CN107447018B - 一种黄麻InDel分子标记及开发方法与应用 - Google Patents
一种黄麻InDel分子标记及开发方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子标记技术领域，具体而言，涉及一种黄麻InDel分子标记及开发方法与应用。这些分子标记可用于鉴定等位基因多态性，鉴定相同或相关的黄麻属植物，区分黄麻属植物及研究种群中的遗传多样性。分子标记也可用于使用统计学方法的遗传和表型研究，例如，连锁分析、QTL定位、系谱确证、群体遗传多态性研究、结合映射、连锁不平衡等。所述信息可用于黄麻属植物的繁殖和/或选择。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，具体而言，涉及一种黄麻InDel分子标记及开发方法与应用。
背景技术
黄麻(Jute)为椴树科(Tiliaceae)黄麻属(Corchorus)一年生韧皮纤维作物，是麻纺和造纸工业的重要原料。黄麻属约有40个种，遍布整个热带和亚热带地区。中国是最古老的黄麻生产国，黄麻单产居世界首位。
分子标记已广泛应用于农作物的研究，如品种鉴定、遗传多样性分析、进化分析、连锁图谱构建、比较基因组学、数量性状位点构图、分子辅助育种选择等。有许多的分子标记被开发用于基础和应用研究，如限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)和随机扩增多态性(RAPD)。RFLP需要放射性化学物质的参与，RAPD重复性较差，这些缺点限制了标记在育种计划中的应用。与这些早期的分子标记相比，基于PCR的简单重复序列(SSR)标记相对比较简单、便宜、重复性较好，但是有些扩增条带不清楚及技术上的缺陷，如假等位基因、无效等位基因导致SSR在基因型分型和数据分析上产生错误。
插入缺失标记(Insertion/Deletions，InDels)是指由核苷酸水平上碱基的插入或缺失多态性，在植物基因组中有较高的分布频率，具有遗传稳定性高、分布广、多态性强等优点。较之SSR标记，InDels分布密度远高于SSRs。较之SNP标记，InDel呈现共显性，PCR极易检测，使用成本极低。目前，随着基因组学及生物信息学的的发展，大量公共数据如表达序列标签(EST)、cDNA和基因组序列等信息大量出现，使得通过生物信息学方法可得到候选InDel成为可能。目前已在水稻、玉米、黄瓜、白菜等主要作物中得到广泛应用。基于高通量测序数据技术开发以PCR为基础、操作简单、应用价值大的InDel标记，可为控制西瓜重要农艺性状基因的定位、遗传多样性分析、指纹图谱构建、全基因组关联分析与高密度遗传连锁图谱的构建和分子标记辅助选择育种奠定基础。
目前，黄麻在InDel方面的研究严重滞后，鲜有InDel开发方法和标记利用的报道。利用多个转录组数据开发黄麻InDel标记的技术还未见报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄麻InDel分子标记，和用于扩增所述分子标记的引物，以及所述分子标记的开发方法与应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
根据本发明的一方面，本发明提供了用于扩增至少一种InDel分子标记的寡核苷酸引物对，其选自下列序列的引物对中的一对或多对：
SEQ ID NO:1和2；SEQ ID NO:3和4；SEQ ID NO:5和6；SEQ ID NO:7和8；SEQ IDNO:9和10；SEQ ID NO:11和12；SEQ ID NO:13和14；SEQ ID NO:15和16；SEQ ID NO:17和18；SEQ ID NO:19和20；SEQ ID NO:21和22；SEQ ID NO:23和24；SEQ ID NO:25和26；SEQ IDNO:27和28；SEQ ID NO:29和30；SEQ ID NO:31和32；SEQ ID NO:33和34；SEQ ID NO:35和36；SEQ ID NO:37和38；SEQ ID NO:39和40；SEQ ID NO:41和42；SEQ ID NO:43和44；SEQ IDNO:45和46；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:49和50；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:53和54；SEQ ID NO:55和56以及SEQ ID NO:57和58。
本发明也请求保护上述任一条引物的变体，变体寡核苷酸引物不需要与SEQ IDNO:1～58共享任何重叠，但仅需能扩增本发明的InDel分子标记。变体寡核苷酸引物也包括与侧接本发明的微卫星DNA分子标记的区互补的任何寡核苷酸引物。如本领域技术人员明晰，用于PCR的变体寡核苷酸引物的3’端可不与InDel分子标记位点具有任何错配，而5’端可具有错配。
本发明也提供试剂盒，其包含来自SEQ ID NO:1～58的至少一种寡核苷酸引物或其片段或变体。
优选的，在所述的试剂盒中，每对引物中至少有一条引物的5’端被荧光染料标记。
在一些实施方式中，所述荧光染料选自FAM、FITC、SYBR GreenⅠ、HEX、VIC、JOE、TAMRA、TET、ROX、Cy3、Cy5、TEXAS-Red、PET、NED、Alexa Fluor、DyLight和FTM。
根据SEQ ID NO:1～58的各引物对扩增来自黄麻属植物的InDel分子标记。扩增产物大小有所不同，并表示微卫星DNA分子标记的不同多态等位基因。因此，本发明涉及包含由本发明的引物对扩增的序列的InDel分子标记。
为方便描述，这29个InDel分子标记的名称及其对应的引物序列如下表所示。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种鉴定黄麻属植物样品基因型的方法，包括：
1).提取所述黄麻属植物样品的DNA；
2).用选自如上所述的引物对中的至少一个引物对扩增至少一种InDel分子标记；
或扩增上述各引物对对应的扩增产物的片段或变体；及
3).鉴定所述黄麻属植物样品中的至少一种多态等位基因。
在一些实施方式中，所述黄麻属植物样品DNA的提取方法包括饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。
优选的，如上所述的方法，其中步骤2)包括用对应引物对扩增2种或更多InDel分子标记；
更优选的，其中步骤2)包括用对应引物对扩增3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29种InDel分子标记。
优选的，如上所述的方法，在步骤2)中，用所述引物对扩增至少一种InDel分子标记时，退火温度为53℃～57℃；
更优选的，退火温度为55℃。
优选的，如上所述的方法，在步骤2)中，用所述引物对扩增至少一种InDel分子标记时，按各成分终浓度计，在PCR反应体系中，上下游引物浓度均为0.15～0.35μmol/L，更优选0.25μmol/L；DNA浓度为2.5～10ng/μL，更优选5～7.5ng/μL。
如上所述的引物对、如上所述的InDel分子标记或如上所述的方法在鉴定种群中的相同或相关的黄麻属植物基因型、区分黄麻属植物种群中的遗传多样性、鉴定黄麻属植物等位基因、区分黄麻属植物种群中的植物变体、黄麻属植物QTL定位、以及黄麻属植物分子辅助育种中的应用。
优选的，前述任一项所述的方法及应用，所述黄麻属植物包括黄麻长果种(C.olitorius)和圆果种(C.capsularis)。
如上所述的引物对及如上所述的InDel分子标记的开发方法，包括：
(1)提取不同黄麻品种的总RNA并进行转录组高通量测序，拼接一套参考转录本；
(2)将不同品种测序reads定位到参考基因组上，找出候选InDel位点和各品种在该位点的等位基因型；
(3)根据找到的候选InDel位点进行引物设计，经引物多态性验证后得到多态性引物，所述多态性引物对应的候选InDel位点即为黄麻的InDel标记。
相对于常用的其它基于PCR的分子标记。该方法开发的基于PCR的标记多态性比例更高，较传统小批量标记开发，通量和效率都得到了极大的提高。此外，转录本通常是具有功能的基因，因此根据转录组开发的标记可能会直接和生物某个性状相关，可以挖掘功能性标记。
优选的，如上所述的方法，在步骤(1)中，所述提取不同黄麻品种的总RNA具体为提取3个或3个以上不同黄麻品种的总RNA；更优选的，本申请采用NY、TC以及圆果179三个品种。
优选的，如上所述的方法，在步骤(3)中，根据找到的候选InDel位点进行引物设计时，选取插入缺失片段大于3bp的候选InDel位点，且所涉及的引物得到扩增片段大小为100bp～500bp以便于分子检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的引物对能在黄麻属植物的样本中扩增出条带清晰、多态性高的条带，使得本发明提供的引物能够应用于黄麻属植物的种群遗传结构和遗传变异水平等方面的研究，采用InDel分子标记可以对黄麻属植物的种群遗传学研究提供较为丰富的遗传基础信息。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为使用多态性引物JLnDeL29得到的22个黄麻种质资源多态性图谱；
图2为使用多态性引物JLnDeL38得到的22个黄麻种质资源多态性图谱；
图3为使用多态性引物JLnDeL39得到的22个黄麻种质资源多态性图谱；
图4为使用多态性引物JLnDeL43得到的22个黄麻种质资源多态性图谱；
图5为使用多态性引物JLnDeL44得到的22个黄麻种质资源多态性图谱；
图6为利用本发明所提供的29对转录组InDel标记引物对22个黄麻种质资源进行聚类分析得到的聚类图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1
利用Trinity拼接软件对188.66Gb的测序数据(来自发明人实验室对NY、TC长果黄麻测序数据和网上下载的圆果179测序数据)进行生物信息学分析，拼接出一套参考转录本
利用生物信息学分析软件GATK3，将NY、TC长果黄麻测序数据和网上下载的圆果179测序数据分别定位到(1)中拼接出来的参考转录本上，找出InDel位点，并找出三个材料(品种)基因型。
利用发明人实验室开发的软件分析NY、TC和圆果179InDel差异片段大小。
提取NY,TC和圆果179DNA，实验验证开发的InDel标记多态性。
利用有多态性的29对引物对22个黄麻种质资源进行基因分型，并开展亲缘关系聚类分析。
引物多态性检测及22个材料基因分型
1材料与方法
1.1材料
22个黄麻种质资源材料。
1.2方法
1.2.1基因组DNA的提取
利用天根试剂盒提取22个黄麻种质材料DNA。提取后的DNA通过电泳检测浓度后，计算样品DNA浓度，并稀释到所需浓度。
1.2.2利用所设计的InDel引物进行PCR
PCR反应体系:20μL反应体系组成见下表
PCR反应体系组成
PCR扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性45sec，55℃复性30sec，72℃延伸1min，30次循环后72℃延伸10min。PCR扩增在PTC-200扩增仪上进行。
1.2.3PCR扩增产物检测
扩增产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行银染。记录带型。以获得的29对多态性引物为例，对22份材料分别进行PCR扩增，进行多态性检测，实验设3次重复，均得到相同的结果，而且得到清晰的22个黄麻种质材料的InDel基因分型结果并利用该结果进行了聚类分析。说明本发明开发的标记可以用于黄麻基因分型和多态性检测等。
图1、图2、图3、图4和图5分别是使用多态性引物JLnDeL29、JLnDeL38、JLnDeL39、JLnDeL43和JLnDeL44得到的22个黄麻种质资源多态性图谱(基因分型图)。
应用实例：利用该29对转录组InDel标记引物，成功将22个黄麻种质资源进行了基因分型(多态性检测)，并进行了聚类。种质资源名称及各标记基因分型如下表所示，聚类图如图6所示。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院麻类研究所
<120> 一种黄麻InDel分子标记及开发方法与应用
<160> 58
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<400> 56
aaggtggatt tggtgtag 18
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
catagagtgt cgccgtag 18
<210> 58
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
atagcacagc caaatga 17
Claims (12)
1.用于扩增至少一种InDel分子标记的寡核苷酸引物对，其选自下列序列的引物对中的一对或多对：
SEQ ID NO:1和2；SEQ ID NO:3和4；SEQ ID NO:5和6；SEQ ID NO:7和8；SEQ ID NO:9和10；SEQ ID NO:11和12；SEQ ID NO:13和14；SEQ ID NO:15和16；SEQ ID NO:17和18；SEQ IDNO:19和20；SEQ ID NO:21和22；SEQ ID NO:23和24；SEQ ID NO:25和26；SEQ ID NO:27和28；SEQ ID NO:29和30；SEQ ID NO:31和32；SEQ ID NO:33和34；SEQ ID NO:35和36；SEQ IDNO:37和38；SEQ ID NO:39和40；SEQ ID NO:41和42；SEQ ID NO:43和44；SEQ ID NO:45和46；SEQ ID NO:47和48；SEQ ID NO:49和50；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:53和54；SEQ IDNO:55和56以及SEQ ID NO:57和58。
2.分离的InDel分子标记，其由权利要求1的引物对扩增。
3.鉴定黄麻属植物样品基因型的方法，包括：
1).提取所述黄麻属植物样品的DNA；
2).用选自权利要求1中的至少一个引物对扩增至少一种InDel分子标记；
或扩增上述各引物对对应的扩增产物的片段或变体；及
3).鉴定所述黄麻属植物样品中的至少一种多态等位基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中步骤2)包括用对应引物对扩增2种或更多InDel分子标记。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中步骤2)包括用对应引物对扩增29种InDel分子标记。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，用所述引物对扩增至少一种InDel分子标记时，退火温度为53℃～57℃。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，用所述引物对扩增至少一种InDel分子标记时，按各成分终浓度计，在PCR反应体系中，上下游引物浓度均为0.15～0.35μmol/L，DNA浓度为2.5～10ng/μL。
8.根据权利要求3～7任一项所述的方法，其特征在于，所述黄麻属植物包括黄麻长果种和圆果种。
9.权利要求1所述的引物对、权利要求2所述的InDel分子标记或权利要求3～6任一项所述的方法在鉴定种群中的相同或相关的黄麻属植物基因型、区分黄麻属植物种群中的遗传多样性、鉴定黄麻属植物等位基因、区分黄麻属植物种群中的植物变体、黄麻属植物QTL定位、以及黄麻属植物分子辅助育种中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述黄麻属植物包括黄麻长果种和圆果种。
11.权利要求1所述的引物对及权利要求2所述的InDel分子标记的开发方法，其特征在于，包括：
(1)提取不同黄麻品种的总RNA并进行转录组高通量测序，拼接一套参考转录本；
(2)将不同品种测序reads定位到参考基因组上，找出候选InDel位点和各品种在该位点的等位基因型；
(3)根据找到的候选InDel位点进行引物设计，经引物多态性验证后得到多态性引物，所述多态性引物对应的候选InDel位点即为黄麻的InDel标记。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述提取不同黄麻品种的总RNA具体为提取3个或3个以上不同黄麻品种的总RNA。
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