CN107435069A

CN107435069A - 一种细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法

Info

Publication number: CN107435069A
Application number: CN201710633469.2A
Authority: CN
Inventors: 卢燎勋; 张黎琛; 梁银明; 黄蓉; 晁天柱; 郑前前; 罗静; 谷妍蓉; 袁鹏
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2017-07-28
Publication date: 2017-12-05

Abstract

本发明涉及一种细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，属于基因工程技术领域。本发明通过直接裂解法能快速获得细胞基因组DNA，结合荧光PCR技术以及基于测序仪的毛细管电泳方法，可以在短时间内精确地对多个基因位点敲除的单克隆细胞进行大规模基因型鉴定。本发明不需要使用试剂盒抽提基因组DNA，对细胞的处理时间只需要25min，极大地节省了经济和时间成本，灵敏度和精确度极高，只需要极少量DNA即可，而且对1个碱基的差异都可以准确检测出来；本发明因为不涉及DNA抽提，对样本进行PCR以后经过简单的稀释、变性和毛细管电泳即可以检测分析，没有繁琐的步骤，所以适合大规模批量化操作。

Description

一种细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是一种最新的基因定点编辑技术，由于此系统操作简便，使用成本低廉，而且对基因组特异性位点进行编辑的效率非常高，所以其在动物、植物和微生物等领域的应用越来越广泛。

CRISPR/Cas9系统对基因组DNA进行剪切以后，常在切割位点形成少数几个碱基的缺失或是插入，不能通过普通的凝胶电泳直接检测出这种变化造成的差异。常规的检测方法有5种：直接测序法、PCR酶切检测法、T7E1酶切检测法、PAGE电泳检测法、高分辨率溶解曲线检测法(high-resolution melting(HRM)analysis)，其中直接测序法可以获得关于突变体非常详细的信息，但是其周期长，操作繁琐，不能大规模应用；PCR酶切检测法极度依赖切割位点附近是否有可用的酶切位点，适用范围非常狭窄；T7E1酶切检测法灵敏度不够高，需要多个步骤进行操作，而且T7E1酶价格昂贵，不适合进行大规模筛选；PAGE电泳检测法步骤繁琐，试剂昂贵，费时费力；高分辨率溶解曲线检测法仅仅只能检测是否有突变，不能得到碱基插入或是缺失的具体数目；所以，以上这些方法都不能同时快速和准确的对突变体进行检测。

公布号为CN105177126A的中国发明专利公开了一种快速检测基因敲除小鼠的方法，采用荧光PCR技术结合标准分子量内参快速检测小鼠的敲除基因，但仅使用密度较少的内参分子量，检测结果不够精确，而且其检测对象仅局限于小鼠，也没有将这一技术应用于细胞系基因敲除的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，该方法不需要抽提细胞的基因组DNA，即可快速检测CRISPR/Cas9系统基因敲除的细胞系是否发生了碱基改变，同时可以获得碱基插入或是缺失的具体数目。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，包括如下步骤：

1)针对目标基因设计特异性的打靶位点，构建CRISPR/Cas9载体后转染细胞系，所述CRISPR/Cas9载体上带有能够被流式细胞仪识别检测的荧光标记；

2)使用流式细胞仪对转染细胞进行分选，获得阳性单克隆细胞；

3)将阳性单克隆细胞扩大培养，取培养后的细胞采用裂解液直接裂解，获得DNA溶液；

4)设计上下游引物，使得PCR扩增序列覆盖打靶位点，对上游引物5‘端进行FAM荧光标记，用步骤3)中的DNA溶液作为模板，进行PCR扩增，获得单克隆细胞PCR产物；

5)制作标准分子量内参DNA：所述标准分子量内参DNA使用ROX进行标记，片段大小分别为：79、90、105、131、151、182、201、254、279、306、337、362、402和425；

6)将甲酰胺、所述单克隆细胞PCR产物和所述标准分子量内参DNA混合，变性后置于测序仪上进行毛细管电泳，结果使用Genemapper软件进行数据分析，直接获得PCR产物的大小，与野生型对照的PCR产物大小进行比较后，得出碱基插入或缺失的具体数目。

本发明增加了分子量大小为279和402的2个标准分子量，更高的密度可以获得更精确的定位结果。

步骤1)所述CRISPR/Cas9载体为在母载体pX458上插入目标sgRNA序列改造而成。

步骤1)中所述细胞系为RAW264.7、B16细胞系。

当步骤1)中所述目标基因为小鼠Vav2基因时，打靶位点为5‘-GGCCAAGTACTACCGCACCCTGG-3’和5‘-GTTAGAGATTCAGGAGACCGAGG-3’。

当步骤1)中所述目标基因为小鼠Vav1基因时，打靶位点为5‘-CTACGAGGACCTAATGCGCT TGG-3’和5‘-CGAGGACCTTTATGACTGCG TGG-3’。

步骤2)中将转染后的细胞培养40-80h后，进行流式细胞仪分选。本发明将转染后的细胞培养40-80h后，进行流式细胞仪分选，可以保证分选后的细胞具有最大的存活率和最高的基因编辑效率。

步骤3)取100-1000个细胞进行直接裂解。

步骤3)中所述裂解液的配方为：100mmol/L KCl，20mmol/L Tris-HCl pH＝9.0，0.3％Triton X-100，1.0mg/mL proteinase K。本发明在通过实验发现采用浓度为0.3％Triton X-100，1.0mg/mL proteinase K的裂解液时，可以获得更好的细胞裂解效果。

步骤3)中所述裂解的具体操作为：于55℃孵育15min，然后于95℃孵育10min。本发明不需要使用试剂盒抽提基因组DNA，对细胞的处理时间只需要25min，极大地节省了经济和时间成本。

步骤5)中所述标准分子量内参DNA：以pUC19质粒DNA为模板，下述引物序列进行PCR扩增得到；

ROX-R：5‘-AAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTC-3’；

79F：5‘-GCTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTG-3’；

90F：5‘-GCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAAC-3’；

105F：5‘-GCAAACTATTAACTGGCGAACTAC-3’；

131F：5‘-GCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGC-3’；

151F：5‘-GACGAGCGTGACACCACGATGCCT-3’；

182F：5‘-GGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACC-3’；

201F：5‘-GAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACC-3’；

254F：5‘-GATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACC-3’；

279F：5‘-ACTGCGGCCAACTTACTTCTGACA-3’；

306F：5‘-GTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACAC-3’；

337F：5‘-ACGGATGGCATGACAGTAAGAGAA-3’；

362F：5‘-CTCACCAGTCACAGAAAAGCATC-3’；

402F：5‘-GGTCGCCGCATACACTATTCTCAGA-3’；

425F：5‘-TGACGCCGGGCAAGAGCA-3’。

本发明的标准分子量内参，具有更高密度的标准分子量，可以得到更加准确的定位结果。

步骤6)中将甲酰胺、所述单克隆细胞PCR产物和所述标准分子量内参DNA以16-20:1:1的比例混合。

所述甲酰胺为高度去离子甲酰胺Hi-Di^TM Formamide(Applied Biosystems，4440753)。

本发明通过直接裂解法能快速获得细胞基因组DNA，结合荧光PCR技术，通过测序仪进行毛细管电泳，可以在短时间内精确地对多个基因敲除细胞单克隆进行大规模基因型鉴定。本发明通过实验发现采用浓度为0.3％Triton X-100，1.0mg/mL proteinase K的裂解液时，可以获得更好的细胞裂解效果。本发明的标准分子量内参，具有更高密度的标准分子量，可以得到更加准确的定位结果。相比于传统方法，本发明具有以下优点：

1)本发明不需要使用试剂盒抽提基因组DNA，对细胞的处理时间只需要25min，极大地节省了经济和时间成本；

2)本发明操作步骤简单，引物设计和PCR与常规方法完全一样，适用于任何具有分子生物学基础的实验室；

3)本发明没有应用范围限制，检测目标区域不需要有特定酶切位点的存在；

4)本发明灵敏度和精确度极高，只需要极少量DNA即可，而且对1个碱基的差异都可以准确检测出来；

5)本发明因为不涉及DNA抽提，对样本进行PCR以后经过简单的稀释、变性和毛细管电泳即可以检测分析，没有繁琐的步骤，所以适合大规模批量化操作；

6)本发明方法具有通用性，没有细胞系或是特定基因的应用限制。

附图说明

图1为标准分子量内参DNA电泳检测图；

图2为细胞系RAW264.7中Vav2基因敲除不同单克隆细胞荧光PCR检测结果和测序峰图；

图3为细胞系B16中Vav1基因敲除不同单克隆细胞荧光PCR检测结果和测序峰图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

(1)针对小鼠Vav2基因设计特异性的打靶位点，并构建载体，转染细胞系RAW264.7，通过流式细胞仪分选获得GFP阳性的单细胞：小鼠Vav2基因ID为MGI：102718(MGI小鼠基因数据库)，打靶位点为Exon6(ENSMUSE00001307648)区段中的5‘-GGCCAAGTACTACCGCACCCTGG-3’(SEQ ID NO.1)和5‘-GTTAGAGATTCAGGAGACCGAGG-3’(SEQ IDNO.2)，载体骨架使用的是pX458(购于Addgene)，载体构建好以后通过脂质体转染细胞系RAW264.7，40-80小时以后通过流式细胞仪(BD fusion)分选获得GFP阳性的单细胞至96孔细胞培养板中；

(2)将GFP阳性的单细胞扩大培养，取部分细胞直接通过裂解，获得DNA溶液，用于后续PCR扩增：取少量细胞(不需要定量，大约100-1000即可)，离心力350g，离心时间5min，弃去上清液，保留底部细胞，然后加入20ul细胞裂解液，(细胞裂解液配方为：100mM KCl，20mM Tris-HCl pH 9.0，0.3％Triton X-100，1.0mg/ml proteinase K)，使用移液器将细胞吹打混匀，加入矿物油覆盖细胞裂解液，置于55℃孵育15min，使细胞充分裂解，再转移至95℃，孵育10min，使蛋白酶K变性，处理完以后的裂解液即可以作为PCR模板使用，置于-20℃保存备用。

(3)设计引物，PCR反应的扩增序列覆盖打靶位点，对上游引物5‘端进行FAM荧光标记；通过PCR扩增，得到覆盖打靶区段的DNA片段：使用在线引物设计软件primer3(http://primer3.ut.ee/)，针对打靶位点侧翼序列设计特异性引物，Vav2-f PCR-F：5‘-CCTCTCTTCCCTCAGCTCCT-3’(SEQ ID NO.3)(上游引物5‘端进行FAM荧光标记)和Vav2-fPCR-R：5‘-CTCACGCGTCATGTCTCCTC-3’(SEQ ID NO.4)，由上海百力格生物科技有限公司进行合成；通过PCR反应扩增覆盖打靶位点的DNA片段(理论长度为241bp)，反应体系为：(Vazyme，P111)2*Taq Master PCR MIX：10μL，Vav2-F PCR-F(5μM)和Vav2-F PCR-R(5μM)各0.5μL；细胞裂解液DNA：2μL；补充ddH2O至总体积20μL；反应程序为：95℃，5 min；95℃，30s，60℃，30 s，72℃，40 s；72℃，10 min；35个循环。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并鉴定PCR产物，如果有清晰DNA条带，则取2μL PCR产物，稀释200倍，用于后续分析。

(4)制作标准分子量内参DNA：合成下游通用型引物

ROX-R：5‘-AAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTC-3’(SEQ ID NO.5)，并在引物5‘端进行ROX荧光标记；

分别合成上游用于扩增不同长度的引物序列：

79F：5‘-GCTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTG-3’(SEQ ID NO.6)；

90F：5‘-GCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAAC-3’(SEQ ID NO.7)；

105F：5‘-GCAAACTATTAACTGGCGAACTAC-3’(SEQ ID NO.8)；

131F：5‘-GCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGC-3’(SEQ ID NO.9)；

151F：5‘-GACGAGCGTGACACCACGATGCCT-3’(SEQ ID NO.10)；

182F：5‘-GGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACC-3’(SEQ ID NO.11)；

201F：5‘-GAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACC-3’(SEQ ID NO.12)；

254F：5‘-GATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACC-3’(SEQ ID NO.13)；

279F：5‘-ACTGCGGCCAACTTACTTCTGACA-3’(SEQ ID NO.14)；

306F：5‘-GTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACAC-3’(SEQ ID NO.15)；

337F：5‘-ACGGATGGCATGACAGTAAGAGAA-3’(SEQ ID NO.16)；

362F：5‘-CTCACCAGTCACAGAAAAGCATC-3’(SEQ ID NO.17)；

402F：5‘-GGTCGCCGCATACACTATTCTCAGA-3’(SEQ ID NO.18)；

425F：5‘-TGACGCCGGGCAAGAGCA-3’(SEQ ID NO.19)。

所得到的标准分子量内参DNA电泳检测结果如图1所示。

以pUC19质粒DNA作为模板，使用高保真聚合酶(NEB Phusion 0530，防止在扩增中加入A)完成PCR扩增反应，反应体系为：5×Phusion HF buffer：10μl；10mm dNTPs：1μl；Phusion DNA Polymerase：0.5μl；10μM上下游引物：各1μl；质粒DNA：0.5μl；补充ddH2O至总体积50μL。反应程序为：98℃，2min；98℃，15s，55℃，15s，72℃，15s；72℃，30min；35个循环。通过2％琼脂糖凝胶电泳检测并鉴定PCR产物，-20℃保存备用。

(5)使用测序仪进行毛细管电泳以鉴定PCR产物的大小：将高去离子甲酰胺Hi-Di^TMFormamide(Applied Biosystems，4440753)、PCR产物(步骤(3)中获得)和标准分子量内参DNA(步骤(4)中获得)按照以下比例混合：Hi-DiTMFormamide：9μl；PCR产物：0.5μl；标准分子量内参DNA：0.5μl。将以上混合物置于PCR仪上，按照以下程序进行变性反应：95℃，10min；4℃，10min。变性完成以后，置于ABI测序仪3730(Applied Biosystems)上进行毛细管电泳，96个样本可以在2小时内完成数据收集。最后采用GeneScan3.0和ID software v3.2软件分析数据，根据标准分子量内参DNA的片段大小直接确定检测样本PCR产物的碱基数，通过与野生型对照样本的PCR产物碱基数进行比较，最终准确反映每个单克隆细胞插入或缺失的碱基数值。

结果如图2所示，图2中A、C、F、I为本申请的检测方法所得到的部分结果，可以准确得出1号克隆为缺失2个和5个碱基的纯合子，3号克隆为缺失8个和17个碱基的纯合子，6号克隆为缺失5个和50个碱基的纯合子。图2中B、D、E、G、H、J、K为普通测序所得到的结果，A图对应B图，C图对应D、E图，F图对应G、H图，I图对应J、K图，可以发现本申请的检测准确度可达到与测序相同的水平。

实施例2

(1)针对小鼠Vav1基因设计特异性的打靶位点，通过构建载体，转染细胞系B16和流式细胞仪分选，最终获得GFP阳性的单细胞：小鼠Vav1基因ID为MGI：98923(MGI小鼠基因数据库，Transcript ID:ENSMUST00000005889)，打靶位点为exon5(exon ID：ENSMUSE00000138941)区段中的(SEQ ID NO.20)：5‘-CTACGAGGACCTAATGCGCT TGG-3’和(SEQ ID NO.21)：5‘-CGAGGACCTTTATGACTGCG TGG-3’，载体骨架使用的是pX458(购于Addgene)，载体构建好以后通过脂质体转染细胞系B16，40-72小时以后通过流式细胞仪(BDfusion)分选获得GFP阳性的单细胞至96孔细胞培养板中；

(3)设计引物，使得PCR扩增产物包含有打靶位点，对上游引物5‘端进行FAM荧光标记；通过PCR扩增，得到包含有打靶区段的DNA片段：使用在线引物设计软件primer3(http://primer3.ut.ee/)，针对打靶位点基因组序列设计特异性引物，Vav1-f PCR-F：TGGCCTGAATCTGTCCCCTA(SEQ ID NO.22)(上游引物5‘端进行FAM荧光标记)和Vav1-f PCR-R：GCAGCCATCTCTACCCTTCC(SEQ ID NO.23)，送上海百力格生物科技有限公司进行合成；通过PCR扩增包含打靶位点目的片段(理论长度为181bp)，体系为：(Vazyme，P111)2*TaqMaster PCR MIX：10μL，Vav1-F PCR-F(5μM)和Vav1-F PCR-R(5μM)各0.5μL；细胞裂解液DNA：2μL；补充ddH2O至总体积20μL；程序为：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，40s；72℃，10min；35个循环。电泳检测PCR产物，如果有清晰DNA条带，则取2μL PCR产物，稀释200倍，用于后续分析。

(4)制作标准分子量内参DNA：详细步骤同实施例1中的步骤(4)。

(5)使用测序仪通过毛细管电泳分析PCR产物片段大小：详细步骤同实施例1中的步骤(5)。

本次检测的结果如图3所示，图3中A、C、F、I为本申请的检测方法所得到的部分结果，可以准确得出2号克隆为缺失12个和34个碱基的纯合子，3号克隆为缺失30个和55个碱基的纯合子，5号克隆为缺失51个碱基的纯合子。图3中B、D、E、G、H、J为普通测序所得到的结果，A图对应B图，C图对应D、E图，F图对应G、H图，I图对应J图，可以发现本申请的检测准确度可达到与测序相同的水平。

<110> 新乡医学院

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<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<221> Vav2基因靶位点1

<400> 1

ggccaagtac taccgcaccc tgg 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<221> Vav2基因靶位点2

<400> 2

gttagagatt caggagaccg agg 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> Vav2-f PCR-F

<400> 3

cctctcttcc ctcagctcct 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> Vav2-f PCR-R

<400> 4

ctcacgcgtc atgtctcctc 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<221> DNA内参下游引物

<400> 5

aagggccgag cgcagaagtg gtc 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 序列

<221> 79F

<400> 6

gctctagctt cccggcaaca attaatagac tg 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 序列

<221> 90F

<400> 7

gcgaactact tactctagct tcccggcaac 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<221> 105F

<400> 8

gcaaactatt aactggcgaa ctac 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 序列

<221> 131F

<400> 9

gcctgtagca atggcaacaa cgttgc 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<221> 151F

<400> 10

gacgagcgtg acaccacgat gcct 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 序列

<221> 182F

<400> 11

ggaaccggag ctgaatgaag ccatacc 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 序列

<221> 201F

<400> 12

gaactcgcct tgatcgttgg gaacc 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 序列

<221> 254F

<400> 13

gatcggagga ccgaaggagc taacc 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<221> 279F

<400> 14

actgcggcca acttacttct gaca 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 序列

<221> 306F

<400> 15

gtgctgccat aaccatgagt gataacac 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<221> 337F

<400> 16

acggatggca tgacagtaag agaa 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<221> 362F

<400> 17

ctcaccagtc acagaaaagc atc 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 序列

<221> 402F

<400> 18

ggtcgccgca tacactattc tcaga 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 序列

<221> 425F

<400> 19

tgacgccggg caagagca 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<221> vav1基因靶位点1

<400> 20

ctacgaggac ctaatgcgct tgg 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<221> vav1基因靶位点2

<400> 21

cgaggacctt tatgactgcg tgg 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> Vav1-f PCR-F

<400> 22

tggcctgaat ctgtccccta 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> Vav1-f PCR-R

<400> 23

gcagccatct ctacccttcc 20

<211> 241

<212> DNA

<213> 序列

<221> Vav2的PCR检测片段（野生型）

<400> 24

cctctcttcc ctcagctcct tttggtcaga gtttcctcac aggcagagag agagagagag 60

aaaactggaa caggtgctaa gaccctgacc ctgggctttc caggagaaat ggctctcacc 120

ttctcaatgt cctccagggt gcggtagtac ttggcctcgg tctcctgaat ctctaacaag 180

cagcagcttc tcttgtcgtc ctcagtcatg cccattttct agaggagaca tgacgcgtga 240

g 241

<211> 181

<212> DNA

<213> 序列

<221> Vav1的PCR检测片段（野生型）

<400> 25

tggcctgaat ctgtccccta gtgacaccgc agaggaagac gaggaccttt atgactgcgt 60

ggaaaatgag gaggcagagg gggacgagat ctacgaggac ctaatgcgct tggagtcggt 120

gcctacgcca gtgagtgggc ctgggaaggg cggggcaggt gggaagggta gagatggctg 180

c 181

Claims

1.一种细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，其特征在于：步骤1)所述CRISPR/Cas9载体为在骨架载体pX458上插入目标sgRNA序列改造而成。

3.根据权利要求1所述的细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，其特征在于：步骤1)中所述细胞系为RAW264.7、B16细胞系。

4.根据权利要求1所述的细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，其特征在于：步骤2)中将转染后的细胞培养40-80h后，进行流式细胞仪分选。

5.根据权利要求1所述的细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，其特征在于：步骤3)中所述裂解液的配方为：100mmol/L KCl，20mmol/L Tris-HCl pH＝9.0，0.3％TritonX-100，1.0mg/mL proteinase K。

6.根据权利要求5所述的细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，其特征在于：步骤3)中所述裂解的具体操作为：于55℃孵育15min，然后于95℃孵育10min。

7.根据权利要求1所述的细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，其特征在于：步骤5)中所述标准分子量内参DNA：以pUC19质粒DNA为模板，下述引物序列进行PCR扩增得到；

ROX-R：5‘-AAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTC-3’；

79F：5‘-GCTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTG-3’；

90F：5‘-GCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAAC-3’；

105F：5‘-GCAAACTATTAACTGGCGAACTAC-3’；

131F：5‘-GCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGC-3’；

151F：5‘-GACGAGCGTGACACCACGATGCCT-3’；

182F：5‘-GGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACC-3’；

201F：5‘-GAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACC-3’；

254F：5‘-GATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACC-3’；

279F：5‘-ACTGCGGCCAACTTACTTCTGACA-3’；

306F：5‘-GTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACAC-3’；

337F：5‘-ACGGATGGCATGACAGTAAGAGAA-3’；

362F：5‘-CTCACCAGTCACAGAAAAGCATC-3’；

402F：5‘-GGTCGCCGCATACACTATTCTCAGA-3’；

425F：5‘-TGACGCCGGGCAAGAGCA-3’。

8.根据权利要求1所述的细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法，其特征在于：步骤6)中将甲酰胺、所述单克隆细胞PCR产物和所述标准分子量内参DNA以16-20:1:1的比例混合。