CN107475269B

CN107475269B - 一种热带假丝酵母的酰基—CoA硫脂酶基因及其应用

Info

Publication number: CN107475269B
Application number: CN201710700527.9A
Authority: CN
Inventors: 汪俊卿; 李楠; 修翔; 王瑞明; 苏静; 杨晓慧; 彭健; 薛乐
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2017-08-16
Filing date: 2017-08-16
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2037-08-16
Also published as: CN107475269A

Abstract

本发明涉及一种热带假丝酵母的酰基—CoA硫脂酶基因及其应用。所述热带假丝酵母的酰基—CoA硫脂酶基因ctacA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述酰基—CoA硫脂酶蛋白CtAcA，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次发现热带假丝酵母中的酰基—CoA硫脂酶基因ctacA为长链二元酸转化过程中的关键基因，其表达可以促进长链二元酸—CoA到游离长链二元酸的转换，为以油脂为原料实现新途径合成长链二元酸打下基础。

Description

一种热带假丝酵母的酰基—CoA硫脂酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种热带假丝酵母的酰基—CoA硫脂酶基因及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

长链二元酸一般是指碳链中含有12个以上碳原子且α、ω位分别有一个羧基的直链脂肪族二羧酸。该产品具有较高的工业应用价值，长链二元酸是合成特种尼龙、高级麝香、粘合剂、热熔胶、医药、农药等重要的化工中间体。目前国内外生产长链二元酸主要有2种方法：化学法和发酵法。化学法合成长链二元酸工艺复杂、反应条件苛刻，成本高，目前只有美国、德国等少数国家利用化学合成法生产长链二元酸。相比化学合成法，微生物发酵法凭借反应专一性强，原料来源广、成本低、反应条件温和等特点，正在取代化学合成法生产长链二元酸。因此众多研究者将目标转向有广阔发展前景、工业价值大的微生物发酵上来。微生物发酵法是以正构烷烃为原料，利用热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)的氧化性能，在常温常压下氧化正构烷烃两端的甲基，生成基质烷烃相应链长的二元酸。目前国内已经实现了以烷烃为底物发酵生产长碳链二元酸的产业化，生物法制备得到十一至十四碳二元酸已投放市场。如中国专利文献CN1570124A(申请号2004100182557)、中国专利文献CN1844404A(申请号CN200610038331X)、中国专利文献CN101225411A(申请号2007101958427)、中国专利文献CN102115769A(申请号2009102565907)、中国专利文献CN102115768A(申请号2009102565890)、中国专利文献CN102115766A(申请号2009102565871)、中国专利文献CN102115765A(申请号2009102565867)、中国专利文献CN102061316A(申请号2010101603101)和中国专利文献CN103805642A(申请号2012104397995)等。

目前微生物发酵法生产长链二元酸的技术特别是微生物育种方面日趋成熟，如中国专利文献CN105400796A(申请号201511003830)则公开了一种热带假丝酵母定位于过氧化物酶体膜上的长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p，并通过基因工程阻断该基因的合成实现长链二元酸产量的提升。中国专利文献CN103992959A(申请号2014101755564)通过增加一个拷贝的CYP单加氧酶基因提高热带假丝酵母长链二元酸的产率，中国专利文献CN102839133A(申请号CN201110168672X)则菌种诱变育种筛选到一株pox4基因、fao基因和CYP52A18基因的突变株，突变株对不同碳链长度的烷烃、脂肪酸等物质具有很高的转化性能。

然而，对于开发具更高长链二元酸生产能力的菌株及生产方法，仍然是目前的研究热点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种热带假丝酵母的酰基—CoA硫脂酶基因及其应用。

本发明技术方案如下：

一种调控热带假丝酵母的酰基—CoA硫脂酶基因ctacA，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

调控热带假丝酵母的酰基—CoA硫脂酶的基因ctacA来源于热带假丝酵母，其表达可以促进长链二元酸—CoA到游离长链二元酸的转换。

一种酰基—CoA硫脂酶蛋白CtAcA，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的酰基—CoA硫脂酶基因ctacA。

一种重组细胞，该重组细胞包含有上述重组表达载体或表达上述酰基—CoA硫脂酶基因ctacA。

上述酰基—CoA硫脂酶基因ctacA在改造热带假丝酵母制备长链二元酸中的应用。

根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：

构建酰基—CoA硫脂酶基因ctacA的多拷贝重组假丝酵母或更换启动子实现酰基—CoA硫脂酶基因ctacA的过量表达。

通过构建酰基—CoA硫脂酶基因ctacA的多拷贝重组假丝酵母或更换启动子实现酰基—CoA硫脂酶基因ctacA的过量表达，从而可以提高热带假丝酵母胞内长链二元酸—CoA到游离长链二元酸的转换速率，增加产物长链二元酸转化并减少内耗，进而提高热带假丝酵母长链二元酸的产率及产量。

有益效果

本发明首次发现热带假丝酵母中的酰基—CoA硫脂酶基因ctacA为长链二元酸转化过程中的关键基因，其表达可以促进长链二元酸—CoA到游离长链二元酸的转换，为以油脂为原料实现新途径合成长链二元酸打下基础。

附图说明

图1、热带假丝酵母原始菌和热带假丝酵母突变菌生长曲线；

图2、热带假丝酵母原始菌和热带假丝酵母突变菌长链二元酸发酵结果柱状图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

质粒pPIC9K购自宝生物有限公司；

热带假丝酵母(Candida tropicalis)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；菌种编号为CICC1798；

实施例1热带假丝酵母ctacA基因功能的验证

1、热带假丝酵母基因工程重组菌的构建方法，步骤如下：

(1)提取热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌体的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到同源臂ctacA1，长度523bp，所述的PCR引物序列如下：

CtacA F₁:GGAATTCCCACTATTTTGGCAGAGTT；

CtacA R₁:CTGGCAAACTTTCTTCGTCATGATACCTGCT；

其中，下划线标识为EcoR I酶切位点；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物CtacA F₁ 2.5μl，浓度10μmol/L的引物CtacA R₁ 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(2)提取pPIC9K质粒，并以此为模板，进行PCR扩增，得到Kan片段，长度1523bp，所述的PCR引物序列如下：

Kan F₂:TCTTGGGGTTGAGGCCGTTGAGCA；

Kan R₂:ATTGTGTGAATTCAGTGAGTCAGTCATCAGG；

其中，下划线标识为EcoR I酶切位点；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物Kan-F₂ 2.5μl，浓度10μmol/L的引物Kan-R₂ 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(3)将步骤(1)制得的CtacA1片段与步骤(2)制得的kan片段进行重叠PCR，制得CtacA1-kan片段，长度2046bp；所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：

CtacA1片段4μl；kan片段4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；

所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：

上游引物CtacA F₁2μl；下游引物Kan R₂ 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O8.5μl；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

2、制备热带假丝酵母感受态，步骤如下：

(i)将热带假丝酵母(Candida tropicalis)接种到含50ml菌体增殖培养基的250ml三角瓶中，30℃，200rpm/min，摇床过夜培养；

所述菌体增殖培养基，每升组分如下：

葡萄糖2g、蛋白胨2g、酵母浸粉1g，pH自然；

(ii)将过夜培养的菌液涂布至固体YPD培养基，30℃培养1～2d，得到热带假丝酵母(Candida tropicalis)单菌落；用接种环挑取单菌落到50ml菌体增殖培养基中，30℃、200rpm/min培养12h，转接，培养10h；

所述YPD固体培养基，每升组分如下：

葡萄糖2g、蛋白胨2g、酵母浸粉1g、琼脂2g，pH自然；

(iii)取1.5ml菌液到Ep管中，3000rpm/min，离心1min，收集菌体，用1.5ml预冷的无菌水吹打悬浮细胞；

(iv)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用1ml预冷的无菌水悬浮细胞；

(v)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用1ml 1mol/L预冷的山梨醇悬浮细胞；

(vi)3000rpm/min，离心1min，弃上清，用80μL预冷的山梨醇悬浮细胞，即制成热带假丝酵母电转化感受态；将制备好的感受态细胞置于-80℃保存备用。

3、将CtacA1-kan片段转化热带假丝酵母细胞

(i)将制得的CtacA1-kan片段用限制性内切酶EcoR I酶切，酶切体系如下，总体系40μL：

(ii)浓缩纯化酶切产物

(1)加入1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃冰箱20min；

(2)12000r/min，离心5min得沉淀；

(3)300μL体积百分比为70％的乙醇重悬沉淀；

(4)12000r/min，离心5min，除去乙醇，37℃风干30min；

(5)加入15～18μL ddH₂O重悬DNA，并置于-20℃保存。

(iii)电转化

利用核酸超微量分光光度计(BioFuture MD2000)测定ctacA1-kan片段浓度，达到浓度500μg/ml后进行电转化，电转化条件为1500V、5ms，然后在含1mol/L山梨醇的复苏液中培养，得到的细胞复苏后取100μL涂布在含1mg/mLG418(遗传霉素)的YPD固体培养基上，在30℃培养3天，筛选具有G418抗性的转化子；

所述复苏液为1mol/L的山梨醇；

所述YPD固体培养基，每升组分如下：

葡萄糖2g、蛋白胨2g、酵母浸粉1g、琼脂2g，pH自然。

4、阳性重组菌的培养及鉴定

将上述筛选获得的转化子接种到含G418抗性的YPD液体培养基中培养过夜，吸取1mL菌液，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，CtacA F₁和Kan R₂为引物进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳证明外源片段ctacA1-kan转化到基因组上。

所述YPD液体培养基，每升组分如下：

葡萄糖2g、蛋白胨2g、酵母浸粉1g，pH自然。

利用上述热带假丝酵母基因工程重组菌发酵验证敲除ctacA基因对细胞吸收油脂速率的影响的方法，步骤如下：

将热带假丝酵母原始菌和上述重组菌种子液分别接种于YPD液体培养基中，30℃条件下培养20小时；每两小时测一次OD₆₀₀，即得热带假丝酵母原始菌和重组菌的生长曲线，结果如图1所示。

所述发酵培养基组分如下：

蛋白胨20g、酵母粉10g、葡萄糖20g，水配制，pH 7.0。

根据图1的OD₆₀₀值可知重组后的热带假丝酵母的生长速率与热带假丝酵母原始菌类似，表明该基因的敲除不影响热带假丝酵母的葡萄糖碳源的代谢。

实施例2热带假丝酵母ctacA基因多拷贝菌株构建

在获得ctacA全长基因的基础上，设计特异性引物克隆目的基因，通过无缝克隆技术将载体和目的基因配置重组反应体系，进行重组反应。转化入DH5α感受态中，筛选阳性克隆子。测序正确后提取质粒电转入热带假丝酵母感受态中。发酵验证增加ctacA基因拷贝数对细胞吸收油脂速率的影响的。其技术核心是利用同源重组原理，将载体进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化载体的末端序列，使得PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列(15bp～20bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在无缝交换酶的催化下，仅需反应30min即可进行转化，完成定向克隆，阳性率可达95％以上。具体步骤如下：

(i)提取热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌体的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到ctacA基因，长度3325bp，所述的PCR引物序列如下：

CtacA F₂:ctcactatagggagagcggccgcTTCTTCATAATAATGCTAACTT；

CtacA R₂:catccggaagatctggcggccgcATTATAATAATTTGATTTTC；

其中，下划线标识为Not I酶切位点；

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×PhantaMaster Mix25μl，浓度10μmol/L的引物CtacA F₂ 2.5μl，浓度10μmol/L的引物CtacA R₂ 2.5μl，模板2.5μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性15sec，51℃退火15sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；

(ii)将质粒载体用限制性内切酶Not I酶切，酶切体系如下，总体系50μL：

所述的载体为实验室已构建的带有G418抗性标签的pZERO-Blunt克隆载体；

(iii)酶切产物使用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒柱纯化，柱纯化产物去磷酸化后配置重组体系进行重组反应，反应产物转化、涂板，挑取单菌落采用菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子；送至上海博尚测序。

所述的去磷酸化体系如下：

所述的重组体系如下：

所述的PCR引物序列如下：

CtacA F₂:ctcactatagggagagcggccgcATAGAAGAGTTATTAAAATG；

CtacA R₂:catccggaagatctggcggccgcATACCACACAGAGAGAATACAT；

(iv)确认序列的信息正确后，抽提相应的质粒，电转入热带假丝酵母感受态中，步骤如实施例1-(iii)所述，阳性重组菌的培养及鉴定如实施例1所述。

利用上述热带假丝酵母基因工程重组菌发酵验证增加ctacA基因拷贝数对二元酸产量影响的方法，步骤如下：

将多拷贝重组热带假丝酵母菌和热带假丝酵母原始菌以及热带假丝酵母基因工程重组菌分别接种于YPD液体培养基中，30℃条件下培养14小时；取10ml多拷贝重组菌菌液和10ml原始菌菌液以及10ml重组菌菌液分别接种到100ml发酵培养基中，培养12h后分别加入5ml油脂，进入产酸期；在产酸期，每12h或24h调节pH到7.5，产酸期4～5天。

所述发酵培养基组分如下：

葡萄糖64g/L、(NH₄)₂SO₄ 1g/L、酵母膏2g/L、VB₁ 0.1g/L、NaCl 2g/L、KH₂PO₄ 4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 10.08g/L、尿素2g/L、Mg₂SO₄·7H₂O 6.15g/L，水配制，pH 7.0；

发酵结束后采用酸碱滴定的方法测量二元酸的产量，结果如图2所示。

根据图2的长链二元酸产量可知重组后的热带假丝酵母菌的长链二元酸(DCA)产量较热带假丝酵母原始菌相比大大减少，多拷贝重组热带假丝酵母菌的长链二元酸产量较热带假丝酵母原始菌相比提高了58％，且菌体并未因拷贝数增加而表现出生长不良的现象。由此可知，ctacA基因拷贝数增加后酵母转化生产长链二元酸的能力增强，表明ctacA基因为热带假丝酵母长链二元酸转化关键基因。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种热带假丝酵母的酰基-CoA硫脂酶基因及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1401

<212> DNA

<213> Candida tropicalis

<400> 1

atgaatcctg ctgaggctgc agatgcagca gccactattt tggcagagtt gcgagataag 60

caaatcaatc caaataaagt aacttggata gatgcattaa aagaacgtga aaaattgcgt 120

gccgagggga aaacaataga tagttttagt tatgttgatc caaagaccac agttgtcggt 180

gagaaaacac gaagtgattc attttctttc ttattattac cttttaagga cgataaatgg 240

ctttgcgacg catacataaa tgcttttgga cgacttagag tggcccaatt atttcaagat 300

cttgatgcac ttgccggtag aattgcttat agacattgtt ctcctgctga accagttaat 360

gtcacagcaa gtgtggatag agtatatatg gtgaagaaag tcgatgagat taacaactat 420

aattttgttt tagctggttc tgttacttgg actggtagat cttccatgga gatcacagtg 480

aaaggttacg catttgaaga tgctgttcct gaaatcacta acgaagaaag tttgccagca 540

gagaacgtgt ttttggctgc taatttcaca ttcgttgcaa gaaatccact tacacataaa 600

tcatttgcta taaaccgatt attacctgtc acagaaaaag attggattga ttatagaaga 660

gctgaatccc ataatgctaa aaagaagtta atggctaaga ataaaaagat acttgagcca 720

accgcagagg aatctaaatt gatctacgac atgtggaaat cctcaaaatc tttaaaaaat 780

attgatcgtc aggatgatgg aatagcattt atgaaggaca ccacaatgaa aagtaccatg 840

tttatgcaac ctcaatatag aaacagacat tcttatatga tttttggtgg ttacttatta 900

cgtcaaacat tcgagcttgc ctattgtaca gcagccacct tttcattagc cggaccaaga 960

tttgttagtt tagattcaac tacttttaaa aatccagttc ctgtcggttc agtcttaacc 1020

atggactcct ctatttctta caccgaacac gtacacgatg ggatagaaga gatagactct 1080

gattctcctt ttaatttctc tcttcctgcc actaataagt tgtccaagaa tccagaagca 1140

ttcttgtcag aacctgggac tttgattcaa gtcaaagtag atacttatat tcagcaattg 1200

gaacagtcag aaaagaagcc agccggtacc ttcatatatt ctttctacgt tccaaaggaa 1260

agtgtcagtg tggatggtaa agcttcttat tgtaccgtta tcccacagac ttactctgaa 1320

atgatgacat atgttggtgg tagaagaaga gcacaggaaa ccgctaatta tgtagaaact 1380

ttaccaagta ctaacaacta a 1401

<210> 2

<211> 466

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 2

Met Asn Pro Ala Glu Ala Ala Asp Ala Ala Ala Thr Ile Leu Ala Glu

1 5 10 15

Leu Arg Asp Lys Gln Ile Asn Pro Asn Lys Val Thr Trp Ile Asp Ala

20 25 30

Leu Lys Glu Arg Glu Lys Leu Arg Ala Glu Gly Lys Thr Ile Asp Ser

35 40 45

Phe Ser Tyr Val Asp Pro Lys Thr Thr Val Val Gly Glu Lys Thr Arg

50 55 60

Ser Asp Ser Phe Ser Phe Leu Leu Leu Pro Phe Lys Asp Asp Lys Trp

65 70 75 80

Leu Cys Asp Ala Tyr Ile Asn Ala Phe Gly Arg Leu Arg Val Ala Gln

85 90 95

Leu Phe Gln Asp Leu Asp Ala Leu Ala Gly Arg Ile Ala Tyr Arg His

100 105 110

Cys Ser Pro Ala Glu Pro Val Asn Val Thr Ala Ser Val Asp Arg Val

115 120 125

Tyr Met Val Lys Lys Val Asp Glu Ile Asn Asn Tyr Asn Phe Val Leu

130 135 140

Ala Gly Ser Val Thr Trp Thr Gly Arg Ser Ser Met Glu Ile Thr Val

145 150 155 160

Lys Gly Tyr Ala Phe Glu Asp Ala Val Pro Glu Ile Thr Asn Glu Glu

165 170 175

Ser Leu Pro Ala Glu Asn Val Phe Leu Ala Ala Asn Phe Thr Phe Val

180 185 190

Ala Arg Asn Pro Leu Thr His Lys Ser Phe Ala Ile Asn Arg Leu Leu

195 200 205

Pro Val Thr Glu Lys Asp Trp Ile Asp Tyr Arg Arg Ala Glu Ser His

210 215 220

Asn Ala Lys Lys Lys Leu Met Ala Lys Asn Lys Lys Ile Leu Glu Pro

225 230 235 240

Thr Ala Glu Glu Ser Lys Leu Ile Tyr Asp Met Trp Lys Ser Ser Lys

245 250 255

Ser Leu Lys Asn Ile Asp Arg Gln Asp Asp Gly Ile Ala Phe Met Lys

260 265 270

Asp Thr Thr Met Lys Ser Thr Met Phe Met Gln Pro Gln Tyr Arg Asn

275 280 285

Arg His Ser Tyr Met Ile Phe Gly Gly Tyr Leu Leu Arg Gln Thr Phe

290 295 300

Glu Leu Ala Tyr Cys Thr Ala Ala Thr Phe Ser Leu Ala Gly Pro Arg

305 310 315 320

Phe Val Ser Leu Asp Ser Thr Thr Phe Lys Asn Pro Val Pro Val Gly

325 330 335

Ser Val Leu Thr Met Asp Ser Ser Ile Ser Tyr Thr Glu His Val His

340 345 350

Asp Gly Ile Glu Glu Ile Asp Ser Asp Ser Pro Phe Asn Phe Ser Leu

355 360 365

Pro Ala Thr Asn Lys Leu Ser Lys Asn Pro Glu Ala Phe Leu Ser Glu

370 375 380

Pro Gly Thr Leu Ile Gln Val Lys Val Asp Thr Tyr Ile Gln Gln Leu

385 390 395 400

Glu Gln Ser Glu Lys Lys Pro Ala Gly Thr Phe Ile Tyr Ser Phe Tyr

405 410 415

Val Pro Lys Glu Ser Val Ser Val Asp Gly Lys Ala Ser Tyr Cys Thr

420 425 430

Val Ile Pro Gln Thr Tyr Ser Glu Met Met Thr Tyr Val Gly Gly Arg

435 440 445

Arg Arg Ala Gln Glu Thr Ala Asn Tyr Val Glu Thr Leu Pro Ser Thr

450 455 460

Asn Asn

465

Claims

1.一种酰基—CoA硫脂酶基因ctacA在改造热带假丝酵母制备长链二元酸中的应用；

所述酰基—CoA硫脂酶基因ctacA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述长链二元酸为12个以上碳原子且α、ω位分别有一个羧基的直链脂肪族二羧酸。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤如下：

构建酰基—CoA硫脂酶基因ctacA的多拷贝重组假丝酵母或更换启动子实现酰基—CoA硫脂酶基因ctacA的过量表达。