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CN107406850A - 用于控制半翅目害虫的KRUPPEL基因的亲代RNAi抑制 - Google Patents

用于控制半翅目害虫的KRUPPEL基因的亲代RNAi抑制 Download PDF

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CN107406850A
CN107406850A CN201580067592.1A CN201580067592A CN107406850A CN 107406850 A CN107406850 A CN 107406850A CN 201580067592 A CN201580067592 A CN 201580067592A CN 107406850 A CN107406850 A CN 107406850A
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M·弗雷
R·哈姆
A·M·威莱斯阿朗戈
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Dow AgroSciences LLC
University of Nebraska
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Abstract

本发明公开涉及通过在半翅目害虫中进行靶编码序列和转录的非编码序列的RNA干扰介导的抑制而控制半翅目害虫的核酸分子及其使用方法。本发明公开还涉及制造表达对于控制半翅目害虫有用的核酸分子的转基因植物的方法、以及由此获得的植物细胞和植物。

Description

用于控制半翅目害虫的KRUPPEL基因的亲代RNAi抑制
优先权声明
本申请要求2014年12月16日提交的题为“PARENTAL RNAI SUPPRESSION OFKRUPPEL GENE TO CONTROL HEMIPTERAN PESTS” 美国临时专利申请序列号62/092,784的申请日的利益，将该申请的内容完整 并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及由半翅目害虫引起的植物损害的遗传控制。在特定的 实施方案中，本发明公开涉及靶编码和非编码多核苷酸的鉴定、以及重组 DNA技术在半翅目害虫细胞中转录后阻遏或抑制靶编码多核苷酸和非编码 多核苷酸表达从而提供植物保护作用的应用。
背景
椿象和其他半翅目昆虫(异翅亚目)是一个重要的农业害虫集群。已知全 世界有超过50个椿象的近缘物种引起作物损害。McPherson&McPherson (2000)Stink bugs of economic importance in America north of Mexico,CRC Press。半翅目昆虫在大量重要作物中存在，包括玉米、大豆、棉花、水果、 蔬菜、和谷物。
椿象在达到成体期之前要经历多个若虫期。这些昆虫在约30-40天内从 卵发育为成虫。若虫和成虫均以来自软组织的汁液为食，它们还将消化酶注 入到所述软组织中，引起口腔外组织消化和坏死。然后摄入消化的植物材料 和养分。植物维管系统水分和养分的耗竭导致植物组织破坏。对于籽粒和种 子发育的损害最为显著，因为产量和萌发显著减少。在温暖的气候下，出现 多个世代，导致显著的昆虫压力。当前的椿象管理依赖于以各个田间为基础 的杀昆虫剂处理。因此，迫切需要替代的管理策略，以将正在经历的作物损 失降低到最低限度。
RNA干扰(RNAi)是一种利用内源细胞途径的方法，由此对足够大小的整 个或任何部分靶基因特异性的干扰RNA(iRNA)分子(例如，双链RNA(dsRNA) 分子)导致由其编码的mRNA的降解。在最近几年，在许多物种和实验系统， 例如秀丽隐杆线虫、植物、昆虫胚胎、和组织培养物中的细胞中，已经使用 RNAi进行基因“敲低”。参见，例如Fire等人(1998)Nature 391:806-11；Martinez 等人(2002)Cell 110:563-74；McManus和Sharp(2002)Nature Rev.Genetics 3:737-47。
RNAi通过包括切丁酶(DICER)蛋白质复合物的内源途径完成mRNA的 降解。切丁酶将长的dsRNA分子切割成约20个核苷酸的短片段，称作小干扰 RNA(siRNA)。siRNA解旋成两个单链RNA：乘客链(passenger strand)和引导 链(guide strand)。乘客链被降解，引导链则被整合到RNA诱导的沉默复合物 (RISC)中。微小抑制性核糖核酸(miRNA)是从包含连接杂交的乘客链和引导 链的多核苷酸“环”的前体分子切下的结构上是非常相似的分子，并且它们可 以类似地整合到RISC中。转录后基因沉默在引导链特异性结合互补mRNA分 子并且诱导Argonaute(RISC复合物的催化组分)切割时发生。尽管siRNA和/ 或miRNA的浓度最初是有限的，但已知此过程遍及一些真核生物(如植物、 线虫类和一些昆虫)呈系统性扩散。
仅与siRNA和/或miRNA互补的转录物被切割和降解，因此mRNA表达的 敲低是序列特异性的。在植物中，存在切丁酶(DICER)基因的几个功能组。 RNAi的基因沉默效应持续数天，并且在实验条件下，可以导致靶向转录物 的丰度下降90％或更多，随之发生相应蛋白质的水平降低。在昆虫中，至少 有两个切丁酶基因，其中切丁酶1通过Argonautel促进miRNA指导的降解。Lee 等人(2004)Cell 117(1):69-81。切丁酶2通过Argonaute2促进siRNA指导的降 解，见上文。
与昆虫DNA互补的绝大多数序列(例如，美国专利7,612,194和美国专利 公开号2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545中鉴定的9,000多个序 列)用作dsRNA或siRNA时不提供植物保护作用。例如，Baum等人(2007) Nature Biotechnology 25:1322-1326，描述了RNAi对几个西方玉米根虫(WCR) 基因靶的抑制作用。这些作者报告，在超过520ng/cm2的极高iRNA(例如， dsRNA)浓度下，他们测试的26个靶基因中有8个不能提供实验上显著的鞘翅 目害虫死亡率。
美国专利7,612,194和美国专利申请公开No.2007/0050860的作者们首次 报道了在玉米植株中靶向西方玉米根虫的植物体内(in planta)RNAi。Baum等 人(2007)Nat.Biotechnol.25(11):1322-6。这些作者们描述了一种高通量体内 饵食RNAi系统，用来筛选用于开发转基因RNAi玉米的潜在靶基因。在290 种靶标的初始基因池中，只有14种基因展现了幼虫控制潜力。最有效的双链 RNA(dsRNA)中之一靶向了编码囊泡性ATP酶亚单位A(V-ATPase)的基因， 导致相应的内源mRNA的迅速阻遏，并以低浓度的dsRNA引发了特异性的 RNAi应答。由此，这些作者首次记录了植物体内RNAi作为害虫管理工具的 潜力，同时证明，有效的靶标是无法先验地准确鉴定的，即使从较小的一组 候选基因鉴定亦然。
RNAi用于昆虫控制的另一个潜在应用涉及亲代RNAi(pRNAi)。首次描 述通过将dsRNA注入秀丽隐杆线虫中体腔(或通过摄取施用dsRNA)导致后代 胚胎中基因失活而鉴定了pRNAi。Fire等人(1998)，上文；Timmons和Fire(1998) Nature 395(6705):854。在鞘翅目模型赤拟谷盗(Tribolium castaneum)中观察到 类似的过程，由此，注射了对应于控制胚胎发育过程中分节的三个独特基因 的dsRNA的雌性蛹导致后代胚胎中的合子基因的敲低。Bucher等人(2002) Curr.Biol.12(3):R85-6。在这项研究中，几乎所有的后代幼虫在注射后一周 显示出基因特异性表型。尽管用于功能基因组学研究的dsRNA注射在各种昆 虫中已经取得成功，为了使RNAi成为有效的害虫管理工具，需要通过经口 暴露于dsRNA从肠环境摄取dsRNA，随后下调必需基因。Auer和Frederick (2009)Trends Biotechnol.27(11)):644-51。
亲代RNAi已经被用于描述许多昆虫物种中胚胎基因的功能，所述昆虫 物种包括跳虫(Orchesella cincta)(Konopova和Akam(2014)Evodevo 5(1):2)； 褐飞虱(Nilaparvata htgens)；叶蜂(菜叶蜂(Athalia rosae)(Yoshiyama等人 (2013)J.InsectPhysiol.59(4):400-7)；德国蟑螂(德国小蠊(Blattella germanica))(Piulachs等人(2010)Insect Biochem.Mol.Biol.40:468-75)；和豌 豆蚜(Acyrthosiphon pisum)(Mao等人(2013)Arch Insect Biochem Physiol 84(4):209-21)。在所有这些情况下，通过将dsRNA注射到亲代雌性的血腔中 来实现pRNAi反应。
公开
本文中公开了用于控制半翅目害虫的核酸分子(例如，靶基因、DNA、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)及其使用方法，所述半翅目 害虫包括，例如，英雄美洲蝽(Euschistus heros(Fabr.)(新热带褐蝽，“BSB”)、 褐椿象(E.servus)(Say)(褐蝽)；稻绿蝽(Nezara viridula(L.)(南部绿椿象)、盖 德拟壁蝽(Piezodorus guildinii(Westwood)(红带椿象)、和茶翅蝽(Halyomorpha halys(Stal)(棕翅椿象)、Chinavia hilare(Say)(绿椿象)；C.marginatum(Palisot de Beauvois)；Dichelops melacanthus(Dallas)；D.furcatus(F.)；Edessa meditabunda(F.)；Thyanta perditor(F.)(新热带红肩蝽)；Horcias nobilellus (Berg)(棉红蝽)；Taedia stigmosa(Berg)；秘鲁红蝽(Dysdercusperuvianus)(Guerin-Meneville)；Neomegalotomus parvus(Westwood)； Leptoglossuszonatus(Dallas)；Niesthrea sidae(F.)；豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)(Knight)(西方牧草盲蝽)；和牧草盲蝽[美国牧草盲蝽(L. lineolaris)(Palisot de Beauvois)]。在具体的实例中，公开了示例性核酸分子， 其可以与半翅目害虫中的一个或多个天然核酸的至少一部分同源。在一些实 施方案中，通过降低现有世代的害虫产生下一代害虫的能力来控制半翅目害 虫。在某些实例中，将所述核酸分子投送给半翅目害虫并不会导致害虫的大 量死亡，但降低了由其产生的有生存力后代的数量。
在这些和另外的实例中，所述天然核酸可以是靶基因，其产物可以例如 但不限于：涉及代谢过程；涉及生殖过程；和/或涉及胚胎和/或若虫发育。 在一些实例中，借助于包含与靶基因同源的多核苷酸的核酸分子，靶基因表 达的转录后抑制可能导致半翅目害虫的生长和/或生殖降低。在具体实例中， 选择kruppel基因作为转录后沉默的靶基因。在具体实例中，可用于转录后抑 制的靶基因是在本文中称为BSB_kruppel(SEQ ID NO:1)的新基因，在本文中 一些地方称为BSB_kr。因此，本文中还公开了包含SEQ ID NO:1的多核苷酸、 SEQ ID NO:1的互补物、和/或前述任一者的片段(例如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)的分离的核酸分子。
还公开了包含这样的多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸编码与靶基因 产物(例如kruppel基因的产物)内的氨基酸序列具有至少约85％同一性的多肽。 例如，核酸分子可以包含编码与SEQ ID NO:2(BSB KRUPPEL)和/或BSB_kr 的产物内的氨基酸序列至少85％相同的多肽的多核苷酸。进一步公开了包含 这样的多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸是编码与靶基因产物内的氨基酸 序列具有至少85％同一性的多肽的多核苷酸的反向互补物。
还公开了用于产生与半翅目害虫靶基因(例如kruppel基因)的全部或部分 互补的iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)分子的cDNA 多核苷酸。在特定的实施方案中，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/ 或hpRNA可以在体外产生，或通过遗传修饰的生物(如植物或细菌)在体内产 生。在特定的实例中，公开了可用于产生与转录自BSB_kr(SEQID NO:1)的 mRNA的全部或部分互补的iRNA分子的cDNA分子。
进一步公开了用于抑制半翅目害虫中必需基因的表达的手段、以及用于 保护植物免受半翅目害虫侵害的手段。用于抑制半翅目害虫中必需基因表达 的手段是由选自下组的多核苷酸构成的单链或双链RNA分子：SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16,和SEQ ID NO:17；和前述者的互补物。用于抑制半翅目害虫 中的必需基因表达的手段的功能等同物包括与转录自包含SEQ ID NO:1的 BSB基因的mRNA的全部或部分基本上同源的单链或双链RNA分子，保护植 物免受半翅目害虫侵害的手段是这样的DNA分子，其包含与启动子可操作连接的、编码用于抑制半翅目害虫中的必需基因的表达的手段的多核苷酸，其 中所述DNA分子能够整合到玉米植物的基因组中。
公开了控制半翅目害虫群体的方法，所述方法包括向半翅目害虫提供 iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)分子，所述iRNA 分子在被所述害虫摄取之后发挥作用而抑制该害虫体内的生物功能，其中所 述iRNA分子包含选自下组的多核苷酸的全部或部分(例如，所述多核苷酸的 至少15个连续核苷酸)：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补物；SEQ ID NO:3； SEQ ID NO:3的互补物；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:4的互补物；包含SEQID NO:1的全部或部分的半翅目生物(例如BSB)的天然编码多核苷酸；包含SEQ ID NO:1的全部或部分的半翅目生物(例如BSB)的天然编码多核苷酸的互补 物；被转录为包含SEQ IDNO:15的全部或部分的天然RNA分子的半翅目生 物的天然非编码多核苷酸；以及被转录为包含SEQ ID NO:15的全部或部分 的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码多核苷酸的互补物。
在特定实例中，公开了控制半翅目害虫群体的方法，包括对半翅目害虫 提供iRNA(例如dsRNA,siRNA,shRNA,miRNA和hpRNA)分子，所述iRNA 分子当被该害虫摄取时即发挥作用以抑制该害虫内的生物学功能，其中该 iRNA包含选自下述者的全部或部分组成的群组的多核苷酸：SEQ ID NO:15； SEQ ID NO:15的互补物；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:16的互补物；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:17的互补物；与包含SEQ ID NO:1的全部或部分的半翅 目(例如BSB)生物的天然编码多核苷酸杂交的多核苷酸；以及与包含SEQ ID NO:1的全部或部分的半翅目(例如BSB)生物的天然编码多核苷酸杂交的多 核苷酸的互补物。
本文中还公开了这样的方法，其中可将dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、 和/或hpRNA在基于饵食的测定中(diet-based assay)提供给半翅目害虫，或提 供在表达dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA的遗传修饰的植 物细胞中。在这些和另外的实例中，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和 /或hpRNA可被半翅目害虫摄入。然后，本发明的dsRNA、siRNA、shRNA、 miRNA、和/或hpRNA的摄入可在该害虫中导致RNAi，进而可导致对于代谢 过程、生殖过程、和或若虫发育必需的基因的沉默。因此，公开了这样的方 法，其中将包含可用于半翅目害虫亲代控制的示例性多核酸序的核酸分子提 供给半翅目害虫。在特定的实例中，通过使用本发明的核酸分子控制的半翅 目害虫可以是BSB。在一些实例中，将所述核酸分子投送给半翅目害虫并不 会导致害虫的大量死亡，但可降低由其产生的有存活力的后代的数量。在一 些实例中，将所述核酸分子投送给半翅目害虫可导致害虫的大量死亡，并且 还可降低由其产生的有存活力的后代的数量。
根据下面援引附图展开的若干实施方案的详细说明，能够更清楚地了解 前述特征和其他特征。
附图简述
图1包括用于从具有单对引物(图1A)的单个转录模板和从两个转录模板 (图1B)产生dsRNA的策略的描述。
图2包括黑腹果蝇(DME)和英雄美洲蝽(BSB)KRUPPEL蛋白序列的结构 域组织的图示。黑腹果蝇和英雄美洲蝽KRUPPEL蛋白质含有4个C2H2型锌 指，它们是利用InterProScan中的SMART数据库注释的。
图3包括模型模拟数据的总结，其显示，当非避难所(non-refuge)植物表 达杀虫蛋白(R)和亲代活性iRNA时，从“避难所缀块”(“refuge patch”)(即，转 基因作物中未表达杀虫iRNA或重组蛋白的缀块)羽化的雌性BSB成虫的 pRNAi效应的相对幅度对杀虫蛋白(R)和RNAi(Y)抗性等位基因频率的增加 速率的影响。
图4包括模型模拟数据的总结，其显示，当非避难所(non-refuge)植物表 达杀虫蛋白(R)以及幼虫活性和亲代活性iRNA分子时，下述前者对后者的影 响：对从“避难所缀块”(“refuge patch”)(即，在包含BSB若虫活性干扰dsRNA 以及BSB活性杀虫蛋白转基因作物中未表达杀虫iRNA或重组蛋白的缀块)羽 化的雌性BSB成虫的pRNAi效应的相对幅度；对杀虫蛋白(R)和RNAi(Y)抗性 等位基因频率的增加速率。
序列表
使用如37C.F.R.§1.822规定的核苷酸碱基的标准字母缩写，示出了所附 序列表中列出的核酸序列。所列出的核酸和氨基酸序列定义了具有以所记载 的方式排列的核苷酸和氨基酸单体的分子(即分别为多核苷酸和多肽)。每个 列出的核酸和氨基酸序列也定义了包含以所记载的方式排列的核苷酸和氨 基酸单体的多核苷酸或多肽的类属(genus)。鉴于遗传密码的冗余，可以理解 的是，某个包含编码序列的核苷酸序列还描述了多核苷酸的类属，其中的多 核苷酸和由参考序列组成的多核苷酸编码相同的多肽。还应当理解，某个氨 基酸序列描述了编码该多肽的多核苷酸ORF的类属。
对每个核酸序列仅显示了一条链，但应理解对被展示的链的任何提述也 包括其互补链。由于一级核酸序列的互补序列和反向互补序列必然被该一级 序列公开，所以对核酸序列的任何提述也包括核酸序列的互补序列和反向互 补序列，但另有明确说明或者从该序列出现的上下文可以明确看出并非如此 的除外。此外，如本领域所知，RNA链的核苷酸序列决定于转录该RNA的 DNA的序列(除了尿嘧啶(U)核碱基被替换为胸腺嘧啶(T)之外)，对于某个 RNA序列而言，任何对编码它的DNA序列的提述也包括了该序列。在所附序 列表中：
SEQ ID NO:1显示了示例性英雄美洲蝽kruppel基因DNA，其在本文中某 些地方被称为BSB_kr:
AGGAGCAATAATCTCAATTTCTGAATTTTTTTACTTAAACCACTTTCATTCTCACCGGCTCAATTATAGTTAAAAATCAGCTGATATATTTTCACTGATATAACCCAACCTGATTAACTTAAACACTTAAGTAATAATTACAAGAATTAACGGTTAGAGAGTTACTCAAACAAATTTTGTAAAATCTTATCAAACATTGATCGAAAAGCCACACAAATATCAACTACTAAATAACATCAACCAAAGTGATTGATTATCATAAAATTTTGTTGTTTTATTAAATGGGAAAAAAATAAATTTTTGAAATCCATAAAAGAGCATAGGGGCATAGAGATGTTAAACAATAAAAAGCGGAATTTTGCATCTGTCGGTTGGGTAAATTTTACAATATACATTCCAATAATAATTATTCCCAGAGATAACCTAATATCAAGTTTCCAGTCACTCTGACGTGGAATCACATGTTTTCATTTGAGAAACATACACGCTCAAAAATAGCGCTTCCATCAATTAAAATATACACAACGAACTTATACTCTAATAATAATATATAATAGAAAACAAAATAAATGAAATGACTATACCGAAACCGGTACATACCCGTAGTCGTTTTTACAGTACCTTCAGTAACCCTTACTATATTTCAAAAATCATAACTTCAATTATTACATCAATCCAGATCAAGAAATTGTACTCTAAAATAAGATATTTTAAATTTATTAATTTATGTACAATAAATCAATTTCGTTTCGTACCTTATGACGTTAAAGCATTCAAATGGTATAGGGCACTGGCGGTACTGTGATAAAAAAATAATAATTTACTAACTAAAGAGGTGAGCCTCCATCCCATTCTTCAGAAAGCTCTTCTTCAGATTCAGTCATTGTGAGATTATTATTATTGTTGATGTTTTTGTTCTTATGCCTGATAGAAAGATCTTCAGGTTCGGTCTGCTCAGGCAACGAAAGGTACGCAGGGATAACGTTTACAAGAGCTTGCGCTTTTCTGTCCCTCGAGTCGCACTTGTGATGCAGGAGGTGGTGTCTCCTTCTGAATTTGGCACCGCACAATCCGCAGCCGAATGGTTTTTCTCCCTTGTGAATTAGAGAATGGGCCTTGAGCTGGTTGGAATCAGCGAACCTCGAGGAACAGACTTGGCAAGCGTAAGGCCGTTCTCCGGTATGTACCCGTAGGTGTCTCCTCAAGTTGGCTACTTGCACGAAGTACCTGTCGCAGTGGTCGCAATGGTAAGGCTTCTCGCCAGTGTGTGTGCGTATGTGGGTGCGGAGATGGTGGTCCCGTCGAAACCTTCTGTGGCACTCGGGGCACTCGAACGGCCGTTCTCCAGTGTGGGTTCTTTCGTGATTTTTGAGAACGTGCTTATGCTTGAAGGACTGGTTACAAGTGAGGCAGACGAAAGCTCTGTCCCTCCCAGGAGGAGAGTCTTCGTCCTTCTTCTTCCTCCCTACAGGCTCTGGAGGTGGAGCTGCCCAGAGCAAAGAGTGCGAGAATAGGGAGCCGCCTCCGATCCCGTGGAGAGCCAAAAGTCCTGGCATTCCGGCTGCCAGAAGACCGGCCTCTGGACCGTTTTCTTCTCGTTTGCTTGCTTCCTTCATTGTGCACCTTCCGACGCCTACTACTGAAGTCAAGCCCTTGGTTGGGTTGTTGGTTGCGTGTATGAGAGACAAGGCCATGGAGGTGTTATAGAGACGAAGGCATGGCAGGAAC。
SEQ ID NO:2显示了由示例性英雄美洲蝽kruppel基因DNA编码的英雄 美洲蝽KRUPPEL多肽的氨基酸序列：
MALSLIHATNNPTKGLTSVVGVGRCTMKEASKREENGPEAGLLAAGMPGLLALHGIGGGSLFSHSLLWAAPPPEPVGRKKKDEDSPPGRDRAFVCLTCNQSFKHKHVLKNHERTHTGERPFECPECHRRFRRDHHLRTHIRTHTGEKPYHCDHCDRYFVQVANLRRHLRVHTGERPYACQVCSSRFADSNQLKAHSLIHKGEKPFGCGLCGAKFRRRHHLLHHKCDSRDRKAQALVNVIPAYLSLPEQTEPEDLSIRHKNKNINNNNNLTMTESEEELSEEWDGGSPL。
SEQ ID NO:3显示了一种示例性英雄美洲蝽kruppel基因DNA(BSB_kr-1)， 其互补链被转录成为一种示例性BSB kruppel dsRNA的有义链：
GAGCTTGCGCTTTTCTGTCCCTCGAGTCGCACTTGTGATGCAGGAGGTGGTGTCTCCTTCTGAATTTGGCACCGCACAATCCGCAGCCGAATGGTTTTTCTCCCTTGTGAATTAGAGAATGGGCCTTGAGCTGGTTGGAATCAGCGAACCTCGAGGAACAGACTTGGCAAGCGTAAGGCCGTTCTCCGGTATGTACCCGTAGGTGTCTCCTCAAGTTGGCTACTTGCACGAAGTACCTGTCGCAGTGGTCGCAATGGTAAGGCTTCTCGCCAGTGTGTGTGCGTATGTGGGTGCGGAGATGGTGGTCCCGTCGAAACCTTCTGTGGCACTCGGGGCACTCGAACGGCCGTTCTCCAGTGTGGGTTCTTTCGTGATTTTTGAGAACGTGCTTATGCTTGAAGGACTGGTTACAAGTGAGGCAGACGAAAGCTCTG。
SEQ ID NO:4显示了一种示例性英雄美洲蝽kruppel基因DNA(BSB_kr-2)， 其互补链被转录成为另一种示例性BSB kruppel dsRNA的有义链：
AAACATTGATCGAAAAGCCACACAAATATCAACTACTAAATAACATCAACCAAAGTGATTGATTATCATAAAATTTTGTTGTTTTATTAAATGGGAAAAAAATAAATTTTTGAAATCCATAAAAGAGCATAGGGGCATAGAGATGTTAAACAATAAAAAGCGGAATTTTGCATCTGTCGGTTGGGTAAATTTTACAATATACATTCCAATAATAATTATTCCCAGAGATAACCTAATATCAAGTTTCCAGTCACTCTGACGTGGAATCACATGTTTTCATTTGAGAAACATACACGCTCAAAAATAGCGCTTCCATCAATTAAAATATACACAACGAACTTATACTCTAATAATAATATATAATAGAAAACAAAATAAATGAAATGACTATACCGAAACCGGTACATACCCGTAGTCGTTTTTACAGTACCTTCAGTAACCCTTACTATATTTCAAAAATCATAACTTCAATTATTACATCAATCCAGATCAAGAAATTGTACTCTAAAATAAGATATTTTAAATTTATTAATTTATGTACAATAAATCAATTTCGTTTCGTACCTTATGACGTTAAAGCATTCAAATGGTATAGGGCACTGGCG
SEQ ID NO:5显示T7噬菌体启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6表示一种植物表达载体中出现的YFP发夹RNA形成序列v2。 大写碱基是YFP有义链，下划线的碱基包含ST-LS1内含子，小写和非下划线 碱基是YFP反义链。
ATGTCATCTGGAGCACTTCTCTTTCATGGGAAGATTCCTTACGTTGTGGAGATGGAAGGGAATGTTGATGGCCACACCTTTAGCATACGTGGGAAAGGCTACGGAGATGCCTCAGTGGGAAAGgactagtaccggttg ggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaa gtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaattt ataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttactttcccactgaggcatctccgtagcctttcccacgta tgctaaaggtgtggccatcaacattcccttccatctccacaacgtaaggaatcttcccatgaaag agaagtgctccagatgacat
SEQ ID NO:7显示一种包含ST-LS1内含子的示例性DNA。
SEQ ID NO:8-11显示用于对BSB_kr-1和BSB_kr-2多核苷酸的PCR扩增的 引物。
SEQ ID NO:12显示一种示例性YFP dsRNA(YFPv2)的有义链的DNA模 板：
CATCTGGAGCACTTCTCTTTCATGGGAAGATTCCTTACGTTGTGGAGATGGAAGGGAATGTTGATGGCCACACCTTTAGCATACGTGGGAAAGGCTACGGAGATGCCTCAGTGGGAAAGGTTGATGCACAGTTCATCTGCACAACTGGTGATGTTCCTGTGCCTTGGAGCACACTTGTCACCACTCTCACCTATGGAGCACAGTGCTTTGCCAAGTATGGTCCAGAGTTGAAGGACTTCTACAAGTCCTGTATGCCAGATGGCTATGTGCAAGAGCGCACAATCACCTTTGAAGGAGATGG
SEQ ID NO:13和14显示用于YFP基因的PCR扩增的引物。
SEQ ID NO:15-17显示从包含示例性kruppel多核苷酸及其片段的核酸转 录的示例性RNA。
SEQ ID NO:18显示肌动蛋白-ORF
TACAAAATGTGTGACGAAGAAGTTGCTGCTTTAGTTGTAGACAATGGATCTGGTATGTGCAAAGCCGGTTTCGCTGGAGATGATGCACCCCGAGCTGTATTCCCATCAATTGTTGGCAGGCCTAGACACCAGGGTGTCATGGTTGGAATGGGACAAAAGGACAGTTATGTTGGAGACGAAGCCCAAAGCAAGAGAGGTATCCTCACCCTGAAATACCCCATTGAACACGGTATCATCACCAACTGGGACGACATGGAAAAGATCTGGCATCACACCTTCTACAACGAGCTGCGAGTCGCTCCAGAGGAACACCCCATCCTCCTGACTGAGGCTCCCCTCAACCCCAAAGCCAACAGGGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTATGTCGCCATCCAGGCTGTACTCTCCCTCTATGCCTCCGGTCGTACTACCGGTATTGTACTTGACTCAGGAGATGGTGTCTCCCACACCGTACCCATCTATGAAGGTTATGCCCTTCCCCACGCCATCCTCCGTCTGGATCTTGCTGGACGTGACTTGACTGACTATCTTATGAAGATCCTCACCGAGCGTGGTTACAGCTTCACCACCACCGCTGAAAGGGAAATCGTCAGGGACATCAAGGAAAAACTGTGCTATGTCGCCCTGGACTTTGAGCAGGAAATGGCCACCGCCGCTGCCTCCACCTCCCTGGAGAAGTCCTATGAACTTCCCGACGGTCAGGTCATCACCATCGGTAACGAGAGGTTCCGTTGCCCAGAGGCTCTCTTCCAGCCTTCCTTCTTGGGTATGGAATCTTGCGGTATCCATGAGACTGTCTACAACTCCATCATGAAGTGCGACGTTGACATCAGGAAGGACTTGTACGCCAACACCGTCCTCTCCGGAGGTACCACCATGTACCCAGGTATTGCTGACAGGATGCAGAAGGAAATCACCGCCCTCGCTCCTTCAACCATCAAGATCAAGATCATTGCTCCCCCAGAAAGGAAGTACTCCGTATGGATCGGTGGTTCCATCTTGGCTTCCCTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCTCCAAGCAGGAATACGACGAATCCGGCCCAGGCATCGTCCACCGCAAATGCTTC
SEQ ID NO:19-21显示用于肌动蛋白qPCR的引物和探针。
实施本发明的模式
I.若干实施方案的概览
使用针对表达dsRNA的转基因植物的靶标害虫物种——新热带褐蝽，我 们开发了RNA干扰(RNAi)作为昆虫害虫管理的工具。到目前为止，大多数被 提议用作特定昆虫中RNAi的靶标的基因并没有实现它们的目的，而那些已 经鉴定为有用的靶标通常涉及在若虫阶段引起致死性的那些靶标。在本文中， 我们描述了在新热带褐蝽中kruppel(kr)的RNAi介导的敲低作用，例如iRNA 分子当通过提供给雌性成虫的kruppel dsRNA被投送时，显示RNAi介导的敲 低作用可破坏胚胎发育。然而，在从暴露于kruppel dsRNA的雌性采集的卵 中，几乎完全没有孵化。在本文的实施方案中，通过对昆虫成虫注射而投送 kruppeldsRNA的能力而赋予了pRNAi效应，该效应对昆虫(例如半翅目)害虫 管理非常有用。此外，影响若虫和成虫半翅目害虫中多个靶序列的潜力可能 会增加开发涉及RNAi技术的可持续的昆虫害虫管理方法的机会。
本文中公开了用于遗传控制半翅目害虫侵染的方法和组合物。还提供了 用于鉴定对于半翅目害虫害虫的生命周期必需的一个或多个基因(例如，对 于正常生殖能力和/或胚胎和/或若虫发育必需的基因)作为用于RNAi介导的 半翅目害虫群体控制的靶基因的方法。可设计编码RNA分子的DNA质粒载体 来抑制生长、存活、发育、和/或生殖所必需的一个或多个靶基因。在一些实 施方案中，所述RNA分子可能能够形成dsRNA分子。在一些实施方案中，提 供了通过与半翅目害虫中靶基因的编码或非编码序列互补的核酸分子来转 录后阻抑靶基因表达或抑制靶基因的方法。在这些和进一步的实施方案中， 半翅目害虫可以摄取一种或多种从与靶基因的编码或非编码序列互补的核 酸分子的全部或部分转录的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA 分子，由此提供植物保护作用。
某些实施方案涉及使用与靶基因的编码和/或非编码序列互补的dsRNA、 siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA对靶基因产物的表达进行序列特异 性抑制，以实现对半翅目害虫的至少部分控制。公开了一组分离纯化的核酸 分子，其包含，例如，如在SEQ ID NO:1中示出的多核苷酸，及其片段。在 一些实施方案中，可以从这些多核苷酸、其片段、或包含这些多核苷酸之一 的基因表达稳定化的dsRNA分子，用于靶基因的转录后沉默或抑制。在某些 实施方案中，分离纯化的核酸分子包含SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3；和SEQ ID NO:4中任一者的全部或部分。
一些实施方案涉及在其基因组中具有编码至少一种iRNA(例如，dsRNA) 分子的至少一种重组DNA的重组宿主细胞(例如，植物细胞)。在特定的实施 方案中，dsRNA分子可以在被半翅目害虫摄取时产生，使得该害虫或该害虫 的后代中的靶基因发生转录后沉默或抑制其表达。重组DNA可以包含，例如： SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的片段；以及由包含SEQID NO:1的基因的部分 序列组成的多核苷酸；和/或其互补物。
替代的实施方案涉及重组宿主细胞，所述细胞在其基因组中具有重组 DNA，所述重组DNA具有编码至少一种iRNA(例如，dsRNA)分子，所述iRNA 分子包含SEQ ID NO:15的全部和部分(例如SEQ ID NO:15-17)。当被半翅目 害虫摄入时，iRNA分子可以在该害虫或该害虫的后代中沉默或抑制kruppel 基因(例如，包含SEQ ID NO:1的多核苷酸的全部或部分的DNA)的表达，从 而导致该害虫生殖的停止、和/或该害虫的后代的生长、发育和/或进食的停 止。
在一些实施方案中，在其基因组中具有编码至少一种能够形成dsRNA分 子的RNA分子的至少一种重组DNA的重组宿主细胞可以是转化的植物细胞。 一些实施方案涉及包含这样的转化的植物细胞的转基因植物。除了这样的转 基因植物之外，还提供了任何转基因植物世代的后代植物、转基因种子、和 转基因植物产品，它们均包含重组DNA。在特定的实施方案中，可以在转基 因植物细胞中表达能够形成dsRNA分子的RNA分子。因此，在这些和其他实 施方案中，可以从转基因植物细胞分离dsRNA分子。在特定的实施方案中， 转基因植物是选自下组的植物，包括：玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、 棉花(Gossypiumsp.)、和禾本科(Poaceae)的植物。
其他实施方案涉及用于调变半翅目害虫细胞中靶基因表达的方法。在这 些和其他实施方案中，可以提供核酸分子，其中所述核酸分子包含编码能够 形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸。在特定的实施方案中，编码能够形 成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸可与启动子可操作连接，并且还可与转 录终止序列可操作连接。在特定的实施方案中，用于调变半翅目害虫细胞中 靶基因表达的方法可包括：(a)用包含编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的 多核苷酸的载体转化植物细胞；(b)在足以容许形成包含多个转化的植物细胞的植物细胞培养物的条件下培养所述转化的植物细胞；(c)选择已将载体整合 到其基因组中的转化的植物细胞；和(d)确定选择的转化的植物细胞包含由载 体的所述多核苷酸编码的、能够形成dsRNA分子的RNA分子。可以从基因组 中整合有载体、且包含由载体的所述多核苷酸编码的dsRNA分子的植物细胞 再生植物。
因此，还公开了包含整合在其基因组中的载体的转基因植物，所述载体 具有编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸，其中转基因植物包含 由所述载体的所述多核苷酸编码的dsRNA分子。在特定的实施方案中，能够 在植物中形成dsRNA分子的RNA分子的表达足以调控接触所述转化的植物 或植物细胞(例如通过以转化的植物、植物的一部分(例如，叶)或植物细胞为 食)的半翅目害虫的细胞或接触所述转化的植物或植物细胞(例如，通过亲代 传递)的半翅目害虫的后代中的细胞中的靶基因的表达，使得害虫的生殖被抑制。本文中公开的转基因植物可以展现出对半翅目害虫侵染的耐受性和/ 或保护。特定的转基因植物可以展现出对一种或多种选自下组的害虫的保护 和/或增强的保护：盖德拟壁蝽；茶翅蝽；稻绿蝽；拟绿蝽；英雄美洲蝽；褐 臭蝽；Chinavia hilare；C.marginatum；Dichelops melacanthus；D.furcatus； Edessa meditabunda；Thyanta perditor；Horciasnobilellus；Taedia stigmosa； 秘鲁红蝽(Dysdercus peruvianus)；Neomegalotomusparvus；Leptoglossus zonatus；Niesthrea sidae；豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)；和美国牧草盲蝽(L. lineolaris)。
本文中还公开了用于将控制剂(如iRNA分子)投送给半翅目害虫的方法。 这样的控制剂可以直接或间接地阻碍半翅目害虫群体进食、生长或以其他方 式致害宿主的能力。在一些实施方案中，提供了这样的方法，包括将稳定化 的dsRNA分子投送至半翅目害虫以抑制该害虫或其后代中的至少一种靶基 因，从而导致亲代RNAi并减少或消除害虫宿主中的植物损害。在一些实施 方案中，抑制半翅目害虫中靶基因表达的方法可以导致害虫的生殖的停止、 和/或该害虫的后代的生长、发育、和/或进食的停止。在一些实施方案中， 该方法可
显著降低后续害虫世代侵染的大小，而不直接导致与iRNA分子接触的 害虫死亡。在一些实施方案中，该方法可显著降低侵染中后续害虫世代的大 小，同时还导致与iRNA分子接触的害虫死亡。
在一些实施方案中，提供了包含iRNA(例如，dsRNA)分子的组合物(例 如，局部用组合物)，供用于植物、动物、和/或植物或动物的环境以实现半 翅目害虫侵染的消除或减少。在特定的实施方案中，组合物可以是要喂给半 翅目害虫的营养组合物或资源、或食物来源。一些实施方案包括使害虫可得 到所述营养组合物或食物来源。包含iRNA分子的组合物的摄入可导致一个 或多个半翅目害虫细胞摄取所述分子，进而可导致害虫或其后代的细胞中至 少一种靶基因表达的抑制。通过在半翅目害虫的宿主中提供一种或多种包含iRNA分子的组合物，可以在任何存在害虫的宿主组织或环境之中或之上限 制或消除该害虫对植物或植物细胞的摄入或侵染损伤。
本文中公开的组合物和方法可与用于控制半翅目害虫所致损害的其他 方法和组合物一起联合使用。例如，本文中所描述的用于针对半翅目害虫保 护植物的iRNA分子可以在这样的方法中使用，所述方法包括另外使用一种 或多种针对半翅目害虫有效的化学剂、针对半翅目害虫有效的生物杀虫剂、 作物轮作、展现出与RNAi介导的方法和RNAi组合物的特征不同的特征的重 组遗传技术(例如，在植物中重组产生对于半翅目害虫有害的蛋白质(例如， Bt毒素))、和/或非亲代iRNA分子(例如导致摄入该iRNA分子的半翅目害虫的 生长、发育和/或进食停止，和/或导致其死亡的致死性iRNA分子)的重组表达。
II.缩写
BSB 新热带褐蝽(英雄美洲蝽，Euschistus heros)
dsRNA 双链核糖核酸
GI 生长抑制
NCBI 美国国家生物技术信息中心
gDNA 基因组脱氧核糖核苷酸
iRNA 抑制性核糖核酸
ORF 开放阅读框
RNAi 核糖核酸干扰
miRNA 微小核糖核酸
siRNA 小抑制性核糖核酸
hpRNA 发夹核糖核酸
shRNA 短发夹核糖核酸
pRNAi 亲代RNA干扰
UTR 非翻译区
PCR 聚合酶链反应
qPCR 定量聚合酶链反应
RISC RNA诱导的沉默复合物
RH 相对湿度
SEM 均值标准误
YFP 黄色荧光蛋白
III.术语
在以下描述和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书 的清楚且一致的理解，包括要赋予此类术语的范围，提供了以下定义：
(与生物)接触：如本文中使用的，与生物(例如，半翅目害虫)“接触”或被 生物“摄取”等术语，就核酸分子而言，包括核酸分子内化到生物中，例如但 不限于：生物摄取分子(例如，通过进食)；使生物与包含核酸分子的组合物 接触；用包含核酸分子的组合物注射该生物；以及用包含核酸分子的溶液浸 泡生物。
重叠群：如本文中使用的，术语“重叠群”指从一组来源于单一遗传来源 的重叠DNA区段重建的DNA序列。
玉米植物：如本文中使用的，术语“玉米植物”指物种玉蜀黍(玉米)的植 物。
表达：如本文中使用的，编码多核苷酸(例如，基因或转基因)的“表达” 是指这样的过程，通过该过程，核酸转录单元(包括，例如gDNA或cDNA)的 编码信息被转化为细胞的操作部分、非操作部分、或结构部分(常常包括蛋 白质的合成)。基因表达可能受到外部信号的影响，例如细胞、组织、或生 物暴露于增加或降低基因表达的物质。基因表达也可以在从DNA到RNA再到 蛋白质的途径中的任何位置受到调节。例如，通过控制对转录、翻译、RNA运输和加工、中间分子比如mRNA的降解的作用，或通过在特异性蛋白分子 已经产生之后的活化、失活、区室化、或降解，或它们的组合，由此发生基 因表达的调节。通过本领域已知的任何方法，包括但不限于，Northern印迹、 RT-PCR、Western印迹，或体外、原位或体内蛋白活性测定，可以在RNA水 平或蛋白质水平测量基因表达。
遗传物质：如本文中使用的，术语“遗传物质”包括所有基因和核酸分子， 诸如DNA和RNA。
半翅目害虫：如本文中使用的，术语“半翅目害虫”指属于半翅目 (Hemiptera)的害虫昆虫，包括但不限于蝽科(Pentatomidae)、盲蝽科(Miridae)、 红蝽科(Pyrrhocoridae)、缘蝽科(Coreidae)、蛛蝽科(Alydidae)、和姬缘蝽科 (Rhopalidae)等科中的昆虫，其以范围很广的宿主植物为食，具有刺吸式口器。 在特定的实例中，半翅目害虫选自下列清单，包括：英雄美洲蝽[Euschistus heros(Fabr.)](新热带褐蝽)、稻绿蝽Nezara viridula(L.)(南方绿椿象)、盖德拟 壁蝽[Piezodorus guildinii(Westwood)](红带椿象)、茶翅蝽[Halyomorpha halys (Stal)](棕色大理石椿象)、绿蝽[Chinaviahilare(Say)](绿色椿象)、褐椿象 [Euschistus servus(Say)](棕色椿象)、Dichelopsmelacanthus(Dallas)、 Dichelops furcatus(F.)、Edessa meditabunda(F.)、Thyantaperditor(F.)(新热带 红肩椿象)、Chinavia marginatum(Palisot de Beauvois)、Horcias nobilellus (Berg)(棉红蝽)、Taedia stigmosa(Berg)、秘鲁红蝽(Dysdercusperuvianus)(Guerin-Meneville)、Neomegalotomus parvus(Westwood)、 Leptoglossuszonatus(Dallas)、Niesthrea sidae(F.)、豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)(Knight)(西方牧草盲蝽)、和牧草盲蝽[美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)(Palisot de Beauvois)]。
抑制：如本文中使用的，术语“抑制”在用于描述对编码多核苷酸(例如基 因)的影响时是指从编码多核苷酸转录的mRNA和/或所述编码多核苷酸的肽、 多肽、或蛋白质产物的细胞水平的可测量的降低。
在一些实例中，抑制编码多核苷酸的表达可以使得表达大致消除。“特 异性抑制”是指在实现特异性抑制的细胞中对靶编码多核苷酸的抑制没有因 此影响其他编码多核苷酸(例如，基因)的表达。
分离的：“分离的”生物学组分(诸如核酸、肽或蛋白质)是已经从该组分 所天然存在的生物细胞中的其他生物学组分(即，其他染色体和染色体外的 DNA和RNA、和蛋白质)实质性分开、分开产生、或纯化出来，同时实现组 分中的化学或功能变化(例如，核酸可以通过断开将核酸连接到染色体中的 其余DNA的化学键而从染色体分离)。已经“分离的”核酸分子和蛋白质包括 通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞 内重组表达制备的核酸分子和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和 肽。
核酸分子：如本文中使用的，术语“核酸分子”可以是指核苷酸的聚合物 形式，可包括RNA、cDNA、gDNA的有义和反义链，以及上述情形的合成 形式和混合聚合物。核苷酸或核碱基可以是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、 或这两种类型核苷酸的任一者的修饰形式。如本文中使用的“核酸分子”与 “核酸”和“多核苷酸”是同义词。除非另外指明，核酸分子通常在长度上具有 至少10个碱基。根据惯例，核酸分子的核苷酸序列从分子的5’至3’端阅读。 核酸分子的“互补物”(互补序列)是指具有可以与该核酸分子的核碱基形成碱 基对(即，A-T/U，和G-C)的核碱基的多核苷酸。
一些实施方案包括包含转录为RNA分子的模板DNA的核酸，所述RNA 分子是mRNA分子的互补序列。在这些实施方案中，转录为mRNA分子的核 酸的互补物以5’至3’方向存在，使得RNA聚合酶(其以5’至3’方向转录DNA) 将从互补物转录出可以与mRNA分子杂交的核酸。因此，除非另有明确说明 或者从上下文中可以清楚地看出另有所指，术语“互补物”是指具有可以与参 考核酸的核碱基形成碱基对的从5’至3’的核碱基的多核苷酸。类似地，除非 另有明确说明或者从上下文中可以清楚地看出另有所指，核酸的“反向互补 物”是指相反取向的互补物。前述内容在以下图示中示出：
ATGATGATG多核苷酸
TACTACTAC该多核苷酸的“互补物”
CATCATCAT该多核苷酸的“反向互补物”
本发明的一些实施方案可以包括形成发夹RNA的RNAi分子。在这些 RNAi分子中，RNA干扰的靶核酸的互补物和反向互补物可以出现在同一分 子中，使得单链RNA分子在包含互补和反向互补的多核苷酸的区域上可以 “回折”并与自身杂交。
“核酸分子”包括所有多核苷酸，例如：DNA的单链和双链形式；RNA 的单链形式；和RNA的双链形式(dsRNA)。术语“核苷酸序列”或“核酸序列” 是指作为个别单链或在双链体中的核酸有义和反义链两者。术语“核糖核 酸”(RNA)包括iRNA(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、 shRNA(小发夹RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、hpRNA(发夹RNA)、tRNA(转运RNA)(无论是装载还是卸下相应的酰化氨基酸)、和cRNA (互补RNA)。术语“脱氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA、gDNA、和DNA-RNA 杂交体。术语“多核苷酸”和“核酸”、及其“片段”正如本领域技术人员将理解 的术语，包括，gDNA、核糖体RNA、转运RNA、信使RNA、操纵子、和较 小的工程化多核苷酸，其编码或可适用于编码肽、多肽、或蛋白质。
寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可通过切割较长核酸 区段、或通过使单独的核苷酸前体聚合而形成。自动合成仪能够合成长度多 达几百个碱基的寡核苷酸。由于寡核苷酸可与互补的核酸结合，因此它们可 用作检测DNA或RNA的探针。由DNA组成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸) 可以用于PCR，PCR是一种用于扩增DNA的技术。在PCR中，寡核苷酸一般 被称为“引物”，其允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。
核酸分子可以包括天然存在的核苷酸和/或修饰核苷酸，它们通过天然存 在和/或非天然存在的核苷酸连接而连接在一起。本领域技术人员易于理解， 核酸分子可被化学修饰或生物化学修饰，或者可以含有非天然的或衍生的核 苷酸碱基。这些修饰包括，例如，标记物、甲基化、用类似物取代一个或多 个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如，如不带电连接(uncharged linkage) 的修饰：例如甲基膦酸盐、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电连 接(charged linkage)的修饰：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂部分 的修饰：例如肽类；嵌入剂修饰：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂修饰；烷 化剂(alkylator)修饰；和修饰的连接：例如α异头核酸等)。术语“核酸分子”还 包括任何拓扑结构，包括单链的、双链的、部分双链体的、三链体的、发夹 形的(hairpinned)、圆形的、挂锁形的结构。
如本文中使用的，就DNA而言，术语“编码多核苷酸”、“结构多核苷酸”、 或“结构核酸分子”是指这样的多核苷酸，当被置于适当的调节元件控制下时， 其通过转录和mRNA最终翻译成多肽。就RNA而言，术语“编码多核苷酸”指 翻译成肽、多肽或蛋白质的多核苷酸。编码多核苷酸的边界由5’端的翻译起 始密码子和3’端的翻译终止密码子所界定。编码多核苷酸包括但不限于： gDNA；cDNA；EST；和重组多核苷酸。
如本文中使用的，“(被)转录的非编码多核苷酸”是指mRNA分子的区段， 比如未翻译成肽、多肽或蛋白质的5'UTR、3'UTR和内含子区段。此外，“转 录的非编码多核苷酸”是指转录成在细胞中起作用的RNA的核酸，例如结构 RNA(例如，由5S rRNA、5.8S rRNA、16SrRNA、18S RNA、23S rRNA和28S rRNA等例示的核糖体RNA(rRNA))；转运RNA(tRNA)；和snRNA，如U4、 U5、U6等等。转录的非编码多核苷酸还包括例如但不限于：小RNA(sRNA)， 该术语通常用于描述细菌非编码小RNA；小核仁/RNA(snoRNA)；微小RNA； 小干扰RNA(siRNA)；Piwi相互作用的RNA(piRNA)；以及长非编码RNA。更 进一步说，“(被)转录的非编码多核苷酸”是指可以在核酸中作为基因内“间隔 子”(spacer)本身存在并且被转录成RNA分子的多核苷酸。
致死性RNA干扰：如本文中使用的，术语“致死性RNA干扰”是指导致被 投送了例如dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA和/或hpRNA的受试者个体死 亡或存活力降低的RNA干扰。
亲代RNA干扰：如本文中使用的，术语“亲代RNA干扰”(pRNAi)是指在 被投送了例如dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA和/或hpRNA的受试者(例如， 半翅目害虫)的后代中可观察到的RNA干扰表型。在一些实施方案中，pRNAi 包括将dsRNA投送至半翅目害虫，其中由此将该害虫产生有存活力的后代的 能力降低。启动pRNAi的核酸可能增加或不增加投送了该核酸的群体中的死 亡发生率。在某些实例中，启动pRNAi的核酸不增加在其中投送了该核酸的群体中的死亡发生率。例如，可以给半翅目害虫群体饲喂一种或多种启动 pRNAi的核酸，其中这些害虫存活并交配，但其产生的卵比未被饲以所述核 酸的相同物种的害虫所产的卵相比，孵化出可存活的后代的能力较低。在 pRNAi的一种机制中，投送至雌性的亲代RNAi能够敲低该雌性的后代胚胎中 的合子基因表达。Bucher等人(2002)Curr.Biol.12(3):R85-6。
基因组：如本文中所使用的，术语“基因组”是指存在于细胞核内的染色 体DNA，并且也指存在于细胞的亚细胞组成部分内的细胞器DNA。在本发 明的一些实施方案中，可以将DNA分子导入植物细胞中，使得DNA分子整 合到植物细胞的基因组中。在这些和进一步的实施方案中，DNA分子可以整 合到植物细胞的核DNA中，或整合到植物细胞的叶绿体或线粒体的DNA中。 术语“基因组”在其应用于细菌时，指细菌细胞内的染色体和质粒两者。在本发明的一些实施方案中，可以将DNA分子导入细菌中，使得DNA分子整合 到细菌的基因组中。在这些和进一步的实施方案中，DNA分子可以整合于染 色体，或者作为稳定的质粒定位或位于稳定的质粒中。
序列同一性：如本文中使用的术语“序列同一性”或“同一性”，在两个多 核苷酸或多肽的情况下，是指在指定比较窗口上以最大对应性比对时，这两 个分子的序列中相同的残基。
如本文中使用的，术语“序列同一性百分比”可以是指通过在比较窗口上 比较分子的两个最优比对序列(例如，核酸序列或多肽序列)确定的值，其中 为了实现这两个序列的最优比对，该比较窗口中的序列部分相比于参考序列 (其不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即，空位)。通过确定在两个序 列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目而产生匹配位置数，用该匹 配位置数除以比较窗口中位置的总数，将结果乘以100而产生序列同一性的 百分比，从而计算出该百分比。每个位置与参考序列相比均相同的序列被认 为是与参考序列是100％相同的，反之亦然。
用于比较的序列比对方法是本领域技术人员熟知的。各种程序和比对算 法例如描述于Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和 Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp (1989)CABIOS 5:151-3；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90； Huang等人(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson等人(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-50。序 列比对方法和同源性计算的详细讨论可见于例如Altschul等人(1990)J.Mol. Biol.215:403-10。
美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM； Altschul等人(1990))可在几个来源访问，包括美国国家生物技术信息中心 (Bethesda,MD)、以及在互联网上，其与几种序列分析程序结合使用。怎样 使用该程序确定序列同一性的描述可在互联网上BLASTTM的“帮助”部分获 得。为了比较核酸序列，可以采用利用默认参数的默认BLOSUM62矩阵集的 BLASTTM(Blastn)程序的“Blast 2序列”函数。在用这种方法评估时，与参考多 核苷酸的序列具有较大序列相似性的核酸将显示出同一性百分比的增加。
可特异性杂交/特异性互补：如本文中使用的，术语“可特异性杂交”和“特 异性互补”是表明互补性的足够程度的术语，该互补性足以使得在核酸分子 与靶核酸分子之间发生稳定且特异的结合。在两个核酸分子之间的杂交涉及 所述两个核酸分子的核碱基之间的反平行比对的形成。然后，两个分子能够 与相反链上的相应碱基形成氢键以形成双链体分子，如果该双链体分子足够 稳定，则可使用本领域中熟知的方法检出。多核苷酸与其可特异性杂交的靶 核酸不一定是100％互补的。然而，对于特异性杂交而言必须存在的互补性 的量依赖所使用的杂交条件而变化。
导致特定严格程度的杂交条件会根据选择的杂交方法的性质和杂交的 核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交的温度和杂交的离子强度(尤其 是Na+和/或Mg++浓度)将决定杂交严格性，尽管洗涤次数也影响严格性。关于 获得特定严格性程度所需要的杂交条件的计算是本领域普通技术人员已知 的，并且论述于例如Sambrook等人(编辑)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nded.,vol.1-3,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY,1989,chapters 9and 11；以及Hames和Higgins(编辑)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985。关于核酸杂交的进一步详细说明和指 导例如可见于Tijssen,"Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays,"收录于Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2, Elsevier,NY,1993；以及Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology.Chapter 2,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995。
如本文中使用的，“严格条件”涵盖仅在杂交分子序列与靶核酸分子内的 同源多核苷酸之间存在小于20％的错配时才发生杂交的条件。“严格条件”包 括另外的特定严格性水平。因此，如本文中使用的，“中等严格性”条件为具 有超过20％序列错配的分子将不会杂交的条件；“高严格性”条件为具有超过 10％错配的序列将不会杂交的条件；并且“极高严格性”条件为具有超过5％错 配的序列将不会杂交的条件。
以下是代表性的非限制性杂交条件：
高严格性条件(检测共享至少90％序列同一性的多核苷酸)：在5x SSC缓 冲液中在65℃杂交16小时；在2x SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次15 分钟；并且在0.5x SSC缓冲液中在65℃洗涤两次，每次20分钟。
中等严格性条件(检测共享至少80％序列同一性的多核苷酸)：在5x-6x SSC缓冲液中在65-70℃杂交16-20小时；在2x SSC缓冲液中在室温下洗涤两 次，每次5-20分钟；并且在lx SSC缓冲液中在55-70℃洗涤两次，每次30分钟。
非严格对照条件(共享至少50％序列同一性的多核苷酸会杂交)：在6x SSC缓冲液中在室温到55℃杂交16-20小时；在2x-3x SSC缓冲液中在室温到 55℃洗涤至少两次，每次20-30分钟。
如本文中使用的，术语“基本上同源”或“实质同源性”就核酸而言是指具 有这样的连续核碱基的多核苷酸，所述连续核碱基在严格条件下与参考核酸 杂交。例如，与具有SEQ ID NO:1、3、和4中任一者的参考核酸基本上同源 的核酸是在严格条件(例如，上文列出的中等严格性条件)下与具有SEQ ID NO:1、3、和4的参考核酸杂交的那些核酸。基本上同源的多核苷酸可以具有 至少80％序列同一性。例如，基本上同源的多核苷酸可以具有约80％到100％ 序列同一性，诸如约79％；80％；约81％；约82％；约83％；约84％；约85％； 约86％；约87％；约88％；约89％；约90％；约91％；约92％；约93％；约94％； 约95％；约96％；约97％；约98％；约98.5％；约99％；约99.5％；和约100％。 实质性同源性的特性与特异性杂交紧密相关。例如，当存在足够的互补程度 时，核酸分子可特异性地杂交，以便避免核酸在特异性结合是期望的情况下 (例如，在严格杂交条件下)与非靶多核苷酸的非特异性结合。
如本文中使用的，术语“直系同源物”是指两种或更多种物种中已经从共 同的祖先核酸进化并且可以在所述两种或更多种物种中保留相同功能的基 因。
如本文中使用的，当一个多核苷酸以5’至3’方向阅读的每个核苷酸与另 一多核苷酸以3’至5’方向阅读的每个核苷酸序列互补时，两个核酸分子被认 为展现出“完全互补性”。与参考多核苷酸互补的多核苷酸将展现出与参考多 核苷酸的反向互补物相同的序列。这些术语和描述是本领域中定义明确的， 并且是本领域普通技术人员容易理解的。
可操作(地)连接：当第一多核苷酸与第二多核苷酸处于功能性关系中时， 则第一多核苷酸与第二多核苷酸是可操作连接的。当以重组方式产生时，可 操作连接的多核苷酸通常是连续的，并且在需要将两个蛋白质编码区连接在 一起的场合，二者在同一个阅读框内(例如，在翻译融合的ORF中)。然而， 可操作连接的核酸不一定是连续的。
在有关调节性遗传元件和编码多核苷酸的语境下使用时，术语“可操作 连接”意味着该调节元件影响该连接的编码多核苷酸的表达。“调节元件”或 “控制元件”是指影响转录的调整(tuning)和水平/量、RNA加工或稳定性、或 相关编码多核苷酸的翻译的多核苷酸。调节元件可以包括启动子；翻译前导； 内含子；增强子；茎环结构；阻抑物结合多核苷酸；具有终止序列的多核苷 酸；具有多腺苷酸化识别序列的多核苷酸等。特定的调节元件可位于与其可 操作连接的编码多核苷酸的上游和/或下游。并且，与编码多核苷酸可操作连 接的特定调节元件可位于双链核酸分子的相关互补链上。
启动子：如本文中使用的，术语“启动子”是指可以在转录起始上游的、 且可能涉及RNA聚合酶与其他蛋白质的识别和结合而启动转录的DNA区域。 启动子可与用于在细胞中表达的编码多核苷酸可操作连接，或者启动子可与 编码信号肽的多核苷酸可操作连接，所述多核苷酸可与用于在细胞中表达的 编码多核苷酸可操作连接。“植物启动子”可以是能够启动植物细胞转录的启 动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先启动某些组织中的转录的启动 子，所述组织例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞、或厚壁组织。 这样的启动子称为“组织优先”启动子。仅启动某些组织中的转录的启动子被 称为“组织特异性”启动子。“细胞类型特异性”启动子主要驱动一个或多个器 官中某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”启动子 可以是可以在环境控制之下的启动子。可通过诱导型启动子启动转录的环境 条件的实例包括厌氧条件和光的存在。组织特异性启动子、组织优先启动子、 细胞类型特异性启动子、和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类别。“组 成型”启动子是可在大多数环境条件下或在大多数组织或细胞类型中有活性 的启动子。
在本发明的一些实施方案中可以使用任何诱导型启动子。参见Ward等人 (1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。利用诱导型启动子，转录速率响应于诱导 剂而增加。诱导型启动子的实例包括但不限于：来自响应于铜的ACEI系统 的启动子；响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因启动子；来 自Tn10的Tet阻抑物；和来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性 可通过糖皮质激素诱导(Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 0421)。
示例性的组成型启动子包括，但不限于：来自植物病毒的启动子，例如 来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子；来自水稻肌动蛋白基因的启动子； 泛素启动子；pEMU；MAS；玉米H3组蛋白启动子；和ALS启动子，甘蓝型 油菜ALS3结构基因5'的Xbal/Ncol片段(或与所述Xbal/Ncol片段相似的多核苷 酸)(国际PCT公开号WO96/30530)。
另外，在本发明的一些实施方案中可以利用任何组织特异性或组织优先 启动子。用包含与组织特异性启动子可操作连接的编码多核苷酸的核酸分子 转化的植物可唯一地或优先地在特异性组织中产生所述编码多核苷酸的产 物。示例性的组织特异性或组织优先启动子包括但不限于：种子优先启动子， 如来自菜豆蛋白基因的启动子；叶特异性和光诱导型启动子，如来自cab或 rubisco的启动子；花药特异性启动子，如来自LAT52的启动子；花粉特异性 启动子，如来自Zm13的启动子；以及小孢子优先启动子，如来自apg的启动子。
大豆植物：如本文中使用的，术语“大豆植物”是指属于大豆属物种 (Glycinesp.)的植物，例如大豆(Glycine max)。
转化：如本文中使用的，术语“转化”或“转导”是指将一个或多个核酸分 子转移到细胞中。当核酸分子通过核酸分子并入细胞基因组中、或通过附加 型复制而由该细胞稳定复制时，细胞被转导到该细胞中的核酸分子“转化”。 如本文中使用的，术语“转化”涵盖可将核酸分子导入这种细胞中的所有技术。 实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm等人， (1986)Nature 319:791-3)；脂质体转染(Feigner等人，(1987)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 84:7413-7)；显微注射(Mueller等人，(1978)Cell 15:579-85)；土壤杆 菌介导的转移(Fraley等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)；直 接DNA摄取；和微粒轰击(Klein等人，(1987)Nature 327:70)。
转基因：外源核酸。在一些实例中，转基因可以是编码RNA的一条或两 条链的DNA，所述RNA能够形成dsRNA分子，包含与存在于半翅目害虫中的 核酸分子互补的多核苷酸。在另外的实例中，转基因可以是反义多核苷酸， 其中所述反义多核苷酸的表达抑制靶核酸的表达，从而产生亲代RNAi表型。 在又另外的实例中，转基因可以为基因(例如除草剂耐性基因、编码工业或 药学上有用的化合物的基因、或编码期望的农业性状的基因)。在这些和其他实例中，转基因可以含有与转基因的编码多核苷酸可操作连接的调节元件 (例如，启动子)。
载体：引入到细胞中，例如产生转化的细胞的核酸分子。载体可以包含 允许其在宿主细胞中复制的遗传元件，诸如复制起点。载体的实例包括但不 限于：质粒；粘粒；噬菌体；和携带外源DNA或RNA进入细胞中的病毒。载 体还可包括一种或多种基因、包括产生反义分子的基因、和/或选择标志物基 因和本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，由此引 起细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋白质。任选地，载体包括辅助核 酸分子实现进入细胞中的物质(例如脂质体、蛋白质包衣等)。
产量：相对于在相同生长位置在相同时间且在相同条件下生长的检验品 种的产量，约100％或更大的稳定化产量。在特定的实施方案中，“提高的产 量”或“提高产量”意指相对于在含有相当大密度的对该作物有害的半翅目害 虫(本文中的组合物和方法以所述害虫为目标)的相同生长位置在相同时间且 在相同条件下生长的检验品种的产量，具有105％或更大的稳定化产量的栽 培种。
除非特别指明或暗示，如本文中使用的术语“一个”、“一种”和“该”表示 “至少一个/种”。
除非另外特别地解释，本文中使用的全部技术术语和科学术语具有与属 于本公开的领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的含义。可以在以下 出版物中找到分子生物学中常见术语的定义：例如，Lewin的Genes X,Jones &Bartlett Publishers,2009(ISBN 10 0763766321)；Krebs等人(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Meyers R.A.(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。除非另有说明，所有百分比均以重量计，所有溶剂混合物 比例以体积计。所有温度以摄氏度计。
IV.包含半翅目害虫多核苷酸的核酸分子
A.概述
本文中描述了可用于控制半翅目害虫的核酸分子。描述的核酸分子包括 靶多核苷酸(例如，天然基因、和非编码多核苷酸)、dsRNA、siRNA、shRNA、 hpRNA、和miRNA。例如，在一些实施方案中描述了dsRNA、siRNA、miRNA、 shRNA和/或hpRNA分子，其可与半翅目害虫中的一种或多种天然核酸的全 部或部分特异性地互补。在这些和进一步的实施方案中，一种或多种天然核 酸可以是一种或多种靶基因，其产物可以例如但不限于：涉及生殖过程或涉及若虫发育。本文中描述的核酸分子在导入包含至少一种与所述核酸分子特 异性互补的天然核酸的细胞中时(例如，通过亲代传递)，可以在细胞中启动 RNAi，随后降低或消除天然核酸的表达。在一些实例中，借助于与靶基因 特异性互补的核酸分子降低或消除靶基因表达，可导致半翅目害虫的生殖、 和/或所述害虫的后代的生长、发育和/或进食停止的减少或停止。例如，这 些方法可显著降低后续害虫世代侵染的大小，而不直接导致与iRNA分子接 触的害虫死亡。
在一些实施方案中，可以选择半翅目害虫中的至少一种靶基因，其中该 靶基因包含kruppel多核苷酸。在具体的实例中，选择半翅目害虫中的靶基因， 其中该靶基因包含选自SEQ ID NO:1、3和4中的任一者的多核苷酸。
在其他实施方案中，靶基因可以是包含能在计算机上反向翻译为多肽的 多核苷酸的核酸分子，所述多肽包含与kruppel多核苷酸的蛋白质产物(即 KRUPPEL多肽)的氨基酸序列至少约85％相同(例如至少84％>、85％、约90％、 约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、或100％相同)的连续氨 基酸序列。靶基因可以是半翅目害虫中的任何核酸，其转录后抑制对该害虫 产生有存活力的后代的能力产生有害影响，从而例如，给植物提供针对该害 虫的保护益处。在具体实例中，靶基因是包含能在计算机上反向翻译为多肽的多核苷酸的核酸分子，所述多肽包含与SEQ ID NO:2的计算机翻译产物的 氨基酸序列至少约85％相同、约90％相同、约95％相同、约96％相同、约97％ 相同、约98％相同、约99％相同、约100％相同、或100％相同的连续氨基酸 序列。
在一些实施方案中提供了DNA，其表达生成包含这样的多核苷酸的RNA 分子，该多核苷酸与由半翅目害虫中的编码多核苷酸编码的天然RNA分子的 全部或部分特异性地互补。在一些实施方案中，在半翅目害虫摄入表达的 RNA分子后，可以获得害虫细胞中或该害虫的后代的细胞中编码多核苷酸的 下调。在特定的实施方案中，半翅目害虫细胞中编码多核苷酸的下调可以导 致该害虫的生殖和/或繁殖、和/或该害虫的后代的生长、发育、和/或进食的 减少或停止。
在一些实施方案中，靶多核苷酸包括转录的非编码性RNA，诸如5’UTR；3’UTR；剪接前导；内含子；末端内含子(outron)(例如，随后在反式剪接中 修饰的5'UTR RNA)；donatron(例如，提供反式剪接的供体序列需要的非编 码RNA)；和半翅目害虫靶基因的其他非编码转录RNA。这样的多核苷酸可 以衍生自单顺反子和多顺反子基因两者。
因此，本文中结合一些实施方案还描述了包含至少一种多核苷酸的 iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)，所述多核苷 酸与半翅目害虫中的靶核酸的全部或部分特异性地互补。在一些实施方案中， iRNA分子可以包含与多个靶核酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、或 更多个靶核酸的全部或部分互补的多核苷酸。在特定的实施方案中，iRNA 分子可以在体外产生，或通过遗传修饰的生物(如植物或细菌)在体内产生。 还公开了cDNA，其可以用于产生与半翅目害虫中的靶核酸的全部或部分特 异性地互补的dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子、和/或 hpRNA分子。进一步描述了在实现特定宿主靶标的稳定转化中使用的重组 DNA构建体。转化的宿主靶标可以从重组DNA构建体表达有效水平的 dsRNA、siRNA、miRNA分子、shRNA分子、和/或hpRNA分子。还描述了 植物转化载体，其包含与在植物细胞中功能性的异源启动子可操作连接的至 少一个多核苷酸，其中多核苷酸的表达生成包含与半翅目害虫中的靶核酸的 全部或部分特异性地互补的连续核碱基串的RNA分子。
在特定实例中，可用于控制半翅目害虫的核酸分子可以包括：从美洲蝽 属(Euschistus)分离的天然核酸的全部或部分，所述核酸包含kruppel多核苷酸 (例如，SEQID NO:1)；表达时生成包含这样的多核苷酸的RNA分子的DNA， 所述多核苷酸与由kruppel编码的天然RNA分子的全部或部分特异性互补；包 含与由kruppel编码的RNA分子的全部或部分特异性互补的至少一个多核苷 酸的iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)；可用 于产生dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子、和/或hpRNA 分子的cDNA，所述这些RNA分子与由kruppel编码的RNA分子的全部或部分 特异性互补；以及用于在实现特定宿主靶标的稳定转化中使用的重组DNA 构建体，其中转化的宿主靶标包含一种或多种前述的核酸分子。
B.核酸分子
本发明提供了，除其他事项外，抑制半翅目害虫的细胞、组织、或器官 中的靶基因表达的iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA) 分子；和能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制半翅目害虫的细胞、 组织、或器官中的靶基因表达的DNA分子。
本发明的一些实施方案提供了分离的核酸分子，其包含至少一个(例如， 一个、两个、三个、或更多个)选自下组的多核苷酸：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补物；SEQ IDNO:1的至少15个连续核苷酸(例如，至少19个连续核 苷酸)的片段(例如，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)；SEQ ID NO:1的至少15 个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:1的半翅目生物(例如，BSB) 的天然编码多核苷酸；包含SEQ ID NO:1的半翅目生物的天然编码多核苷酸 的互补物；包含SEQ ID NO:1的半翅目生物的天然编码多核苷酸的至少15个 连续核苷酸的片段；以及包含SEQ ID NO:1的半翅目生物的天然编码多核苷 酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。在特定的实施方案中，所述分离 的多核苷酸与半翅目害虫接触或被所述害虫摄取而抑制该害虫的生长、发育、 生殖和/或进食。
在其他实施方案中，本发明的分离的核酸分子可以包含至少一个(例如， 一个、两个、三个、或更多个)选自下组的多核苷酸：SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:15的互补物；SEQ IDNO:16；SEQ ID NO:16的互补物；SEQ ID NO:17； SEQ ID NO:17的互补物；SEQ ID NO:15-17中任一者的至少15个连续核苷酸 的片段；SEQ ID NO:15-17中任一者的至少15个连续核苷酸的片段的互补物； 半翅目生物中自包含SEQ ID NO:1的基因转录的天然多核糖核苷酸；半翅目 生物中自包含SEQ ID NO:1的基因转录的天然多核糖核苷酸的互补物；半翅 目生物中自包含SEQ ID NO:1的基因转录的天然多核糖核苷酸的至少15个 核苷酸的片段；以及半翅目生物中自包含SEQ ID NO:1的基因转录的天然多 核糖核苷酸的至少15个核苷酸的片段的互补物。在特定的实施方案中，所述 分离的多核苷酸与半翅目害虫接触或被所述害虫摄取而抑制该害虫的生长、 发育、生殖和/或进食。
在替代实施方案中，本发明的核酸分子可以包含至少一个(例如，一个、 两个、三个、或更多个)DNA，其能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以 抑制半翅目害虫的细胞、组织、或器官中的靶基因表达。这样的DNA可以与 在包含该DNA分子的细胞中具备功能的启动子可操作连接，以启动或增强编 码的能够形成dsRNA分子的RNA的转录。在一个实施方案中，至少一个(例 如，一个、两个、三个、或更多个)DNA序列可衍生自SEQ ID NO:1的多核 苷酸。SEQ ID NO:1的衍生物包括SEQ ID NO:1的片段。在一些实施方案中， 这样的片段可包含例如SEQ ID NO:1或其互补物的至少15个连续核苷酸。因 此，这样的片段可包含，例如，SEQ ID NO:1的15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、 110、120、130、140、150、160、170、180、190、200个或更多个连续核苷 酸，或其互补物。在一些实例中，这样的片段可包含，例如，SEQ ID NO:1 的至少19个连续核苷酸(例如，19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、或30个连续核苷酸)，或其互补物。
一些实施方案包括将部分或完全稳定化的dsRNA分子导入半翅目害虫 中以抑制半翅目害虫的细胞、组织或器官中靶基因的表达。当表达为iRNA 分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)并被半翅目害虫 摄取时，包含SEQ ID NO:1的一个或多个片段(例如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)的多核苷酸以及其互补物可以引起下列一项或多项：半翅目害虫的死 亡、发育停止、生长抑制、性别比变化、产卵量(brood size)减少、感染停止、和/或进食停止。在具体实例中，包含SEQ ID NO:1的一个或多个片段的多核 苷酸(例如，包含约15个至约300个核苷酸的多核苷酸)及其互补物引起现有世 代的害虫产生下一代害虫的能力降低。
在某些实施方案中，本发明提供的dsRNA分子包含与来自包含SEQ ID NO:1的靶基因的转录物互补的多核苷酸；和/或与SEQ ID NO:1的片段互补的 多核苷酸，所述靶基因在半翅目害虫中的抑制导致对于该害虫或该害虫的后 代的生长、发育、或其他生物学功能必需的多肽或多核苷酸物质的减少或消 除。选择的多核苷酸可以与下列各项展现出约80％到约100％序列同一性： SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的连续片段；或前述任一者的互补物。例如， 选择的多核苷酸可以与下列各项展现出79％、80％、约81％、约82％、约83％、 约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、 约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约98.5％、约99％、约 99.5％、或约100％的序列同一性：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的连续片段； 或前述任一者的互补物。
在一些实施方案中，能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制靶 基因表达的DNA分子可以包含与存在于一个或多个靶半翅目害虫物种中的 天然多核苷酸的全部或部分特异性地互补的单个多核苷酸，或者DNA分子可 以是从多个这样的特异性互补的多核苷酸构建而成的嵌合体。
在其他实施方案中，核酸分子可以包含以“接头”分开的第一和第二多核 苷酸。接头可以是任何包含促进第一和第二多核苷酸之间的二级结构形成 (在期望的情况下)的核苷酸序列的区域。在一个实施方案中，接头是mRNA 的有义或反义编码多核苷酸的一部分。或者，接头可以包含能够与核酸分子 可操作连接的核苷酸或其同源物的任何组合。在一些实例中，接头可以包含 内含子(例如ST-LS1内含子)。
例如，在一些实施方案中，DNA分子可以包含编码一种或多种不同iRNA 分子的多核苷酸，其中每种不同iRNA分子包含第一多核苷酸和第二多核苷 酸，其中第一和第二多核苷酸彼此互补。第一和第二多核苷酸在RNA分子内 可以通过间隔子连接。间隔子可以构成第一多核苷酸或第二多核苷酸的一部 分。包含第一和第二核苷酸多核苷酸的RNA分子的表达可以通过第一和第二 核苷酸多核苷酸的特异性分子内碱基配对而导致本发明的dsRNA分子的形 成。第一多核苷酸或第二多核苷酸可以与对于半翅目害虫而言天然的多核苷 酸(例如，靶基因、或转录的非编码多核苷酸)、其衍生物、或其互补多核苷 酸基本上相同。
dsRNA核酸分子包含聚合核糖核苷酸的双链，并且可以包含对磷酸-糖 主链或核苷的修饰。可以适宜调整RNA结构的修饰以使得特异性抑制能够发 生。在一个实施方案中，可以通过普遍存在的酶促过程来修饰dsRNA分子， 以便能够生成siRNA分子。此酶促过程可以利用体外或体内的RNA酶III酶， 如真核生物中的切丁酶。参见Elbashir等人，(2001)Nature 411:494-8；以及 Hamilton和Baulcombe(1999)Science 286(5441):950-2。切丁酶或功能等效的 RNA酶III酶将较大的dsRNA链和/或hpRNA分子切割成较小的寡核苷酸(例如，siRNA)，每个所述寡核苷酸长度为约19-25个核苷酸。由这些酶生成的 siRNA分子具有2到3个核苷酸3’突出端、和5’磷酸和3’羟基末端。由RNA酶III 酶生成的siRNA分子在细胞中解旋，并分成单链RNA。然后，siRNA分子与 从靶基因转录的RNA特异性地杂交，并且这两种RNA分子随后通过固有的细 胞RNA降解机制而被降解。这个过程可以导致由靶生物中的靶基因编码的 RNA的有效降解或消除。结果导致靶向基因的转录后沉默。在一些实施方案中，通过内源RNA酶III酶从异源核酸分子产生的siRNA分子可以有效介导半 翅目害虫中靶基因的下调。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以包括至少一种可被转录成单 链RNA分子的非天然存在的多核苷酸，所述单链RNA分子能够在体内通过分 子间杂交形成dsRNA分子。这样的dsRNA常常进行自组装，并且可以在半翅 目害虫的营养来源中提供，以实现靶基因的转录后抑制。在这些和进一步的 实施方案中，本发明的核酸分子可以包含两种不同的非天然存在的核苷酸序 列，其中每种序列与半翅目害虫中的不同靶基因特异性地互补。当向例如半 翅目害虫以dsRNA分子的形式提供这样的核酸分子时，dsRNA分子抑制害虫 中至少两种不同靶基因的表达。
C.获得核酸分子
可以使用半翅目害虫中的多种多核苷酸作为靶标来设计本发明的核酸 分子，如iRNA和编码iRNA的DNA分子。然而，天然多核苷酸的选择并非是 直截了当的过程。例如，半翅目害虫的天然多核苷酸中仅有少数会是有效的 靶标。例如，特定的天然多核苷酸是否可以被本发明的核酸分子有效下调， 抑或特定的天然多核苷酸的下调是否会对半翅目害虫的生长、存活力、繁殖 和/或生殖具有有害影响，都是无法肯定地预测的。绝大多数的半翅目害虫天 然多核苷酸，如自这些害虫分离的EST，对害虫的生长、存活力、繁殖和/ 或生殖没有有害影响。同样无法预测的是，在可以对半翅目害虫具有有害影 响的天然多核苷酸中哪些能够在重组技术中使用，从而在宿主植物中表达与 这样的天然多核苷酸互补的核酸分子，并且在进食后对害虫造成有害影响， 同时不对宿主植物引起损害。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子(例如，要在半翅目害虫的宿主 植物中提供的dsRNA分子)被选择为靶向这样的cDNA，其编码对于半翅目害 虫生殖和/或发育必需的蛋白质或蛋白质部分(如涉及代谢或分解代谢生物化 学途径、细胞分裂、生殖、能量代谢、胚胎发育、若虫发育、转录调节等的 多肽)。如本文中描述的，靶生物与含有一种或多种dsRNA——所述dsRNA 的至少一个区段与靶害虫生物细胞中产生的RNA的至少一个基本上相同的 区段特异地互补——的组合物接触(例如通过注射或表面接触)，可以导致交 配、产卵、或产生有存活力的后代的能力衰竭或降低。可以使用从半翅目害 虫衍生的多核苷酸(DNA或RNA)来构建对所述害虫的侵染有抗性的植物细 胞。例如，可以转化半翅目害虫的宿主植物(例如，玉米、大豆、或棉属(Gossypium sp.))，使其含有从半翅目害虫衍生的如本文中提供的一种或多种 多核苷酸。转化到宿主中的多核苷酸可以编码一种或多种RNA，其在转化的 宿主内的细胞或生物学流体中形成dsRNA结构，这样，如果/当害虫与转基因 宿主形成营养关系时，就有dsRNA可用。这可以导致害虫细胞中一种或多种 基因表达的阻抑，最终导致生殖和/或发育的抑制。
在替代实施方案中，靶向实质参与半翅目害虫的生长、发育和生殖的基 因。本发明中使用的其他靶基因可以包括例如那些在半翅目害虫的存活力、 运动、迁移、生长、发育、感染性、和进食位置的建立中发挥重要作用的靶 基因。因此，靶基因可以是管家基因或转录因子。另外，本发明中使用的天 然半翅目害虫多核苷酸也可以从植物、病毒、细菌或昆虫基因的同源物(例 如，直向同源物)衍生，所述同源物的功能对于本领域技术人员是已知的， 且其多核苷酸与靶半翅目害虫的基因组中的靶基因可特异性地杂交。通过杂 交鉴定已知核苷酸序列的基因同源物的方法是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，本发明提供了用于获得包含用于产生iRNA(例如， dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)分子的多核苷酸的核酸分子 的方法。一种这样的实施方案包括：(a)对一种或多种靶基因分析其在半翅目 害虫中在dsRNA介导的基因阻抑后的表达、功能和表型；(b)用探针探查cDNA 或gDNA文库，所述探针包含来自靶向的半翅目害虫的多核苷酸的全部或部 分或其同源物，所述靶向的半翅目害虫在dsRNA介导的阻抑分析中展现出改 变的(例如，降低的)生殖或发育表型；(c)鉴定与探针特异性杂交的DNA克隆； (d)分离步骤(b)中鉴定的DNA克隆；(e)对包含步骤(d)中分离的克隆的cDNA 或gDNA片段测序，其中测序的核酸分子包含RNA的全部或大部分或其同源 物；和(f)化学合成基因的全部或大部分、或siRNA、miRNA、hpRNA、mRNA、 shRNA、或dsRNA。
在另外的实施方案中，用于获得包含用于产生大部分的iRNA(例如， dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)分子的多核苷酸的核酸片段 的方法包括：(a)合成第一和第二寡核苷酸引物，其与来自靶向的半翅目害虫 的天然多核苷酸的一部分特异性地互补；和(b)使用步骤(a)的第一和第二寡核 苷酸引物扩增克隆载体中存在的cDNA或gDNA插入物，其中扩增的核酸分子 包含siRNA、miRNA、hpRNA、mRNA、shRNA或dsRNA分子的大部分。
本发明的核酸可以通过多种途径分离、扩增、或产生。例如，可以通过PCR扩增从gDNA或cDNA文库衍生的靶多核苷酸(例如，靶基因或靶转录的 非编码多核苷酸)、或其部分而获得iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、 shRNA、和hpRNA)分子。可以从靶生物提取DNA或RNA，并且可以使用本 领域普通技术人员已知的方法从其制备核酸文库。可使用自靶生物生成的 gDNA或cDNA文库进行靶基因的PCR扩增和测序。可以使用确认的PCR产物 作为体外转录的模板以在最低限度的启动子的情况下生成有义和反义RNA。 或者，可以使用标准化学，如亚磷酰胺化学，通过许多技术(参见，例如Ozaki 等人，(1992)Nucleic AcidsResearch,20:5205-5214；和Agrawal等人，(1990) Nucleic Acids Research,18:5419-5423)，包括使用自动化DNA合成仪(例如， P.E.Biosystems,Inc.(Foster City,Calif.)392或394型DNA/RNA合成仪)的任一 者来合成核酸分子。参见，例如，Beaucage等人，(1992)Tetrahedron,48: 2223-2311；美国专利4,980,460、4,725,677、4,415,732、4,458,066、和4,973,679。 也可以采用备选化学，其生成非天然主链基团，如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯，等等。
本发明的RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、或hpRNA分子可以 由本领域技术人员通过手动或自动反应以化学或酶促方式产生，或者在包含 含有编码RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、或hpRNA分子的多核苷 酸的核酸分子的细胞中体内产生。还可以通过部分或完全有机合成产生RNA， 可以通过体外酶促或有机合成引入任何经修饰的核糖核苷酸。可以通过细胞 RNA聚合酶或噬菌体RNA
聚合酶(例如，T3RNA聚合酶、T7RNA聚合酶、和SP6RNA聚合酶)合 成RNA分子。可用于克隆和表达多核苷酸的表达构建体是本领域中已知的。 参见，例如，国际PCT公开号WO97/32016；及美国专利5,593,874、5,698,425、 5,712,135、5,789,214、和5,804,693。可以在导入细胞中之前纯化化学合成或 通过体外酶促合成合成的RNA分子。例如，可以通过用溶剂或树脂提取、沉 淀、电泳、色谱法、或其组合从混合物纯化RNA分子。或者，可以在不纯化 或最小程度纯化的情况下使用化学合成或通过体外酶促合成而合成的RNA 分子，例如，以避免由于样品加工所致的损失。可以将RNA分子干燥贮存或 溶解在水溶液中。溶液可以含有缓冲剂或盐以促进dsRNA分子双链体链的退 火和/或稳定化。
在具体的实施方案中，可以通过单一自身互补的RNA链或者从两条互补RNA链形成dsRNA分子。dsRNA分子可以在体内或在体外合成。细胞的内源 RNA聚合酶可以在体内介导一条或两条RNA链的转录，或者可以使用克隆的 RNA聚合酶在体内或在体外介导转录。通过宿主器官、组织、或细胞类型中 的特异性转录(例如，通过使用组织特异性启动子进行)；刺激宿主中的环境 条件(例如，通过使用响应于感染、胁迫、温度、和/或化学诱导物的诱导型启动子)；和/或在宿主的某个发育阶段或年龄人工造成转录(例如，通过使用 发育阶段特异性启动子)，在半翅目害虫中靶基因的转录后抑制可以是宿主 靶向性的。形成dsRNA分子的RNA链(不论是体外还是体内转录的)可以是也 可以不是多聚腺苷酸化的，并且可以能够也可以不能被细胞翻译装置翻译成 多肽。
D.重组载体和宿主细胞转化
在一些实施方案中，本发明还提供了用于导入细胞(例如，细菌细胞、 酵母细胞、或植物细胞)中的DNA分子，其中DNA分子包含这样的多核苷酸， 该多核苷酸在表达为RNA并被半翅目害虫摄取后，可实现对害虫的细胞、组 织或器官中靶基因的阻抑。因此，一些实施方案提供了重组核酸分子，其包 含能够在植物细胞中表达为iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、 和hpRNA)分子以抑制半翅目害虫中靶基因表达的多核苷酸。为了启动或增强表达，这样的重组核酸分子可以包含一种或多种调节元件，所述调节元件 可以与能够表达为iRNA的多核苷酸可操作连接。在植物中表达基因阻抑分 子的方法是已知的，并且可以用于表达本发明的多核苷酸。参见，例如，国 际PCT公开号WO06/073727；和美国专利公开号2006/0200878A1)。
在具体的实施方案中，本发明的重组DNA分子可以包含编码可形成 dsRNA分子的RNA的多核苷酸。这样的重组DNA分子可以编码可形成dsRNA 分子的RNA，其被摄取后能够抑制半翅目害虫细胞中内源靶基因的表达。在 许多实施方案中，转录的RNA可以形成dsRNA分子，所述dsRNA分子可以以 稳定化形式提供；例如，以发夹和茎和环结构的形式提供。
在其他实施方案中，dsRNA分子的一条链可以通过从与选自下组的多核 苷酸所编码的RNA基本上同源的多核苷酸转录而形成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补物；SEQ IDNO:1的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO: 1的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:1、3和4中任一 者的半翅目生物(例如BSB)的天然编码多核苷酸；包含SEQ ID NO:1、3和4 中任一者的半翅目生物的天然编码多核苷酸的互补物；包含SEQ IDNO:1、 3和4中任一者的半翅目生物的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的 片段；和包含SEQ ID NO:1、3和4中任一者的半翅目生物的天然编码多核苷 酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。
在特定的实施方案中，编码可形成dsRNA分子的RNA的重组DNA分子可 包含编码区，其中至少两个多核苷酸如此排列，使得相对于至少一个启动子， 一个多核苷酸处于有义取向，另一多核苷酸处于反义取向，其中该有义多核 苷酸和该反义多核苷酸通过间隔子联接或连接，所述间隔子具有，例如，约 5个(～5)至约一千个(～1000)核苷酸。间隔子可以在有义和反义多核苷酸之间 形成环。有义多核苷酸或反义多核苷酸可以与由靶基因(例如，包含SEQ ID NO:1的kruppel基因)或其片段编码的RNA基本上同源。然而，在一些实施方案中，重组DNA分子可以编码可以形成没有间隔子的dsRNA分子的RNA。在 实施方案中，有义编码多核苷酸和反义编码多核苷酸可以是不同的长度。
通过在本发明的重组核酸分子中创建适当的表达盒，可以容易地将鉴定 为对半翅目害虫具有有害影响或具有针对半翅目害虫的植物保护效果的多 核苷酸掺入表达的dsRNA分子中。例如，可以通过如下步骤将这样的多核苷 酸表达为具有茎和环结构的发夹：采用对应于靶基因多核苷酸(例如，包含 SEQ ID NO:1的kruppel基因、及前述任一者的片段)编码的RNA的第一区段， 将此多核苷酸与第二区段间隔子区连接，所述第二区段间隔子区与第一区段 不是同源或互补的；并将这与第三区段连接，其中第三区段的至少一部分与第一区段基本上互补。这样的构建体通过第一区段与第三区段的分子内碱基 配对而形成茎和环结构，其中环结构形式包含第二区段。参见，例如，美国 专利公开文本2002/0048814和2003/0018993；以及国际PCT公开文本 WO94/01550和WO98/05770。可以例如以双链结构诸如茎环结构(例如，发夹) 形式生成dsRNA分子，由此通过共表达靶基因的片段(例如在另外的植物表 达盒上的靶基因的片段)增强靶向天然半翅目害虫多核苷酸的siRNA的产生，这可导致siRNA产生增强，或者降低甲基化以防止dsRNA发夹启动子的转录 基因沉默。
本发明的特定实施方案包括将本发明的重组核酸分子导入植物中(即， 转化)以实现一种或多种iRNA分子的抑制半翅目害虫水平的表达。重组DNA 分子可以例如是载体，如线性或闭合环状质粒。载体系统可以是单一载体或 质粒，或者共同含有要导入宿主基因组中的总DNA的两个或更多个载体或质 粒。另外，载体可以是表达载体。可以例如将本发明的核酸适当地插入载体 中，在一种或多种宿主中发挥功能以驱动连接的编码多核苷酸或其他DNA 元件表达的合适启动子控制下。许多载体可用于此目的，适当载体的选择主 要将取决于要插入载体中的核酸的大小和要用载体转化的特定宿主细胞。每 种载体含有不同的组分，根据其功能(例如，DNA扩增或DNA表达)及与其相 容的特定宿主细胞而定。
为了对转基因植物赋予对半翅目害虫的保护，例如可以在重组植物的组 织或流体内将重组DNA转录成iRNA分子(例如，形成dsRNA分子的RNA分 子)。iRNA分子可包含与可引起宿主植物物种损害的半翅目害虫内的相应转 录多核苷酸基本上同源且可特异性杂交的多核苷酸。例如，半翅目害虫可以 通过摄取包含iRNA分子的转基因宿主植物的细胞或流体而接触在转基因宿 主植物细胞中转录的iRNA分子。因此，靶基因的表达在侵染转基因宿主植 物的半翅目害虫内受到iRNA分子阻抑。在一些实施方案中，对靶半翅目害 虫中靶基因表达的阻抑可以导致植物耐受害虫攻击。
为了使iRNA分子能够被投送给与已经用本发明的重组核酸分子转化的 植物细胞存在营养关系的半翅目害虫，需要在植物细胞中表达(即，转录) iRNA分子。因此，重组核酸分子可以包含与一种或多种调节元件(诸如在宿 主细胞中发挥功能的异源启动子元件)可操作连接的本发明的多核苷酸，所 述宿主细胞诸如其中要扩增核酸分子的细菌细胞，或其中要表达核酸分子的 植物细胞。
适合于用于本发明的核酸分子的启动子包括诱导型、病毒的、合成的、 或组成型的那些启动子，它们都是本领域中熟知的。描述这样的启动子的非 限制性实例包括美国专利6,437,217(玉米RS81启动子)；5,641,876(水稻肌动蛋 白启动子)；6,426,446(玉米RS324启动子)；6,429,362(玉米PR-1启动子)； 6,232,526(玉米A3启动子)；6,177,611(组成型玉米启动子)；5,322,938、 5,352,605、5,359,142、和5,530,196(CaMV 35S启动子)；6,433,252(玉米L3油 质蛋白启动子)；6,429,357(水稻肌动蛋白2启动子和水稻肌动蛋白2内含子)； 6,294,714(光诱导型启动子)；6,140,078(盐诱导型启动子)；6,252,138(病原体诱导型启动子)；6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)；6,388,170(双向启动子)；6,635,806(γ薏苡辛(coixin)启动子)；及美国专利公开号2009/757,089(玉米叶绿 体醛缩酶启动子)。其他启动子包括胆脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert等人， (1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16):5745-9)和章鱼碱合酶(OCS)启动子 (两者都在根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒上携带)；花椰菜花叶病毒组 (caulimovirus)启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人， (1987)Plant Mol.Biol.9:315-24)；CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313:810-2；玄参花叶病毒35S启动子(Walker等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84(19):6624-8)；蔗糖合酶启动子(Yang和Russell(1990)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 87:4144-8)；R基因复合物启动子(Chandler等人，(1989)PlantCell 1:1175-83)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；CaMV 35S(美国专利5,322,938、 5,352,605、5,359,142、和5,530,196)；FMV 35S(美国专利6,051,753和5,378,619)； PCl SV启动子(美国专利5,850,019)；SCP1启动子(美国专利6,677,503)；和 AGRtu.nos启动子(GENBANKTM登录号V00087；Depicker等人，(1982)J.Mol. Appl.Genet.1:561-73；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7)。
在特定的实施方案中，本发明的核酸分子包含组织特异性启动子，如叶 特异性启动子或花粉特异性启动子。在一些实施方案中，可以在两个组织特 异性启动子之间克隆依照本发明的用于半翅目害虫控制的多核苷酸或片段， 所述组织特异性启动子相对于所述多核苷酸或片段以相反的转录方向排布， 在转基因植物细胞中可操作，并且在转基因植物细胞中表达以在转基因植物 细胞中产生RNA分子，RNA分子随后可形成dsRNA分子，如上文所述。半翅 目害虫可以摄取植物组织中表达的iRNA分子，从而实现对靶基因表达的阻 抑。
其他可任选地与感兴趣核酸分子可操作连接的调节元件包括5'UTR， 5'UTR作为位于启动子元件和编码多核苷酸之间的翻译前导元件发挥功能。 翻译前导元件存在于完全加工的mRNA中，并且其可以影响初级转录物的加 工和/或RNA的稳定性。翻译前导元件的例子包括玉米和矮牵牛热休克蛋白 前导序列(美国专利No.5,362,865)、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物rubisco 前导序列等。参见，例如，Turner和Foster(1995)MolecularBiotech.3(3):225-36。 5'UTR的非限制性实例包括GmHsp(美国专利No.5,659,122)；PhDnaK(美国专 利5,362,865)；AtAnt1；TEV(Carrington和Freed(1990)J.Virol.64:1590-7)； 和AGRtunos(GenBankTM登录号V00087；和Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7)。
其他任选地与感兴趣核酸分子可操作连接的调节元件还包括3'非翻译元 件、3'转录终止区、或多腺苷酸化区。这些是位于多核苷酸下游的遗传元件， 并且包括提供多腺苷酸化信号、和/或能够影响转录或mRNA加工的其他调节 信号的多核苷酸。多腺苷酸化信号在植物中发挥功能，导致多腺苷酸化的核 苷酸被添加至mRNA前体的3'端。多腺苷酸化元件可以源自多种植物基因或 T-DNA基因。3'转录终止区的一个非限制性实例是胆脂碱合酶3'区(nos 3'； Fraley等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)。在Ingelbrecht等人， (1989)Plant Cell 1:671 80中提供了使用不同3'非翻译区的实例。多腺苷酸化 信号的非限制性实例包括来自豌豆RbcS2基因的信号(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi 等人，(1984)EMBO J.3:1671-9)和AGRtu.nos(GENBANKTM登录号E01312)。
一些实施方案可以包括植物转化载体，该植物转化载体包含分离纯化的 DNA分子，该DNA分子包含与本发明的一种或多种多核苷酸可操作连接的 至少一种上文描述的调节元件。在表达时，一种或多种多核苷酸生成一种或 多种包含多核苷酸的iRNA分子，所述多核苷酸与半翅目害虫中的天然RNA 分子的全部或部分特异性地互补。因此，多核苷酸可以包含编码靶向的半翅 目害虫RNA转录物内存在的多核糖核苷酸的全部或部分的区段，并且可以包 含被靶向的害虫转录物的全部或部分的反向重复。植物转化载体可以含有与 超过一种靶多核苷酸特异性互补的多核苷酸，由此容许产生超过一种dsRNA 以抑制靶半翅目害虫的一个或多个群体或物种的细胞中两种或更多种基因 的表达。可以将与不同基因中存在的多核苷酸特异性互补的多核苷酸区段组 合成单一复合核酸分子，以便在转基因植物中表达。这样的区段可以是连续 的或者由间隔子分开。
在其他实施方案中，可以通过在同一质粒中依次插入另外的多核苷酸来 修饰已经含有本发明的至少一个多核苷酸的本发明质粒，其中所述另外的多 核苷酸与原有的至少一个多核苷酸可操作连接于相同的调节元件。在一些实 施方案中，核酸分子可以设计为抑制多种靶基因。在一些实施方案中，要抑 制的多种基因可以获自相同的半翅目害虫物种，这样做可以增强核酸分子的 有效性。在其他实施方案中，基因可以来自不同的半翅目害虫，这样可以拓 宽药剂有效的害虫的范围。当靶向多种基因以实现阻抑、或表达和阻抑的组 合时，可以工程化多顺反子DNA元件。
本发明的重组核酸分子或载体可以包含赋予转化的细胞，诸如植物细胞 可选择表型的选择标志物。也可以使用选择标志物来选择包含本发明的重组 核酸分子的植物或植物细胞。标志物可以编码杀生物剂抗性、抗生素抗性(例 如，卡那霉素、遗传霉素(G418)、博来霉素、潮霉素，等等)、或除草剂耐受 性(例如，草甘膦等)。选择标志物的实例包括但不限于编码卡那霉素抗性并 且可以使用卡那霉素、G418等选择的neo基因；编码双丙氨磷抗性的bar基因； 编码草甘膦耐受性的突变体EPSP合酶基因；赋予对溴苯腈的抗性的腈水解酶 基因；赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变体乙酰乳酸合酶基因(ALS)；和甲 氨蝶呤抗性DHFR基因。可用多种选择标志物，其赋予对氨苄青霉素、博来 霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、膦丝 菌素、嘌呤霉素、大观霉素、利福平、链霉素和四环素等的抗性。这样的选 择标志物的实例展示于，例如美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708和 6,118,047。
本发明的重组核酸分子或载体还可以包含可筛选标志物。可以使用可筛 选标志物来监测表达。示例性筛选标志物包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因 (GUS)，其编码已知的多种生色底物的酶(Jefferson等人，(1987)Plant Mol.Biol. Rep.5:387-405)；R基因座基因，其编码调节植物组织中花色素苷色素(红色) 产生的产物(Dellaporta等人，(1988)"Molecular cloning of the maize R nj allele by transposon tagging with Ac."收录于18th Stadler Genetics Symposium,P. Gustafson和R.Appels编辑，(New York:Plenum),pp.263-82)；β-内酰胺酶基 因(Sutcliffe等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3737-41)；编码已知的 多种生色底物的酶(例如，PADAC，一种生色头孢菌素)的基因；萤光素酶基 因(Ow等人，(1986)Science 234:856-9)；xylE基因，其编码能转化生色儿茶 酚的儿茶酚双加氧酶(Zukowski等人，(1983)Gene 46(23):247-55)；淀粉酶基 因(Ikatu等人，(1990)Bio/Technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其编码能够将酪 氨酸氧化为DOPA和多巴醌(dopaquinone)(其继而缩合成黑色素)的酶(Katz等 人，(1983)J.Gen.Microbiol.129:2703-14))；和α-半乳糖苷酶。
在一些实施方案中，在用于创建转基因植物和在植物中表达异源核酸的 方法中，可以使用如上文所描述的重组核酸分子来制备表现出对半翅目害虫 的易感性降低的转基因植物。例如，可以通过将编码iRNA分子的核酸分子 插入植物转化载体中，并将这些导入植物中来制备植物转化载体。
用于宿主细胞转化的适合方法包括任何能将DNA导入细胞中的方法，如 通过原生质体转化(参见，例如，美国专利5,508,184)，通过干燥/抑制介导的 DNA摄取(参见，例如，Potrykus等人.(1985)Mol.Gen.Genet.199:183-8)，通过 电穿孔(参见，例如，美国专利5,384,253)，通过用碳化硅纤维搅拌(参见，例 如，美国专利5,302,523和5,464,765)，通过土壤杆菌介导的转化(参见，例如， 美国专利5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840；和6,384,301)， 以及通过加速DNA包被的颗粒(参见，例如，美国专利5,015,580、5,550,318、 5,538,880、6,160,208、6,399,861、和6,403,865)，等。特别可用于转化玉米 的技术描述于例如美国专利7,060,876和5,591,616；以及国际PCT公开 WO95/06722中。通过应用诸如此类的这些技术，几乎任何物种的细胞都可 被稳定转化。在一些实施方案中，转化DNA被整合到宿主细胞的基因组中。 在多细胞物种的情况下，转基因细胞可再生为转基因生物。可以使用任何这 些技术来产生转基因植物，例如在转基因植物的基因组中包含编码一种或多 种iRNA分子的一种或多种核酸。
用于将表达载体导入植物中的广泛使用的方法是基于土壤杆菌的天然 转化系统。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌是将植物细胞遗传转化的植物致病 性土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物 遗传转化的基因。Ti(诱导肿瘤)质粒含有被称为T-DNA的大片段，其被转移 到转化的植物中。Ti质粒的另一个片段，Vir区，负责T-DNA的转移。T-DNA 区的边界为末端重复序列。在修饰的二元载体中，肿瘤诱导基因已缺失，Vir 区的功能用于转移以T-DNA边界元件为界的外来DNA。T区还可含有用于转 基因细胞和植物有效恢复的选择标志物、以及插入用于转移诸如编码核酸的 dsRNA之类多核苷酸的多克隆位点。
在一些实施方案中，植物转化载体来源于根癌土壤杆菌的Ti质粒(参见， 例如，美国专利4,536,475、4,693,977、4,886,937、和5,501,967；以及欧洲专 利No.EP 0 122 791)或发根土壤杆菌的Ri质粒。其他的植物转化载体包括， 例如但不限于，由Herrera-Estrella等人，(1983)Nature 303:209-13；Bevan等 人，(1983)Nature 304:184-7；Klee等人，(1985)Bio/Technol.3:637-42；以及 在欧洲专利No.EP 0 120 516中所描述的那些载体，以及从任何前述文献来源 的那些载体。可以修饰天然地与植物相互作用的其他细菌，如中华根瘤菌属、 根瘤菌属、和中慢生根瘤菌属，以介导到许多各种各样的植物中的基因转移。 通过获取卸甲Ti质粒和适合的二元载体，可以使这些植物相关的共生细菌能 够胜任基因转移。
在提供外源DNA到受体细胞之后，通常鉴定出转化的细胞用于进一步培 养和植物再生。为了提高鉴定转化细胞的能力，人们可能期望采用如前提出 的选择或筛选标志物基因，与用来再生转化体的转化载体一道使用。在采用 选择标志物的情况下，通过使细胞暴露于选择剂或药剂，鉴定出在潜在转化 的细胞群中的转化细胞。在采用筛选标志物的情况下，可针对期望的标志物 基因性状来筛选细胞。
暴露于选择剂后存活的细胞、或者在筛选测定中已被评分为阳性的细胞， 可以在支持植物再生的介质中进行培养。在一些实施方案中，可通过包含其 他物质，如生长调节剂来改良任何适合的植物组织培养基(例如，MS和N6培 养基)。可将组织维持在具有生长调节剂的基本培养基上，直到可得到足够 的组织用于启动植物再生工作时为止，或者在重复多轮的手动选择之后，直 到组织形态适合于再生时为止(例如，至少2周)，然后转移到有助于芽形成的 介质中。定期转移培养物，直到已经出现充分的芽形成时为止。一旦形成芽，将它们转移到有助于根形成的介质中。一旦形成足够的根，可将植物转移到 土壤中，以便进一步生长和成熟。
为了证实再生植物中感兴趣核酸分子(例如，编码一种或多种iRNA分子 的DNA，所述iRNA分子抑制半翅目害虫中的靶基因表达)的存在，可以进行 多种测定法。这样的测定法例如包括：分子生物学测定，如Southern和northern 印迹、PCR、和核酸测序；生物化学测定，如检测蛋白质产物的存在，例如 通过免疫学手段(ELISA和/或western印迹)或借助于酶功能；植物部分测定， 如叶或根测定；和再生的全植物的表型分析。
可例如通过使用对感兴趣核酸分子特异的寡核苷酸引物进行PCR扩增 来分析整合事件。PCR基因分型应当理解为包括但不限于，来源于分离的宿 主植物愈伤组织的gDNA的聚合酶链反应(PCR)扩增，所述愈伤组织预期含有 整合到基因组中的感兴趣核酸分子，然后进行标准克隆和PCR扩增产物的序 列分析。PCR基因分型方法已被很好地描述(例如Rios,G等人，(2002)Plant J. 32:243-53)，并可应用于来源于任何植物物种(例如，玉米、大豆或棉属)或组 织类型(包括细胞培养物)的gDNA。
采用依赖于土壤杆菌的转化方法形成的转基因植物一般含有插入一个 染色体中的单个重组DNA。该单个重组DNA的多核苷酸被称为“转基因事件” 或“整合事件”。这样的转基因植物对于插入的外源多核苷酸而言是杂合的。 在一些实施方案中，通过含有单个外源基因的独立分离的转基因植物与自身 (例如T0植物)有性交配(自交)以产生Tl种子，可获得相对于转基因为纯合的 转基因植物。所产生的Tl种子的四分之一相对于所述转基因是纯合的。萌发 Tl种子产生的植物可用于测试杂合性，所述测试一般使用SNP测定或热扩增测定，使得允许在杂合子和纯合子之间进行区分(即，接合型测定)。
在特定的实施方案中，在植物细胞中产生具有抑制半翅目害虫效果的至 少2、3、4、5、6、7、8、9种或10种或更多种不同iRNA分子。可以从引入 不同转化事件中的多种核酸、或从引入单一转化事件中的单一核酸表达 iRNA分子(例如，dsRNA分子)。在一些实施方案中，在单一启动子的控制下 表达多个iRNA分子。在其他实施方案中，在多个启动子的控制下表达多个 iRNA分子。可以表达包含多个多核苷酸的单一iRNA分子，所述多核苷酸各 自与在相同半翅目害虫物种的不同群体中或在不同的半翅目害虫物种中的 一个或多个半翅目害虫内的不同基因座(例如，由SEQ ID NO:1定义的基因座) 同源。
除了用重组核酸分子直接转化植物之外，可通过使具有至少一个转基因 事件的第一植物与缺乏这种事件的第二植物杂交来制造转基因植物。例如， 可将包含编码iRNA分子的多核苷酸的重组核酸分子导入易于转化的第一植 物品系中而产生转基因植物，其中转基因植物可与第二植物品系杂交而使编 码iRNA分子的多核苷酸渗入到第二植物品系中。
本发明还包括含有本发明的一种或多种多核苷酸的商业产品。具体的实 施方案包括自含有本发明一种或多种多核苷酸的重组植物或种子产生的商 业产品。包含本发明的一种或多种多核苷酸的商业产品意在包括，但不限于： 植物的粕、油类、碾碎的或完整的籽粒或种子，或包含含有本发明的一种或 多种多核苷酸的重组植物或种子的任何粕、油、或碾碎的或完整的籽粒的任 何食物产品。在一种或多种商品或商业产品中检出本发明的一种或多种多核 苷酸，事实上证明该商品或商业产品是由为了利用dsRNA介导的基因阻遏方 法来控制植物害虫的目的被设计为表达本发明的一种或多种多核苷酸的转 基因植物生产的。
在一些方面，包括由自转化的植物细胞衍生的转基因植物产生的种子和 商业产品，其中种子或商业产品包含可检出量的本发明的核酸。在一些实施 方案中，例如，可以通过获得转基因植物并从它们制备食物或饲料来生产这 样的商业产品。包含本发明的一种或多种多核苷酸的商业产品包括例如但不 限于：植物的粕、油类、碾碎的或完整的籽粒或种子，和包含含有本发明的 一种或多种核酸的重组植物或种子的任何粕、油、或碾碎的或完整的籽粒的 任何食物产品。在一种或多种商品或商业产品中检出本发明的一种或多种多 核苷酸，事实上证明该商品或商业产品是由为了控制半翅目害虫的目的被设 计为表达本发明的一种或多种iRNA分子的转基因植物生产的。
在一些实施方案中，包含本发明核酸分子的转基因植物或种子也可在其 基因组中包含至少一个其他的转基因事件，包括但不限于：自其转录靶向半 翅目害虫中的基因座的iRNA分子的转基因事件，所述基因座不同于由SEQ ID NO:1定义的基因座；自其转录靶向与半翅目害虫不同的生物(例如，植物 寄生性线虫)中的基因的iRNA分子的转基因事件；编码杀虫蛋白(例如，苏云 金芽孢杆菌杀虫蛋白)的基因；除草剂耐受基因(例如提供对草甘膦耐受性的 基因)；以及促成转基因植物中的期望表型的基因，所述期望表型例如产量 增加、脂肪酸代谢改变、或细胞质雄性不育的恢复。在特定的实施方案中， 可以在植物中将编码本发明iRNA分子的多核苷酸与其他昆虫控制和疾病性 状组合以实现增强的植物疾病和昆虫损害控制的期望性状。例如，由于对所 述性状的抗性的概率在田间将发生降低，组合采用独特作用模式的昆虫控制 性状可以对受保护的转基因植物提供优越的持久性，该持久性优于含有单一 控制性状的植物。
V.半翅目害虫中的靶基因阻抑
A.概述
在本发明的一些实施方案中，可以针对半翅目害虫提供至少一种可用于 控制半翅目害虫的核酸分子，其中所述核酸分子在所述害虫中导致RNAi介 导的基因沉默。在特定的实施方案中，可以给半翅目宿主提供iRNA分子(例 如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)。在一些实施方案中， 通过使可用于控制半翅目害虫的核酸分子与该害虫接触，可以针对该害虫提 供所述核酸分子。在这些和进一步的实施方案中，可以在害虫的进食基质， 例如营养组合物中提供可用于控制半翅目害虫的核酸分子。在这些和进一步 的实施方案中，可以通过摄取被半翅目害虫摄取的包含可用于控制半翅目害 虫的核酸分子的植物材料来提供所述核酸分子。在某些实施方案中，核酸分 子通过表达导入植物材料中的重组核酸而存在于植物材料中，所述导入例如 通过用包含重组核酸的载体转化植物细胞，并从转化的植物细胞再生植物材 料或全植物来进行。
B.RNAi介导的靶基因阻抑
在特定实施方案中，本发明提供了iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、 miRNA、shRNA、和hpRNA)，可以设计此类分子使之靶向半翅目(例如BSB) 害虫的转录组中的必需天然靶多核苷酸(例如，必需基因)，例如设计有至少 一条链包含与靶多核苷酸特异性互补的多核苷酸的iRNA分子。如此设计的 iRNA分子的序列可以与靶多核苷酸相同，或者可以含有不会阻止iRNA分子 与其靶多核苷酸之间的特异性杂交的错配。
本发明的iRNA分子可以在用于半翅目害虫中基因阻抑的方法中使用， 由此降低由害虫对植物(例如，包含iRNA分子的受保护的转化植物)引起的损 害水平或发生率。如本文中使用的，术语“基因阻抑”是指用于降低由于基因 转录成mRNA及随后mRNA翻译而产生的蛋白质水平的任何公知方法，包括 降低基因或编码多核苷酸的蛋白质表达，包括转录后抑制表达和转录阻抑。 通过从靶向阻抑的基因转录的mRNA的全部或部分与用于阻抑的相应iRNA 分子之间的特异性同源性而介导转录后抑制。另外，转录后抑制是指通过核 糖体结合的细胞中可用的mRNA量的实质性且可测量的降低。
在其中RNAi分子是dsRNA分子的某些实施方案中，切丁酶这种酶可以 将dsRNA分子切割成短siRNA分子(大约20个核苷酸长)。借助于切丁酶对 dsRNA分子的活性而生成的双链siRNA分子可以分成两个单链siRNA：“乘客 链”和“引导链”。乘客链可以被降解，而引导链可以掺入RISC中。通过引导 链与mRNA分子的特异性互补多核苷酸的特异性杂交，随后通过酶Argonaute (RISC复合物的催化组分)切割而发生转录后抑制。
在本发明的其他实施方案中，可以使用任何形式的iRNA分子。本领域 技术人员会理解的是，在制备过程中及在对细胞提供iRNA分子的步骤过程 中，dsRNA分子一般比单链RNA分子更稳定，并且一般在细胞中也是更稳定 的。因此，例如，虽然在一些实施方案中siRNA和miRNA分子可能是同等有 效的，但是dsRNA分子可以由于其稳定性而被选用。
在特定的实施方案中，提供了包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸 可以在体外表达以产生iRNA分子，所述iRNA分子与由半翅目害虫基因组内 的多核苷酸编码的核酸分子基本上同源。在某些实施方案中，体外转录的 iRNA分子可以是包含茎环结构的稳定化的dsRNA分子。在半翅目害虫接触 体外转录的iRNA分子后，可以发生对该害虫中靶基因(例如，必需基因)的转 录后抑制。
在本发明的一些实施方案中，在用于半翅目害虫中靶基因的转录后抑制 的方法中，利用包含多核苷酸的至少15个连续核苷酸(例如至少19个连续核 苷酸)的核酸分子表达iRNA，其中所述多核苷酸选自下组：SEQ ID NO:1； SEQ ID NO:1的互补物；SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸的片段(例如 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)；SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸的片段 的互补物；包含SEQ ID NO:1、3、4中任一者的半翅目生物的天然编码多核 苷酸；包含SEQ ID NO:1、3、4中任一者的半翅目生物的天然编码多核苷酸 的互补物；包含SEQ ID NO:1、3、4中任一者的半翅目生物的天然编码多核 苷酸的至少15个连续核苷酸的片段；以及包含SEQ ID NO:1、3、4中任一者 的半翅目生物的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。 在某些实施方案中，可以使用与前述任一项至少约80％相同(例如，79％、 约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、 约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、 约98％、约99％、约100％、和100％)的核酸分子的表达。在这些和进一步的 实施方案中，可以表达这样的核酸分子，其与半翅目害虫的至少一个细胞中 存在的RNA分子特异性杂交。
本文中的一些实施方案的重要特征在于，RNAi转录后抑制系统能够容 忍靶基因中预期由于遗传突变、株系多态性、或进化趋异而可能发生的序列 变异。导入的核酸分子可以不必与靶基因的初级转录产物或完全加工的 mRNA绝对同源，只要导入的核酸分子与靶基因的初级转录产物或完全加工 的mRNA可特异性杂交即可。而且，相对于靶基因的初级转录产物或完全加 工的mRNA，导入的核酸分子可以不必是全长的。
使用本发明的iRNA技术抑制靶基因是序列特异性的；即，靶向与iRNA 分子基本上同源的多核苷酸进行遗传抑制。在一些实施方案中，可以使用包 含具有与靶基因的一部分相同的核苷酸序列的多核苷酸的RNA分子进行抑 制。在这些和进一步的实施方案中，可以使用包含相对于靶多核苷酸具有一 个或多个插入、缺失和/或点突变的多核苷酸的RNA分子。在特定的实施方 案中，iRNA分子和靶基因的一部分可以共享例如至少约80％、至少约81％、 至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、 至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、 至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、 至少约100％、和100％的序列同一性。或者，dsRNA分子的双链体区可以与 靶基因转录物的一部分可特异性地杂交。在可特异性杂交的分子中，展现出 较大同源性的小于全长的多核苷酸可补偿较长的、同源性较低的多核苷酸。 dsRNA分子的双链体区中与靶基因转录物的一部分相同的多核苷酸的长度 可以是至少约25、50、100、200、300、400、500个、或至少约1000个碱基。 在一些实施方案中，可以使用大于20-100个核苷酸的多核苷酸；例如，可以 使用100-200个或300-500个核苷酸的多核苷酸。在特定的实施方案中，可以 使用大于约200-300个核苷酸的多核苷酸。在特定的实施方案中，根据靶基 因的大小，可以使用大于约500-1000个核苷酸的多核苷酸。
在某些实施方案中，可以将半翅目害虫中靶基因的表达在害虫细胞内抑 制至少10％；至少33％；至少50％；或至少80％，使得发生显著抑制。显著 抑制是指高于阈值的抑制，所述抑制导致可检出的表型(例如，生殖、进食、 发育的停止，等等)，或与所抑制的靶基因对应的RNA和/或基因产物的可检 出降低。虽然在本发明的某些实施方案中，在害虫的基本上所有细胞中均发 生抑制，但在其他实施方案中，仅在表达靶基因的细胞的一个子集中发生抑 制。
在一些实施方案中，细胞中的转录阻抑由细胞中展现出与启动子DNA 或其互补物的实质性序列同一性的dsRNA分子的存在所介导，从而产生所谓 的“启动子反式阻抑”。基因阻抑可以在可以摄取或接触此类dsRNA分子的半 翅目害虫中针对靶基因发挥效果，例如通过害虫摄取或接触含有dsRNA分子 的植物材料。在启动子反式阻抑中使用的dsRNA分子可以特异性地设计为抑 制或阻抑半翅目害虫细胞中一种或多种同源或互补多核苷酸的表达。美国专 利5,107,065；5,759,829；5,283,184；和5,231,020中公开了通过反义或有义取向的RNA进行转录后基因阻抑以调节植物细胞中的基因表达。
C.对半翅目害虫提供的RNAi分子的表达
可以许多体外或体内形式的任一种进行表达用于在半翅目害虫中RNAi 介导的基因抑制的iRNA分子。然后，可以对半翅目害虫提供iRNA分子，例 如通过使iRNA分子与害虫接触，或通过引起害虫摄取或以别的方式内在化 iRNA分子。本发明的一些实施方案包括半翅目害虫的经转化的宿主植物、 经转化的植物细胞、和经转化的植物的后代。经转化的植物细胞和经转化的 植物可以工程化改造为，例如，在异源启动子控制下表达一种或多种iRNA 分子，以提供害虫防护效果。因此，当在昆虫害虫在进食期间食用转基因植 物或植物细胞时，害虫可以摄取转基因植物或细胞中表达的iRNA分子。也 可以将本发明的多核苷酸导入广泛而多样的原核和真核微生物宿主中以产 生iRNA分子。术语“微生物”包括原核和真核物种，如细菌和真菌。
基因表达的调变可以包括对此类表达的部分或完全阻抑。在另一个实施 方案中，用于阻抑半翅目害虫中基因表达的方法包括在害虫宿主的组织中提 供基因阻抑量的至少一种如本文中所描述的多核苷酸在转录后形成的 dsRNA分子，其至少一个区段与半翅目害虫细胞内的mRNA互补。根据本发 明的半翅目害虫所摄取的dsRNA分子，包括其修饰的形式，如siRNA、miRNA、 shRNA、或hpRNA分子，可以与转录自kruppel DNA分子的RNA分子至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或约100％相同，所述DNA 分子包含例如选自下组的多核苷酸：SEQ ID NO:1、3、和4。因此，提供了 用于制备本发明的dsRNA分子的分离的且基本上纯化的核酸分子，包括但不 限于非天然存在的多核苷酸和重组DNA构建体，其在导入半翅目害虫时阻抑 或抑制其中的内源编码多核苷酸或靶编码多核苷酸的表达。
特定的实施方案提供了用于投送iRNA分子以转录后抑制半翅目植物害 虫中的一种或多种靶基因并控制该植物害虫群体的投送系统。在一些实施方 案中，所述投送系统涉及包括对宿主转基因植物细胞或包含在宿主细胞中转 录的RNA分子的宿主细胞内容物的摄取。在这些和进一步的实施方案中，创 建转基因植物细胞或转基因植物，其含有可提供本发明的稳定化dsRNA分子 的重组DNA构建体。包含编码特定iRNA分子的核酸的转基因植物细胞和转 基因植物可以如下产生：采用重组DNA技术(这些基础技术是本领域中熟知的)构建包含编码本发明的iRNA分子(例如，稳定化的dsRNA分子)的多核苷 酸的植物转化载体；以此转化植物细胞或植物；并以此生成含有转录的iRNA 分子的转基因植物细胞或转基因植物。
为了对转基因植物赋予针对半翅目害虫的保护，可以例如将重组DNA 分子转录成iRNA分子，如dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA 分子、或hpRNA分子。在一些实施方案中，从重组DNA分子转录的RNA分 子可以在重组植物的组织或流体内形成dsRNA分子。这样的dsRNA分子可以 包含在多核苷酸的一部分中，所述多核苷酸与转录自可侵染宿主植物的类型 的半翅目害虫内的DNA的相应多核苷酸相同。半翅目害虫内靶基因的表达被 所述dsRNA分子所阻抑，并且该半翅目害虫中靶基因表达的阻抑导致该转基 因植物对该害虫有抗性。已经显示dsRNA分子的调控作用可适用于害虫中表 达的多种基因，包括例如负责细胞分裂、染色质重塑、以及细胞代谢或细胞 转化的内源基因，包括管家基因；转录因子；蜕皮相关基因；和编码涉及细 胞代谢或正常生长和发育的多肽的其他基因。
为了从体内转基因或表达构建体转录，可以在一些实施方案中使用调节 区(例如，启动子、增强子、沉默子、和多聚腺苷酸化信号)以转录一条或多 条RNA链。因此，在一些实施方案中，如上文提出的，在产生iRNA分子中 使用的多核苷酸可以与在植物宿主细胞中有功能的一种或多种启动子元件 可操作连接。启动子可以是通常驻留于宿主基因组中的内源启动子。在可操 作连接的启动子元件控制下的本发明的多核苷酸可以进一步侧接其他有利 地影响其转录和/或所得转录物的稳定性的元件。这样的元件可以位于可操作 连接启动子的上游、表达构建体3'端的下游、并且可以同时存在于启动子的 上游和表达构建体3'端的下游。
在实施方案中，靶基因(例如，kruppel基因)的抑制产生亲代RNAi表型； 其为与iRNA分子接触的受试者(例如，半翅目害虫)的后代中可观察到的表型。 在一些实施方案中，pRNAi表型包括害虫产生有存活力的后代的能力被降低。 在pRNAi的具体实例中，启动pRNAi的核酸不增加投送了该核酸的群体中的 死亡发生率。在pRNAi的其他实例中，启动pRNAi的核酸也增加投送了该核 酸的群体中的死亡发生率。
在一些实施方案中，可以使半翅目害虫群体与iRNA分子接触，由此产 生pRNAi，其中所述害虫存活并交配，但是产生的卵孵化出有存活力的后代 的能力比未提供所述核酸的相同物种的害虫所产生的卵低。在一些实例中， 这样的害虫不产卵，或者相比于在未与所述iRNA分子接触的相同物种的害 虫中的所见产出更少的卵。在一些实例中，这样的害虫所产下的卵不能孵化， 或者相比于在未与所述iRNA分子接触的相同物种的害虫中的观察，其孵化 率显著更低。在一些实例中，从这样的害虫所产下的卵孵出的若虫没有存活 力，或者相比于在未与所述iRNA分子接触的相同物种的害虫中的观察，其 存活力更低。
产生防止昆虫进食的物质的转基因作物易于被靶昆虫害虫群体适应，从 而降低昆虫防护物质的益处的持久性。传统上，通过(1)种植“避难所植物”(不 包含杀虫物质的作物，因此允许对杀虫物质敏感的昆虫的存活)；和/或(2)将 杀虫物质与针对靶害虫的多种作用方式相结合，使得抵抗一种作用方式的个 体被第二种作用方式杀死，由此实现昆虫害虫对转基因作物的适应的延迟。
在一些实例中，iRNA分子(例如，表达自宿主植物中的转基因)代表新的 作用方式，其与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白技术和/或昆虫抗性管理基因金字塔 中的致死性RNAi技术相结合，以减缓对这些控制技术的任一者有抗性的昆 虫种群的发育。
在一些实施方案中，亲代RNAi可以产生这样一种类型的害虫防治，其 不同于通过致死性RNAi获得的控制，并且其可与致死性RNAi结合以产生协 同的害虫控制。因此，在具体实施方案中，用于半翅目植物害虫中的一种或 多种靶基因的转录后抑制的iRNA分子可与其他iRNA分子相结合，以提供冗 余的RNAi靶向和协同的RNAi效应。
导致卵死亡或卵存活力丧失的亲代RNAi(pRNAi)有可能为使用RNAi和 其他机制进行昆虫保护的转基因作物带来更多的持久性益处。pRNAi阻止暴 露的昆虫产生后代，并因此阻止将它们携带的任何赋予对杀虫物质的抗性的 等位基因传递给下一代。当与一种或多种提供针对相同害虫群体的防护的其 他杀虫物质联合时，pRNAi在延长转基因作物害虫防护的持久性中特别有用。 在一些实施方案中，此类其他杀虫物质可以包括例如若虫活性的dsRNA；杀 虫蛋白(例如源自苏云金芽孢杆菌或其他生物的那些)；以及其他杀虫物质。这种益处的发生是因为在转基因作物中对杀虫物质具有抗性的昆虫的群体 比例高于避难作物。如果在pRNAi存在下传递给下一代的抗性等位基因与易 感等位基因的比率低于不存在pRNAi时的比率，则抗性的演变将会延迟。
例如，pRNAi可能不减少在表达iRNA分子的植物上造成损害的第一害虫 世代的个体数量。然而，这样的害虫能够通过后代维持侵染的能力可能降低。 相反，致死性RNAi可以杀死已经侵染植物的害虫。当pRNAi与致死性RNAi 联合时，与亲代iRNA分子接触的害虫可以与来自系统外部的未接触过iRNA 的害虫繁殖，然而，这种交配的后代可能没有存活力或存活力较低，因此可 能不能侵染植物。同时，与致死性iRNA分子接触的害虫可能直接受到影响。 这两种效应的联合可以是协同的；即，联合的pRNAi和致死性RNAi效应可以 大于独立的pRNAi和致死性RNAi效应的总和。pRNAi可与致死性RNAi联合， 例如通过提供表达致死性iRNA分子和亲代iRNA分子的植物；通过在相同位 置提供表达致死性iRNA分子的第一种植物和表达亲代iRNA分子的第二种植 物；和/或通过使害虫与pRNAi分子接触，随后将接触的害虫释放到植物环境 中，使得它们可以与植物害虫进行非生产性交配。
一些实施方案提供了用于降低由以植物为食的半翅目害虫引起的对宿 主植物(例如，大豆植物)的损害的方法，其中所述方法包括在宿主植物中提 供表达本发明的至少一种核酸分子的转化植物细胞，其中所述核酸分子在被 害虫摄取后发挥功能以抑制该害虫内靶多核苷酸的表达，该表达抑制导致例 如，该害虫的死亡和/或生长降低，还有生殖力降低，由此降低由该害虫引起 的对宿主植物的损害。在一些实施方案中，核酸分子包括dsRNA分子。在这 些和进一步的实施方案中，核酸分子包括dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交的多核 苷酸。在一些实施方案中，核酸分子由一种多核苷酸组成，所述多核苷酸与 半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交。
在其他实施方案中，提供了用于提高玉米作物产量的方法，其中所述方 法包括将本发明的至少一种核酸分子导入玉米植物中；栽培玉米植物以容许 表达包含核酸的iRNA分子，其中包含所述核酸的iRNA分子的表达可抑制半 翅目害虫损害和/或生长，由此降低或消除由于半翅目害虫侵染所致的产量损 失。在一些实施方案中，iRNA分子是dsRNA分子。在这些和进一步的实施 方案中，核酸分子包括dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与半 翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交的多核苷酸。在一些实施方 案中，核酸分子由一种多核苷酸组成，所述多核苷酸与半翅目害虫细胞中表 达的核酸分子可特异性地杂交。
在一些实施方案中，提供了用于提高植物作物产量的方法，其中所述方 法包括将本发明的至少一种核酸分子引入雌性半翅目害虫(例如通过注射， 通过摄取，通过喷雾和通过DNA的表达)中；以及将雌性害虫释放到作物中， 其中包括该雌性害虫的交配对不能产生有存活力的后代或产生有存活力的 后代的能力降低，从而减少或消除由于半翅目害虫侵染所致的产量损失。在 特定的实施方案中，这样的方法提供对害虫后代的控制。在类似的实施方案 中，该方法包括将本发明的核酸分子引入雄性半翅目害虫中，并将雄性害虫释放到作物中(例如，其中pRNAi雄性害虫比未处理的对照产生更少的精子)。 在一些实施方案中，核酸分子是被表达产生iRNA分子的DNA分子。在一些 实施方案中，核酸分子是dsRNA分子。在这些和进一步的实施方案中，核酸 分子包括dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与半翅目害虫细胞 中表达的核酸分子可特异性地杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分 子由一种多核苷酸组成，所述多核苷酸与半翅目害虫细胞中表达的核酸分子 可特异性地杂交。
在一些实施方案中，提供了用于调变半翅目害虫中靶基因表达的方法， 所述方法包括：用包含编码本发明的至少一种iRNA分子的多核苷酸的载体 转化植物细胞，其中所述多核苷酸与启动子和转录终止元件可操作连接；在 足以容许形成包含多个转化植物细胞的植物细胞培养物的条件下培养经转 化的植物细胞；选择已经将核酸分子整合到其基因组中的转化植物细胞；对 转化植物细胞筛选由整合的多核苷酸编码的iRNA分子的表达；选择表达 iRNA分子的转基因植物细胞；并且用选择的转基因植物细胞喂养半翅目害 虫。也可以从表达由整合的核酸分子编码的iRNA分子的转化植物细胞再生 植物。在一些实施方案中，iRNA分子是dsRNA分子。在这些和进一步的实 施方案中，核酸分子包括dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超过一种与 半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性地杂交的多核苷酸。在一些实施 方案中，核酸分子由一种多核苷酸组成，所述多核苷酸与半翅目害虫细胞中 表达的核酸分子可特异性地杂交。
可以将本发明的iRNA分子作为来自掺入植物细胞基因组中的重组基因 的表达产物、或者掺入应用于种植前种子的包衣或种子处理中而掺入植物物 种(例如，大豆)的种子之内。包含重组基因的植物细胞被视为转基因事件。 本发明的实施方案中还包括用于将iRNA分子投送给半翅目害虫的投送系统。 例如，可以将本发明的iRNA分子直接导入害虫的细胞中。用于导入的方法 可以包括将iRNA直接混合到半翅目害虫的食物中(例如，通过与害虫宿主的 植物组织混合)，以及对宿主植物组织施用包含本发明的iRNA分子的组合物。例如，可将iRNA分子喷雾到植物表面上。或者，可以通过微生物表达iRNA 分子，并且可以将微生物施用到植物表面上，或通过物理手段诸如注射导入 根或茎中。如上文论述的，也可以对转基因植物进行遗传工程改造，使其以 足以杀死已知侵染植物的半翅目害虫的量表达至少一种iRNA分子。通过化 学或酶促合成产生的iRNA分子也可以以符合常见农业实践的方式配制，并 且作为喷雾产品使用以控制半翅目害虫所致的植物损害。配制剂可以包含有 效的叶覆盖需要的适当辅料(例如粘着剂(sticker)和湿润剂)，以及保护iRNA 分子(例如，dsRNA分子)免于UV损伤的UV保护剂。这样的添加剂通常在生 物杀虫剂产业中使用，并且是本领域技术人员熟知的。这样的应用可以与其 他喷雾杀虫剂应用(基于生物学的或其他方面)联合以增强针对半翅目害虫的 植物保护。
本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均通过提 述并入本文，只要与本公开的明确细节不冲突，如同单独地和具体地明示将 每篇参考文献通过提述并入本文一样。本文所讨论的参考文献仅为其在本申 请的申请日之前的公开内容而提供。本文中任何内容不应被解释为承认发明 人无权凭借在先发明而先于这些公开。
提供以下实施例以展示某些具体特征和/或方面。这些实施例不应被理解 为将本公开限于所描述的具体特征或方面。
实施例
实施例1：RNAi构建体
通过PCR制备模板和dsRNA合成。
用于为kruppel dsRNA产生提供特定模板的策略如图1A和图1B所示。 通过使用特异性引物和由总RNA制备的第一链cDNA，通过PCR制备了准备 用于kruppel dsRNA合成的模板DNA。对于kruppel的选定的靶基因区域，进 行两个分别的PCR扩增。图1。第一个PCR扩增在扩增出的有义链的5'末端 引入T7启动子序列。第二个反应将T7启动子序列纳入反义链的5'末端。然 后将目标基因的每个区域的两个PCR扩增片段以大约相等的量混合，并将该混合物用作dsRNA产生的转录模板。图1。
对于YFP阴性对照，进行单次PCR扩增。图1B。PCR扩增在扩增出的有 义链和反义链的5'端引入T7启动子序列。然后将目标基因的每个区域的两个 PCR扩增片段以大约相等的量混合，并将该混合物用作dsRNA产生的转录模 板。图1B。使用特异性引物和YFP编码区的DNA克隆作为模板产生阴性对照 YFP编码区的dsRNA(SEQ ID NO:6)。使用MEGAscript高产转录试剂盒 (Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)，将为kruppel和YFP而扩增的PCR 产物用作体外合成dsRNA的模板。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Valencia， CA)或 RNAi试剂盒，大体上按制造商的说明书规定纯 化合成的dsRNA。使用NANODROPTM 8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC，Wilmington，DE)或等效手段定量dsRNA制备物，并通过凝胶 电泳分析以确定纯度。
实施例2：实时PCR分析
定量实时PCR：使用Roche LightCycler480通过探针水解定量实时PCR (qPCR)分析转录物的相对表达水平。PCR引物和水解探针使用LightCycler Probe Design Software2.0(Roche)进行设计。dsRNA注射的昆虫或卵在干冰上 冷冻。使用KleckoTM组织粉碎机(Garcia Manufacturing，Visalia，CA)在具有 一个不锈钢珠的试剂盒RLT裂解缓冲液中进行组织破坏。在组织浸渍之后， 使用试剂盒(Qiagen，#74182)，按照试剂盒方案，以高通量形式 分离总RNA，以1/2X建议浓度进行可选的柱DNA酶I处理步骤30分钟，并使用另外的DNA酶消化TurboTM DNA酶(AM2238，Life Technologies，Carlsbad CA)在室温下在洗脱液上1小时。
用于高通量qPCR测定的第一链cDNA合成：根据制造商提供的方案使用 高容量cDNA RT试剂盒(部件号：4368813。Life technologies，Carlsbad CA)， 具有以下修改。用无核酸酶的水将总RNA调节至～10ng/μL。将RNA样品(5μL 或不超过250ng总RNA)加热至70℃10分钟并冷却至4℃。通过加入5μL2x预混 物开始半反应。首先将引物预混物，其仅仅是作为随机引物提供，掺入定制 合成的T20VN寡聚物(Integrated DNA Technologies，Coralville IA)至终浓度为2 μM，以提高基于3'UTR的测定的灵敏度。在第一链合成后，将样品以不含核 酸酶的水1:3稀释并保存在-20℃，直到准备好通过高通量(HTP)qPCR进行测定。
使用未注射的昆虫和注射YFP dsRNA的昆虫作为对照。BSB肌动蛋白 (Act)用作参考基因(Ponton et al.(2011)J Insect Physiol 57(6):840-50)。实验基 因和参考基因的引物和探针见表1。
表1.用于BSB探针水解qPCR测定的寡核苷酸和探针。
实施例3：植物转化载体的构建
使用化学合成片段的组合(DNA2.0,Menlo Park,CA)和标准分子克隆方 法，组装包含用于dsRNA发夹形成的靶基因构建体的入门载体，其包含 kruppel基因(SEQ ID NO:1)的区段。通过以彼此相反的取向安排(在单个转录 单位内)两个拷贝的靶基因区段而促进经由RNA初级转录物的分子内发夹形 成，其中两个区段由间隔子序列(例如，ST-LS1内含子；SEQ ID NO:7； Vancanneyt等人(1990)Mol.Gen.Genet.220:245-250)分开。因此，初级mRNA 转录物含有被间隔子序列分开的两个kruppel基因区段序列，其中两者互为大 的反向重复序列。启动子的拷贝(例如，玉米泛素1，美国专利5,510,474；来 自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S；来自水稻肌动蛋白基因的启动子；泛素启 动子；pEMU；MAS；玉米H3组蛋白启动子；ALS启动子；菜豆蛋白基因启 动子；cab；rubisco；LAT52；Zm13；和/或apg)用于驱动初级mRNA发夹转 录物的产生；包含3'非翻译区的片段，例如但不限于玉米过氧化物酶5基因(ZmPer5 3′UTR v2；美国专利6,699,984)、AtUbi10、AtEf1、或StPinII用于终 止表达发夹RNA的基因的转录。
使用上述入门载体与典型的二元目标载体进行标准重组反 应，产生用于土壤杆菌介导的植物胚转化的kruppel发夹RNA表达转化载体。
通过典型的二元目标载体与入门载体进行标准重组反应， 构建包含表达YFP发夹dsRNA的基因的阴性对照二元载体。入门载体包含处 于玉米泛素1启动子的表达控制之下的YFP发夹序列和包含来自玉米过氧化 物酶5基因的3'非翻译区的片段。
二元目标载体包含处于植物可操作启动子(例如，甘蔗杆状DNA病毒 (ScBV)启动子(Schenk等人，(1999)Plant Molec.Biol.39:1221-30)或ZmUbil (美国专利5,510,474))的调节之下的耐除草剂基因(芳氧基链烷酸酯双加氧酶； AAD-1v3)(美国专利7,838,733，和Wright等人(2010)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.107:20240-5))。离开这些启动子的5'UTR和内含子位于启动子片段的 3'端和AAD-1编码区的起始密码子之间。包含玉米脂肪酶基因的3'非翻译区 (ZmLip 3′UTR；美国专利7,179,902)的片段用于终止AAD-1mRNA的转录。
通过典型的二元目标载体与入门载体进行标准重组反应， 构建了另外的包含表达YFP蛋白的基因的阴性对照二元载体。二元目标载体 包含在玉米泛素1启动子的表达调节之下的耐除草剂基因(芳氧基链烷酸酯 双加氧酶；AAD-1v3)和包含来自玉米脂肪酶基因的3'非翻译区(ZmLip 3'UTR) 的片段。入门载体包含处于玉米泛素1启动子的表达控制之下的YFP编码区 和包含来自玉米过氧化物酶5基因的3'非翻译区的片段。
实施例4：新热带褐蝽象(英雄美洲蝽)中的昆虫饲养和候选基因选择
昆虫饲养.将新热带棕椿象(BSB；英雄美洲蝽)饲养在27℃、相对湿度 65％、16:8小时的光照:黑暗循环的培养箱中。将经2-3天收集的1克卵接种在 5L容器中，容器底部有滤纸盘，并用#18目筛盖住容器以便通风。每个饲养 容器产生约300-400只成虫BSB。在所有阶段，昆虫均每周三次喂养新鲜青豆， 每周更换一小袋含有向日葵种子，大豆和花生(3:1:1重量比)的种子混合物。 水在带有棉塞作为捻子的小瓶中补充。经最初两周后，每周一次将昆虫转移到 新的容器上。
RNAi靶选择.选择六个BSB发育期用于mRNA文库制备。从冷冻在 -70℃的昆虫提取总RNA，并将其在设备(MP BIOMEDICALS) 上的Lysing MATRIX A 2mL管(MPBIOMEDICALS,Santa Ana,CA)中的10 倍体积的溶解/结合缓冲液中均质化。使用MIRVANATMmiRNA分离试剂盒 (AMBION；INVITROGEN)根据制造商的方案提取总mRNA。使用 HiSeqTM系统(San Diego,CA)的RNA测序提供了用于在RNAi昆 虫控制技术中使用的候选靶基因序列。HiSeqTM为六个样品生成了总共约3.78 亿个读段。使用TRINITY汇编程序软件(Grabherr等人，(2011)Nature Biotech. 29:644-652)针对每个样品将读段逐一汇编。合并汇编的转录物以生成汇集的转 录组。这个BSB汇集的转录组含有378,457个序列。
英雄美洲蝽kruppel直系同源物鉴定.使用果蝇属KRUPPEL(Kr-PA, GENBANK登录号NP_523867)蛋白的序列进行英雄美洲蝽汇集的转录组的 tBLASTn检索。英雄美洲蝽kruppel(SEQ ID NO:1)被鉴定为英雄美洲蝽候选 靶基因。
SEQ ID NO:1的序列是新的。在GENBANK中检索未发现显著同源的核 苷酸序列。叶甲属KRUPPEL氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的最接近的同源物是 具有马利筋长蝽(Oncopeltus fasciatus)的一种蛋白质，其GENBANK登录号为 AAT44519.1(82％相似；同源区上78％相同)。
模板制备和dsRNA合成.使用试剂(LIFE TECHNOLOGIES, GrandIsland,NY)，从提取自单一年轻成虫(约90mg)的总BSB RNA制备 cDNA。使用微量管研磨棒(pellet pestle)(FISHERBRAND,Grand Island,NY)和 研磨棒混合器(Pestle MotorMixer)(COLE-PARMER,Vernon Hills,IL)，在装 有200μL的的1.5mL微量离心管中将昆虫均质化。均质化之后，再 添加800μL的使匀浆涡旋，然后在室温下温育五分钟。通过离心 去除细胞碎片，上清液转移到新的管中。按照制造商推荐的提取 方案，将RNA离心沉淀在室温下干燥，并重悬于来自GFX PCR DNA ANDGEL EXTRACTION KIT(IllustraTM；GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES, Pittsburgh,P)的200μLTris缓冲液中，使用洗脱缓冲液类型4(即10mM Tris-HCl， pH 8.0)。使用NANODROPTM 8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC， Wilmington，DE)测定RNA浓度。
使用针对RT-PCR的SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEMTM(INVITROGEN)，根据供应商的推荐方案，从5μg的BSB总RNA 模板和寡dT引物反向转录而成cDNA。用无核酸酶的水将转录反应的终体积 调节为100μL。
使用用于BSB_kr-1的引物，dsRNA BSB_kr-1-F(SEQ ID NO:8)和 BSB_kr-1-R(SEQID NO:9)，来扩增用于dsRNA转录的模板。使用用于 BSB_kr-2的引物，dsRNA BSB_kr-2-F(SEQ ID NO:10)和BSB_kr-2-R(SEQ ID NO:11)，扩增用于dsRNA转录的DNA模板。用1μL的cDNA(上文)进行触 地(touch-down)PCR(退火温度从60℃降至50℃，以10℃/循环降低)来扩增该 DNA模板。在35个循环的PCR中产生了包含BSB_kr-1的434bp的区段(SEQ ID NO:3)和BSB_kr-2的605bp的区段(SEQ ID NO:4)的片段。上述程序也被 用于使用YFPv2-F(SEQID NO:13)和YFPv2-R(SEQ ID NO:14)引物扩增 301bp阴性对照模板YFPv2(SEQ ID NO:12)。BSB特异性引物和YFPv2引物 在其5'端含有T7噬菌体启动子元件(SEQ ID NO:5)，因此使得上述BSB DNA 片段能够用于dsRNA转录。
利用MEGAscriptTM RNAi试剂盒(AMBION)或 T7体外转录试 剂盒，根据制造商的说明，使用2μL的PCR产物(上文)作为模板合成dsRNA。 参见图1。在NANODROPTM8000分光光度计上将dsRNA定量并在无核酸酶的 0.1X TE缓冲液(1mM Tris HCL，0.1mMEDTA，pH7.4)中稀释到1μg/μL。
实施例5：向第2龄新热带褐蝽象(英雄美洲蝽)若虫中注射dsRNA
BSB人工饵食.用如下制备的BSB人工饵食，并在制备两周内使用。在 MAGIC混合器中将冻干绿豆混合成细粉，同时在另一台MAGIC 混合器中将生(有机)花生混合。在大的MAGIC混合器中 合并混合的干成分(重量百分比:绿豆35％；花生35％；蔗糖5％；维生素复合 物(例如用于昆虫的Vanderzant维生素混合物，SIGMA-ALDRICH,目录号 V1007)，0.9％)，加盖并充分振摇以将这些成分混合。然后将混合的干成分添 加到混合碗。在另一容器中，将水和苯菌灵抗真菌剂(50ppm；25μL 20,000ppm溶液/50mL饵食液)充分混合，然后添加到干成分混合物中。人工混合所有成 分，直到溶液完全混合时为止。将饵食成形为期望的大小，松散地包装在铝箔 中，在60℃加热4小时，然后冷却，在4℃储存。
dsRNA注射到BSB血腔中.在27℃培养箱中，在65％相对湿度和16:8 小时的光:暗光周期下，用绿豆和种子饵食喂养作为如上所述的群落的BSB。 用小刷子轻轻操作第二龄若虫(每只重1到1.5mg)以防损伤，并将它们置于冰 上培养皿中，以使昆虫预冷和固定。给每只昆虫注射55.2nL的500ng/μL dsRNA溶液(即，27.6ng dsRNA；18.4到27.6μg/g体重的剂量)。注射使用配 备有从Drummond 8.9cm#3-000＝203-G/X玻璃毛细管拉制而成的注射针的 NANOJECTTM II注入器(DRUMMOND SCIENTIFIC,Broomhall,PA)。将针尖 打破，用轻矿油装填毛细管，然后充填2到3μL的dsRNA。将dsRNA注射 到若虫的腹部(每次试验每dsRNA注射10个昆虫)，在不同的三天重复试验。 经过注射的昆虫(每孔5个)被转移到含有一团人工BSB饵食并覆盖有 PULL-N-PEELTM盖片(BIO-CV-4；BIO-SERV)的32孔托盘(Bio-RT-32Rearing Tray；BIO-SERV,Frenchtown,NJ)中。借助于带有棉花芯的装有1.25mL水的1.5mL微量离心管提供水分。将这些托盘在26.5℃、60％湿度和16:8小时光: 暗光周期下温育。在注射之后7天，获取生存力计数和重量。
在BSB第二龄若虫中注射靶向kruppel的dsRNA.在BSB注射实验中使 用与YFP编码区YFPv2同源的dsRNA作为阴性对照。如表2中总结的，将27.6 ng的BSB_kr-1dsRNA注射到第二龄BSB若虫的血腔中，在七天内未导致升高 的死亡率。
表2.第二龄英雄美洲蝽若虫的血腔中注射英雄美洲蝽kruppel dsRNA 在注射7日后的结果。表格显示平均百分比死亡率，试验次数，均值标准误 (SEM)，以及双尾student t检验的p值。
处理 平均％死亡率 SEM 试验次数 t-检验(p)
BSB_kr-1 20 5.8 3 2.88E-01
未注射 13 3.3 3 6.43E-01
YFPv2 dsRNA 10 5.8 3
实施例6：英雄美洲蝽中注射dsRNA之后的卵孵化
注射dsRNA到BSB成虫血腔中。对于该群体，如上所述饲养BSB。在下 面的例子中，采集年轻成虫(成虫蜕皮后零至三天)，并在冰上的二次容器中 冷冻。基于生殖器的结构二态性，分离雌性和雄性。雌性BSB用轻量级昆虫 学镊子进行处理，使用装备有从Drummond8.9cm#3-000-203-G/X玻璃毛细 管拉制而成的注射针的NANOJECTTM II注入器(DRUMMONDSCIENTIFIC, Broomhall,PA)进行注射。将针尖断开，在毛细管中充入轻矿油，然后充入3μLdsRNA。每处理10至20只雌性(每只约90mg)接受dsRNA注射。对于每只雌性 以69μL的1μg/μL的dsRNA注入腹部，连续两次，总共138nL(138ng)。将每 批10只雌性移入1夸脱(约950mL)的箱子中，该箱子的盖子中有开口，带有 18号网用于换气。具有十只雌性的每个箱子中添加两只成虫雄性。如饲养程 序中所述，向昆虫提供一小瓶水、青豆和种子。将昆虫保持在26.5℃、60％ 湿度和16:8光:暗光周期下。
在注射后第9天开始，每天收集存活的雌性计数、产卵和卵孵化数，持 续长达24天。每天取出卵，并保持在培养皿或多孔板中的1％琼脂糖水溶液 层上。每隔一天给成虫供应新鲜的绿豆。每周将成虫转移到具有淡水和食物 的箱子中。
注射靶向YFP编码区的301nt序列(SEQ ID NO:12)的dsRNA的雌性用作 阴性对照，将其与未注射的雌性和注射BSB_kr-1(SEQ ID NO:3)dsRNA的雌 性进行比较。
在BSB雌性中注射靶向kruppel的dsRNA对产卵无显著影响。如表3中总 结的，注射了kruppel dsRNA的雌性相比于注射YFPv2dsRNA和未注射的对 照产的卵数稍有降低。每只雌性每日产的卵的平均数(表3)与YFP对照没有显 著差异。用kruppel dsRNA处理的雌性的总体孵化率是惊人的、预料不到的。
在所有重复实验中孵化的总卵数都有急剧减少，范围在10％-30％不等，而与 之相比YFPv2的孵化率为89％(表4)。
表3.在BSB_kr-1dsRNA应用的三个重复实验中，每日每只雌性所产的 卵数。用靶向BSB kruppel或阴性对照YFPv2的dsRNA注射10-20只雌性。卵 计数涵盖了14天的收集，自注射后第11日起。在Excel中进行了双尾配对t检 验。双尾配对t检验在Excel中进行。
表4.每日每只雌性孵化的BSB卵数，基于表3中产的卵。每天收集卵， 其中收集后第5、6、7日孵化最多。在Excel中进行双尾配对t-检验以得出每 只雌性每日孵化数均值。
*表示显著的差异(p-值<0.05)
实施例7：包含半翅目害虫序列的转基因玉米
如实施例3中所述，生成10个到20个包含表达载体的转基因T0玉米植物， 所述表达载体包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的核酸。 获得另外的10-20个T1玉米独立系，其表达针对RNAi构建体的发夹dsRNA， 用于BSB攻击。可获得发夹dsRNA，其包含SEQ ID NO:1的区段。这些通过 RT-PCR或其他分子分析方法加以确认。来自选择的独立T1系的总RNA制备 物任选地用于RT-PCR，其中引物被设计为结合在每个RNAi构建体中的发夹 表达盒中的间隔子。另外，任选地用针对RNAi构建体中每个靶基因的特异 性引物进行扩增，并确认在植物体内产生siRNA所需要的预加工mRNA的产 生。每个靶基因的期望条带的扩增可确认每个转基因玉米植物中发夹RNA的 表达。随后任选地在独立转基因系中利用RNA印迹杂交来确认靶基因的 dsRNA发夹加工成siRNA。
而且，与靶基因具有80％以上序列同一性、具有错配序列的RNAi分子对 半翅目的影响方式类似于与靶基因具有100％序列同一性的RNAi分子。错配 序列与天然序列的配对在同一个RNAi构建体中形成发夹dsRNA，由此产生 出能够影响摄食中的半翅目害虫的生长、发育、生殖、和存活力的植物加工 的siRNA。
对应于靶基因的dsRNA、siRNA、shRNA、hpRNA、或miRNA的植物体 内投送以及被半翅目害虫进食后的摄取，导致半翅目害虫中的靶基因由于 RNA介导的基因沉默而下调。当靶基因在所影响的半翅目害虫的发育、生长、 发育和/或生殖的一个或多个阶段中发挥重要功能时，并且在英雄美洲蝽、盖 德拟壁蝽、茶翅蝽、稻绿蝽、Acrosternum hilare和褐椿象中至少一者的情况 下，可导致半翅目害虫无法成功侵染、进食、发育、和/或生殖，或导致其死 亡。然后通过靶基因的选择和RNAi的成功应用来控制半翅目害虫。
转基因RNAi系和非转化玉米的表型比较。
选用于创建发夹dsRNA的靶半翅目害虫基因或序列与任何已知的植物 基因序列都没有相似性。因此不期望靶向这些半翅目害虫基因或序列的构建 体的(系统性)RNAi的产生或活化对转基因植物会有任何有害影响。然而， 将转基因系的发育和形态特征与非转化植物、以及用没有发夹表达基因的 “空”(empty)载体转化的那些转基因系进行比较。比较了植物根、芽、叶和生 殖特征。转基因植物和非转化植物在根长和生长模式上没有可观察到的差异。 植物地上部特征，诸如高度、叶数和大小、开花时间、花大小和外观之类， 是相似的。总的来说，在体外以及在温室土壤中培养时，在转基因系和没有 表达靶iRNA分子的那些品系之间没有可观察到的形态差异。
实施例8：包含半翅目害虫序列的转基因大豆
生成10个到20个包含核酸的表达载体的转基因T0大豆植物，所述核酸包 含SEQID NO:1或SEQ ID NO:1的区段，所述植物按照本领域已知的方式生 成，包括例如通过如下所述的土壤杆菌介导的转化。用氯气将成熟大豆 (Glycine max)种子消毒十六小时过夜。用氯气消毒之后，将种子置于 LAMINARTM层流罩内的开放容器中以驱散氯气。接着，使用黑盒，在黑暗 中24℃下使消毒过的种子吸收无菌H20十六小时。
分割种子大豆的制备.包含部分胚轴的大豆种子分割方案需要制备纵向 切开的大豆种子材料，纵向切开使用固定在解剖刀上的10号刀片，沿着种子 的种脐分离并去除种皮，并将种子分开为两个子叶部分。小心地部分移除胚 轴，其中约1/2-1/3的胚轴仍然附着在子叶的节端。
接种.然后将包含部分胚轴的分割大豆种子在含有二元质粒的根癌土壤 杆菌(例如，菌株EHA 101或EHA 105)溶液中浸没约30分钟，所述二元质粒包 含SEQ ID NO:1、SEQID NO:3和/或SEQ ID NO:4。在浸入带胚轴的子叶之 前，将根癌土壤杆菌溶液稀释到λ＝0.6OD650的终浓度。
共培养.接种后，将分割的大豆种子与根癌土壤杆菌菌株在培养皿中的 共培养基(Agrobacterium Protocols,vol.2,2nd Ed.,Wang,K.(Ed.)Humana Press,New Jersey,2006)上共培养5天，培养皿用一片滤纸覆盖。
芽诱导.在共培养5天之后，将分割的大豆种子在含有B5盐、B5维生素、 28mg/L二价铁、38mg/L Na2EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L MES、1.11mg/L BAP、100mg/L TIMENTINTM、200mg/L头孢噻肟、和50mg/L万古霉素的液体芽诱 导(SI)培养基(pH 5.7)中洗涤。然后将分割的大豆种子在含有B5盐、B5维生素、 7g/L Noble琼脂、28mg/L二价铁、38mg/LNa2EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L MES、 1.11mg/L BAP、50mg/L 200mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉 素的芽诱导II(SI II)培养基(pH 5.7)上培养，其中子叶的平坦一侧向上，而子 叶的节端埋入培养基中。在培养2周之后，将来自转化的分割大豆种子的外 植体转移到芽诱导II(SI II)培养基中，该培养基含有补充了6mg/L草丁膦 的SII培养基。
芽伸长.在SI II培养基上培养2周之后，将子叶从外植体移除，通过在子 叶的基部做切口切下含有胚轴的齐平的(flush)芽垫。将分离自子叶的芽垫转 移到芽伸长(SE)培养基上。该SE培养基含有MS盐、28mg/L二价铁、38mg/L Na2EDTA、30g/L蔗糖和0.6g/L MES、50mg/L天冬酰胺、100mg/L L-焦谷 氨酸、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA3、1mg/L玉米素核苷、50mg/L TIMENTINTM、200mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素、6mg/L草丁膦、7g/L Noble琼脂，(pH 5.7)。每2周将培养物转移到新鲜的SE培养基上。培养物在 CONVTRONTM生长室中在24℃下培养，使用18h光周期，光强为80-90 μmol/m2sec。
生根.对于从子叶芽垫发出的伸长芽，通过在子叶芽垫基部切割伸长芽 加以分离，并将伸长芽浸入1mg/L IBA(吲哚-3-丁酸)中1-3分钟促进生根。接 着，将伸长芽转移到Phyta托盘中的生根培养基(MS盐、B5维生素、28mg/L 二价铁、38mg/L Na2EDTA、20g/L蔗糖和0.59g/L MES、50mg/L天冬酰胺、 100mg/L L-焦谷氨酸、7g/L Noble琼脂，pH 5.6)中。
栽培.在CONVTRONTM生长室24℃、18h光周期培养1-2周之后，将已 经生根的芽转移到带盖的圣代杯内的土壤混合物中，放到CONVTRONTM生 长室(型号CMP4030和CMP3244,Controlled Environments Limited,Winnipeg, Manitoba,Canada)内，置于长的白昼条件下(16小时光照/8小时黑暗)，光强度 为120-150μmol/m2sec，温度(22℃)和湿度(40-50％)恒定，以驯化小植物。生 根的小植物在圣代杯中驯化数周之后，转移到温室中进行进一步的驯化并定 植强健的转基因大豆植物。
获得另外的10-20个T1大豆独立系，其表达针对RNAi构建体的发夹 dsRNA，用于BSB攻击。可获得这样的发夹dsRNA，其如SEQ ID NO:3和4 所示，或还包含SEQ ID NO:1。这些通过本领域已知的RT-PCR或其他分子分 析方法加以确认。来自选择的独立T1系的总RNA制剂任选地用于RT-PCR， 其中引物被设计为结合在每个RNAi构建体中的发夹表达盒的间隔子中。另 外，用针对RNAi构建体中每个靶基因的特异性引物进行扩增，并确认在植 物体内产生siRNA所需要的预加工mRNA的产生。对于每个靶基因的期望条 带的扩增证实了每个转基因大豆植物中发夹RNA的表达。随后任选地在独立 转基因系中利用RNA印迹杂交来确认靶基因的dsRNA发夹加工成siRNA。
与靶基因具有80％以上序列同一性、具有错配序列的RNAi分子对BSB的 影响方式类似于与靶基因具有100％序列同一性的RNAi分子。错配序列与天 然序列的配对在同一个RNAi构建体中形成发夹dsRNA，由此产生出能够影 响摄食中的半翅目害虫的生长、发育、生殖、和存活力的植物加工的siRNA。
对应于靶基因的dsRNA、siRNA、或miRNA的植物体内投送以及被半翅 目害虫进食后的摄取，导致半翅目害虫中的靶基因由于RNA介导的基因沉默 而下调。当靶基因在所影响的半翅目害虫的发育、生长、发育和/或生殖的一 个或多个阶段中发挥重要功能时，并且在英雄美洲蝽、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、 稻绿蝽、Acrosternum hilare和褐椿象中至少一者的情况下，可导致半翅目害 虫无法成功侵染、进食、发育、和/或生殖，或导致其死亡。然后通过靶基因 的选择和RNAi的成功应用来控制半翅目害虫。
转基因RNAi系和非转化大豆的表型比较。选用于创建发夹dsRNA的靶 半翅目害虫基因或序列与任何已知的植物基因序列都没有相似性。因此不期 望靶向这些半翅目害虫基因或序列的构建体的(系统性)RNAi的产生或活化 对转基因植物会有任何有害影响。然而，将转基因系的发育和形态特征与非 转化植物、以及用没有发夹表达基因的“空”(empty)载体转化的那些转基因系 进行比较。比较了植物根、芽、叶和生殖特征。转基因植物和非转化植物在 根长和生长模式上没有可观察到的差异。植物地上部特征，诸如高度、叶数 和大小、开花时间、花大小和外观之类，是相似的。总的来说，在体外以及 在温室土壤中培养时，在转基因系和没有表达靶iRNA分子的那些品系之间 没有可观察到的形态差异。
实施例9：人工饵食的英雄美洲蝽生物测定
在使用人工饵食的dsRNA进食测定中，与注射实验相同，设置具有约18 mg的人工饵食小丸和水的32孔托盘。将浓度为200ng/μL的dsRNA加入到食 物小丸和水样品中，向两个孔中的每一个加入100μl。向每个孔中加入5只第 2龄的英雄美洲蝽若虫。以水样品和靶向YFP转录物的dsRNA作为阴性对照。 在三个不同的日期重复这些实验。将存活的昆虫称重，并在处理7天后测定 死亡率。
在如上所述的32孔托盘上进行成虫雌性英雄美洲蝽的进食生物测定。将 年轻的(成年不到一周)交配后的雌性加入到具有人工饵食的生物测定托盘中， 每个托盘一只。经过7天的dsRNA暴露后，最多可以将10只成虫雌性移入含 有青豆、水、种子和两只雄性的容器。在随后的两周，记录雌性存活力以及 产卵的卵数和孵化的卵数。数据显示，产卵和/或孵化的卵数显著降低。
实施例10：包含半翅目害虫序列的转基因拟南芥
使用与实施例4相似的标准分子方法产生包含用于发夹形成的靶基因构 建体的拟南芥转化载体，所述构建体包含kruppel(SEQ ID NO:1)的区段。使 用标准的基于土壤杆菌的方法进行拟南芥转化。用草铵膦耐受性选择标志物 选择T1种子。产生转基因T1拟南芥植物，并产生纯合的单拷贝T2转基因植物 用于昆虫研究。对具有花序的生长中的拟南芥植物进行生物测定。将五至十 只昆虫放置在每株植物上，并监测在14天内的存活。
拟南芥转化载体的构建.使用化学合成的片段(DNA2.0，Menlo Park， CA)的组合和标准分子克隆方法，组装基于入门载体的入门克隆，这些入门 载体包含用于发夹形成的靶基因构建体，所述构建体包含kruppel(SEQ ID NO:1)的区段。通过以相反的取向安排(在单个转录单位内)两个拷贝的靶基因 区段而促进经由RNA初级转录物的分子内发夹形成，其中两个区段由间隔子 序列(例如，ST-LS1内含子；SEQ ID NO:7)Vancanneyt等人(1990)Mol.Gen. Genet.220(2):245-50)分开。因此，初级mRNA转录物含有被间隔子序列分开 的两个kruppel基因区段序列，其中两者互为大的反向重复序列。使用启动子 (例如，拟南芥泛素10启动子(Callis et al.(1990)J.Biological Chem.265: 12486-12493))的拷贝来驱动初级mRNA发夹转录物的产生，并且使用包含来 自根癌土壤杆菌的开放阅读框23的3'非翻译区(AtuORF23 3′UTR v1；美国专 利5,428,147)的片段来终止表达发夹RNA的基因的转录。
在标准重组反应中，使用上述入门载体内的发夹克隆与典 型的二元目标载体，产生用于土壤杆菌介导的拟南芥转化的发夹RNA表达转 化载体。
二元目标载体包含在木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV启动子v2，美国 专利号US7601885；Verdaguer等人(1996)Plant Mol.Biol.31:1129-39))调节下 的耐除草剂基因DSM-2v2(美国专利申请号2011/0107455)。使用包含来自根 癌土壤杆菌开放阅读框1的3'非翻译区(AtuORF1 3′UTR v6；Huang等人(1990) J.Bacteriol.172:1814-22)的片段来终止DSM2v2mRNA的转录。
通过典型的二元目标载体与入门载体进行标准重组反应， 构建包含表达YFP发夹RNA的基因的阴性对照二元构建体。入门构建体包含 在拟南芥泛素10启动子(如上文)的表达控制下的YFP发夹序列(SEQ ID NO:6) 和包含来自根癌土壤杆菌的ORF23 3'非翻译区的片段(如上文)。
包含杀虫发夹RNA的转基因拟南芥的产生：土壤杆菌介导的转化.将含 有发夹序列的二元质粒电穿孔到土壤杆菌菌株GV3101(pMP90RK)中。通过 重组土壤杆菌菌落的质粒制备物的限制性分析确认重组土壤杆菌克隆。使用 Qiagen Plasmid Max Kit(Qiagen，目录号12162)根据制造商推荐的方案从土壤 杆菌培养物中提取质粒。
拟南芥转化和T1选择.将12至15株拟南芥植物(Columbia栽培种)在温室 中在光强度250μmol/m2、25℃和18:6小时光照:黑暗的条件下在4”盆中生长。 在转化前一周修剪主花茎。通过将10μl的重组土壤杆菌甘油储液在28℃、225 rpm振荡下在100mL LB肉汤(Sigma L3022)+100mg/L壮观霉素+50mg/L 卡那霉素中温育72小时来制备土壤杆菌接种物。收获土壤杆菌细胞，并将其 悬浮于5％蔗糖+0.04％Silwet L77(Lehle Seeds目录号VIS 02)+10μg/L苯甲 氨基嘌呤(BA)溶液中至OD600 0.8-1.0，然后浸花。将植株的地上部分浸入土 壤杆菌溶液5-10分钟，轻柔搅动。然后将植株转移到温室中进行正常生长， 并定期浇水和施肥，直到种子定植。
实施例11：转基因拟南芥的生长和生物测定
用发夹RNAi构建体转化的T1拟南芥的选择.将来自每次转化的至多达 200mg的T1种子在0.1％琼脂糖溶液中分层。将种子种植在装有5号阳光培养 基(sunshine media)的发芽盘(10.5”x 21”x 1”；T.O.Plastics Inc.,Clearwater, MN.)中。在种植后6天和9天，选择对280g/ha的(草铵膦)具有耐受 性的转化体。将选出的事件移植到4”直径的盆中。使用Roche LightCyclerTM 480，通过水解定量实时PCR(qPCR)在移植的一周内进行插入拷贝分析。使 用LightCyclerTM Probe Design Software 2.0(Roche)，针对DSM2v2选择标志物 设计PCR引物和水解探针。在24℃、在强度为100-150mE/m2s的荧光和白炽 灯下以16:8小时光:暗光周期维持植物。
英雄美洲蝽若虫的植物进食生物测定.为每个构建体选择至少四个低拷 贝事件(1-2个插入)、四个中拷贝事件(2-3个插入)和四个高拷贝(≥4个插入)事 件。使植物生长至生殖期(植物有花和长角果)。土壤表面覆盖有约50ml体积 的白色沙子，便于鉴别昆虫。向每株植物引入5到10只第2龄的英雄美洲蝽若 虫。植物用直径3”、高16”、壁厚0.03”的塑料管(产品号484485，Visipack Fenton MO)覆盖；用尼龙网盖住管子以隔离昆虫。在Conviron培养箱中将植物保持 在正常温度、光照和浇水条件下。在14天中，收集昆虫并称重，计算死亡率 百分比以及生长抑制(1-处理重量/对照重量)。用表达YFP发夹的植物作为对 照。
英雄美洲蝽成虫的植物饲养生物测定.如上所述，选择pRNAi拟南芥T1植物并在温室中培养。每个植物释放一到五个新出现的BSB成虫，如上所述 覆盖整个植物以防成虫逃逸。释放一周后，从每株植物回收雌性成虫，并维 持在实验室中，以便采集卵。根据亲代RNAi目标和预期表型，记录诸如每 雌性的卵数、卵孵化百分比和若虫死亡率之类的参数，并与对照植物进行比 较。
T2拟南芥种子生成和T2生物测定.对于每个构建体，从选定的低拷贝(1-2 个插入)事件产生T2种子。如上所述，对植物(纯合的和/或杂合的)进行英雄美 洲蝽若虫饲养生物测定。从纯合子收获T3种子并储存用于将来分析。
实施例12：其他作物物种的转化
通过利用本领域技术人员已知的那些方法，例如，以前在美国专利 7,838,733或PCT国际专利公开号WO 2007/053482的实施例12中描述的基本 上相同的技术，用kruppel(含或不含叶绿体转运肽)转化棉花来提供椿象的控 制。
实施例13：pRNAi介导的昆虫保护
导致卵死亡或卵存活力丧失的亲代RNAi为使用RNAi和其他机制进行昆 虫保护的转基因作物带来更多的持久性益处。使用基本的二缀块模型 (two-patch model)来演示该用处。
一个缀块含有表达杀虫成分的转基因作物，另一个缀块含有不表达杀虫 成分的避难所作物。根据两种作物的相对比例，在两个建模的缀块中产卵。 在这个实例中，转基因缀块占95％的景观(landscape)，避难所缀块占5％的农 田结构。所述转基因作物表达对昆虫有活性的杀虫蛋白。
害虫对杀虫蛋白被建模为单基因，其中具有两个可能的等位基因；一个 (S)赋予易感性，另一个(R)赋予抗性。杀虫蛋白根据模型模拟能够引起以其 为食的纯合易感(SS)若虫的97％的死亡。对抗性等位基因为纯合(RR)的若虫 被假定为没有死亡。对杀虫蛋白的抗性被假定为不完全隐性的，由此功能优 势度为0.3(以转基因作物为食的、对该蛋白的抗性为杂合(RS)的若虫的死亡 率为67.9％)。
通过RNA干扰(pRNAi)，转基因作物也表达了亲代活性的dsRNA，导致 暴露于转基因作物的成年雌性昆虫的卵没有存活力。昆虫对pRNAi的抗性也 被认为是具有两个可能等位基因的单基因；一个(X)赋予成年雌性对RNAi的 易感性，另一个(Y)赋予成年雌性对RNAi的抗性。假定对dsRNA的高水平暴 露，pRNAi根据模型模拟可导致纯合易感(XX)雌性产生的卵99.9％没有存活 力。该模型假定，pRNAi对由纯合抗性(YY)雌性产生的卵的存活力没有影响。 对dsRNA的抗性被假定为隐性的，由此功能优势度是0.01(对于dsRNA抗性而 言为杂合(XY)的雌性所产生的卵98.9％没有存活力)。
在模型中，存在着在存活成虫中的随机交配以及根据其相对比例在两个 缀块上的随机产卵。有存活力的后代的基因型频率遵循两基因座遗传系统的 孟德尔遗传学。
pRNAi的影响需要成年雌性以表达亲代活性dsRNA的植物组织为食。从 避难所作物羽化的成年雌性与从转基因作物羽化的成年雌性相比，卵发育所 受的干扰可能较低；成虫在经过若虫发育后在某个缀块中羽化，可能就会在 那个缀块中更广泛地采食。因此，就从避难所缀块中羽化的雌性成虫而言， 作用于其上的pRNAi效应的相对幅度是变化的，pRNAi效应的比例范围为0 (从避难所缀块中羽化的成年雌性上没有pRNAi效应)到1(从避难所缀块中羽 化的成年雌性与从转基因缀块中羽化的成年雌性上的pRNAi效应相同)不等。
当pRNAi效应(还)通过以表达亲代活性dsRNA的植物组织喂养成年雄性 来实现时，可以容易地调整该模型来演示这种情形。
计算各个世代中的两种抗性等位基因的频率。假定两个抗性等位基因(R 和Y)的初始频率均为0.005。结果以每个抗性等位基因的频率达到0.05所需的 昆虫世代数表示。为了检查由pRNAi引起的抗性延迟，将包括pRNAi的模拟 与不包括pRNAi的模拟进行比较，但在各方面都彼此相同。图3.
还修改了该模型以包括对若虫有活性的干扰dsRNA与转基因作物中杀 虫蛋白质的组合。其中，给幼虫RNAi赋予导致纯合RNAi敏感若虫(基因型 XX)97％的若虫死亡率的效力，而对纯合RNAi抗性(YY)的若虫没有效力。 对RNAi抗性(XY)为杂合的若虫死亡率为67.9％。假设同一抗性机制适用于若 虫活性RNAi和pRNAi二者。如前所述，对从避难所缀块羽化的成年雌性的 pRNAi效应相对于对从转基因缀块羽化的成年雌性的pRNAi效应从0到1变化。 如前所述，为了检查由pRNAi引起的抗性延迟，将包括pRNAi的模拟与不包 括pRNAi的模拟进行比较，但是所有其他方面(包括若虫RNAi)相同。图4。
与从转基因缀块出现的成虫的效应量值相比，当从避难所缀块出现的雌 性成虫的卵存活力的pRNAi效应量值降低时，观察到清楚的pRNAi的抗性管 理益处。与仅产生杀虫蛋白的转基因作物相比，产生除了杀虫蛋白之外的亲 代活性dsRNA的转基因作物的持久性高得多。类似地，与仅产生杀虫蛋白和 幼虫活性dsRNA的转基因作物相比，产生除了杀虫蛋白和若虫活性dsRNA之 外的亲代活性dsRNA的转基因作物的持久性高得多。在后一种情况下，持久 性益处适用于杀虫蛋白和杀虫干扰dsRNA两者。
实施例14.包含半翅目害虫序列和另外的RNAi构建体的转基因植物
转基因植物在其基因组中包含异源编码多核苷酸，所述异源编码多核苷 酸被转录成靶向半翅目害虫之外的生物的iRNA分子，对这样的转基因植物通 过土壤杆菌或WHISKERSTM方法(参见Petolino和Arnold(2009)Methods Mol. Biol.526:59-67)进行二次转化，以产生一种或多种杀虫dsRNA分子(例如，至 少一种dsRNA分子，包括靶向包含SEQ IDNO:1的基因的dsRNA分子)。基 本上如实施例3中所述制备植物转化质粒载体，经由土壤杆菌或 WHISKERSTM-介导的转化方法递送到获自转基因植物的悬浮细胞或未成熟胚 中，所述植物在其基因组中包含异源编码多核苷酸，所述异源编码多核苷酸被 转录成靶向半翅目害虫之外的生物的iRNA分子。
实施例15.包含RNAi构建体和另外的半翅目害虫控制序列的转基因植物
转基因植物在其基因组中包含被转录成靶向半翅目害虫生物的iRNA分 子的异源编码多核苷酸(例如，至少一种dsRNA分子，包括靶向包含SEQ ID NO:1的基因的dsRNA分子)，对于这样的转基因植物，通过土壤杆菌或 WHISKERSTM方法(参见Petolino和Arnold(2009)Methods Mol.Biol. 526:59-67)进行二次转化以产生一种或多种杀虫蛋白分子，例如，Cry3、Cry34 和Cry35杀虫蛋白。基本上如实施例3中所述制备植物转化质粒载体，经由土 壤杆菌或WHISKERSTM-介导的转化方法递送到获自转基因植物悬浮细胞或 未成熟胚中，所述玉米植物在其基因组中包含被转录成靶向半翅目害虫生物 的iRNA分子的异源编码多核苷酸。获得产生用于控制半翅目害虫的iRNA分 子和杀虫蛋白的双重转化植物。
序列表
<110> 美国陶氏益农公司及内布拉斯加大学董事会
B·齐格弗里德
K·E·纳尔瓦
K·阿罗拉
S·E·沃登
C·卡朱里亚
E·菲什里维奇
N·P·斯托勒
M·弗雷
R·哈姆
A·M·威莱斯阿朗戈
<120> PARENTAL RNAI SUPPRESSION OF KRUPPEL GENE TO CONTROL HEMIPTERAN
PESTS
<130> 2971-P12624.3US (76901-UP-NP)
<150> 62/092,784
<151> 2014-12-16
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1728
<212> DNA
<213> Euschistus heros
<400> 1
aggagcaata atctcaattt ctgaattttt ttacttaaac cactttcatt ctcaccggct 60
caattatagt taaaaatcag ctgatatatt ttcactgata taacccaacc tgattaactt 120
aaacacttaa gtaataatta caagaattaa cggttagaga gttactcaaa caaattttgt 180
aaaatcttat caaacattga tcgaaaagcc acacaaatat caactactaa ataacatcaa 240
ccaaagtgat tgattatcat aaaattttgt tgttttatta aatgggaaaa aaataaattt 300
ttgaaatcca taaaagagca taggggcata gagatgttaa acaataaaaa gcggaatttt 360
gcatctgtcg gttgggtaaa ttttacaata tacattccaa taataattat tcccagagat 420
aacctaatat caagtttcca gtcactctga cgtggaatca catgttttca tttgagaaac 480
atacacgctc aaaaatagcg cttccatcaa ttaaaatata cacaacgaac ttatactcta 540
ataataatat ataatagaaa acaaaataaa tgaaatgact ataccgaaac cggtacatac 600
ccgtagtcgt ttttacagta ccttcagtaa cccttactat atttcaaaaa tcataacttc 660
aattattaca tcaatccaga tcaagaaatt gtactctaaa ataagatatt ttaaatttat 720
taatttatgt acaataaatc aatttcgttt cgtaccttat gacgttaaag cattcaaatg 780
gtatagggca ctggcggtac tgtgataaaa aaataataat ttactaacta aagaggtgag 840
cctccatccc attcttcaga aagctcttct tcagattcag tcattgtgag attattatta 900
ttgttgatgt ttttgttctt atgcctgata gaaagatctt caggttcggt ctgctcaggc 960
aacgaaaggt acgcagggat aacgtttaca agagcttgcg cttttctgtc cctcgagtcg 1020
cacttgtgat gcaggaggtg gtgtctcctt ctgaatttgg caccgcacaa tccgcagccg 1080
aatggttttt ctcccttgtg aattagagaa tgggccttga gctggttgga atcagcgaac 1140
ctcgaggaac agacttggca agcgtaaggc cgttctccgg tatgtacccg taggtgtctc 1200
ctcaagttgg ctacttgcac gaagtacctg tcgcagtggt cgcaatggta aggcttctcg 1260
ccagtgtgtg tgcgtatgtg ggtgcggaga tggtggtccc gtcgaaacct tctgtggcac 1320
tcggggcact cgaacggccg ttctccagtg tgggttcttt cgtgattttt gagaacgtgc 1380
ttatgcttga aggactggtt acaagtgagg cagacgaaag ctctgtccct cccaggagga 1440
gagtcttcgt ccttcttctt cctccctaca ggctctggag gtggagctgc ccagagcaaa 1500
gagtgcgaga atagggagcc gcctccgatc ccgtggagag ccaaaagtcc tggcattccg 1560
gctgccagaa gaccggcctc tggaccgttt tcttctcgtt tgcttgcttc cttcattgtg 1620
caccttccga cgcctactac tgaagtcaag cccttggttg ggttgttggt tgcgtgtatg 1680
agagacaagg ccatggaggt gttatagaga cgaaggcatg gcaggaac 1728
<210> 2
<211> 288
<212> PRT
<213> Euschistus heros
<400> 2
Met Ala Leu Ser Leu Ile His Ala Thr Asn Asn Pro Thr Lys Gly Leu
1 5 10 15
Thr Ser Val Val Gly Val Gly Arg Cys Thr Met Lys Glu Ala Ser Lys
20 25 30
Arg Glu Glu Asn Gly Pro Glu Ala Gly Leu Leu Ala Ala Gly Met Pro
35 40 45
Gly Leu Leu Ala Leu His Gly Ile Gly Gly Gly Ser Leu Phe Ser His
50 55 60
Ser Leu Leu Trp Ala Ala Pro Pro Pro Glu Pro Val Gly Arg Lys Lys
65 70 75 80
Lys Asp Glu Asp Ser Pro Pro Gly Arg Asp Arg Ala Phe Val Cys Leu
85 90 95
Thr Cys Asn Gln Ser Phe Lys His Lys His Val Leu Lys Asn His Glu
100 105 110
Arg Thr His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Glu Cys Pro Glu Cys His Arg
115 120 125
Arg Phe Arg Arg Asp His His Leu Arg Thr His Ile Arg Thr His Thr
130 135 140
Gly Glu Lys Pro Tyr His Cys Asp His Cys Asp Arg Tyr Phe Val Gln
145 150 155 160
Val Ala Asn Leu Arg Arg His Leu Arg Val His Thr Gly Glu Arg Pro
165 170 175
Tyr Ala Cys Gln Val Cys Ser Ser Arg Phe Ala Asp Ser Asn Gln Leu
180 185 190
Lys Ala His Ser Leu Ile His Lys Gly Glu Lys Pro Phe Gly Cys Gly
195 200 205
Leu Cys Gly Ala Lys Phe Arg Arg Arg His His Leu Leu His His Lys
210 215 220
Cys Asp Ser Arg Asp Arg Lys Ala Gln Ala Leu Val Asn Val Ile Pro
225 230 235 240
Ala Tyr Leu Ser Leu Pro Glu Gln Thr Glu Pro Glu Asp Leu Ser Ile
245 250 255
Arg His Lys Asn Lys Asn Ile Asn Asn Asn Asn Asn Leu Thr Met Thr
260 265 270
Glu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Glu Glu Trp Asp Gly Gly Ser Pro Leu
275 280 285
<210> 3
<211> 434
<212> DNA
<213> Euschistus heros
<400> 3
gagcttgcgc ttttctgtcc ctcgagtcgc acttgtgatg caggaggtgg tgtctccttc 60
tgaatttggc accgcacaat ccgcagccga atggtttttc tcccttgtga attagagaat 120
gggccttgag ctggttggaa tcagcgaacc tcgaggaaca gacttggcaa gcgtaaggcc 180
gttctccggt atgtacccgt aggtgtctcc tcaagttggc tacttgcacg aagtacctgt 240
cgcagtggtc gcaatggtaa ggcttctcgc cagtgtgtgt gcgtatgtgg gtgcggagat 300
ggtggtcccg tcgaaacctt ctgtggcact cggggcactc gaacggccgt tctccagtgt 360
gggttctttc gtgatttttg agaacgtgct tatgcttgaa ggactggtta caagtgaggc 420
agacgaaagc tctg 434
<210> 4
<211> 605
<212> DNA
<213> Euschistus heros
<400> 4
aaacattgat cgaaaagcca cacaaatatc aactactaaa taacatcaac caaagtgatt 60
gattatcata aaattttgtt gttttattaa atgggaaaaa aataaatttt tgaaatccat 120
aaaagagcat aggggcatag agatgttaaa caataaaaag cggaattttg catctgtcgg 180
ttgggtaaat tttacaatat acattccaat aataattatt cccagagata acctaatatc 240
aagtttccag tcactctgac gtggaatcac atgttttcat ttgagaaaca tacacgctca 300
aaaatagcgc ttccatcaat taaaatatac acaacgaact tatactctaa taataatata 360
taatagaaaa caaaataaat gaaatgacta taccgaaacc ggtacatacc cgtagtcgtt 420
tttacagtac cttcagtaac ccttactata tttcaaaaat cataacttca attattacat 480
caatccagat caagaaattg tactctaaaa taagatattt taaatttatt aatttatgta 540
caataaatca atttcgtttc gtaccttatg acgttaaagc attcaaatgg tatagggcac 600
tggcg 605
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子寡核苷酸
<400> 5
taatacgact cactataggg 20
<210> 6
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> YFP hpRNA形成序列
<400> 6
atgtcatctg gagcacttct ctttcatggg aagattcctt acgttgtgga gatggaaggg 60
aatgttgatg gccacacctt tagcatacgt gggaaaggct acggagatgc ctcagtggga 120
aaggactagt accggttggg aaaggtatgt ttctgcttct acctttgata tatatataat 180
aattatcact aattagtagt aatatagtat ttcaagtatt tttttcaaaa taaaagaatg 240
tagtatatag ctattgcttt tctgtagttt ataagtgtgt atattttaat ttataacttt 300
tctaatatat gaccaaaaca tggtgatgtg caggttgatc cgcggttact ttcccactga 360
ggcatctccg tagcctttcc cacgtatgct aaaggtgtgg ccatcaacat tcccttccat 420
ctccacaacg taaggaatct tcccatgaaa gagaagtgct ccagatgaca t 471
<210> 7
<211> 222
<212> DNA
<213> Solanum tuberosum
<400> 7
gactagtacc ggttgggaaa ggtatgtttc tgcttctacc tttgatatat atataataat 60
tatcactaat tagtagtaat atagtatttc aagtattttt ttcaaaataa aagaatgtag 120
tatatagcta ttgcttttct gtagtttata agtgtgtata ttttaattta taacttttct 180
aatatatgac caaaacatgg tgatgtgcag gttgatccgc gg 222
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物BSB_kr-1-F
<400> 8
ttaatacgac tcactatagg gagacagagc tttcgtctgc ctcac 45
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物BSB_kr-1-R
<400> 9
ttaatacgac tcactatagg gagagagctt gcgcttttct gtcc 44
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物BSB_kr-2-F
<400> 10
ttaatacgac tcactatagg gagacgccag tgccctatac catttga 47
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物BSB_kr-2-R
<400> 11
ttaatacgac tcactatagg gagaaaacat tgatcgaaaa gccacac 47
<210> 12
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> YFPv2 dsRNA的有义链
<400> 12
catctggagc acttctcttt catgggaaga ttccttacgt tgtggagatg gaagggaatg 60
ttgatggcca cacctttagc atacgtggga aaggctacgg agatgcctca gtgggaaagg 120
ttgatgcaca gttcatctgc acaactggtg atgttcctgt gccttggagc acacttgtca 180
ccactctcac ctatggagca cagtgctttg ccaagtatgg tccagagttg aaggacttct 240
acaagtcctg tatgccagat ggctatgtgc aagagcgcac aatcaccttt gaaggagatg 300
g 301
<210> 13
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YFPv2-F
<400> 13
ttaatacgac tcactatagg gagagcatct ggagcacttc tctttca 47
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物YFPv2-R
<400> 14
ttaatacgac tcactatagg gagaccatct ccttcaaagg tgattg 46
<210> 15
<211> 1728
<212> RNA
<213> Euschistus heros
<400> 15
aggagcaaua aucucaauuu cugaauuuuu uuacuuaaac cacuuucauu cucaccggcu 60
caauuauagu uaaaaaucag cugauauauu uucacugaua uaacccaacc ugauuaacuu 120
aaacacuuaa guaauaauua caagaauuaa cgguuagaga guuacucaaa caaauuuugu 180
aaaaucuuau caaacauuga ucgaaaagcc acacaaauau caacuacuaa auaacaucaa 240
ccaaagugau ugauuaucau aaaauuuugu uguuuuauua aaugggaaaa aaauaaauuu 300
uugaaaucca uaaaagagca uaggggcaua gagauguuaa acaauaaaaa gcggaauuuu 360
gcaucugucg guuggguaaa uuuuacaaua uacauuccaa uaauaauuau ucccagagau 420
aaccuaauau caaguuucca gucacucuga cguggaauca cauguuuuca uuugagaaac 480
auacacgcuc aaaaauagcg cuuccaucaa uuaaaauaua cacaacgaac uuauacucua 540
auaauaauau auaauagaaa acaaaauaaa ugaaaugacu auaccgaaac cgguacauac 600
ccguagucgu uuuuacagua ccuucaguaa cccuuacuau auuucaaaaa ucauaacuuc 660
aauuauuaca ucaauccaga ucaagaaauu guacucuaaa auaagauauu uuaaauuuau 720
uaauuuaugu acaauaaauc aauuucguuu cguaccuuau gacguuaaag cauucaaaug 780
guauagggca cuggcgguac ugugauaaaa aaauaauaau uuacuaacua aagaggugag 840
ccuccauccc auucuucaga aagcucuucu ucagauucag ucauugugag auuauuauua 900
uuguugaugu uuuuguucuu augccugaua gaaagaucuu cagguucggu cugcucaggc 960
aacgaaaggu acgcagggau aacguuuaca agagcuugcg cuuuucuguc ccucgagucg 1020
cacuugugau gcaggaggug gugucuccuu cugaauuugg caccgcacaa uccgcagccg 1080
aaugguuuuu cucccuugug aauuagagaa ugggccuuga gcugguugga aucagcgaac 1140
cucgaggaac agacuuggca agcguaaggc cguucuccgg uauguacccg uaggugucuc 1200
cucaaguugg cuacuugcac gaaguaccug ucgcaguggu cgcaauggua aggcuucucg 1260
ccagugugug ugcguaugug ggugcggaga uggugguccc gucgaaaccu ucuguggcac 1320
ucggggcacu cgaacggccg uucuccagug uggguucuuu cgugauuuuu gagaacgugc 1380
uuaugcuuga aggacugguu acaagugagg cagacgaaag cucugucccu cccaggagga 1440
gagucuucgu ccuucuucuu ccucccuaca ggcucuggag guggagcugc ccagagcaaa 1500
gagugcgaga auagggagcc gccuccgauc ccguggagag ccaaaagucc uggcauuccg 1560
gcugccagaa gaccggccuc uggaccguuu ucuucucguu ugcuugcuuc cuucauugug 1620
caccuuccga cgccuacuac ugaagucaag cccuugguug gguuguuggu ugcguguaug 1680
agagacaagg ccauggaggu guuauagaga cgaaggcaug gcaggaac 1728
<210> 16
<211> 434
<212> RNA
<213> Euschistus heros
<400> 16
gagcuugcgc uuuucugucc cucgagucgc acuugugaug caggaggugg ugucuccuuc 60
ugaauuuggc accgcacaau ccgcagccga augguuuuuc ucccuuguga auuagagaau 120
gggccuugag cugguuggaa ucagcgaacc ucgaggaaca gacuuggcaa gcguaaggcc 180
guucuccggu auguacccgu aggugucucc ucaaguuggc uacuugcacg aaguaccugu 240
cgcagugguc gcaaugguaa ggcuucucgc cagugugugu gcguaugugg gugcggagau 300
gguggucccg ucgaaaccuu cuguggcacu cggggcacuc gaacggccgu ucuccagugu 360
ggguucuuuc gugauuuuug agaacgugcu uaugcuugaa ggacugguua caagugaggc 420
agacgaaagc ucug 434
<210> 17
<211> 605
<212> RNA
<213> Euschistus heros
<400> 17
aaacauugau cgaaaagcca cacaaauauc aacuacuaaa uaacaucaac caaagugauu 60
gauuaucaua aaauuuuguu guuuuauuaa augggaaaaa aauaaauuuu ugaaauccau 120
aaaagagcau aggggcauag agauguuaaa caauaaaaag cggaauuuug caucugucgg 180
uuggguaaau uuuacaauau acauuccaau aauaauuauu cccagagaua accuaauauc 240
aaguuuccag ucacucugac guggaaucac auguuuucau uugagaaaca uacacgcuca 300
aaaauagcgc uuccaucaau uaaaauauac acaacgaacu uauacucuaa uaauaauaua 360
uaauagaaaa caaaauaaau gaaaugacua uaccgaaacc gguacauacc cguagucguu 420
uuuacaguac cuucaguaac ccuuacuaua uuucaaaaau cauaacuuca auuauuacau 480
caauccagau caagaaauug uacucuaaaa uaagauauuu uaaauuuauu aauuuaugua 540
caauaaauca auuucguuuc guaccuuaug acguuaaagc auucaaaugg uauagggcac 600
uggcg 605
<210> 18
<211> 1134
<212> DNA
<213> Euschistus heros
<400> 18
tacaaaatgt gtgacgaaga agttgctgct ttagttgtag acaatggatc tggtatgtgc 60
aaagccggtt tcgctggaga tgatgcaccc cgagctgtat tcccatcaat tgttggcagg 120
cctagacacc agggtgtcat ggttggaatg ggacaaaagg acagttatgt tggagacgaa 180
gcccaaagca agagaggtat cctcaccctg aaatacccca ttgaacacgg tatcatcacc 240
aactgggacg acatggaaaa gatctggcat cacaccttct acaacgagct gcgagtcgct 300
ccagaggaac accccatcct cctgactgag gctcccctca accccaaagc caacagggag 360
aagatgaccc agatcatgtt tgagaccttc aacaccccag ccatgtatgt cgccatccag 420
gctgtactct ccctctatgc ctccggtcgt actaccggta ttgtacttga ctcaggagat 480
ggtgtctccc acaccgtacc catctatgaa ggttatgccc ttccccacgc catcctccgt 540
ctggatcttg ctggacgtga cttgactgac tatcttatga agatcctcac cgagcgtggt 600
tacagcttca ccaccaccgc tgaaagggaa atcgtcaggg acatcaagga aaaactgtgc 660
tatgtcgccc tggactttga gcaggaaatg gccaccgccg ctgcctccac ctccctggag 720
aagtcctatg aacttcccga cggtcaggtc atcaccatcg gtaacgagag gttccgttgc 780
ccagaggctc tcttccagcc ttccttcttg ggtatggaat cttgcggtat ccatgagact 840
gtctacaact ccatcatgaa gtgcgacgtt gacatcagga aggacttgta cgccaacacc 900
gtcctctccg gaggtaccac catgtaccca ggtattgctg acaggatgca gaaggaaatc 960
accgccctcg ctccttcaac catcaagatc aagatcattg ctcccccaga aaggaagtac 1020
tccgtatgga tcggtggttc catcttggct tccctgtcca ccttccagca gatgtggatc 1080
tccaagcagg aatacgacga atccggccca ggcatcgtcc accgcaaatg cttc 1134
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Actin-F
<400> 19
tcaaggaaaa actgtgctat gt 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Actin-R
<400> 20
taccgatggt gatgacctga 20
<210> 21
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针Actin-FAM
<400> 21
accgccgctg cc 12

Claims (56)

1.一种分离的核酸分子，其包含至少一种选自下组的多核苷酸：
SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:1的互补物；SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸的片段；SEQID NO:1的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；包含SEQ ID NO:1的半翅目生物的天然编码序列；包含SEQ ID NO:1的半翅目生物的天然编码序列的互补物；被转录为包含SEQ IDNO:1的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列；被转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的互补物；包含SEQ ID NO:1的半翅目生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:1的半翅目生物的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；被转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；以及被转录为包含SEQ ID NO:1的天然RNA分子的半翅目生物的天然非编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补物，
其中所述多核苷酸与异源启动子可操作连接。
2.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸选自下组：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3和SEQID NO:4。
3.一种植物转化载体，其包含权利要求1的多核苷酸。
4.权利要求1的多核苷酸，其中所述生物选自下组：英雄美洲蝽[Euschistus heros(Fabr.)](新热带褐蝽)、稻绿蝽(Nezara viridula)(L.)(南方绿椿象)、盖德拟壁蝽[Piezodorus guildinii(Westwood)](红带椿象)、茶翅蝽[Halyomorpha halys](棕色大理石椿象)、绿蝽[Chinavia hilare(Say)](绿色椿象)、褐椿象[Euschistus servus(Say)](棕色椿象)、Dichelops melacanthus(Dallas)、Dichelops furcatus(F.)、Edessameditabunda(F.)、Thyanta perditor(F.)(新热带红肩椿象)、Chinavia marginatum(Palisot de Beauvois)、Horcias nobilellus(Berg)(棉红蝽)、Taedia stigmosa(Berg)、秘鲁红蝽(Dysdercus peruvianus)(Guerin-Meneville)、Neomegalotomus parvus(Westwood)、Leptoglossus zonatus(Dallas)、Niesthrea sidae(F.)、豆荚草盲蝽(Lygushesperus)(Knight)(西方牧草盲蝽)、和牧草盲蝽[美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)(Palisot de Beauvois)]。
5.从权利要求1的多核苷酸转录的核糖核酸(RNA)分子。
6.从权利要求1的多核苷酸的表达产生的双链核糖核酸分子。
7.权利要求6的双链核糖核酸分子，其中使所述多核苷酸序列与半翅目害虫接触可抑制与所述多核苷酸特异性互补的内源核苷酸序列的表达。
8.权利要求7的双链核糖核酸分子，其中使所述核糖核苷酸分子与半翅目害虫接触可杀死害虫或抑制害虫的生长、生殖和/或进食。
9.权利要求6的双链RNA，其包含第一、第二和第三RNA区段，其中所述第一RNA区段包含所述多核苷酸，其中所述第三RNA区段通过所述第二多核苷酸序列连接到所述第一RNA区段，以及其中所述第三RNA区段基本上是所述第一RNA区段的反向互补物，使得所述第一和第三RNA区段在被转录成核糖核酸时杂交而形成所述双链RNA。
10.权利要求5的RNA，其选自由长度为约15个至约30个核苷酸的双链核糖核酸分子和单链核糖核酸分子构成的组。
11.包含权利要求1的多核苷酸的植物转化载体，其中所述异源启动子在植物细胞中有功能。
12.用权利要求1的多核苷酸转化的细胞。
13.权利要求12的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
14.权利要求12的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
15.权利要求14的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
16.用权利要求1的多核苷酸转化的植物。
17.权利要求16的植物的种子，其中所述种子包含所述多核苷酸。
18.从权利要求16的植物生产的商业产品，其中该商业产品包含可检测量的所述多核苷酸。
19.权利要求16的植物，其中所述至少一种多核苷酸在该植物中表达为双链核糖核酸分子。
20.权利要求15的细胞，其中所述细胞是玉米细胞、大豆细胞或来自棉属的细胞。
21.权利要求16的植物，其中所述植物是玉米、大豆或棉花。
22.权利要求16的植物，其中所述至少一种多核苷酸在该植物中表达为核糖核酸分子，且当半翅目害虫摄食该植物的一部分时，该核糖核酸分子抑制与该至少一种多核苷酸特异性互补的内源多核苷酸的表达。
23.权利要求1的多核苷酸，还包含至少一种另外的多核苷酸，所述另外的多核苷酸编码抑制内源害虫基因的表达的RNA分子。
24.权利要求23的多核苷酸，其中所述另外的多核苷酸编码导致亲代RNAi表型的iRNA分子。
25.权利要求24的多核苷酸，其中所述另外的多核苷酸编码抑制brahma或hunchback基因的表达的iRNA分子。
26.权利要求23的多核苷酸，其中所述另外的多核苷酸编码这样的iRNA分子，该iRNA分子导致与其接触的半翅目害虫的生长和/或发育的降低和/或死亡(致死性RNAi)。
27.一种植物转化载体，其包含权利要求23的多核苷酸，其中每个所述另外的多核苷酸在植物细胞中有功能的异源启动子可操作连接。
28.一种用于控制半翅目害虫群体的方法，所述方法包括提供包含核糖核酸(RNA)分子的作用剂，所述RNA分子与半翅目害虫接触时起作用以抑制半翅目害虫内的生物学功能，其中RNA与选自下组的多核苷酸可特异性地杂交：SEQ ID NO:15-17；SEQ ID NO:15-17中任一者的互补物；SEQ ID NO:15-17中任一者的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:15-17中任一者的至少15个连续核苷酸的片段的互补物；SEQ ID NO:1的转录物；SEQ ID NO:1的转录物的互补物；SEQ ID NO:1的转录物的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:1的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。
29.根据权利要求28的方法，其中所述作用剂是双链RNA分子。
30.一种控制半翅目害虫群体的方法，所述方法包括：
向半翅目害虫中引入核糖核酸(RNA)分子，所述核糖核酸(RNA)分子在与半翅目害虫接触时起作用以抑制半翅目害虫内的生物学功能，其中所述RNA与选自由下述任何者组成的组的多核苷酸可特异性地杂交：
SEQ ID NO:15-17，
SEQ ID NO:15-17任一者的互补物，
SEQ ID NO:15-17任一者的至少15个连续核苷酸的片段，
SEQ ID NO:15-17任一者的至少15个连续核苷酸的片段的互补物，
SEQ ID NO:1的转录物，
SEQ ID NO:1转录物的互补物，
SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸的片段，以及
SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸的片段的互补物，
从而产生具有pRNAi表型的半翅目害虫。
31.根据权利要求30的方法，其中所述RNA被引入雄性半翅目害虫中。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述RNA被引入雌性半翅目害虫中，所述方法还包括将具有pRNAi表型的雌性半翅目害虫释放到害虫群体中，其中具有pRNAi表型的雌性半翅目害虫与所述群体的雄性害虫之间的交配产生的有存活力的后代比其他雌性害虫与所述群体的雄性害虫之间的交配产生的有存活力的后代少。
33.一种控制半翅目害虫群体的方法，所述方法包括：
提供包含第一和第二多核苷酸序列的作用剂，所述作用剂在与半翅目害虫接触时起作用以抑制半翅目害虫内的生物学功能，其中所述第一多核苷酸序列包含这样的区域，所述区域与SEQ ID NO:15的约19个至约30个连续核苷酸展现出约90％至约100％的序列同一性，其中所述第一多核苷酸序列与所述第二多核苷酸序列特异性地杂交。
34.根据权利要求33的方法，其中所述核酸分子是双链核酸分子。
35.根据权利要求33所述的方法，其中，相对于侵染缺乏经转化的植物细胞的相同宿主植物物种的宿主植物的相同害虫物种的群体，所述半翅目害虫群体减小。
36.一种控制半翅目害虫群体的方法，所述方法包括：
在半翅目害虫的宿主植物中提供包含权利要求1的多核苷酸的经转化的植物细胞，其中所述多核苷酸被表达以产生核糖核酸分子，所述核糖核酸分子在与属于该群体的半翅目害虫接触时起作用以抑制该半翅目害虫中的靶序列的表达，并导致所述半翅目害虫或害虫群体的生殖相对于不包含所述多核苷酸的相同宿主植物物种的植物上的相同害虫物种的生殖降低。
37.根据权利要求36的方法，其中所述核糖核酸分子是双链核糖核酸分子。
38.根据权利要求36所述的方法，其中，相对于侵染缺乏所述经转化的植物细胞的相同物种的宿主植物的半翅目害虫群体，所述半翅目害虫群体减小。
39.一种控制植物中半翅目害虫侵染的方法，所述方法包括在半翅目害虫的饵食中提供与选自下组的多核苷酸可特异性杂交的核糖核酸(RNA)：
SEQ ID NO:15-17，
SEQ ID NO:15-17任一者的互补物，
SEQ ID NO:15-17任一者的至少15个连续核苷酸的片段，
SEQ ID NO:15-17任一者的至少15个连续核苷酸的片段的互补物，
SEQ ID NO:1的转录物，
SEQ ID NO:1转录物的互补物，
SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸的片段，以及
SEQ ID NO:1的至少15个连续核苷酸的片段的互补物。
40.根据权利要求39的方法，其中所述饵食包含经转化而表达所述多核苷酸的植物细胞。
41.根据权利要求39的方法，其中可特异性杂交的RNA包含在双链RNA分子中。
42.一种用于改善玉米作物产量的方法，所述方法包括：
将权利要求1的核酸引入玉米植物中以产生转基因玉米植物；和
栽培所述玉米植物以允许所述至少一种多核苷酸的表达；其中所述至少一种多核苷酸的表达抑制半翅目害虫的生殖或生长以及由于该半翅目害虫感染所致的产量损失。
43.根据权利要求42的方法，其中所述至少一种多核苷酸的表达产生RNA分子，所述RNA分子阻抑已接触该植物的一部分的半翅目害虫中的至少第一靶基因的表达。
44.一种用于产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
用包含权利要求1的核酸的载体转化植物细胞；
在足以允许生发出包含多个经转化的植物细胞的植物细胞培养物的条件下培养经转化的植物细胞；
选择已将所述至少一种多核苷酸整合到其基因组中的经转化的植物细胞；
对所述经转化的植物细胞筛选由所述至少一种多核苷酸编码的核糖核酸(RNA)分子的表达；和
选择表达所述RNA的植物细胞。
45.根据权利要求44的方法，其中所述RNA分子是双链RNA分子。
46.一种用于产生半翅目害虫抗性转基因植物的方法，所述方法包括：
提供通过权利要求44的方法产生的转基因植物细胞；和
从所述转基因植物细胞再生转基因植物，其中由所述至少一种多核苷酸编码的核糖核酸分子的表达足以调变与经转化的植物接触的半翅目害虫中的靶基因的表达。
47.一种用于产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
用载体转化植物细胞，所述载体包含用于保护植物免遭半翅目害虫的手段；
在足以允许生发出包含多个经转化的植物细胞的植物细胞培养物的条件下培养经转化的植物细胞；
选择已在其基因组中整合了所述用于保护植物免遭半翅目害虫的手段的经转化的植物细胞；
对经转化的植物细胞筛选用于抑制半翅目害虫中必需基因表达的手段的表达；和
选择表达所述用于抑制半翅目害虫中必需基因表达的手段的植物细胞。
48.一种用于产生半翅目害虫抗性转基因植物的方法，所述方法包括：
提供通过权利要求47的方法产生的转基因植物细胞；和
从所述转基因植物细胞再生转基因植物，其中所述用于抑制半翅目害虫中必需基因表达的手段的表达足以调变与经转化的植物接触的半翅目害虫中靶基因的表达。
49.权利要求1的核酸，还包含编码来自苏云金芽孢杆菌的多肽或PIP-1多肽的多核苷酸。
50.权利要求49的核酸，其中来自苏云金芽孢杆菌的多肽选自包括下述者的组：CrylA、Cry2A、Cry3A、Cry11A、和Cry51A。
51.权利要求15的细胞，其中所述细胞包含编码来自苏云金芽孢杆菌的多肽或PIP-1多肽的多核苷酸。
52.权利要求51的细胞，其中来自苏云金芽孢杆菌的多肽选自包括下述者的组：CrylA、Cry2A、Cry3A、Cry11A、和Cry51A。
53.权利要求16的植物，其中所述植物包含编码来自苏云金芽孢杆菌的多肽或PIP-1多肽的多核苷酸。
54.权利要求53的植物，其中来自苏云金芽孢杆菌的多肽选自包括下述者的组：CrylA、Cry2A、Cry3A、Cry11A、和Cry51A。
55.根据权利要求44的方法，其中所述经转化的植物细胞包含编码来自苏云金芽孢杆菌的多肽或PIP-1多肽的核苷酸序列。
56.根据权利要求55的方法，其中来自苏云金芽孢杆菌的多肽选自包括下述者的组：CrylA、Cry2A、Cry3A、Cry11A、和Cry51A。
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