五(5)微米或更小的小颗粒尺寸。这样的颗粒尺寸可以通过本领域已知的方法获得，例如通过微粉化获得。活性成分在加压包装中与合适的推进剂一起提供，推进剂例如氯氟烃(CFC)，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷，或二氧化碳或其他合适的气体。气溶胶也可以方便地含有表面活性剂，例如卵磷脂。药物的剂量可以通过计量阀来控制。或者，活性成分可以以干粉末的形式提供，例如化合物在合适的粉末基质例如乳糖、淀粉、淀粉衍生物(例如羟丙基甲基纤维素)或聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)中的粉末混合物。粉末载体将在鼻腔中形成凝胶。粉末组合物可以以单位剂量形式提供于例如胶囊或药筒中，例如明胶或泡罩包装，粉末可以通过吸入器由此施用。

气溶胶制剂通常包括活性物质在生理学上可接受的水性或非水性溶剂中的溶液或细悬浮液，并且通常以无菌形式的单剂量或多剂量存在于密封容器中，所述密封容器可以采取药筒或再填充装置(refill)的形式用于雾化装置。或者，密封容器可以是单一分配装置，例如单剂量经鼻吸入器或装有计量阀的气溶胶分配器，预期在使用后废弃。当剂型包括气溶胶分配器时，其将包含推进剂，推进剂可以是压缩气体，例如压缩空气或有机推进剂，例如，氟氯烃。气溶胶剂型还可以采用泵-雾化器的形式。

肠胃外施用制剂

本文所述的用于本发明方法的化合物可以如本文所述以药学上可接受的肠胃外(例如静脉内或肌内)制剂施用。药物制剂还可以以含有常规无毒的药学上可接受的载体和佐剂的剂型或制剂肠胃外(静脉内、肌内、皮下等)施用。特别地，适用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及可以包括悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。例如，为了制备这样的组合物，本发明的化合物可以溶解或悬浮在肠胃外可接受的液体载体中。可以使用的可接受的载体和溶剂是水；通过加入适量的盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲液调节至合适的pH的水；1,3-丁二醇、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。水性制剂还可含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯。关于肠胃外制剂的其他信息可见于例如美国药典-国家处方集(USP-NF)，通过引用并入本文。

肠胃外制剂可以是由USP-NF确定为适合于肠胃外施用的五种一般类型的制剂中的任何一种：

(1)“药物注射剂”：为药物物质(例如式(I)或(II)的化合物)或其溶液的液体制剂；

(2)“用于注射的药物”：作为干燥固体的药物物质(例如式(I)或(II)的化合物)，其将与合适的无菌载体组合作为药物注射剂用于肠胃外施用；

(3)“药物可注射乳液”：溶解或分散在合适的乳液介质中的药物物质(例如式(I)或(II)的化合物)的液体制剂；

(4)“药物可注射悬浮液”：悬浮在合适的液体介质中的药物物质(例如式(I)或(II)的化合物)的液体制剂；和

(5)“用于可注射悬浮液的药物”：作为干燥固体的药物物质(例如式(I)或(II)的化合物)，其将与合适的无菌载体组合作为药物注射悬浮液用于肠胃外施用。

用于肠胃外施用的示例性制剂包括在适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合的水中制备的化合物的溶液。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、DMSO及其混合物中在含或不含醇的情况下制备，以及在油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂可含有防止微生物生长的防腐剂。用于选择和制备合适制剂的常规方法和成分描述于例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, Gennaro编辑,Lippencott Williams & Wilkins (2005)，以及美国药典：国家处方集(USP 36 NF31)，2013年公开。

用于肠胃外施用的制剂可以例如含有赋形剂、无菌水或盐水；聚亚烷基二醇，例如聚乙二醇；植物来源的油或氢化萘。生物相容的可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。用于化合物的其他可能有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。用于吸入的制剂可以含有赋形剂，例如乳糖，或者可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或者可以是以滴鼻剂形式或作为凝胶施用的油溶液。

可以将肠胃外制剂配制成快速释放或持续/延长释放化合物。用于肠胃外释放化合物的示例性制剂包括：水溶液、用于重构的粉末、助溶剂溶液、油/水乳液、悬浮液、油基溶液、脂质体、微球和聚合物凝胶。

治疗方法

本发明的单核苷酸可用于治疗可通过单核苷酸或单核苷疗法治疗的疾病或病症(例如，RNA病毒感染(例如HIV或丙型肝炎))，因为本发明的单核苷酸可包括在体内暴露后已知治疗所述疾病或病症(例如，RNA病毒感染(例如HIV或丙型肝炎))的单核苷或单核苷酸。本发明的方法包括通过施用本发明的单核苷酸或本发明的药物组合物给有需要的受试者(例如，人)来治疗可通过单核苷酸或单核苷疗法治疗的疾病或病症(例如，RNA病毒感染(例如HIV或丙型肝炎))的方法。制剂、施用途径和剂量可以如上所述。本发明的方法还包括通过使细胞与本发明的单核苷酸接触将单核苷或单核苷酸递送至细胞(例如肝细胞或淋巴细胞)的方法。

以下实施例旨在说明本发明。它们并不意味着以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1-本发明化合物的制备

化合物1

在室温下向二硫联吡啶(52.0g，236.3mmol)和乙酸(3.0mL)的甲醇(200mL)溶液中加入2-(2-羟基乙基)苯硫酚(14.6g，94.5mmol)的甲醇(50mL)溶液并搅拌过夜。除去挥发物，向残余物中加入100mL乙醚，过滤分离的固体，用乙醚(3×50mL)洗涤。将合并的乙醚洗涤液蒸发，得到粗产物，使用ISCO companion (乙酸乙酯/己烷，0-50%)在快速硅胶柱上纯化，得到14.1g(57%) 2-(2-羟乙基)苯基吡啶基二硫化物。¹H NMR (500MHz, CDCl₃): δ8.48 (1H,d, J 5.0Hz), 7.65-7.60 (3H, m), 7.25-7.18 (3H, m), 7.13-7.10 (1H, m), 3.96(2H, t, J 6.5Hz), 3.17 (1H, t, J 6.5Hz)。

在室温下向2-(2-羟乙基)苯基吡啶基二硫化物(4.5g，17.0mmol)在30.0mL二氯甲烷中的溶液中滴加MeOTf。将反应混合物搅拌10分钟，然后加入叔丁基硫醇(1.9mL，17.0mmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.0mL，34.0mmol)。将反应混合物在室温下再搅拌30分钟，然后真空浓缩。将粗混合物使用乙酸乙酯/己烷溶剂系统(0-30%梯度，使用Combi Flash Rf仪器)通过硅胶柱色谱纯化，得到化合物1，为无色油状物(2.5g，61%产率)。¹H NMR(500MHz): δ7.84 (1H, d, J 5.0Hz), 7.25-7.13 (3H, m), 3.92 (2H, t, J 7.0Hz),3.12 (2H, t, J 7.0Hz), 1.30 (9H, s)。

化合物2

将亚磷酸(1.69g，20.6mmol)与无水吡啶共同蒸发三次，然后再溶解在10mL无水吡啶中。向该混合物中加入醇1(0.5g，2.06mmol)，将所得混合物搅拌10分钟，然后冷却至0℃。将新戊酰氯(1.37 g, 11.33 mmol)加入到反应混合物中，升温至室温，再搅拌3小时。用碳酸氢三乙基铵缓冲液(5.0mL，1M)猝灭反应，用乙酸乙酯(30.0mL)稀释。用乙酸乙酯(3×20.0mL)萃取后，合并的有机层用碳酸氢三乙基铵缓冲液(5.0mL，0.5M)洗涤，用无水硫酸钠干燥。真空除去挥发物，得到残余物，将其用ISCO companion (0-10%的甲醇/含有1%三乙胺的二氯甲烷)进行快速硅胶柱纯化，得到0.49g(58%)化合物2，为白色固体。¹H NMR (500Hz, CDCl₃): δ 12.15 (1H, s), 7.80 (1H, d, J 8.5Hz), 7.20 (2H, t, J 6.5 Hz),7.11 (1H, t, J 6.5 Hz), 6.81 (1H, d, J 6.5 Hz), 4.18 (2H, m), 3.21 (2H, t, J7.0Hz), 3.07 (6H, m), 1.35 (9H, t, J 7.0Hz), 1.29 (9H, s)。³¹P NMR (202MHz,CDCl₃): δ10.3 (s)。

化合物3

将化合物2(0.49g，1.20mmol)和2'-甲基-2'-氟-脱氧尿苷(0.26g，1.0mmol)的溶液与无水吡啶共同蒸发两次，将残余物再溶解在15.0mL无水吡啶中并冷却至-15℃。向该混合物中滴加新戊酰氯(0.25mL，2mmol)，并在-15℃下持续搅拌1.5小时。将反应混合物用二氯甲烷(30.0mL)稀释，用氯化铵水溶液(0.5M，20.0mL)猝灭。分离有机层，水层用二氯甲烷(2×20.0mL)萃取。合并的有机层用氯化铵水溶液(0.5M)和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。在真空中除去挥发物，得到残余物，将其用ISCO companion(2-10%的甲醇/含有1%乙酸的二氯甲烷)进行快速硅胶柱纯化，得到0.24g(44%)化合物3，为白色固体。¹H NMR (500 Hz, CDCl₃):δ 8.25 (1H, s), 7.84 (1H, d, J 8.5Hz), 7.56 (1H, d, J 8.5 Hz), 7.39 (1H, dd,J 6.5, 3.5 Hz), 7.27 (1H, m), 7.17 (2H, m), 6.85 (1H, d, J 710Hz), 5.70 (1H,dd, J 8.0Hz), 4.42-4.25 (4H, m), 4.04 (1H, d, J 9.0Hz), 5 3.90 (1H, m), 3.27(2H, t, J 6.5Hz), 1.40 (3H, d, J 22.0 Hz), 1.30 (9H, s)。³¹P NMR (202MHz,CDCl₃): δ 4.25 (s), 14.21 (s)。

化合物4

向化合物3(0.14g，0.26mmol)在二氯甲烷和四氯化碳(v/v=1:1，4mL)的混合物中的溶液中滴加苄胺(0.14mL，1.28mmol)，将所得混合物搅拌3小时。真空除去挥发物，得到残余物，将其用ISCO companion(1-8%甲醇/二氯甲烷)进行快速硅胶柱纯化，得到0.069g(41%)化合物4(非对映异构体混合物)，为白色固体。ESI MS C₂₉H₃₇FN₃O₇PS₂的计算值为653.7，测得值为654.7 [M+H]⁺。³¹P NMR (202MHz, CDCl₃): δ 15.3 (s), 15.1 (s)。

化合物6

在-78℃向2’-甲基-2ʼ-氟-脱氧尿苷(0.13g, 0.5mmol)在无水二氯甲烷(3.0mL)中的溶液中滴加在无水二氯甲烷(2.0mL)中的双-(N,N-二异丙基氨基)-氯膦(0.13g,0.5mmol)，随后加入N,N-二异丙基乙胺(0.094mL，0.55mmol)。将反应混合物温热至室温并再搅拌1小时。向该混合物中加入4,5-二氰基咪唑(0.054g，0.5mmol)在无水乙腈(3.0mL)中的溶液，并将所得混合物搅拌1小时，然后加入醇5(0.097g，0.5mmol)、4,5-二氰基咪唑(0.054g，0.5mmol)的乙腈(5.0mL)溶液，并继续搅拌过夜。向该溶液中加入叔丁基氢过氧化物(0.1mL，5-6 M，在癸烷中)，并将混合物再搅拌30分钟。真空除去挥发物，得到残余物，将其进行HPLC纯化(乙腈/H₂O；15%-65%, 30 min)，得到白色固体形式的两种异构体(0.028g较大极性的非对映异构体6A和0.041g较小极性的非对映异构体6B)。

化合物6A: ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 8.50 (1H, s), 7.18 (1H, d, J8.0Hz), 6.38 (1H, d, J 19.0Hz), 5.82 (1H, d, J 7.5Hz), 4.68 (1H, m), 4.55(1H, m), 4.36 (1H, m), 4.25-4.15 (3H, m), 2.73 (2H, t, J 6.5Hz), 1.87-1.77(4H, m), 1.47 (3H, d, J 20.0Hz), 1.33 (9H, s)。ESI MS C₁₈H₂₈FN₂O₇PS₂的计算值为498.5, 测得值为497.4 [M-H]⁺。³¹P NMR (202MHz, CDCl₃) δ 1.7 (s)。

化合物6B: ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 7.65-7.60 (2H, m),6.35 (1H, d, J21.0Hz), 5.76 (1H, s, br), 4.671 (1H, m), 4.60 (1H, m), 4.32 (1H, m), 4.25-4.18 (3H, m), 2.78 (2H, t, J 6.5Hz), 1.92-1.78 (4H, m), 1.46 (3H, d, J 22.0Hz), 1.33 (9H, s)。ESI MS C₁₈H₂₈FN₂O₇PS₂的计算值为498.5, 测得值为497.4 [M-H]⁺。³¹P NMR (202MHz, CDCl₃) δ 0.6(s)

化合物7

在-78℃将双-(N,N-二异丙基氨基)-氯膦(0.13g，0.5mmol)在无水二氯甲烷(2.0mL)中的溶液滴加到2-甲基-2'-氟-尿苷(0.13g，0.5mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.094mL，0.55mmol)在无水二氯甲烷(3.0mL)中的溶液中。将反应混合物温热至室温并搅拌1小时。加入4,5-二氰基咪唑(0.054g，0.5mmol)在无水乙腈(3.0mL)中的溶液，将所得混合物搅拌1小时。向其中加入醇1(0.12g，0.5mmol)和4,5-二氰基咪唑(0.054g，0.5mmol)在乙腈(5.0mL)中的溶液，将所得混合物搅拌过夜。加入叔丁基氢过氧化物溶液(0.1mL，5-6M，在癸烷中)，将混合物再搅拌30分钟。在真空中除去挥发物，得到残余物，将其进行HPLC纯化(乙腈/H₂O；20%-75%，30分钟)，得到0.011g较大极性的非对映异构体7A和0.039g较小极性的非对映异构体7B，为白色固体。

化合物7A: ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 8.68 (1H, s), 7.83 (1H, d, J8.0Hz), 7.30-7.15 (3H, m), 7.04 (1H, s), 6.29 (1H, d, J 20.0Hz), 6.02 (1H,s), 4.55-4.43 (3H, m), 4.21 (1H, td, J 10.0, 4.5Hz), 3.95-3.50 (2H, m), 3.40-3.25 (2H, m), 1.29 (9H, s),1.29 (3H, m)。ESI MS C₂₂H₂₈FN₂O₇PS₂的计算值为546.6,测得值为545.6 [M-H]⁺。³¹P NMR (202MHz, CDCl₃): δ -2.2 (s)。

化合物7B: ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 8.45 (1H, s), 7.83 (1H, d, J8.0Hz), 7.29-7.20 (1H, m), 7.20-7.13 (3H, m), 6.35 (1H, d, J 18.5Hz), 5.82(1H, d, J 7.0Hz), 4.60-4.40 (4H, m), 4.32-4.15 (2H, m), 3.32-3.23 (2H, m),1.45 (3H, d, J 20.0Hz), 1.30 (9H, s)。ESI MS C₂₂H₂₈FN₂O₇PS₂的计算值为546.6, 测得值为545.5 [M-H]⁺。³¹P NMR (202MHz, CDCl₃) δ 1.1 (s)。

化合物8

在-78℃将双-(N,N-二异丙基氨基)-氯膦(0.27g，1.0mmol)在无水二氯甲烷(0.5mL)中的溶液滴加到2-甲基-2'-OH-尿苷(0.26g，1.0mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.19mL，1.1mmol)的无水N,N-二甲基甲酰胺(2.0mL)溶液中。将反应混合物温热至室温并搅拌1小时。加入4,5-二氰基咪唑(0.11g，1.0mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液，将所得混合物再搅拌1小时。加入醇1(0.24g，1.0mmol)和4,5-二氰基咪唑(0.11g，1.0mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)中的溶液，将所得混合物搅拌过夜。加入叔丁基氢过氧化物溶液(0.2mL，5-6M，在癸烷中)，将混合物搅拌30分钟。真空除去挥发物，得到残余物，将其进行HPLC纯化(乙腈/H₂O；20%-60%，30分钟)，得到0.023g较大极性的异构体8A和0.012g较小极性的异构体8B，为白色粉末(7%)。

化合物8A: ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD): δ 7.86 (1H, dd, J 8.0, 1.0Hz), 7.38(1H, d, J 7.5Hz), 7.33-7.28 (2H, m), 7.24 (1H, td, J 7.0, 1.0Hz), 6.04 ( 1H,s), 5.84 (1H, d, J 7.0Hz), 4.59 (1H, d, J 23.0Hz), 4.41 (1H, t, J 6.5Hz),4.40 (1H, t, J6.5Hz), 4.28-4.19 (2H, m), 3.83 (1H, d,J 7.5Hz), 3.33 (2H, t, J6.5Hz), 1.29 (9H, s), 1.16 (3H, s)。ESI MS C₂₂H₂₉N₂O₈PS₂的计算值为544.6, 测得值为543.6 [M-H]⁺。³¹P NMR (202MHz, CD₃OD) δ -0.46 (s)。

化合物8B: ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD): δ 7.84 (1H, dd, J 8.0, 1.0Hz), 7.58(1H, d, J 8.0Hz), 7.29-7.25 (2H, m), 7.21 (1H, m), 6.09 (1H, s), 5.74 (1H, d,J 8.0Hz), 4.59-4.50 (2H, m), 4.43-4.35 (3H, m), 4.30 (1H, d, J 10.0Hz), 3.33(2H, t, J 6.5Hz), 1.29 (9H, s), 1.26 (3H, s)。ESI MS C₂₂H₂₉N₂O₈PS₂的计算值为544.6, 测得值为543.6 [M-H]⁺。³¹P NMR (202MHz, CD₃OD) δ 1.2 (s)

化合物9

在-78℃将双-(N,N-二异丙基氨基)-氯膦(0.27g，1.0mmol)在无水二氯甲烷(0.5mL)中的溶液滴加到2-甲基-2'-F-胞苷(0.26g，1.0mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.19mL，1.1mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺(2.0mL)中的溶液中。将反应混合物温热至室温并搅拌1小时。加入4,5-二氰基咪唑(0.11g，1.0mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液，将所得混合物再搅拌1小时。加入醇1(0.24g，1.0mmol)和4,5-二氰基咪唑(0.11g，1.0mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)中的溶液，将所得混合物搅拌过夜。加入叔丁基氢过氧化物溶液(0.2mL，5-6M，在癸烷中)，将混合物搅拌30分钟。真空除去挥发物，得到残余物，将其进行HPLC纯化(乙腈/H₂O；20%-60%，30分钟)，得到0.023g(47%)较大极性的异构体9A和0.017g较小极性的异构体9B，为白色粉末(7%)。

化合物9A: ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD): δ 7.86 (1H, dd, J 8.0, 1.0Hz), 7.73(1H, m), 7.32-7.28 (2H, m), 7.23 (1H, td, J 7.0, 1.0Hz), 6.30 (1H, d, J18.0Hz), 6.20 (1H, s, br), 4.64 (1H, s, br), 4.44-4.25 (2H, m), 4.44 (1H, t,J 7.0Hz), 4.43 (1H, t, J 7.0Hz), 4.09-4.01 (1H, m), 3.35 (2H, t, J 7.0Hz),1.40 (3H, d, J 20.0Hz), 1.30 (9H, s)。ESI MS C₂₂H₂₉FN₃O₆PS₂的计算值为545.6, 测得值为544.4 [M-H]⁺。³¹P NMR (202MHz, CD₃OD) δ 1.09 (s)。

化合物9B: ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD): δ 7.85 (1H, d, J 1.0Hz), 7.84 (1H,s), 7.30-7.25 (2H, m), 7.21 (1H, td, J 7.0, 1.0Hz), 6.31 ( 1H, d, J 18.0Hz),6.13 (1H, d, J 8.0Hz), 4.60 (1H, s, br), 4.50-4.30 (2H, m), 4.43 (1H, t, J7.0Hz), 4.40 (1H, t, J 7.0Hz), 3.31 (2H, t, J 7.0Hz), 1.45 ( 3H, d, J20.0Hz), 1.30 (9H, s)。ESI MS C₂₂H₂₉FN₃O₆PS₂的计算值为545.6, 测得值为544.5 [M-H]⁺。³¹P NMR (202MHz, CD₃OD) δ 0.63(s)。

化合物10

在-78℃将双-(N,N-二异丙基氨基)-氯膦(0.27g，1.0mmol)在无水二氯甲烷(0.5mL)中的溶液滴加到2-甲基-2'-OH-胞苷(0.26g，1.0mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.19mL，1.1mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺(2.0mL)中的溶液中。将反应混合物温热至室温并搅拌1小时。加入4,5-二氰基咪唑(0.11g，1.0mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液，将所得混合物再搅拌1小时。加入醇1(0.24g，1.0mmol)和4,5-二氰基咪唑(0.11g，1.0mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)中的溶液，将所得混合物搅拌过夜。加入叔丁基氢过氧化物溶液(0.2mL，5-6M，在癸烷中)，将混合物搅拌30分钟。真空除去挥发物，得到残余物，将其进行HPLC纯化(乙腈/H₂O；20%-60%，30分钟)，得到0.042g(47%)较大极性的异构体10A和0.007g较小极性的异构体10B，为白色粉末(9%)。

化合物10A: ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD): δ 7.86 (1H, dd, J 8.0, 1.0Hz),7.70 (1H, d, J 6.5Hz), 7.32-7.28 (2H, m), 7.23 (1H, td, J 7.0, 1.0Hz), 6.20( 1H, d, J 7.0Hz), 6.05 (1H, s), 4.62 (1H, d, J 22.0Hz), 4.41 (1H, t, J6.5Hz), 4.40 (1H, t, J 6.5Hz), 4.35-4.25 (2H, m), 3.86 (1H, s), 3.34 (2H, t,J 6.5Hz), 1.29 (9H, s), 1.18 (3H, s); ESI MS C₂₂H₃₀N₃O₇PS₂ 的计算值543.6, 测得值542.5 [M-H]⁺; ³¹P NMR (202MHz, CD₃OD) δ -0.50 (s)。

化合物10B: ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD): δ 7.84 (1H, dd, J 8.0, 1.0Hz),7.84 (1H, s), 7.30-7.27 (2H, m), 7.21 (1H, td, J 7.5, 1.0Hz), 6.15-6.07 (2H,m), 4.60-4.52 (2H, m), 4.48-4.39 (3H, m), 4.26 (1H, d, J 9.0Hz), 3.34 (2H, t,J 6.5Hz), 1.30 (9H, s), 1.26 (3H, s); ESI MS C₂₂H₃₀N₃O₇PS₂的计算值543.6, 测得值542.9 [M-H]⁺; ³¹P NMR (202MHz, CD₃OD) δ 1.25 (s)。

化合物16

化合物13的合成：

在-78℃向三苯甲酸(3R,4S,5R)-5-((苯甲酰氧基)甲基)-3-甲基四氢呋喃-2,3,4-三苯甲酯11(2.9g，5mmol)和2,6-二氨基嘌呤12(0.83g，5.5mmol)在无水乙腈(30mL)中的搅拌的悬浮液中加入DBU(2.3mL，15.0mmol)，然后缓慢加入TMSOTf (3.8 mL, 20.0 mmol)。将反应混合物加热至65℃并搅拌过夜，冷却至室温，并用二氯甲烷(200mL)稀释。所得混合物用饱和NaHCO₃水溶液洗涤。分离有机层，水层用二氯甲烷(2×20mL)萃取。合并的有机层用无水硫酸钠干燥。真空除去挥发物，得到残余物，将其用ISCO companion(2-10%甲醇/乙酸乙酯)进行快速硅胶柱纯化，得到1.5g(49%)化合物13，为白色固体。¹H NMR (500 MHz,CDCl₃): δ 8.15-8.17 (2H, m), 7.97-8.02 (4H, m), 7.77 (1H, s), 7.45-7.61 (5H,m), 7.32-7.37 (4H, m), 6.62 (1H, s), 6.53 (1H, d, J 6.5Hz), 5.91 (2H, s),5.04-5.10 (3H, m), 4.82-4.86 (1H, m), 4.70-4.74 (1H, m), 1.62 (3H, s); ESI MSC₃₂H₂₈N₆O₇₇ 的计算值为608.6, 测得值为609.2 [M+H]⁺。

化合物14的合成：

向13(1.0g，1.64mmol)在THF(10mL)中的溶液中加入Boc酐(2.15g，9.86mmol)和DMAP(0.040g，0.33mmol)，将混合物搅拌24小时。真空除去挥发物，得到残余物，将其用ISCOcompanion(0-40%乙酸乙酯/己烷)进行快速硅胶柱纯化，得到1.2g(73%)白色固体的化合物14。¹H NMR (500 Hz, CDCl₃): δ 8.37 (1H, s), 8.17 (2H, d, J 7.5Hz), 8.07 (2H, d,J 7.5Hz), 7.87 (2H, d, J 7.5Hz), 7.61- 7.55 (2H, m), 7.52- 7.47 (3H, ), 7.43(2H, t, J 7.5Hz), 7.27 (2H, t, J 7.5Hz), 6.74 (1H, s), 6.00 (1H, d, J 5.0Hz),4.97-4.91 (2H, m), 4.73 (1H, q, J 5.0Hz), 1.58 (3H, s), 1.43 (18H, s), 1.37(18H, s)。

化合物15的合成：

向化合物14(1.15g，1.14mmol)在甲醇(40mL)中的溶液中加入甲醇钠的溶液(4.37M，0.23mL，1.0mmol)，将混合物搅拌30分钟。反应混合物通过分批加入Dowex®树脂(H⁺形式)中和至pH = 7.0，过滤树脂，并用甲醇洗涤。将滤液蒸发，得到残余物，将其用ISCOcompanion(30-100%乙酸乙酯/己烷)进行快速硅胶柱纯化，得到0.65g(73%)化合物15，为白色固体。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 9.09 (1H, s), 6.19 (1H, s), 4.22 (1H, d, J 8.8Hz), 4.03-4.11 (2H, m), 3.89 (1H, dd, J 12.5, 3.0Hz), 1.41 (18H, s), 0.92(3H, s)；ESI MS C₃₁H₄₈N₆O₁₂的计算值为696.7, 测得值为697.4 [M+H]⁺。

化合物16的合成：

在-78℃将双-(N,N-二异丙基氨基)-氯膦(0.25g，0.94mmol)在无水二氯甲烷(2.0mL)中的溶液滴加到化合物15(0.65g，0.94mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.176mL，1.03mmol)在无水二氯甲烷(5.0mL)中的溶液中。将反应混合物温热至室温并搅拌1小时。加入4,5-二氰基咪唑(0.11g，0.94mmol)在无水乙腈(3mL)中的溶液，将所得混合物搅拌1小时。向其中加入醇1(0.23g，0.94mmol)和4,5-二氰基咪唑(0.11g，0.94mmol)在乙腈(5mL)中的溶液，将所得混合物搅拌过夜。加入叔丁基氢过氧化物溶液(0.19mL，5-6M，在癸烷中)，并将混合物再搅拌30分钟。真空除去挥发物20，得到残留物，用4mL的TFA/DCM(1:1)混合物处理。将所得混合物搅拌2小时。在真空中除去挥发物，得到残余物，将其进行HPLC纯化(乙腈/H₂O；20%-55%，30分钟)，得到0.022g较大极性的非对映异构体16A和0.008g较小极性的非对映异构体16B，为白色固体。

化合物16A: ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD):δ 7.87 (1H, dd, J 8.0, 1.0Hz), 7.84(1H, s), 7.31 (1H, d, J 7.5Hz), 7.28 (1H, td, J 7.5, 1.0Hz), 7.22 (1H, td, J7.5, 1.0Hz), 5.97 ( 1H, s),4.66-4.60 (1H, m), 4.48-4.32 (5H, m), 3.36 (2H, t,J 6.5Hz), 1.27 (9H, s), 1.00 (3H, s); ESI MS C₂₃H₃₁N₆O₆PS₂的计算值为582.6, 测得值为581.6 [M-H]⁺; ³¹P NMR (202MHz, CD₃OD) δ -0.28 (s)。

化合物16B: ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD): δ 7.86 (1H, d, J 8.0Hz), 7.77 (1H,s), 7.32 (1H, d, J 7.5Hz), 7.28 (1H, td, J 7.5, 1.0Hz), 7.21 (1H, td, J 7.5,1.0Hz), 5.95 ( 1H, s), 4.66-4.58 (1H, m), 4.48-4.32 (5H, m), 3.36 (2H, t, J7.0Hz), 1.27 (9H, s), 1.00 (3H, s); ESI MS C₂₃H₃₁N₆O₆PS₂的计算值为582.6, 测得值为581.5 [M-H]⁺; ³¹P NMR (202MHz, CD₃OD) δ 2.0(s)。

化合物18

使用与对于化合物7报道的相同的程序合成化合物18的两种非对映异构体，使用TBDMS保护的二硫化物17，随后使用在THF中的TBAF脱保护。

化合物18A: ESI MS C₂₃H₃₀FN₂O₈PS₂的计算值为576.6, 测得值为 577.5 [M+H]⁺；化合物18B: ESI MS C₂₃H₃₀FN₂O₈PS₂的计算值为576.6, 测得值为577.3 [M+H]⁺。

化合物19

化合物20的合成

将胞苷(10.0g，41.1mmol)与吡啶(2×20mL)共沸并悬浮于40.0mL吡啶中。在15分钟内向悬浮液中滴加四异丙基二硅氧烷二氯化物(14.3g，45.2mmol)。将所得悬浮液在室温下搅拌约16小时。将反应混合物用水小心地稀释并用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。残余物用己烷研磨，得到化合物20，为白色固体。ESI MSC₂₁H₃₉N₃O₆Si₂的计算值为485.7, 测得值为486.2 [M+H]⁺。

化合物21的合成

将化合物20溶于200mL乙醇中，并用20.0mL乙酸酐处理。将反应混合物加热回流并搅拌3小时。减压除去溶剂。将所得残余物在冰浴中冷却至0℃，用饱和NaHCO₃处理，并用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。将粗混合物使用乙酸乙酯/己烷溶剂系统(0-70%梯度，使用Combi Flash Rf仪器)通过硅胶柱色谱纯化，得到9.0g白色固体产物21(两步为42%)。ESI MS C₂₃H₄₁N₃O₇Si₂的计算值为527.7, 测得值为528.3 [M+H]⁺。

化合物22的合成

将化合物21(8.6g，16.3mmol)在200mL二氯甲烷中的溶液在冰浴中冷却至0℃，并用Dess-Martin高碘烷(17.4g，40.8mmol)处理。将所得混合物在室温下搅拌约16小时，并用乙醚稀释。溶液用饱和NaHCO₃和10%硫代硫酸钠(v/v=1:1)的混合物洗涤。将有机层用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。将粗混合物使用乙酸乙酯/己烷溶剂系统(0-60%梯度，使用Combi Flash Rf仪器)通过硅胶柱色谱纯化，得到6.0g浅黄色泡沫状产物22(72%)。

ESI MS C₂₃H₃₉N₃O₇Si₂的计算值为525.7, 测得值为526.2 [M+H]⁺。

化合物23的合成

在氩气下向甲基三苯基溴化鏻(16.2g，45.4mmol)在150mL四氢呋喃中的悬浮液中滴加KHMDS溶液(0.5M于甲苯中，87.0mL，43.3mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，在冰浴中冷却至0℃，并滴加化合物22(6.0g，11.4mmol)在40.0mL四氢呋喃中的溶液进行处理。将所得混合物温热至室温并搅拌4小时。将反应混合物用饱和氯化铵猝灭并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。将粗混合物使用乙酸乙酯/己烷溶剂系统(0-50%梯度，使用Combi Flash Rf仪器)通过硅胶柱色谱纯化，得到4.7g白色泡沫状化合物23(79%)。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 9.96 (1H, s), 8.0 (1H, d, J 7.5Hz),7.43 (1H, d, J 7.5Hz), 6.61 (1H, d, J 1.0Hz), 5.71 (1H, d, J 1.5Hz), 5.39(1H, t, J 2.0Hz), 4.81 (1H, dd, J 9.0, 1.0Hz), 4.2 (1H, dd, J 13.5, 1.5 Hz),4.05 (1H, dd, J 13.0, 2.5Hz), 3.73 (1H, dd, J 9.0, 4.5Hz), 2.27 (s, 3H),1.12-1.02 (m, 28H); ESI MS C₂₄H₄₁N₃O₆Si₂的计算值为523.7, 测得值为524.2 [M+H]⁺。

化合物25

将N,N-双(3,5-二叔丁基亚水杨基)-1,1,2,2-四甲基乙二胺(24，0.73g，1.3mmol)悬浮于10.0mL乙醇中。将所得悬浮液加热至80℃，并在氩气球下搅拌5分钟。然后加入乙酸钴(II)(0.24g，1.3mmol)，将反应混合物在80℃下再搅拌2小时。将深红色悬浮液在冰浴中冷却至室温并过滤。收集的红色固体在真空下干燥，得到0.70g化合物25(87%)。

化合物26的合成

将化合物23(4.7g，9.0mmol)和化合物25(0.19g，0.3mmol)溶于4-甲基苯磺酰基叠氮化物(28.4g，144mmol)，将反应混合物在室温下搅拌5分钟。滴加苯基硅烷(1.17g，10.8mmol)在30.0mL乙醇中的溶液，并将反应混合物再搅拌40分钟。将反应用盐水猝灭并用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。将粗混合物使用乙酸乙酯/己烷溶剂系统(0-30%梯度，使用Combi Flash Rf仪器)通过硅胶柱色谱纯化，得到3.34g浅黄色固体产物26(66%)。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 9.78 (1H, br), 8.18 (1H, d, J7.5Hz), 7.43 (1H, d, J 7.5Hz), 5.9 (1H, s), 4.24 (1H, d, J 13.5Hz), 4.17-4.12(m, 2H), 4.04 (1H, d, J 13.5Hz), 2.27 (s, 3H), 1.40 (s, 3H), 1.12-1.02 (m,28H); ESI MS C₂₄H₄₂N₆O₆Si₂的计算值为566.8, 测得值为567.3 [M+H]⁺。

化合物27的合成

将化合物26(3.34g，5.9mmol)溶于25.0mL四氢呋喃中，并用四丁基氟化铵(1.0M，在THF中，11.8mL，11.8mmol)的溶液处理。将反应混合物在室温下搅拌1小时，真空浓缩。将所得残余物溶于30%氨水(15.0mL)和甲胺(15.0mL)的混合物中，搅拌3小时，真空浓缩。将粗混合物使用甲醇/二氯甲烷系统(0-20%梯度，使用Combi Flash Rf仪器)通过硅胶柱色谱纯化，得到1.2g白色固体的产物27(72%)。¹H NMR (500 MHz, CD₃OD): δ 8.56 (1H, d, J 8.0Hz),6.09 (1H, d, J 7.5Hz), 5.86 (1H, s), 4.09 (1H, d, J 9.5Hz), 4.01-3.96 (2H,m), 3.80 (1H, d, J 13.0 Hz), 1.39 (3H, s); ESI MS C₁₀H₁₄N₆O₄的计算值为282.2,测得值为 283.5 [M+H]⁺。

化合物28

将二氯化磷酸2-氯苯酯(2.0g，8.3mmol)在10.0mL无水THF(经过4Å分子筛)中的溶液在冰浴中冷却，并在氩气下加入在5.0mL THF中的化合物1(2.0g，8.3mmol)，然后滴加2,6-二甲基吡啶(0.89g，8.3mmol)。使反应混合物温热至室温并再搅拌3小时。过滤悬浮液，真空浓缩滤液，残余物用乙酸乙酯/己烷溶剂系统(0-30%梯度，使用Combi Flash Rf仪器)通过硅胶柱色谱纯化，得到2.5g产物28，为无色油(68%)。

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 7.81 (1H, d, J 8.0Hz), 7.37 (1H, d, J8.0Hz), 7.29-7.07 (6H, m), 4.41 (2H, t, J 7.0Hz), 4.12 (2H, t, J 7.0Hz), 1.27(9H, s)。

化合物29的合成

将化合物27(0.10g，0.35mmol)在1.0mL无水THF(经过4Å分子筛)中的溶液在冰浴中冷却，并加入1.0mL的1-甲基咪唑。将反应混合物搅拌15分钟，直到形成澄清的反应溶液，然后滴加化合物28(0.17g，0.39mmol)在1.0mL THF中的溶液。使反应混合物温热至室温，再搅拌2小时，并将反应用水猝灭并用乙酸乙酯萃取。有机层用饱和氯化铵和盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。残余物用甲醇/二氯甲烷溶剂系统(0-15%梯度，使用CombiFlash Rf仪器)通过硅胶柱色谱纯化，得到0.050g无色油状产物29(20%)。ESI MSC₂₈H₃₄ClN₆O₇PS₂的计算值为697.1，测得值为697.8 [M+H]⁺。

化合物30的合成

将化合物29(0.025g，0.035mmol)在1.0mL无水THF(经过4Å分子筛)中的溶液在冰浴中冷却，并一次性加入叔丁醇钾(0.008g，0.071mmol)。将反应混合物温热至室温并再搅拌15分钟。该反应用饱和氯化铵在0℃猝灭并在减压下浓缩。将残余物用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。不经纯化将非对映异构体30A和30B的粗混合物用于下一步骤。ESI MS C₂H₂₉N₆O₆PS₂的计算值为568.6, 测得值为569.4 [M+H]⁺。

化合物19的合成

向化合物30A和30B在1.0mL在THF/水(4:1，v/v)混合物中的溶液中加入三苯基膦(0.009g，0.035mmol)，将反应混合物在室温下搅拌16小时。在减压下除去溶剂，残余物用甲醇稀释，通过制备型HPLC(C18柱，乙腈/H₂O/0.1%TFA)纯化，得到0.004g产物19A(较大极性)和0.001g产物19B(较小极性)，为白色固体。

化合物19A:¹H NMR (500 MHz, CD₃OD): δ 7.87 (1H, d, J 7.5Hz), 7.73 (1H,m), 7.33-7.23 (3H, m), 6.15-6.13 (2H, m), 4.72 (1H, dd, J 23, 4.5Hz), 4.47(2H, m), 4.32 (2H, m), 4.21 (1H, m), 3.36 (2H, m), 1.30 (9H, s), 1.25 (3H,s); ESI MS C₂₂H₃₁N₄O₆PS₂的计算值为542.6, 测得值为543.2 [M+H]⁺; ³¹P NMR (202 MHz,CDCl₃) δ -7.07 (s)。

化合物19B:¹H NMR (500 MHz, CD₃OD):δ 7.85 (1H, d, J 7.5Hz), 7.70 (1H,m), 7.30-7.20 (3H, m), 6.19 (1H, m), 6.03 (1H, m), 4.68-4.65 (3H, m), 4.48-4.42 (3H, m), 3.31 (2H, m), 1.33 (3H, s), 1.30 (9H, s); ³¹P NMR (202 MHz,CDCl₃) δ -4.38 (s)。

化合物31

已知胞苷药效团通过脱氨过程代谢成尿苷。这种转化可能损害胞苷药效团的药理学结果。在一个实施方案中，可以通过使用减慢或甚至停止代谢活性的重原子方法，例如将¹⁵N插入胞苷碱基，来降低该代谢倾向。

可以使用与所述制备化合物7相似的方法制备化合物31。

可以按照本文所述的方法制备下列化合物：

或其药学上可接受的盐或磷非对映异构体。

缀合物

细胞穿透肽(蛋白转导结构域)的合成

肽合成：

合成：将Rink酰胺聚苯乙烯树脂(0.080g，0.61mmol/g)加入到反应容器中，在二甲基甲酰胺(5体积)中溶胀3次，历时7分钟，每次用氮气鼓泡，然后排干。肽的组装使用以下循环并使用标准的Fmoc化学进行：

•用20%哌啶/二甲基甲酰胺(DMF)进行Fmoc脱保护3×4分钟；

•用DMF洗涤树脂，6×1分钟；

•使用5eq受保护的氨基酸、15eq N-甲基吗啉(NMM)和5eq HCTU进行偶联。加入偶联溶液后，使反应进行2×20分钟；

•完成偶联后，树脂用DMF洗涤6×1分钟；

•对于最终组装步骤，通过加入5eq Fmoc-6-肼基烟酸、5eq HATU和15eq NMM/DMF并混合直到反应完成(约1小时)，如通过Kaiser(茚三酮)测试所证实，从而将N-末端加帽。通过20%哌啶/DMF除去Fmoc 3×4分钟；和

•将完成的树脂结合肽用DMF洗涤三次，用二氯甲烷(DCM)洗涤三次，然后真空干燥。

切割：使用以下溶液从树脂切割/脱保护肽：三氟乙酸/二硫苏糖醇/水/丙酮/三异丙基硅烷(10ml，90/3/2/3/2)，同时搅拌2小时。将树脂通过中等玻璃料、注射器过滤器过滤并用纯三氟乙酸(TFA)洗涤两次。将滤液合并，通过蒸发将体积减少至一半。搅拌TFA溶液，通过缓慢加入4体积的冰冷乙醚使粗肽沉淀。通过过滤收集沉淀的粗肽。

纯化：使用Phenomenex Luna C₁₈ (100 x 4.6 mm 5µ)柱，经20分钟，使用15-75%B(A=0.1%三氟乙酸/水；B=0.1%三氟乙酸/乙腈)，通过LC/MS分析粗物质。制备的细胞穿透肽列于表1中。

靶向部分的合成

GalNAc (NAG)配体合成

五乙酸D-半乳糖胺(NAG2)的制备。将D-半乳糖胺(25.0g，116mmol)悬浮于无水吡啶(250mL)中，并在惰性气氛下冷却至0℃。在2小时内加入乙酸酐(120 mL, 1160 mmol)。搅拌过夜后，将反应混合物真空浓缩。加入甲醇后，沉淀出白色固体，通过过滤收集，得到所需产物(42.1g，93%产率)。¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz): δ 5.69 (d, 1H, J 9.0 Hz), 5.40 (m,1H), 5.37 (d, 1H, J 3.0 Hz), 5.08 (dd, 1H, J 3.0 Hz, 11 Hz), 4.44 (dt, 1H, J9.5 Hz, 11 Hz), 4.17 (dd, 1H, J 7.0 Hz, 11.5 Hz), 4.11 (dd, 1H, , J 7.0 Hz,11.5 Hz), 4.01 (t, 1H, J 7.0 Hz), 2.17 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 2.05 (s, 3H),2.02 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.57 (s, 3H)。

5-羟基戊酸苄酯(NAG5)的制备。将δ-戊内酯(10.0g，100mmol)和NaOH(4.00g，100mmol)在水(100mL)中的溶液在70℃下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温并真空浓缩，得到白色固体NAG4。将该固体悬浮于丙酮(100mL)中，并与苄基溴(20.5g，120mmol)和四丁基溴化铵(1.61g，0.50mmol)一起回流过夜。真空除去丙酮，得到油状残余物，将其溶于EtOAc中，并用饱和NaHCO₃(水溶液)和盐水洗涤。将有机层用Na₂SO₄干燥并真空浓缩，得到油状产物NAG5(17.1 g, 82%产率)。¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz): δ 7.35 (m, 5H), 3.64 (q,2H, J 6 Hz, 11.5 Hz), 2.41 (t, 2H, J 7.5 Hz), 1.75 (m, 2H), 1.60 (m, 2H),1.44 (t, 1H, J 6 Hz)。

苄氧基羰基丁基2-脱氧2-N-乙酰基-3,4,6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG7)的制备-方法A。在惰性气氛下，在环境温度下将TMSOTf (8.56g, 38.4mmol)加入NAG2(10.0g，25.6mmol)在DCE(100mL)中的溶液中。将混合物在55℃下搅拌2小时，移除热，并搅拌过夜。将反应混合物倒在冰冷的饱和NaHCO₃(水溶液)上，用CH₂Cl₂萃取。将有机层用Na₂SO₄干燥并真空浓缩，得到浆料NAG6。向DCE(60mL)中的NAG6溶液中加入醇NAG5(8.00g，38.4mmol)和分子筛。将混合物置于惰性气氛下，用TMSOTf(2.85g，12.8mmol)处理，并在室温下搅拌过夜。将混合物倒在冰冷的饱和NaHCO₃(水溶液)上，用CH₂Cl₂萃取。将有机层用Na₂SO₄干燥并真空浓缩，得到浆料。将该粗物质通过SiO₂凝胶色谱纯化，得到糖苷NAG7(3.3g，24%产率)。¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz): δ 7.35 (m, 5H), 5.98 (d, 1H, J 7.0Hz), 5.57 (m, 1H), 5.34 (d, 1H, J 3.0 Hz), 5.25 (dd, 1H, J 3.0 Hz, 11 Hz),5.10 (s, 2H), 4.63 (d, 1H, J 8.5 Hz), 4.11 (m, 2H), 3.95 (m, 1 H), 3.88 (m,2H), 3.49 (m, 1H), 2.37 (m, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.99 (s, 3H),1.90 (s, 3H), 1.70 (m, 2H), 1.61 (m, 2H)。

苄氧基羰基丁基2-脱氧2-N-乙酰基-3,4,6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG7)的制备-方法B。向NAG2(5.00g，12.8mmol)和醇NAG5(5.33g，25.6mmol)在DCE(50mL)中的溶液中一次性加入Sc(OTf)₃ (0.44 g, 0.90 mmol)。将混合物置于惰性气氛下并回流3小时。冷却后，混合物用CH₂Cl₂稀释，用饱和NaHCO₃(水溶液)洗涤，用MgSO₄干燥，真空浓缩。通过SiO₂凝胶色谱纯化，得到糖苷NAG7(5.53g，80%产率)。

羧基丁基2-脱氧2-N-乙酰基-3,4,6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(NAG8)的制备。将糖苷NAG7(1.50g，2.41mmol)在EtOH(25mL)中的溶液在真空下脱气并用氩气吹扫。一次性加入钯催化剂(10重量%，在活性炭上，0.50g)，将混合物在真空下脱气，用氩气吹扫。向非均相混合物中加入环己烯(25mL)并回流6小时。冷却后，过滤除去催化剂，真空浓缩母液。将粗产物通过SiO₂凝胶色谱纯化，得到白色泡沫NAG8(0.76g，70%产率)。¹H NMR (CDCl₃,500 MHz): δ 5.72 (d, 1H, J 8.5 Hz), 5.35 (d, 1H, J 3.5 Hz), 5.26 (dd, 1H, J3.5 Hz, 11.5 Hz), 4.67 (d, 1H, J 8.5 Hz), 4.17 (dd, 1H, J 6.5 Hz, 11.5 Hz),4.12 (dd, 1H, 6.5 Hz, 11.5 Hz), 4.00 (dt, 1H, J 8.5 Hz, 11.5 Hz), 3.92 (m,2H), 3.53 (m, 1H), 2.39 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.01 (s, 3H),1.97 (s, 3H), 1.71 (m, 2H), 1.65 (m, 2H)。

三价GalNAc靶向部分(NAG21)的合成

三-(羧基乙氧基甲基)-甲基酰氨基-十二烷二酸甲酯(NAG14)的制备。向用HATU(122mg，0.50mmol)和DIEA(218μL，1.25mmol)活化的十二烷二酸甲酯(211 mg, 0.42 mmol)在DMF(2mL)中的溶液中加入三连接基NAG12。1小时后，将反应混合物真空浓缩并通过SiO₂凝胶色谱纯化，得到NAG13(214mg，70%产率)。MALDI-TOF质量计算值C₃₈H₆₉NO₁₂: 731.48, 测得值: 755.10 [M+Na]。三叔丁基酯 NAG13用TFA:TIPS:DCM (9:0.25:1)混合物(10.25 mL)水解4小时，并真空浓缩得到三酸NAG14。MALDI-TOF质量计算值C₂₆H₄₅NO₁₂: 563.29, 测得值: 565.33 [M+H]。

三-(氨基丙酰氨基-乙氧基甲基)-甲基酰氨基-十二烷二酸甲酯(NAG16)的制备。向用HATU(557mg，1.35mmol)和DIEA(470μL，2.70mmol)活化的三酸NAG14(230mg，0.41mmol)在DMF(4mL)中的溶液中加入单Boc 1,3-二氨基丙烷(250mg，1.44mmol)。1小时后，将反应真空浓缩并通过SiO₂凝胶色谱纯化，得到NAG15(335mg，79%产率)。MALDI-TOF质量计算值C₅₀H₉₃N₇O₁₅: 1031.67, 测得值: 1056.40 [M+Na]. 三Boc连接基NAG15用TFA:TIPS:DCM(9:0.25:1)混合物(10.25 mL)处理1小时并真空浓缩得到三胺NAG16。MALDI-TOF质量计算值C₃₅H₆₉N₇O₉: 731.51, 测得值: 733.18 [M+H]。

三-GalNAc(NAG18)的制备：用HATU(163mg，0.43mmol)和DIEA(150μL，0.86mmol)处理在DMF(2mL)中的单糖NAG8(192mg，0.43mmol)。30分钟后，加入NAG16(80mg，0.11mmol)在DMF(1mL)中的溶液，将混合物搅拌1小时。将粗混合物通过SiO₂凝胶色谱纯化，得到NAG17(82mg，37%产率)。质量计算值C₉₂H₁₅₀N₁₀O₃₉: 2019.00, 测得值: 2041.85 [M+Na]。将全乙酰化三聚体GalNAc (82mg, 0.04mmol)用THF:H₂O (3:1)溶液(8 mL)中的LiOH·H₂O (34 mg,0.81 mmol)处理，将其水解，得到NAG18。MALDI-TOF质量计算值C₇₃H₁₃₀N₁₀O₃₀: 1626.89, 测得值: 1634.52 [M+Li]。

叠氮基-Peg₃-三聚体GalNAc (NAG21)的制备。将GalNAc三聚体羧酸NAG18(60mg，0.03mmol)、叠氮基-Peg₃-胺NAG20(45.6mg，0.21mmol)、TBTU(23.8mg，0.07mmol)、HOBt(11.5mg，0.03mmol)和DIEA(34μL)溶于DMSO(0.5mL)中，并搅拌2小时。真空除去碱，粗产物通过RP-HPLC纯化，得到NAG21(24mg，44%)。AP-ESI+ 质量计算值C₈₁H₁₄₆N₁₄O₃₂: 1827.02, 测得值: 914.8 [M+2H]²⁺。

六价甘露糖靶向部分(M9)的合成

Lys₆-Peg₂₄-叠氮化物(M8)的制备。使用标准Fmoc化学在Rink酰胺树脂(0.61mmol/g)上用HCTU偶联和20%哌啶脱保护合成肽支架。简而言之，肽M1在自动合成仪上以100μmol的规模制备。在Lys(Mtt)脱保护后，将叠氮基-Peg₂₄酸偶联，得到M7。使用混合物TFA:TIPS:H₂O(92.5:2.5:5)从树脂中释放肽，得到M8(167.0mg)。MALDI TOF质量计算值C₈₇H₁₇₄N₁₆O₃₁:1940.4, 测得值: 1941.1。

Man₆-Lys₆-Peg₂₄-叠氮化物(M9)的制备。用甘露糖异硫氰酸酯和NMM(500μL)处理在DMSO(2mL)中的肽支架M4(167.0mg)。将反应在37℃下搅拌并通过MALDI TOF监测，直至达到完全转化为所需产物(总共加入了58mg的甘露糖异硫氰酸酯)。通过RP-HPLC纯化最终产物得到M9(22mg)。MALDI-TOF质量计算值C₁₆₅H₂₆₄N₂₂O₆₇S₆:3820.37, 测得值: 3843.79 [M+Na]。

三价甘露糖靶向部分的合成(M15)

叠氮基三甘露糖(M15)的制备：将D-甘露糖在吡啶中用Ac₂O全乙酰化过夜。通过旋转蒸发浓缩，然后与PhMe共沸，以定量产率得到五乙酸酯(M8)。在市售的叠氮基-Peg₂醇的存在下，用Sc(OTf)₃活化M8，得到叠氮基-Peg₂甘露糖苷(M9)，其定量氢化为胺(M10)。同时，将三连接基的甲酯(NAG13)水解以选择性地得到酸(M11)。通过TBTU活化将市售的叠氮基Peg₃胺与M11偶联，得到叠氮基三连接基(M12)。用TFA处理三叔丁基酯M12得到三酸M13。M10与M13的偶联由HATU介导，粗混合物全部脱乙酰化，得到叠氮基三甘露糖(M15)。

六价甘露糖靶向部分(M30)的合成

N-苄氧羰基三-(叔丁氧基羰基乙氧基甲基)-甲基酰胺(M22)的制备：向在冰浴中冷却的CH₂Cl₂ (12 mL)中的NAG12(3.55g，7.02mmol)溶液中加入Cbz-Cl (35%在PhMe中, 7.3mL)和TEA (3.9 mL)。将反应温热至室温并搅拌过夜。将混合物用CH₂Cl₂稀释，并用饱和NaHCO₃(水溶液)洗涤，用Na₂SO₄干燥，真空浓缩。粗油通过SiO₂色谱纯化，得到M22(0.98g，22%产率)。AP-ESI+质量计算值C₃₃H₅₃NO₁₁: 639.4, 测得值: 662.4 [M+Na]⁺。

N-苄氧羰基三-((2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-O-α-D-吡喃甘露糖基)-Peg₃-酰氨基乙氧基甲基)-甲基酰胺(M24)的制备：在CH₂Cl₂ (5 mL)中的三叔丁基酯M22(0.97g，1.51mmol)和TIPS(0.93mL，4.55mmol)用TFA(20mL)处理5小时。将混合物真空浓缩，油状残余物用己烷洗涤，在高真空下干燥，得到M23。AP-ESI+ 质量计算值C₂₁H₂₉NO₁₁: 471.2, 测得值: 493.9 [M+Na]⁺。

在DMF(5mL)中的粗M23在冰浴上冷却，并用HATU(0.62g，1.63)和DIEA(0.65mL，3.71mmol)处理。搅拌20分钟后，加入M10(0.89g，1.86mmol)在DMF(5mL)中的溶液，将混合物温热至室温并搅拌3小时。真空除去溶剂，粗品溶于EtOAc中，用饱和NaHCO₃(水溶液)洗涤，用Na₂SO₄干燥，真空浓缩。通过SiO₂色谱纯化，得到M24(0.49g，62%产率)。MALDI-TOF 质量计算值C₈₁H₁₂₂N₄O₄₄: 1854.74, 测得值: 1850.14。

三-((2,3,4,6-四-O-乙酰基-1-O-α-D-吡喃甘露糖基)-Peg₃-酰氨基乙氧基甲基)-甲胺(M25)的制备：将M24(0.49g，0.26 mmol)溶解在具有HOAc(0.2mL)的EtOAc(50mL)中，得到的溶液在真空下脱气并用Ar(g)吹扫。加入Pd/活性炭(0.16g)，将混合物抽真空，然后用H₂ (g)吹扫三次。将反应搅拌2天，通过过滤除去催化剂，真空浓缩母液，得到M25。AP-ESI+ 质量计算值C₇₃H₁₁₆N₄O₄₂: 1720.7, 测得值: 1723.42。

N-Fmoc 双-亚氨基-(乙酰氨基-Peg₄叔丁基酯) (MA13)的制备。用MA12 (212 mg,0.66 mmol)、TBTU (193 mg, 0.60 mmol)、HOBt (92 mg, 0.60 mmol)和DIEA (209 μL,1.20 mmol)在DMF中处理N-Fmoc亚氨基二乙酸MA11(107mg，0.30mmol)2小时。将反应真空浓缩并通过SiO₂凝胶色谱纯化，得到MA13(250mg，91%)。AP-ESI+质量计算值C₄₉H₇₅N₃O₁₆:961.51, 测得值: 962.6 [M+H]⁺, 984.6 [M+Na]⁺。

叠氮基-Peg₄-酰亚胺基-双-(乙酰胺基-Peg₄-叔丁酯) (M27)的制备：CH₂Cl₂中的N-Fmoc MA13 (0.72 g, 0.75 mmol)用哌啶(0.75 mL)处理1小时。HPLCMS显示完全转化为M26，AP-ESI+ 质量计算值C₃₄H₆₅N₃O₁₄: 739.4, 测得值: 740.5 [M+H]⁺。将混合物真空浓缩并与PhMe共沸。将粗M26与叠氮基Peg₄酸(0.44 g, 1.51 mmol)、HATU (0.57 g, 1.51mmol)和DIEA (0.52 mL)在DMF (5 mL)中的溶液反应1小时。真空除去溶剂后，将粗品溶于EtOAc中，用饱和NaHCO₃(水溶液)洗涤，用Na₂SO₄干燥，真空浓缩。通过SiO₂色谱纯化，得到M27(0.71g，93%产率，2个步骤)。AP-ESI+质量计算值C₄₅H₈₄N₆O₁₉: 1012.6, 测得值: 1013.6[M+H]⁺。

叠氮基-Peg₄-酰亚胺基-双-(三聚体甘露糖) (M30)的制备：将酰亚胺基连接基M27 (0.69 g, 0.68 mmol)用TIPS (0.28 mL, 1.36 mmol)和TFA (10 mL)处理，得到三酸M28；AP-ESI+质量计算值C₃₇H₆₈N₆O₁₉: 900.5, 测得值: 900.9 [M+H]⁺, 922.9 [M+Na]⁺。真空除去挥发物，将M28在高真空下干燥。在0℃，用在DMF(2mL)中的HATU(75mg，0.2mmol)和DIEA(0.28mL)活化二酸M28(82.0mg，0.09mmol)。30分钟后，加入M25(0.26mmol)在DMF(2mL)中的溶液，将混合物温热至室温并搅拌2小时。RP-HPLCMS显示完全转化为M29；质量计算值C₁₈₃H₂₉₆N₁₄O₁₀₁: 4305.84。MALDI-TOF测得值: 4303.36 AP-ESI+测得值: 1436.1 [M+3H]³⁺,1077.3 [M+4H]⁴⁺。将反应用CH₂Cl₂稀释，用饱和NaHCO₃(水溶液)洗涤，用Na₂SO₄干燥，真空浓缩。将溶解在MeOH(20mL)中的粗M29油(538mg)用NaOMe(25重量%，在MeOH中，0.5mL)处理1小时。RP-HPLCMS显示完全转化为M30。通过加入Dowex H+树脂中和来猝灭反应。将粗物质通过HPLC纯化，得到M30(38.1 mg，13%产率，3个步骤)。质量计算值C₁₃₅H₂₄₈N₁₄O₇₇: 3297.59,MALDI-TOF 测得值: 3318.61 [M+Na]⁺ AP-ESI+ 测得值: 1100.0 [M+3H]³⁺, 825.3 [M+4H]⁴⁺。

递送结构域的缀合

铜-THPTA复合物制剂：

将5mM硫酸铜五水合物(CuSO₄-5H₂O)水溶液和10mM三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)水溶液以1:1(v/v)(1:2摩尔比)混合，并让其在室温下静置1小时。该复合物可以用于催化Hüisgen环加成，例如在下面的缀合方案中所示的反应中。

缀合方案

如上述缀合方案所示，递送结构域可以使用例如环加成反应(例如Hüisgen环加成)与本发明的单核苷酸连接。Hüisgen环加成可以用铜-THPTA催化剂进行(参见上文)。

可以使用本文所述的方法制备以下缀合物：

实施例2-HCV复制测定

在野生型GT1b (Con1)、GT1a (H77)和GT1b/2a、GT1b/3a、GT1b/4a和GT1b/5a NS5B嵌合复制子中以及表2a和2b中列出的NS5B突变体复制子中评估测试化合物的抗病毒活性。

为了产生HCV NS5B嵌合复制子，使用GT1b复制子作为骨架，NS5B基因被源自临床分离株的GT2a、GT3a、GT4a和GT5a的NS5B基因取代。将这些NS5B基因克隆到GT1b骨架中，并通过测序证实。

通过定点诱变(SDM)产生HCV复制子突变体。通过PCR进行SDM，将PCR片段插入骨架复制子构建体。通过测序证实插入的PCR片段和突变体。

所有的复制子测定均为Huh-7细胞中的基于荧光素酶的，以稳定的形式(GT1b和GT1a)进行或通过电穿孔瞬时转染(嵌合和突变复制子)。对于标准HCV复制子测定，将稳定或瞬时转染的Huh-7细胞接种在96孔板(5,000个细胞/孔)中，在含有10%FBS的DMEM中培养，并在37℃，5% CO₂下培养。第二天，用测定培养基稀释测试化合物，并加入适当的孔中(细胞培养基中的最终DMSO浓度为0.5%)。每次操作中包括测定参考阳性对照以确保测定效果。将细胞在37℃，5% CO₂下培养72小时，此时细胞仍然近汇合。通过使用Bright Glo试剂盒根据供应商(Promega)提供的方案测定复制子报告子萤火虫荧光素酶活性来测定抗病毒活性。通过CytoTox-1细胞增殖测定(Promega)评估测试化合物的毒性。使用GraphPad Prism软件计算半数最大有效浓度(EC₅₀)和半数最大毒性浓度(TC₅₀)值。

表2. 核苷酸化合物的基因型分析

表3. 选择核苷酸化合物的基因型和突变体分析

血清中的核苷磷酯稳定性：

在DMSO中以10mM制备单核苷酸储备溶液；将10μL每种储备溶液加入到1mL血清(小鼠、大鼠和人)中以提供100μM的最终化合物浓度。样品在37℃下培养；在选定的时间点取出100μL等分试样，并直接加入200μL冷乙腈中以沉淀蛋白质。样品在4℃下以14K RPM离心30分钟；将100μL所得上清液与100μL水+0.1%甲酸混合，并如下所述进行LCMS分析。

LCMS条件如下：

柱：Phenomenex Kinetex 5u C18, 2.1 x 50 mm；

流动相A：水+0.1%甲酸；

流动相B：乙腈+0.1%甲酸；

流速：0.4 mL/min；

注射体积：10μL；

梯度：5-95%；B，2.5分钟内；

检测：ESI正和负m/z 250-800。

使用各核苷酸前药的完整理论MW的M+1H或M-1H离子产生提取的离子色谱图，并使用LCMS处理软件测量积分峰面积。通过与掺入适当血清的并如上所述进行处理的化合物的外标曲线比较以进行定量。数据图表示为与t=0时间点相比的剩余化合物的比率。

该测试的结果示于图2、3和4中。

在另一个测试中，在DMSO中以10mM制备单核苷酸储备溶液，并将10μL每种储备溶液加入到1mL胎牛血清(FBS)中以提供100μM的最终化合物浓度。将这些样品在37℃水浴中培养24小时，并在t = 0、1、2、4、6和24小时取出100 μL等分试样。各样品用200 μL冷乙腈沉淀，碎片在4℃以14K RPM沉淀30分钟，取上清液并进行如下所述的LCMS分析。

LCMS方法：

柱：Kinetex 5u C8 100A, 2.1x50 mm

流动相A：95:5 H₂O:乙腈，10mM乙酸铵，0.01%甲酸

流动相B：95:5乙腈:H₂O，10mM乙酸铵，0.01%甲酸

流速：0.4 mL/min

注射体积：7.5 μL

梯度：0-100%B，2.5分钟内

检测：A254, m/z 100-1000 (锥形V=30)

每种化合物使用M+1H和铵加合物产生提取的离子色谱图。

该试验的结果列于表4、5和6。

表4

表4显示了索非布韦的胎牛血清稳定性数据；ESI⁺, EIC: m/z = 530 [M+H]⁺和547 [M+NH₄ ⁺]。

表5

表5显示化合物4的胎牛血清稳定性数据；ESI⁺, EIC: m/z = 654 [M+H]⁺和671 [M+NH₄ ⁺]。

表6

表6显示化合物7A的胎牛血清稳定性数据；ESI⁺, EIC: m/z = 547 [M+H]⁺和564 [M+NH₄ ⁺]。

实施例3.核苷三磷酸体外和体内测定

对于体外实验，将大约5,000,000个分离的肝细胞铺在胶原涂布的培养皿上并使其粘附6小时。在生长培养基中含有核苷酸前药的给药溶液暴露于细胞长达24小时。通过从培养皿中刮下收获细胞、沉淀并保持在冰上。对于体内实验，通过在生理盐水溶液中静脉内尾静脉注射或通过在PEG-甲基纤维素混合物中口服管饲(PO给药)将各小鼠或大鼠暴露于核苷酸前药。在选定的时间点，将动物用超剂量CO₂安乐死，将肝脏切下，并将200mg的肝切片在液氮中快速冷冻。

将来自上述的肝细胞或肝组织悬浮于冷的60%甲醇、10mM EDTA和50mM乙酸铵中，并使用珠粒破碎进行匀浆化。将碎片沉淀，并通过如下所述的阴离子交换LCMS直接分析上清液。

LCMS条件如下：柱-Thermo BioBasic AEX, 5μm, 2.1x100 mm；流动相A-30:70乙腈:50 mM乙酸铵pH=6，流动相B-30:70乙腈:10 mM乙酸铵pH=10；流速-0.4 mL/min；注射体积：25-100 μL；梯度：2分钟内30-95% B，在95%B保持另外3分钟；检测：ESI负m/z 250-800。使用三磷酸化合物的完整理论MW的M-1H离子产生提取离子色谱图，并使用LCMS处理软件测量积分峰面积。通过与掺入空白基质中的适当三磷酸化合物的外标曲线比较以进行定量。

结果示于图5、6、7和8中。

实施例4.模拟胃液中的核苷磷酯稳定性

将2 μM的试验化合物在37℃下与模拟胃液(SGF，0.2% (w/v)氯化钠/0.7% (v/v)盐酸，去离子水，0.3%胃蛋白酶(w/v)，pH 1.2)一起培养。样品一式两份。在0、15、30、60、120、360和1440min取出样品，立即与含有内标(IS)的冷乙腈混合，并在-80℃储存，然后分析。奥美拉唑用作阳性对照。通过LC/MS/MS方法分析样品，通过比较分析物/内标的峰面积比来评估测试化合物的消失，并报告为每个时间点剩余的测试化合物的百分比。

结果列于表7。

表7. 模拟胃液中的核苷酸磷酯稳定性

实施例5. 模拟肠液中的核苷磷酯稳定性

将2μM的试验化合物在37℃下与模拟肠液(SIF)一起培养，该模拟肠液在超纯水中含有0.68% (w/v)磷酸二氢钾和1% (w/v)胰液素(pH 6.8)。样品一式两份。在0、15、30、60、120、360和1440min取出样品，立即与含有内标(IS)的冷乙腈混合，并在-80℃储存，然后分析。苯丁酸氮芥用作阳性对照。通过LC/MS/MS方法分析样品，通过比较分析物/内标的峰面积比来评估测试化合物的消失，并报告为每个时间点剩余的测试化合物的百分比。

结果列于表8。

表8. 模拟肠液中的核苷磷酯稳定性

其它实施方案

在不脱离本发明的范围和实质的情况下，本发明所述组合物和方法的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。尽管本发明已结合具体实施方案加以描述，应理解，所要求保护的发明不应不当地限制于该具体实施方案。实际上，对于本领域技术人员显而易见的实施本发明的所述方式的各种变化意欲包含在本发明范围内。

其它实施方案见权利要求。

Claims

1.一种含有与糖键合的核碱基的单核苷酸，该糖具有3'-碳和5'-碳，其中所述5'-碳通过氧原子与磷酸酯基团的磷(V)原子键合，所述磷(V)原子：

(i) 通过氧原子键合到一个且仅一个二硫生物可逆基团；且

(ii) (a)键合到任选取代的氨基、任选取代的C_1-6烷氧基、任选取代的C_6-14芳氧基或任选取代的C_1-9杂芳氧基；或

(b) 通过氧原子键合到所述3'-碳。

2.权利要求1的单核苷酸，其中所述磷酸酯基团包含一个且仅一个磷(V)原子。

3.权利要求1或2的单核苷酸，其中所述磷(V)原子通过所述氧原子键合到所述3'-碳。

4.权利要求1或2的单核苷酸，其中所述磷(V)原子键合到任选取代的氨基、任选取代的C_1-6烷氧基、任选取代的C_6-14芳氧基或任选取代的C_1-9杂芳氧基。

5.权利要求4的单核苷酸，其中所述磷(V)原子键合到任选取代的氨基或任选取代的C_6-14芳氧基。

6.权利要求5的单核苷酸，其中所述磷(V)原子键合到任选取代的氨基。

7.权利要求1-6中任一项的单核苷酸，其中所述二硫生物可逆基团具有式(I)的结构：

其中

G是官能帽基，

LinkA是分子量大于或等于28Da的连接基，且

X是与所述磷酸酯基团的氧原子的键。

8.权利要求1的单核苷酸，其具有式(II)的结构：

或其药学上可接受的盐或磷非对映异构体，

其中

G是官能帽基；

LinkA是连接基；

B¹是核碱基；

R⁷是H或任选取代的C_1-6烷基。

9.权利要求8的单核苷酸，其中G是封闭基团、递送结构域或染料。

10.式(II)的单核苷酸：

或其药学上可接受的盐或磷非对映异构体，

其中

G是任选取代的C_3-10烷基、任选取代的C_3-10杂烷基、任选取代的C_6-14芳基、任选取代的C_1-9杂环基；

LinkA由1、2或3个独立地选自以下的单体组成：任选取代的C_1-6亚烷基、任选取代的C_1-6亚杂烷基、任选取代的C_6-14亚芳基、任选取代的C_1-9亚杂环基、任选取代的氮杂、O和S；其中LinkA不包含选自O和S的两个相邻原子，并且其中连接到所述磷酸酯基团的氧原子的单体是任选取代的C_1-6亚烷基；

B¹是核碱基；

R¹独立是H、叠氮基、氰基、任选取代的C_1-6烷基、任选取代的C_2-6烯基或任选取代的C_2-6炔基；

G¹是任选取代的氨基、任选取代的烷氧基、任选取代的C_6-14芳氧基或任选取代的C_1-9杂芳氧基，R⁴是羟基、任选取代的C_1-6烷氧基、任选取代的氨基或叠氮基，或G¹和R⁴结合形成-O-；

R⁷是H或任选取代的C_1-6烷基。

11.权利要求8-10中任一项的单核苷酸，其中R¹是H。

12.权利要求8-11中任一项的单核苷酸，其中R²是任选取代的C_1-6烷基。

13.权利要求8-12中任一项的单核苷酸，其中R³是羟基、任选取代的C_1-6烷氧基或卤素。

14.权利要求13的单核苷酸，其中R³是卤素。

15.权利要求8-14中任一项的单核苷酸，其中R⁵是H。

16.权利要求8-15中任一项的单核苷酸，其中R⁶是H。

17.权利要求8-16中任一项的单核苷酸，其中R⁷是H或Me。

18.权利要求8-17中任一项的单核苷酸，其中G¹是任选取代的氨基或任选取代的C_6-14芳氧基。

19.权利要求18的单核苷酸，其中G¹是任选取代的氨基。

20.权利要求8-19中任一项的单核苷酸，其中R⁴是羟基。

21.权利要求8-20中任一项的单核苷酸，其中G¹和R⁴结合形成-O-。

22.权利要求7-9中任一项的单核苷酸，其中G是递送结构域。

23.权利要求22的单核苷酸，其中所述递送结构域包括靶向部分、内体逃逸部分或细胞穿透肽。

24.权利要求23的单核苷酸，其中所述递送结构域包括靶向部分。

25.权利要求24的单核苷酸，其中所述靶向部分包含1至10个糖。

26.权利要求25的单核苷酸，其中每个所述糖独立为GalNAc或甘露糖。

27.权利要求26的单核苷酸，其中所述糖为GalNAc。

28.权利要求27的单核苷酸，其中所述糖为甘露糖。

29.权利要求24的单核苷酸，其中所述靶向部分是脂质。

30.权利要求7-9中任一项的单核苷酸，其中G是封闭基团。

31.权利要求30的单核苷酸，其中G是任选取代的C_3-10烷基、任选取代的C_3-10杂烷基、任选取代的C_6-14芳基或任选取代的C_1-9杂环基。

32.权利要求7-31中任一项的单核苷酸，其中LinkA由1、2或3个独立地选自以下的单体组成：任选取代的C_1-6亚烷基、任选取代的C_1-6亚杂烷基、任选取代的C_6-14亚芳基、任选取代的C_1-9亚杂环基、任选取代的氮杂、O和S；其中LinkA不包含选自O和S的两个相邻原子，并且其中连接到所述磷酸酯基团的氧原子的单体是任选取代的C_1-6亚烷基。

33.权利要求32的单核苷酸，其中LinkA由1、2或3个独立地选自以下的单体组成：任选取代的C_1-6亚烷基、任选取代的C_6-14亚芳基和O。

34.权利要求33的单核苷酸，其中LinkA由1或2个独立地选自以下的单体组成：任选取代的C_1-6亚烷基和任选取代的C_6-14亚芳基。

35.单核苷酸：

或

或其药学上可接受的盐或磷非对映异构体。

36.权利要求39的单核苷酸，其中所述单核苷酸是4、6、7、8、9、10、16或18，或其药学上可接受的盐或磷非对映异构体。

37.包含权利要求1-36中任一项的单核苷酸的组合物，其中所述单核苷酸是同位素富集的。

38.权利要求37的组合物，其中所述单核苷酸富集了¹⁵N。

39.权利要求38的组合物，其中所述核碱基包括环外氨基。

40.权利要求39的组合物，其中所述环外氨基是¹⁵N同位素富集的。

41.权利要求40的组合物，其中所述单核苷酸是：

或其药学上可接受的盐或磷非对映异构体。

42.一种药物组合物，包含权利要求1-36中任一项的单核苷酸或权利要求37-41中任一项的组合物。

43.一种将单核苷酸递送至细胞的方法，包括使所述细胞接触权利要求1-36中任一项的单核苷酸或权利要求37-41中任一项的组合物。

44.权利要求43的方法，其中所述细胞是肝细胞。

45.一种治疗丙型肝炎患者的方法，包括给予所述患者权利要求1-36中任一项的单核苷酸或权利要求37-41中任一项的组合物或权利要求42的药物组合物。