CN107406513A - 双链分子(bipartite)及其于治疗异常蛋白聚集的用途 - Google Patents

Abstract

包括胜肽亲和性部分及至少一个带电部分之双链(Bipartite)分子及其于减少异常蛋白聚集体形成及治疗与此异常蛋白聚集体相关的疾病(包含特征在于蛋白聚集体形成的神经退化性疾病)的用途。

Description

双链分子(BIPARTITE)及其于治疗异常蛋白聚集的用途

相关申请案交叉参照

本PCT申请案根据35U.S.C.§119主张2014年7月25日申请的美国临时申请案第62/029,030号的权利。所述先前申请案的全部内容以引用的方式并入本文中。

背景技术

诸如阿兹海默氏症(AD)、杭丁顿氏舞蹈症(HD)、共核蛋白症(例如，帕金森氏症(PD)及路易氏体失智(DLB))、Tau蛋白症(tauopathy)(例如，匹克氏症、进行性核上性麻痹、皮质基底变性及与染色体17相关的额颞叶痴呆症及帕金森氏症)、TDP-43蛋白症(例如，肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)与具有泛素化包涵体的额颞叶变性(FTLD-U))及库贾氏症(CJD)的神经退化性疾病的特征在于病原蛋白的异常聚集，此导致包涵体(IBs)的形成。最近，已建立异常蛋白聚集体的类普立昂蛋白(prion)行为，所述行为显示此等IBs不仅充当诊断性病理标志物，亦于此等疾病的发病原理中发挥重要作用。

由于神经退化性疾病通常与年龄相关，因此其等主要影响处于中年至晚年生活的病患。预期神经退化性疾病的发生率将随人口年龄增大而增加。由于未充分了解许多神经退化性疾病的病程，因此目前仍无针对此等疾病的治愈方法。因此发展针对神经退化性疾病的有效治疗方法极为重要。

发明内容

本发明是(至少部分)基于以下意外发现：大量双链分子(例如，polyR-Aβ40(25-35)-PEI、V24P(10-40)-PEI及polyR-polyQ)成功减少异常蛋白聚集并于杭丁顿氏舞蹈症及阿兹海默氏症(APP/PS1)的鼠类模型中证实有利的治疗作用。更具体言之，发现polyR-polyQ结合突变杭丁顿氏(mHtt)蛋白聚集体；降低经mHtt介导的毒性并延迟于杭丁顿氏疾病的R6/2鼠类模型中观察到的神经性功能障碍的发病及进展。此外，发现polyR-Aβ40(25-35)-PEI及V24P(10-40)-PEI减轻小鼠神经母细胞瘤细胞中的Aβ₄₀细胞毒性；预防记忆力退化并降低阿兹海默氏症的APP/PS1转基因鼠类模型的脑中的Aβ斑块程度。本文描述的双链分子全部含有可结合至异常蛋白聚集体或其组分(例如，所述聚集体的单体)的亲和性部分(例如，polyQ部分、Aβ40(25-35)部分及V24P(10-40)部分)及带电部分(例如，polyR部分或PEI部分)。

因此，本发明的一态样涉及一种双链分子，其包括(i)结合至与疾病相关的异常蛋白聚集体或其组分的胜肽亲和性部分；及(ii)至少含一带电部分。所述亲和性部分(例如，共价)连接至所述至少一个带电部分。在一些实例中，本文描述的双链分子可含有一个可结合至所述胜肽亲和性部分的N端或C端的带电部分(例如，带电胜肽片段)。在其他实例中，本文描述的双链分子可含有两个带电部分(例如，相同或不同)，一者是结合至所述胜肽亲和性部分的N端及另一者是结合至所述胜肽亲和性部分的C端。

在一些实施例中，所述胜肽亲和性部分结合与神经退化性疾病(例如，阿兹海默氏症、杭丁顿氏舞蹈症、共核蛋白症(例如，帕金森氏症与路易氏体失智)、Tau蛋白症(例如，匹克氏症、进行性核上性麻痹、皮质基底变性及与染色体17相关的额颞叶痴呆症及帕金森氏症)、TDP-43蛋白症(例如，肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性-TDP-43蛋白症、额颞叶变性-Tau蛋白症、匹克氏症、皮质基底变性、进行性核上性麻痹、具有泛素化包涵体的FTDP-17(FTLD-U))或库贾氏症)相关的异常蛋白聚集体或其组分。

在一些实例中，所述双链分子的胜肽部分是可干扰类淀粉β或TDP蛋白聚集的类淀粉β或TDP-43的片段。类淀粉β的所述片段可包括可干扰类淀粉β蛋白聚集的GSNKGAIIGLM(SEQ ID NO:1)或YEVHHQKLVFFAED^DPGSNKGAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO:2)(^DP是指脯胺酸的D-型)的氨基酸序列。

在其他实例中，本文描述的双链分子的胜肽亲和性部分可是聚麸酰胺酸(PolyQ)片段(含有(例如)5至20个Q残基，诸如10个Q或15个Q残基)，所述片段可结合至杭丁顿氏蛋白的polyQ延伸物，从而预防异常蛋白聚集体的形成。

在本文描述的任何双链分子中，所述双链分子的所述至少一个带电部分可是聚精胺酸(PolyR)片段(含有(例如)至少5、8、10或12个R残基)或聚乙烯亚胺(PEI)。在一些实施例中，这些双链分子可含有超过2个(例如，2、3或更多个)带电部分。如本文描述的双链分子的实例包含(但不限于)：

RRRRRRRRGSNKGAIIGLM(SEQ ID NO:3)；

YEVHHQKLVFFAED^DPGSNKGAIIGLMVGGVV-PEI(SEQ ID NO:5)；

RRRRRRRRWDQQQQQQQQQQ(SEQ ID NO:6)；

RRRRRRRRWDQQQQQQQQQQQQQQQ(SEQ ID NO:7)；或

RRRRRRRRGSNKGAIIGLM-PEI(SEQ ID NO:4)。

在另一态样中，本发明提供一种医药组合物，其包括一或多种如本文描述的双链分子及医药上可接受的载剂。

在又另一态样中，本发明提供一种用于减少与疾病(例如，神经退化性疾病)相关的异常蛋白聚集体的形成或治疗此类疾病的方法，所述方法包括向需所述治疗的个体投与(例如，经由鼻内途径)有效量的一或多种如本文描述的双链分子。在一些实例中，所述个体患有神经退化性疾病、怀疑患有神经退化性疾病或存在患有神经退化性疾病风险的人类病患，所述神经退化性疾病是例如，阿兹海默氏症、杭丁顿氏舞蹈症、帕金森氏症、路易氏体失智、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、额颞叶变性-TDP-43蛋白症、额颞叶变性-Tau蛋白症、匹克氏症、皮质基底变性、进行性核上性麻痹、FTDP-17及/或库贾氏症。

在一些实例中，所述神经退化性疾病是阿兹海默氏症(AD)且用于治疗AD的双链分子包括具有氨基酸序列GSNKGAIIGLM(SEQ ID NO:1)或YEVHHQKLVFFAED^DPGSNKGAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO:2)的亲和性部分。此类双链分子可是RRRRRRRRGSNKGAIIGLM(SEQ ID NO:3)、RRRRRRRRGSNKGAIIGLM-PEI(SEQ ID NO:4)或YEVHHQKLVFFAED^DPGSNKGAIIGLMVGGVV-PEI(SEQ ID NO:5)。

在另一实例中，所述神经退化性疾病是杭丁顿氏舞蹈症且用于治疗所述疾病的双链分子包括具有PolyQ片段的亲和性部分。此类双链分子可是RRRRRRRRWDQQQQQQQQQQ(SEQID NO:6)或RRRRRRRRWDQQQQQQQQQQQQQQQ(SEQ ID NO:7)。

亦于本发明范围内的揭示内容是(a)用于干扰与疾病相关的异常蛋白聚集(例如，预防聚集体的形成或破坏现存聚集体)或治疗此类疾病的医药组合物，所述医药组合物包括医药上可接受的载剂及一或多种如本文描述的双链分子；及(b)任何医药组合物或双链分子在制造用于治疗与异常蛋白聚集相关的疾病的药物中的用途。此类疾病可是特征在于异常蛋白的神经退化性疾病，包含(但不限于)阿兹海默氏症、杭丁顿氏舞蹈症、帕金森氏症、路易氏体失智、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、额颞叶变性-TDP-43蛋白症、额颞叶变性-Tau蛋白症、匹克氏症、皮质基底变性、进行性核上性麻痹、FTDP-17及/或库贾氏症。

本揭示内容的一或多个实施例的细节阐述于下文说明中。本发明的其他特征或优点将自下列图式说明及若干实施例的实施方式及亦自随附申请专利范围而变得明显。

附图说明

图1：针对HD的治疗胜肽的模块化设计的示意图。

图2：藉由HPLC测定的治疗胜肽的稳定性。A：显示经测试的胜肽自第0天至第28天的滞留时间的图。B：显示经测试的胜肽在第0天及第28天的量的图。注意8R5Q及8R10Q于水中保持稳定达28天，但可溶8R15Q及8R20Q随时间逐渐减少。

图3：显示经测试的双链胜肽及109QmHtt聚集体的位置重迭的图。A区：用于本研究中的经TAMRA标记的8R10Q的结构。B区：经TAMRA-8R10Q(8R10Q)治疗的表达109QmHtt的Neuro2a细胞于各种时间点时的倒立荧光显微图。注意8R10Q及109QmHttGFP聚集体(GFP)自8至24小时(箭头)的位置重迭。比例尺：10μm。C区：根据指示经水或指定胜肽治疗的表达109QmHtt的Neuro2a于各种时间点时的TIRF显微图。注意经8R10Q及8R15Q治疗的细胞内的聚集体尺寸的减小。D区：经胜肽治疗后的8小时(左)及24小时(右)的Neuro2a中的个别聚集体的尺寸的定量。两个时间点下的尺寸藉由8R10Q或8R15Q胜肽显著减小。E区：经胜肽治疗后的12小时(左)及24小时(右)的20个Neuro2a细胞中的聚集体数的定量。8R10Q及8R15Q两者皆增加聚集体数。以单向ANOVA进行统计。**p<0.01；***p<0.001。

图4：测试治疗胜肽减少过度表达mHtt的Neuro2a细胞中的mHtt聚集的能力。A区：经109QmHtt构筑体转染后的8小时(T1)、24小时(T2)或两者(T1+2)下的过滤器陷阱分析及根据指示治疗的细胞的相应定量(B区)。当在T1或两个时间点而非单独于T2下治疗时，8R10Q及8R15Q两者均显著减少mHtt聚集体。C区：过度表达25QHtt或109QmHtt并根据指示经治疗的Neuro2a细胞的RIPA可溶(sol)及-不溶(ins)片段的西方墨点转渍法及定量(D区)。藉由8R10Q显著降低于可溶及不溶片段两者中的109QmHtt浓度。E区：根据指示治疗的细胞中的109QmHtt的西方墨点转渍法。注意MG132相对于减少不溶109QmHtt而阻挡8R10Q胜肽的作用。F区：经MG132(+):DMSO(-)治疗的细胞中的与胜肽相关的109QmHtt的比率的定量。以单向ANOVA进行统计分析，*<0.05；**<0.01；***<0.001，ns：不显著。

图5：8R10Q及8R15Q于109QmHtt表达细胞中的治疗作用。A区：于经H₂O₂以50μM及指定胜肽治疗的表达25QHtt(左)或109QmHtt(右)的Neuro2a细胞中藉由MTT的细胞存活率分析。B区：经指定胜肽治疗的表达25QHtt或109QmHtt的Neuro2a细胞的细胞生长曲线。右侧子区中的细胞在转染后16小时经H₂O₂以12.5μM进一步治疗。109QmHtt细胞生长慢于25QHtt细胞的细胞生长。8R10Q治疗藉由109QmHtt在经或未经H₂O₂治疗下救助Neuro2a细胞的缓慢生长。C区：经指定胜肽治疗的表达GFP-25QHtt或GFP-109QmHtt(GFP)的经视网酸分化的Neu2a细胞的相差及荧光影像的显微图。注意分化细胞的轴突。D区：具有轴突的分化细胞的百分率的定量。相对于25QHtt表达细胞，较少109QmHtt表达细胞具有轴突。8R10Q治疗可显著救助轴突赘疣中的缺陷。重复进行这些三重复实验两次。以单向ANOVA进行统计分析，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，ns：不显著。

图6：R6/2转基因小鼠的经8R10Q减轻的功能性退化。A区：经PBS或8R10Q胜肽治疗的野生型(WT)及R6/2小鼠的纵向滚轮运动性能。注意经8R10Q治疗的R6/2小鼠自11周龄的运动性退化的显著延迟。B区：13周龄的WT及R6/2小鼠的T型迷宫测试。8R10Q显著救助R6/2小鼠的记忆力减退。C区：根据指示治疗的WT及R6/2小鼠的血清中的血糖曲线。注意8R10Q治疗显著降低R6/2小鼠的血糖上升。D区：经PBS治疗相对于经8R10Q治疗的WT及R6/2小鼠的寿命。100％的R6/2小鼠于16周龄前死亡。8R10Q显著延长R6/2小鼠的寿命。WT小鼠N＝6只/组；R6/2小鼠N＝10只/组；以双向ANOVA(A及C区)、单向ANOVA(B区)进行统计分析，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，ns：不显著及对数秩(Mantel-Cox)测试(D)，***p<0.0001。

图7：藉由8R10Q胜肽减轻13周大的R6/2小鼠的神经元损伤。A区：WT及R6/2小鼠的皮质(CTX)的尼氏(Nissl)染色部分的显微图。分别藉由虚线及红色实线突出所述皮质及其厚度。B区：皮质厚度的定量。注意8R10Q逆转R6/2小鼠的皮质厚度的减小。C及E区：显微图(D区)及(F区)分别显示皮质及纹状体的尼氏染色部分的相应定量。注意8R10Q逆转神经元数量的减少。N＝3只/组，各条柱表示5个部分的平均值。以单向ANOVA进行统计分析，*p<0.05；***p<0.001，ns：不显著。

图8：藉由8R10Q胜肽治疗的13周大的R6/2小鼠的mHtt聚集体及神经胶质病理的减少。A区：具有EM48抗体的皮质(CTX)及纹状体的免疫染色部分的显微图及相应定量(B区)。棕色点显示mHtt聚集体。B区的左侧子区显示聚集体相占总面积的定量资料及右侧子区显示个别聚集体的强度。C区：具有抗GFAP抗体的R6/2小鼠的皮质的免疫荧光染色部分的照片。D区：GFAP强度的定量显示经8R10Q治疗的小鼠中显著减少。E区：具有抗Iba1抗体的WT及R6/2小鼠的皮质(CTX)及纹状体的免疫染色部分的显微图。F区：Iba1强度的定量揭示R6/2小鼠的Iba1免疫反应性的显著增加，此由8R10Q逆转。N＝3只/组。各条柱表示15个部分/小鼠组的平均值。针对B及D区以学生t检验进行统计，并以单向ANOVA进行统计，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，ns：不显著。

图9：藉由经25QHtt或109QmHtt转染并经指定胜肽治疗的Neuro2a中藉由定量RT-PCR获得的Htt mRNA的浓度的变化。以单向ANOVA进行统计分析，***p<0.001，ns：不显著。

图10：经设计的双链胜肽对纤维化(fibrillization)的抑制的影响。使这些胜肽溶解于含有150mM KCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7)中并在25℃下培养。针对Aβ40(A及D区)、R₈Aβ(25-35)(B及E区)、^DR₈-Aβ(25-35)(C及F区)及Aβ40与R₈-Aβ(25-35)的1:1混合物(G及J区)或Aβ40与^DR₈-Aβ(25-35)的1:1混合物(H及K区)拍摄的CD光谱及TEM影像。在指定培养时间下记录CD光谱。长期培养后拍摄TEM影像。I区：利用或不利用经设计的双链胜肽进行的Aβ40类淀粉形成的时间进程。

图11：藉由MTT分析进行的细胞存活率量测。A区：经DMSO(对照)、Aβ40、R₈-Aβ(25-35)或^DR₈-Aβ(25-35)治疗的Neuro2a细胞。B区：经DMSO(对照)、Aβ40及具有等莫耳R₈-Aβ(25-35)、^DR₈-Aβ(25-35)或Aβ(25-35)的Aβ40治疗的Neuro2a细胞。各条柱藉由三重复实验产生；所述研究重复3次。以经费雪LSD检验(Fisher’s LSD test)修正的单向ANOVA进行统计。***：p<0.001；****p<0.0001；ns：不显著。

图12：如藉由莫氏水迷宫分析(Morris water maze assay)量测的经R₈-Aβ(25-35)-PEI改善的记忆力。A区：自4月大至8月大经PEI或R₈-Aβ(25-35)胜肽治疗的8月大野生型(WT)及APP×PS1转基因(Tg)小鼠的寻找平台时间的图。注意藉由治疗胜肽治疗的Tg小鼠中寻找平台时间的显著缩短。B区：根据指示治疗的WT或Tg小鼠于其中常为隐藏平台的目标象限中游泳所耗费的时间百分率。指定小鼠通过目标象限的次数。R₈-Aβ(25-35)-PEI胜肽增加Tg小鼠在目标象限中的时间。C区：WT或Tg小鼠根据指示通过目标象限的次数的百分率。本研究中使用每组十只小鼠。以双向ANOVA及费雪LSD事后分析进行统计。N＝10只/组。*<0.05；***<0.0005；****<0.0001。

图13：针对经PEI或R₈-Aβ(25-35)-PEI治疗的8月大Tg小鼠的皮质(A区)及海马区(B区)中的Aβ40及Aβ42的浓度的ELISA分析。所述治疗胜肽显著减小两个区域中的Aβ40及Aβ42两者的浓度。N＝3/组；*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p<0.0001；ns：不显著。藉由学生t检验统计。

图14：4个月治疗后经鼻内递送的R₈-Aβ(25-35)-PEI对APP×PS1小鼠的Aβ清除的影响。自4月至8月龄用PEI或R₈-Aβ(25-35)-PEI治疗野生型(WT)及APP×PS1转基因(Tg)小鼠。A至E区显示脑片的ThS染色。

图15：针对自4月至8月龄经PEI或R₈-Aβ25-35-PEI胜肽治疗的8月大Tg小鼠的皮质(N＝3只/组)中的IL-6及IL-1β的浓度的分析。如图所示，所述治疗胜肽显著减小皮质中的介白素IL-6及IL-1β的浓度。N＝3只/组；**：P<0.01。藉由学生t检验统计。

图16：经PEI或R₈-Aβ(25-35)-PEI胜肽治疗8个月的12月大野生型(WT)对照小鼠及转基因(Tg)小鼠的MicroPET类淀粉影像。A区：与小鼠T2-加权MRI脑模板共注册的Tg小鼠脑的代表性PET影像。如图所示，经PEI治疗的Tg小鼠的脑相较于WT小鼠的脑在皮质(CT)、海马区(HP)及杏仁体(AMY)处具有更高类淀粉讯号。R₈-Aβ(25-35)-PEI胜肽治疗减少Tg小鼠的类淀粉讯号。B区：指定区域中的经¹¹C标记的Pittsburg化合物B(PIB)的讯号的定量。N＝6只每组，**<0.001；***<0.0005，以学生t检验进行统计。

图17：经PEI或R₈-Aβ(25-35)-PEI治疗8个月的12月大Tg小鼠的皮质及海马区中的总及不溶Aβ₄₀及Aβ₄₂的浓度的ELISA分析。皮质(A区)及海马区(B区)中的总Aβ₄₀及Aβ₄₂及皮质(C区)及海马区(D区)中的不溶Aβ₄₀及Aβ₄₂的ELISA分析。(N＝5只每组)。以学生t检验进行统计。**：p<0.01；***：p<0.001；ns，不显著。

图18：关于V24P(1-28)及V24P(10-40)的结构性研究。将30或60μM浓度的胜肽在25℃下培养指定时间(0至12天)，然后记录CD光谱(A及C区)及结合ThT后的荧光光谱(B及D区)。E区：在25℃下培养约1个月后的60μM V24P(1-28)及V24P(10-40)的电子显微术影像。

图19：关于V24P(13-36)、V24P(16-33)及V24P(19-30)的结构性研究。将这些胜肽以30、60或90μM的浓度溶解并立即记录其等CD光谱(A区)及结合ThT后的荧光光谱(B区)。

图20：细胞存活率分析。使用MTT分析量测以所述(等)指定胜肽培养的小鼠N2a细胞的存活率。A区：Aβ40与含有V24→^DP突变的经设计的胜肽的存活率的比较。B区：单独30μMAβ40或Aβ40连同30μM经设计的胜肽的存活率的比较。以条柱显示标准偏差(相较于Aβ40，藉由学生t检验针对所有其他资料的p<0.01)。A：皮质。B：海马区。

图21：仓鼠普立昂蛋白胜肽PrP(108-144)在缺乏(A区)或存在V24P(10-40)(B区)的情况下的类淀粉形成。在室温下在20mM NaOAc(pH3.7)/140mM NaCl中将具有(B区)或不具有(A区)50μM V24P(10-40)的50μM PrP(108-144)的溶液培养不同时间。然后移除样品并使用ThT结合分析量测类淀粉形成。

图22：V24P(10-40)-PEI对Aβ胜肽浓度的影响。如实例中描述自4月至8月龄以PEI(对照)或V24P(10-40)-PEI治疗APP/PS1小鼠。藉由ELISA量测海马区(B区)及皮质(A区)中的Aβ40及Aβ42浓度。数据表示为每组3只小鼠的平均值±标准偏差(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，学生t检验)。

图23：V24P(10-40)-PEI减少APP/PS1小鼠中的Aβ斑块积聚。A区：经PEI(对照)或V24P(10-40)-PEI治疗8个月后拍摄的APP/PS1小鼠的代表性microPET影像。野生型小鼠(WT)的microPET影像计入以供比较。B区：皮质、海马区、杏仁体及嗅球中摄取的[¹¹C]PiB的定量分析。数据表示为每组6只小鼠的平均值±标准偏差(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，学生t检验)。

具体实施方式

神经退化性疾病是一组特征在于印记包涵体(IBs)的形成相关的神经元的逐渐损失的神经性疾病，神经元的逐渐损失会导致神经系统的功能障碍及病患的最终死亡。Takalo等人，Am J Neuro Degener Dis(2013)2:1-14。神经退化性疾病诸如杭丁顿氏舞蹈症(HD)、阿兹海默氏症(AD)、帕金森氏症(PD)及其他视为由因印记包涵体(IBs)的形成所致的蛋白错误折迭介导的疾病。Yates,Nature Reviews(2012)11:352-353。

例如，HD是藉由在编码含有延长的聚麸酰胺酸(polyQ)延伸物的突变体Htt(mHtt)蛋白的基因Huntingtin(HTT)中的CAG三核苷酸重复的扩增所引起的体染色体显性遗传的神经退化性疾病。Zheng等人，Progress in Mol Biol and Translational Sci(2012)107:189-214。尽管HD具有看似简单的病原学，但事实上其发病原理十分复杂(Li等人，MolNeurodengener(2006)1:19)，所述发病原理涉及大量重要的已出错的生物过程及发讯号路径。Munoz-Sanjuan等人，J Clin Invest(2011)121:476-83。目前，无法获得针对HD或其他神经退化性疾病的改善疾病的治疗。因此，找出有效治疗方案是神经退化性疾病群集的焦点。异常路径或过程可充当有价值的治疗目标(Munoz-Sanjuan等人，J Clin Invest(2011)121:476-83)；然而，将此等过程作为目标的尝试可产生如绘示于AD.Doody等人，N Eng JMed(2013)369:341-50的Semagacestat临床试验中的非所欲副作用。

藉由类淀粉斑块及神经纤维缠结病理定义的阿兹海默氏症(AD)(Nelson等人，JNeuropathol Exp Neurol(2012)71:362-81)是最常见的引起跨多重认知领域的失智的神经退化性疾病及其发生率在年龄≥65岁的人群中以指数方式增加。Reitz等人，Nat RevNeurol(2011)7:137-52。尽管基于此等发现而科学进步显著并向药物开发投入巨大资源，但目前针对AD无可获得有效的改善疾病的治疗。Castellani等人，Biochem Pharmacol(2014)88:671-6。因此，其是全世界主要未满足的医学需求中的一者。

尽管尚不清楚AD的病原学，但已提出多个过程中的改变为重要原因及/或贡献者，包含类淀粉级联假说。Yamashima Prog Neurobiol(2013)105:1-23；Swerdlow等人，Biochim Biophys Acta(2014)1842:1219-31；Erickson等人，J Cereb Blood Flow Metab(2013)33:1500-13；Clavaguera等人，Neuropharmacol(2014)76Pt A:9-15；Castello等人，Ageing Res Rev(2013)12:282-8；Sutherland等人，Redox Rep(2013)18:134-41；Tiiman等人，Neurochem Int(2013)62:367-78；Puglielli Neurobiol Aging(2008)29:795-811；Hardy,J Alzheimer’s Dis(2006)9:151-3；及Checler等人，J Neurochem(2012)120Suppl1:iii-iv。类淀粉级联假说提出「类淀粉β蛋白」(Aβ)(一种在两端具有变动及修饰的不同长度(39至43个氨基酸)的胜肽)在AD发病原理及/或进展中起主要及主动作用。Hardy等人，Science(1992)256:184-5；Hardy等人，Science(2002)297:353-6；Tanzi等人，Cell(2005)120:545-55。Aβ是衍生自类淀粉前驱蛋白(APP)。在正常或非类淀粉基因异化代谢期间，APP被α-及γ分泌酶裂解，而在类淀粉基因异化代谢中，其被β-及γ分泌酶裂解。Aβ胜肽的长度差异是部分由于γ分泌酶的剪切位点的变化。Aβ胜肽趋于自聚集成类淀粉纤维及细胞毒性更大的寡聚体。Walsh等人，J Neurochem(2007)101:1172-84。Aβ40及Aβ42是回收自类淀粉斑块的Aβ胜肽的两种主要物质且后者更易聚集及更具细胞毒性。

类淀粉斑块属于包涵体(IBs)的一大家族，其等特征是各种神经退化性疾病，包含帕金森氏症(PD)、杭丁顿氏舞蹈症(HD)及肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。尽管构成蛋白的差异及组装机制的复杂性，但在病患群的实质子集中公认不同神经退化性疾病及相关IBs的共存。Keith-Rokosh Can J Neurol Sci(2008)35:602-8；Tada等人，ActaNeuropathol(2012)124:749-60；Schwab等人，J Neuropathol Exp Neurol(2008)67:1159-65；Amador-Ortiz等人，Ann Neurol(2007)61:435-45；Arai等人，Acta Neuropathol(2009)117:125-36；Szpak等人，Folia Neuropathol(2001)39:63-71。此外，充足的证据证实不同疾病的错误折迭蛋白可彼此交叉播种以共聚集。Jucker等人，Ann Neurol(2011)70:532-40；Ma等人，J Mol Biol(2012)421:172-84；Guo等人，Cell(2013)154:103-17；Waxman等人，J Neurosci(2011)31:7601-18；Vitrenko等人，J Biol Chem(2007)282:1779-87；Wasmer等人，J Mol Biol(2010)402:311-25；Yan等人，Am J Pathol(2007)171:172-80。此等发现表明IBs的形成可能(至少部分)由一组常见热力学原理控制(Jucker等人，Ann Neurol(2011)70:532-40)，及对朝向最热力学稳定寡聚体或纤维的关联性途径的干扰揭示类淀粉变性症治疗。

概念地，减少由错误折迭蛋白或其衍生物所形成的毒性物质(异常聚集体)可是实务及安全的治疗策略。Mielcarek等人，PLoS Biol(2013)11:e1001717；Appl等人，DrugDiscovery Today(2012)17:1217-23。在HD中，延长的polyQ赋予自聚集异常倾向以形成神经毒性物质mHtt蛋白。神经核中的寡聚体或大纤维性聚集体及神经元与神经胶质的过程是与HD发病原理相关。Olshina等人，J Biol Chem(2010)285:21807-16；Ren等人，Nat CellBiol(2009)11:219-25；Hoffner等人，Prion(2007)1:26-31；Marcellin等人，PLoS One(2012)7:e44457；及Legleiter等人，J Biol Chem(2010)285:14777-90。确实，已于包含HD(Kordasiewicz等人，Neuron(2012)74:1031-44；Sontag等人，J Neurosci(2012)32:11109-19)及AD(Aisen等人，Current Alzheimer Research(2007)4:473-78；Frisardi等人，Current Alzheimer Research(2010)7:40-55)的若干神经退化性疾病模型中测试此方法并获得令人鼓舞的结果。

由于毒性错误折迭蛋白/衍生物的形成由一组常见的跨不同疾病的热物理定律控制，因此使用如本文描述的常见策略以开发藉由减少此等神经退化性疾病中的错误折迭物质的治疗手段。

因此，本文描述一种预期逆转如本文描述的神经退化性疾病中IB形成的病原过程的治疗胜肽的合理设计。此处，设计含有至少一个亲和性模块及至少一个带电模块的新颖双链分子并使用细胞APP/PS1 AD模型及R6/2HD模型证实其等效力。这些双链分子将减少跨各种神经退化性疾病的毒性异常蛋白聚集体。所述合理设计是建立于亲和性部分(例如，胜肽亲和性部分)及至少一个带电部分(例如，带正电或带负电)的模块化组装的原理上。不受理论的束缚，所述亲和性部分将促进此类治疗分子(双链分子)结合至异常蛋白聚集体的蛋白组分或异常蛋白聚集体的单体及所述(等)带电部分将藉由(例如)电荷的互斥力阻止或减少异常蛋白聚集体的形成(图1)。

本文描述的方法相较于目前针对神经退化性疾病的治疗方法具有若干独特特征及优点。下文提供一些实例。第一，可取自形成异常聚集体的病原胜肽/蛋白的亲和性部分不仅显著减少找到并优化合适的胜肽序列的辛苦工作，亦通过其自聚集性质保证与IBs的高亲和性。第二，带电部分(例如，polyR片段)中的多重电荷致使本文描述的双链分子(a)可溶于水性环境中，从而简化合成及递送过程及(b)细胞可穿透性(Mitchell等人，J PeptRes(2000)56:318-25)，使得其等适用于抑制细胞外及细胞内IB形成两者。此外，这些双链分子中的带电部分可在这些双链分子结合至病原胜肽/蛋白或蛋白聚集体后藉由电荷互斥阻止或减少IB形成。第三，带电部分与亲和性部分的组合在跨含有不同IB的疾病应用此设计中提供极佳的可行性及可挠性。

因此，本发明提供包括结合与疾病相关的异常蛋白聚集体或其组分(例如，形成所述异常蛋白聚集体的蛋白单体)的亲和性部分及至少一个带电部分的双链分子，及此类双链分子在阻止或减少异常蛋白聚集体的形成及/或治疗涉及此类异常蛋白聚集体的疾病(例如，神经退化性疾病)中的用途。

I.双链分子

本文描述的双链分子包括(i)可结合至异常蛋白聚集体或所述异常聚集体的组分的胜肽亲和性部分，及(ii)至少一个促进所述双链分子横跨细胞膜并阻止或减少与疾病(诸如，如文本描述的这些神经退化性疾病)相关的异常蛋白聚集体的形成的带电部分(例如，带正电或带负电)。

(i)胜肽亲和性部分

所述双链分子的胜肽亲和性部分可是任何基于胜肽(例如，包括胜肽)的分子，所述分子可结合至目标异常蛋白聚集体或其蛋白组分(例如，可形成所述异常蛋白聚集体或其涉及所述聚集体形成的片段的单体)。所述胜肽亲和性部分可含有具有多达100(例如，80、60、50、40、30、20或10)个氨基酸残基的胜肽，这些氨基酸残基可含有天然生成的氨基酸或经修饰的氨基酸(诸如D-氨基酸)或其组合。在一些实例中，所述胜肽亲和性部分可含有具有5-10、5-20、5-30、10-15、10-20、10-30或20-30个氨基酸残基的胜肽。所述胜肽亲和性部分可于N端处经甲基化或乙酰化，于C端处经酰胺化，或两者兼而有的以增强稳定性。

此项技术中已知与疾病相关的异常蛋白聚集体及相应的蛋白成分。一些实例是提供于下表1中：

表1：例示性神经退化性疾病及与此类疾病相关的异常蛋白聚集体

在一些实施例中，所述胜肽亲和性部分可含有衍生自形成异常蛋白聚集体的疾病蛋白或衍生自与疾病蛋白或由此形成的异常蛋白聚集体相互作用的其他蛋白的区域的氨基酸序列。在一些实施例中，所述胜肽亲和性部分包括涉及自聚集(异常蛋白聚集体的形成)的疾病蛋白(例如，上表1中所列这些疾病蛋白中的任何一种)的片段。

在一些实例中，所述胜肽亲和性部分包括polyQ片段。此种胜肽亲和性部分可结合至涉及polyQ的蛋白聚集体并减少/破坏其形成，例如，HD中涉及的mHtt的聚集。所述polyQ部分可包括至少2个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个或至少50个麸酰胺酸(Q)氨基酸残基(例如，5-10、5-15、5-20、5-30或10-20个Q残基)。在一些实施例中，所述胜肽亲和性部分是5Q、10Q、15Q或20Q。

所述蛋白亲和性部分可含有衍生自野生型疾病蛋白(如彼等表1、3及4中所列及本文描述者)或衍生自所述疾病蛋白的突变体形式或经修饰的形式(特别是彼等疾病发病原理的涉及者)的片段。所述蛋白的经修饰的形式可包含转译后修饰诸如磷酸化。例如，可藉由与微管相关的Tau蛋白的高度磷酸化形成神经纤维缠结(NFTs)。因此，所述胜肽亲和性部分可含有高度磷酸化形式或Tau的高度磷酸化形式的部分。可藉由使用各种已知激酶的用途或藉由模拟磷酸化蛋白的磷酸化模拟氨基酸取代达成高度磷酸化。例如，天门冬胺酸(D)是化学类似于磷酸丝胺酸。因此，当天门冬胺酸置换丝胺酸时，其是磷酸丝胺酸的磷酸化模拟。

在一些实施例中，所述胜肽亲和性部分可含有衍生自类淀粉β蛋白、SOD1、Tau、TDP-43、α-突触核蛋白、泛蛋白、神经丝蛋白、αB水晶体蛋白、PrP^SC或转甲状腺素蛋白的片段。此种片段可涉及含有疾病蛋白的蛋白聚集体的形成。例如，来自类淀粉β-蛋白的可含有N-甲基化Gly33的片段Aβ25-35可与类淀粉斑块相互作用。Hughes等人，J Biol Chem(2000)275:25109-115。在另一实例中，V24经D-型脯胺酸(^DP)置换的Aβ40突变体胜肽(V24P)仍然作为缓冲液中的无规线圈并以高胜肽浓度形成无定形的聚集体。Chang等人，J Mol Biol(2009)385:1257-65。将V24P与Aβ40以1:1莫耳比率混合会抑制类淀粉形成及Aβ40的细胞毒性。Iwata等人，Pharmacol Therapeut(2005)108:129-48。

在一些实例中，所述胜肽亲和性部分可包括衍生自类淀粉β蛋白的氨基酸序列GSNKGAIIGLM(SEQ ID NO:1)。或者，所述亲和性部分可包括氨基酸序列YEVHHQKLVFFAED^DPGSNKGAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO:2)，其中^DP是指脯胺酸的D-型。在另一实例中，所述亲和性部分可包括RPRTRLHTHRNR(SEQ ID NO:8)，其可是如描述于Wiesehan等人(ChemBioChem(2003)4:748-53)中的Aβ42-结合12-mer D-型胜肽，其中的相关教示以引用的方式并入本文中。在制造本文描述的双链分子中用作所述胜肽亲和性部分的其他例示性类淀粉β-蛋白片段提供于下表3中。

可藉由(例如)化学合成或重组技术制造如本文描述的胜肽亲和性部分中的任何一者。

(ii)带电部分

所述双链分子的带电部分可藉由错误折迭疾病蛋白阻止或减少异常蛋白聚集体的形成或可藉由电荷互斥力导致现存异常蛋白聚集体的解离。参见(例如)图1。此外，所述带电部分可促进含有此类带电部分的双链分子横跨细胞膜及/或血脑障壁(BBB)。

在一些实施例中，所述带电部分可含有包括多达100(例如，80、60、50、40、30、20或10)个氨基酸残基的胜肽，这些氨基酸残基可含有至少2个、至少4个、至少5个、至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个带电氨基酸。在一些实例中，所述带电部分可是具有所有带电氨基酸残基的胜肽。例如，所述胜肽可含有至少1(例如，至少2、4、5或10)个带负电氨基酸，例如，天门冬胺酸(例如，polyD片段)或麸胺酸(例如，polyE片段)或D及E氨基酸的组合。或者，所述胜肽可含有至少1(例如，至少2、4、5或10)个带正电氨基酸，例如，精胺酸、组胺酸、离胺酸或其组合。在一些实例中，所述带电部分含有精胺酸(例如，polyR片段)或离胺酸残基(例如，polyK片段)的延伸物。如本文使用，polyR、polyK、polyD或polyE片段是指R、K、D或E残基的延伸物。此种片段可含有多达30(例如，25、20、15、10或5)个R、K、D或E残基。在一些实例中，所述带电部分可是含有不同带负电氨基酸的组合或不同带正电氨基酸的组合的胜肽。

除阻止错误折迭的目标蛋白形成异常蛋白聚集体或使其自现存聚集体解离外，本文描述的带电部分(例如，polyR片段)亦可促进包括此类带电部分的双链分子穿透细胞膜、血脑障壁(BBB)或两者。在一些实施例中，所述带电部分具有氨基酸序列RRRRRRRR(SEQ IDNO:9)。

在一些实施例中，所述带电部分可是诸如TAT的细胞穿透性胜肽(CPP)，其是指一种包括GRKKRRQRRRPQ(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的胜肽，所述氨基酸序列衍生自人类免疫缺乏病毒的转录反式活化子(TAT)。细胞穿透性胜肽(CPPs)已被用以克服细胞膜的亲脂性障壁并将大分子及甚至小颗粒(例如，蛋白、DNA、抗体、对比(成像)剂、毒素及奈米颗粒药物载剂包含脂质体)两者递送至细胞内以供其等生物作用。可藉由化学合成或重组技术制造基于胜肽的带电部分。

在其他实施例中，所述带电部分可是非胜肽聚合物，诸如聚乙烯亚胺(PEI)分子。用于合成经PEI结合的胜肽的方法是此项技术中熟知。例如，可藉由分批茀甲氧羰基(fmoc)-聚酰胺方法合成经PEI结合的肽。

(iii)双链分子中的亲和性及带电部分的构形

在如本文描述的任何双链分子中，所述胜肽亲和性部分及所述带电部分或这些部分连接(例如，共价)并可以合适的方式构形。在一些实施例中，所述双链分子含有如本文描述的胜肽亲和性部分及单一带电部分。所述带电部分可直接或者经由合适的连接符附接至所述胜肽亲和性部分的N端或C端。若所述带电部分亦是基于胜肽，则可经由肽键连接所述胜肽亲和性部分及所述带电胜肽。若所述带电部分是非胜肽聚合物(诸如PEI)，则可经由合适的键(例如，合适的共价键)将所述非胜肽聚合物连接至所述胜肽亲和性部分的N端或C端。

在一些实施例中，所述双链分子可含有两个可相同或不同的带电部分。在其他实例中，这些两个带电部分均是polyR片段。例如，具有八个精胺酸残基的聚精胺酸(polyR)部分是连接至所述胜肽亲和性部分的胺基端及另一具有八个精胺酸残基的聚精胺酸(polyR)部分可连接至所述胜肽亲和性部分的羧基端。

在一些实施例中，这些两个带电部分可是不同的。例如，这些带电部分中的一者可是基于胜肽的部分(诸如polyR片段)及其他带电部分可是非胜肽聚合物(诸如PEI)。所述polyR片段及PEI可分别连接至所述胜肽亲和性部分的N端及C端或反之亦然。在一些实施例中，这些两个带电部分可具有相反电荷。例如，带正电聚精胺酸(polyR)部分可连接至所述胜肽亲和性部分的胺基端及带负电聚天门冬胺酸(polyD)部分可连接至所述胜肽亲和性部分的羧基端。在一些实例中，这些带电部分既可均携载正电荷或均携载负电荷。例如，带正电聚精胺酸(polyR)部分可连接至所述胜肽亲和性部分的胺基端及带正电聚离胺酸(polyK)部分可连接至所述胜肽亲和性部分的羧基端。在一些实施例中，所述双链分子是RRRRRRRRGSNKGAIIGLM-PEI(SEQ ID NO:4)。应了解如本文描述的所述双链分子的所述或这些带电部分可以相对于胜肽亲和性部分的任何数量方式构形。

在一些实例中，所述或这些胜肽部分可于C端处修饰(例如，乙酰化)、于N端处修饰(例如，甲基化)或两者兼而有的以至少增强含有此类胜肽部分的双链分子的稳定性。

II.医药组合物

可将本文描述的双链分子与医药上可接受的载剂(赋形剂)混合以形成用于治疗目标疾病的医药组合物。「可接受」意谓所述载剂必须与所述组合物的活性成分兼容(及优选地，可稳定所述活性成分)及不有害于欲治疗的个体。医药上可接受的赋形剂(载剂)(包含缓冲液)是此项技术中熟知。参见例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkins，编辑K.E.Hoover。

欲用于本方法中的医药组合物可包括医药上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，呈冻干调配物或水溶液形式。(Remington:The Science and Practice of Pharmacy第20th版(2000)Lippincott Williams and Wilkins，编辑K.E.Hoover)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量及浓度对接受者无毒，且可包括缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸及甲硫胺酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲双铵(hexamethonium chloride)；氯化苄二甲烃铵(benzalkonium chloride)、氯化本索宁(benzethonium chloride)；酚、丁醇或苄醇；对羟苯甲酸烷基酯，诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环已醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多胜肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，诸如甘胺酸、麸酰胺酸、天门冬酰胺酸、组胺酸、精胺酸或离胺酸；单醣、双醣及其他醣，包含葡萄糖、甘露糖或聚葡萄醣；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的相对离子，诸如钠；金属错合物(例如Zn-蛋白错合物)；及/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

在一些实例中，本文描述的医药组合物包括含有这些双链分子(或编码核酸)的脂质体，其可藉由此项技术中已知的方法诸如描述于Epstein,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；及美国专利案第4,485,045号及第4,544,545号中的方法制造。具有增强循环时间的脂质体揭示于美国专利案第5,013,556号中。可藉由以包括磷脂酰胆碱、胆固醇及PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物进行的反相蒸发方法形成特别有用的脂质体。将脂质体挤压通过具有确定孔径的过滤器以产生具有所需直径的脂质体。

这些双链分子亦可包裹于(例如)藉由凝聚技术或藉由接口聚合制得的微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包裹于胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、奈米颗粒及奈米胶囊)中或包裹于巨乳剂中。此类技术是此项技术中已知，参见，例如，Remington,The Science and Practice ofPharmacy第20版Mack Publishing(2000)。

在其他实例中，可将本文描述的医药组合物调配成缓释形式。缓释制剂的合适的实例包含含有所述双链分子的固体疏水性聚合物的半透性基质，这些基质是呈成型对象形式(例如，膜或微胶囊)。缓释基质的实例包含聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利案第3,773,919号)、L-麸胺酸与7-乙基-L-麸胺酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、诸如LUPRON DEPOT^TM的可降解的乳酸-甘醇酸共聚物(包含乳酸-甘醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林的可注射微球)、乙酸异丁酸蔗糖酯及聚-D-(-)-3-羟丁酸。

待用于活体内投与的医药组合物必须是无菌的。此藉由(例如)滤过无菌过滤膜易于完成。可将治疗双链分子组合物放置于具有无菌入孔的容器内，例如，静脉内注射溶液袋或具有可藉由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。

本文描述的医药组合物可以诸如锭剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、溶液或悬浮液或栓剂的单元剂型用于经口、非经肠或直肠投与或藉由吸入或吹入投与。

为制造诸如锭剂的固体组合物，可将主要活性成分与药物载剂((例如)诸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶的习知制锭成分)及其他药物稀释剂(例如，水)混合以形成含有本发明化合物或其无毒性医药上可接受的盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。当提及此等预制剂组合物均匀时，意指所述活性成分均匀分散于整个组合物上使得所述组合物可易于细分为同样有效的单元剂型(诸如锭剂、丸剂及胶囊)。然后将此固体预制剂组合物细分为上述类型的含有0.1至约500mg的本发明的活性成分的单元剂型。可包覆或以其他方式复合新颖组合物的锭剂或丸剂以提供可给予长期作用的优点的剂型。例如，所述锭剂或丸剂可包括内部剂量及外部剂量组分，后者是呈前者上的外壳的形式。可藉由有助于抵抗于胃中的分崩解并容许内部组分完整进入十二指肠中或延迟释放的肠层分离这些两种组分。各种材料可用于此类肠层或包衣，此类材料包含大量聚合酸及聚合酸与诸如虫胶、鲸腊醇及乙酸纤维素的材料的混合物。

合适的表面活性剂包含(特定言之)非离子剂，诸如聚氧乙烯去水山梨醇(例如，Tween^TM 20、40、60、80或85)及其他去水山梨醇(例如，Span^TM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将便利地包括0.05与5％间的表面活性剂，且可在0.1与2.5％间。应了解若必要则可添加其他成分(例如，甘露醇或其他医药上可接受的媒剂)。

可使用市售脂肪乳剂(诸如Intralipid^TM、Liposyn^TM、Infonutrol^TM、Lipofundin^TM及Lipiphysan^TM制造合适的乳剂)。可使活性成分溶解于预混乳剂组合物中或另一选择可使其溶解于油(例如，大豆油、红花子油、棉籽油、麻油、玉米油或杏仁油)中及一经与磷脂(例如，蛋黄磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合即形成乳剂。应了解可添加其他成分(例如，甘油或葡萄糖)以调节所述乳剂的渗透性。合适的乳剂通常将含有高达20％(例如，在5与20％间)的油。脂肪乳剂可包括在0.1与1.0.im间，特别是在0.1与0.5.im间的脂肪液滴，并具有在5.5至8.0的范围内的pH。

这些乳剂组合物可是彼等藉由混合双链分子与Intralipid^TM或其组分(大豆油、蛋黄磷脂、甘油及水)制得者。

用于吸入或吹入的医药组合物包含含于医药上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液及悬浮液剂及粉剂。这些液体或固体组合物可含有如上文所列的合适的医药上可接受的赋形剂。在一些实施例中，这些组合物是针对局部或全身性作用藉由经口或鼻呼吸途径投与。

可藉由使用气体将含于较佳无菌医药上可接受的溶剂中的组合物雾化。经雾化的溶液可直接呼吸自雾化装置或所述雾化装置可附接至面罩、帐幕或间歇正压呼吸机。可自以适当方式递送所述调配物的装置较佳经口或经鼻投与溶液、悬浮液或粉剂组合物。

III.治疗方法

这些双链分子中的任何一者可用于阻止/减少与疾病诸如如本文描述的神经退化性疾病的相关的蛋白聚集体的形成或破坏此种蛋白聚集体。所述双链分子亦可用于治疗特征在于异常蛋白聚集体的疾病或病症，特别是神经退化性疾病或病症。

为实践本文揭示的方法，可经由合适的途径向需治疗的个体(例如，人类)投与有效量的本文描述的医药组合物，所述合适的途径诸如静脉内注射投与，例如，作为大丸剂或经一段时间的连续输液，藉由肌内、腹腔内、脑内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、吸入或局部途径。用于液体调配物的市售雾化器(包含喷射雾化器及超音波雾化器)对投与是有用的。可直接雾化液体调配物及可在重构后雾化经冻干的粉剂。或者，如本文描述的双链分子可使用氟碳调配物及经计量的剂量吸入器喷雾化或呈经冻干及研磨的粉剂形式吸入。在一个实例中，经由鼻内途径(例如，藉由鼻滴剂)投与所述双链分子。

待藉由本文描述的方法治疗的个体可是哺乳动物，更佳是人类。哺乳动物包含(但不限于)农场动物、比赛用动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠及大鼠。需要治疗的人类个体可是患有目标疾病/病症、处于患有目标疾病/病症的风险或怀疑患有目标向疾病/病症的人类病患，所述目标疾病/病症是诸如阿兹海默氏症(AD)、杭丁顿氏舞蹈症(HD)、帕金森氏症(PD)、路易氏体失智(DLB)、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性-TDP-43蛋白症、额颞叶变性-Tau蛋白症(匹克氏症、皮质基底变性、进行性核上性麻痹、FTDP-17)、库贾氏症(CJD)或另一疾病。可藉由例行医学检查(例如，实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超音波)识别患有目标疾病或病症的个体。怀疑患有此类目标疾病/病症中的任何一者的个体可显示所述疾病/病症的一或多种症状。处于患有所述疾病/病症的风险中的个体可是具有针对所述疾病/病症的风险因素中的一或多者的个体。

如本文使用，「有效量」是指各活性剂之单独或与一或多种其他活性剂组合给予所述个体治疗作用所需的量。在一些实施例中，所述治疗作用是降低异常蛋白聚集体，或阻止异常蛋白聚集形成。熟习此项技术者将明了双链分子的量是否达成治疗作用的判定。如熟习此项技术者所知晓，有效量取决于以下因素而变化：治疗的特定病症、病症的严重性、个别病患参数(包含年龄、身体状态、体型、性别及体重)、治疗持续时间、并行治疗(若有)的性质、投与的具体途径及在健康医师的知识及专业知识范围内的类似因素。此等因素为一般技术者熟知且可使用不超出常规的实验解决此等因素。通常较佳是使用最大剂量(即，根据合理的医学判断的最高安全剂量)的个别组分或其组合。

经验性考虑(诸如半衰期)通常将有助于剂量的判定。投与频率可视治疗过程判定及调整且通常(但不一定)基于目标疾病/病症的治疗及/或抑制及/或减轻及/或延迟。或者，双链分子的连续缓释调配物可是适合的。用于达成缓释的各种调配物及装置是此项技术中已知。

在一个实例中，可在已给予一次或多次双链分子的投与的个体中经验地判定如本文描述的双链分子的剂量。给予个体递增剂量的拮抗剂。为评估所述拮抗剂的效力，可密切关注疾病/病症的指标。

通常，对本文描述的双链分子中的任何一者的投与，初始候选剂量可为约2mg/kg。出于本发明的目的，典型每日剂量取决于上文提及的因素可在自约0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg中的任何一者至30mg/kg至100mg/kg或更大的范围内变化。对取决于病症的经数天或更长时间的重复投与，所述治疗持续直至达成症状的所需抑制或直至达成足够的治疗程度以减轻目标疾病或病症或其症状。例示性剂量方案包括投与约2mg/kg的初始剂量，接着投与约1mg/kg的双链分子的每周保持剂量，或接着每隔一周投与约1mg/kg的保持剂量。然而，其他剂量方案可为有用的，此取决于医师希望达成的药物动力学衰减模式。例如，考虑每周一至四次的剂量。在一些实施例中，可使用在自约3μg/mg至约2mg/kg(诸如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg及约2mg/kg)的范围内变化的剂量。在一些实施例中，剂量频率是每周、每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周一次；或每月、每2月或每3月或更长时间一次。藉由习知技术及分析容易监测此治疗的进展。所述剂量方案(包含所用的双链分子)可随时间变化。

在一些实施例中，对正常体重的成年病患，可投与自约0.3至5.00mg/kg的范围内的剂量。特定剂量方案(即，剂量、时间设定及重复)将取决于特定个体及所述个体的医疗历史及个别药剂的性质(诸如所述药剂的半衰期及此项技术中熟知的其他考虑)。

出于本发明的目的，如本文描述的双链分子的适合剂量将取决于特定双链分子、多种双链分子、疾病/病症的类型及严重性、所述双链分子是否出于预防性目的或治疗目的投与、先前治疗、所述病患的临床历史及对拮抗剂的反应、及主治医师的裁量。临床医师可投与双链分子直至达到达成所需结果的剂量。在一些实施例中，所需结果是异常蛋白聚集体的减少。熟习此项技术者将明了判定剂量是否导致所需结果的方法。一或多种双链分子的投与可是连续或间歇性的，此取决于(例如)接受者的生理状态、投与目的是治疗性或预防性及熟练医师已知的其他因素。双链分子的投与在预选时间周期内可基本上连续或可以一系列间隔剂量，例如，在形成目标疾病或病症之前、期间或之后。在一些实例中，所述量的双链分子有效减少异常蛋白聚集体的形成达至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或以上)。

如本文使用，术语「治疗」是指出于治愈、愈合、缓和、缓解、改变、补救、减轻、改善或影响病症、疾病的症状或患疾病或病症的倾向的目的向患有目标疾病或病症、患有所述疾病/病症的症状或具有患所述疾病/病症的倾向的个体施加或投与包含一或多种活性剂的组合物。

缓和目标疾病/病症包含延迟所述疾病的发展或进展或降低疾病严重性。缓和所述疾病不一定要求治愈性结果。如本文使用，「延迟」靶目标疾病或病症的发展意谓推迟、妨碍、减慢、阻碍、稳定及/或推迟所述疾病的进展。此延迟可取决于所述疾病的历史及/或治疗的个体而变化时间长度。一种「延迟」或缓和疾病的发展或延迟所述疾病发病的方法是一种相较于未使用所述方法可在给定时间框架内降低发展所述疾病的一或多种症状的可能性及/或在给定时间框架内降低这些症状的程度的方法。此模拟较通常是基于使用足以给出统计学显著结果的大量个体的临床研究。

疾病的「发展」或「进展」意谓所述疾病的初始临床表达及/或接踵而至的进展。可使用此项技术中熟知的标准临床技术侦测及评估所述疾病的发展。然而，发展亦是指不可侦测的进展。出于本揭示内容的目的，发展或进展是指这些症状的生物过程。「发展」包含发生、复发及发病。如本文使用，目标疾病或病症的「发病」或「发生」包含初始发病及/或复发。

在一些实施例中，本文描述的双链分子是以足以减少活体内异常蛋白聚集体达至少5％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大)的量向需治疗的个体投与。在其他实施例中，这些双链分子是以有效降低目标蛋白质或胜肽的活动程度达至少5％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大)的量投与。

可使用一般药品技术者已知的习知方法向个体投与所述医药组合物，此可取决于待治疗的疾病类型或疾病部位。亦可经由其他习知途径(例如，经口投与、非经肠、经吸入喷雾、经局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入型容器)投与所述组合物。如本文使用的术语「非经肠」包含皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内及颅内注射或输注技术。此外，可经由可注射储积投与途径(诸如使用1、3或6个月储积可注射或生物可降解材料及方法)向个体投与所述组合物。在一些实例中，所述医药组合物是眼内或玻璃体内投与。

可注射组合物可含有各种载剂，诸如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇及多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇及其类似物)。对静脉内注射，可藉由滴注方法投与水溶性双链分子，藉由滴注方法输注含有双链分子及生理上可接受的赋形剂的医药调配物。生理上可接受的赋形剂可包含(例如)5％右旋糖、0.9％生理盐水、林格氏溶液或其他合适的赋形剂。肌内制剂(例如，双链分子的合适的可溶盐形式的无菌调配物)可溶解并投与于医药赋形剂(诸如注射用水、0.9％生理盐水或5％葡萄糖溶液)中。

在一个实施例中，经由部位特异性或目标向局部递送技术投与双链分子。部位特异性或目标向局部递送技术的实例包含双链分子的各种可植入储积源或局部递送导管(诸如输注导管、留置导管或针导管)、合成性移植件、动脉外膜包覆件、分流件及支架或其他可植入装置、部位特异性载剂、直接注射或直接施用。参见，例如，PCT专利案第WO 00/53211号及美国专利案第5,981,568号。

亦可使用含有反义多核苷酸、表达载体或子基因组多核苷酸的治疗组合物向目标递送。受体介导的DNA递送技术描述于(例如)Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11:202；Chiou等人，Gene Therapeutics:Methods And Applications Of Direct GeneTransfer(J.A.Wolff,ed.)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988)263:621；Wu等人，J.Biol.Chem.(1994)269:542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:3655；Wu等人，J.Biol.Chem.(1991)266:338中。

在基因治疗方案中针对局部投与，以约100ng至约200mg的DNA的范围投与含有多核苷酸(例如，彼等编码本文描述的双链分子者)的治疗组合物。在一些实施例中，在基因治疗方案期间，亦可使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg及约20μg至约100μg的DNA或更大的浓度范围。

在一些实例中，可以具有包括附接至至少一个带电部分的polyQ的亲和性部分的双链分子治疗患有或处于患有杭丁顿氏舞蹈症风险下的病患。在一些实施例中，所述双链分子是RRRRRRRRWDQQQQQQQQQQ(SEQ ID NO:6)或RRRRRRRRWDQQQQQQQQQQQQQQQ(SEQ ID NO:7)。或者，可以具有包括一部分附接至至少一个带电部分的类淀粉β蛋白的亲和性部分的双链分子治疗患有或处于患有阿兹海默氏症风险下的病患。在一些实施例中，所述双链分子是RRRRRRRRGSNKGAIIGLM(SEQ ID NO:3)、RRRRRRRRGSNKGAIIGLM-PEI(SEQ ID NO:4)或YEVHHQKLVFFAED^DPGSNKGAIIGLMVGGVV-PEI(SEQ ID NO:5)。

用于本文描述的方法中的特定剂量方案(即，剂量、时间设定及重复)将取决于特定个体及所述个体的医疗历史。

在一些实施例中，可向需治疗的个体投与超过一种双链分子或双链分子与另一合适的治疗药剂的组合。所述双链分子亦可与有助于增强及/或补充这些药剂的有效性的其他药剂结合使用。

可藉由(例如)下文实例中描述的方法评估针对目标疾病/病症的治疗效力。

IV.用于缓和与神经退化性疾病相关的异常蛋白聚集体的套组

本发明亦提供用于缓和与疾病/病症相关的异常蛋白聚集体的套组，这些疾病/病症诸如阿兹海默氏症(AD)、杭丁顿氏舞蹈症(HD)、帕金森氏症(PD)、路易氏体失智(DLB)、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性-TDP-43蛋白症、额颞叶变性-Tau蛋白症(匹克氏症、皮质基底变性、进行性核上性麻痹、FTDP-17)或库贾氏症(CJD)。此类套组可包含一或多个包括双链分子(例如，彼等本文描述者中的任何一者)的容器。

在一些实施例中，所述套组可包括根据本文描述的方法中的任何一者使用的说明书。包含的说明书可包括投与所述双链分子以治疗、延迟发病或缓和目标疾病(如彼等本文描述者)的说明。所述套组可进一步包括基于识别所述个体是否患有目标疾病以选择适用于治疗的个别的说明。在其他实施例中，这些说明书包括向处于患目标疾病风险下的个体投与双链分子的说明。

关于双链分子的用途的说明书通常包含有关剂量、投药时间表及用于预定治疗的投与途径的信息。这些容器可是单元剂量、批量包装(例如，多剂量包装)或子单元剂量。提供于本发明的套组中的说明书通常涉及标签或包装插页的书面说明书(例如，包含于所述套组内的纸片)，但亦可接受机器可读的说明书(例如，携载于磁性或光学储存碟上的说明书)。

所述卷标或包装插页指示所述组合物是用于治疗、延迟发病及/或缓和与异常蛋白聚集体的存在相关的疾病或病症(诸如彼等本文描述者)。可提供说明书以实践本文描述的方法中的任何一者。

本发明的套组是在合适的包装中。合适的包装包含(但不限于)小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)及类似物。亦考虑与特定装置诸如吸入器、鼻投与装置(例如，雾化器)或输注装置诸如微型泵组合使用的包装。套组可具有无菌入孔(例如，所述容器可是静脉内注射溶液袋或具有可以皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述容器亦可具有无菌入孔(例如，所述容器可是静脉内注射溶液袋或具有可以皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述组合物中的至少一种活性剂是彼等本文描述的双链分子。

套组可视需要提供额外组分(诸如缓冲液)及解释性信息。通常，所述套组包括容器及在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页。在一些实施例中，本发明提供包括上述套组的内容物的制造对象。

一般技术

除非另有指示，否则本发明的实践将使用此项技术范围内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的习知技术。此类技术充分解释于文献，诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts，1998)PlenumPress；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths及D.G.Newell编，1993-8)J.Wiley及Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell编)；Gene TransferVectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos编，1987)；Current Protocolsin Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编，1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis等人编，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley及Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies:a practicalapproach(D.Catty编，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practicalapproach(P.Shepherd及C.Dean编，Oxford University Press，2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti及J.D.Capra编，Harwood Academic Publishers，1995)。

无进一步详细阐述，据信熟习此项技术者可基于上文的说明最大限度地利用本发明。因此，下列特定实施例仅视为说明性，且无论如何不以任何方式限制揭示内容的剩余部分。出于本文引用的目的或目标而以引用的方式将本文所援引的所有公开案并入本文中。

实例

为可更充分了解本文描述的本发明，阐述下列实例。本申请案中描述的实例是经提供以阐述本文提供的分子、医药组合物及方法且不应以任何方式视为对其等范围的限制。

实例1：例示性双链治疗胜肽及其于治疗杭丁顿氏舞蹈症中的用途

杭丁顿氏舞蹈症(HD)是由杭丁顿氏(HTT)基因中的CAG三核苷酸重复的扩增引起。经扩增的CAG重复编码突变体Htt(mHtt)蛋白内的长形聚麸酰胺酸延伸物(polyQ)，所述polyQ导致mHtt的错误折迭及聚集。本文提供一系列治疗胜肽，例如，8R5Q、8R10Q、8R15Q及8R20Q，其含有聚精胺酸(例如，8R)及polyQ的短延伸物(例如，5Q、10Q、15Q或20Q)。预期所述polyQ序列赋予所述治疗胜肽特异性亲和性以结合至mHtt且这些聚精胺酸片段具有穿透神经元并阻止mHtt/胜肽自聚集电荷互斥的能力。此由在Neuro2a细胞(小鼠神经母细胞瘤)中，8R10Q与109QmHtt聚集体位置重迭的观察证实。8R10Q及8R15Q均显著减小109QmHtt聚集体的尺寸。此外，8R10Q降低藉由蛋白酶体抑制剂MG132阻断的109QmHtt的浓度，此指示所述胜肽增强降解109QmHtt的细胞能力。就功能而言，8R10Q减弱未分化Neuro2a细胞的生长中藉由MTT分析的109QmHtt诱发的毒性及Neuro2a细胞的视网酸介导的轴突赘疣。活体内，8R10Q显著延迟R6/2转基因小鼠(HD小鼠模型)的运动性及记忆力退化。就组织病理学而言，8R10Q亦减少mHtt的聚集及神经元损失，并减轻星形神经胶质细胞及微神经胶质的活化。有趣地，8R10Q减少R6/2小鼠的糖尿病表现型、炎性指数及异常肝功能。总而言之，藉由此针对HD工作的模块化原理设计的治疗胜肽亦可有助于针对其他神经退化性疾病的治疗策略的开发。

这些双链胜肽的设计及合成

尝试基于模块化组装的原理合理设计治疗胜肽以减少跨不同神经退化性疾病的毒性错误折迭蛋白/衍生物。推测性治疗胜肽将假定包含上游或下游(双链)或两者(三链)侧悬带电氨基酸延伸物的来自错误折迭蛋白(例如，mHtt或类淀粉β胜肽等)的自聚集区域的完整或部分序列的双链或三链结构。此设计背后的基本原理是所述自聚集序列将通过其自聚集性质在所述胜肽与所述错误折迭蛋白/衍生物间提供特异性亲和性。本研究中选择的带电氨基酸可为精胺酸。聚精胺酸延伸物使这些治疗胜肽可穿透通过细胞膜进入细胞质及细胞核隔室(Mitchell,J Pept Res(2000)56:318-25)中。亦预期其阻止治疗胜肽自聚集。此外，聚精胺酸可藉由电荷互斥力阻止mHtt/胜肽混合物自聚集(图1)。

在本研究中，针对HD测试所述合理设计。合成含有8个附接至连续麸酰胺酸(polyQ)的延伸物的连续精胺酸(8R)的若干种双链治疗胜肽并研究其等减少mHtt蛋白的聚集倾向的生物活性。此等双链胜肽的polyQ的长度是5个(8R5Q)、10个(8R10Q)、15个(8R15Q)或20个(8R20Q)(表2)。胜肽8R5Q及8R10Q高度溶于水或培养基(表2)中，且保持滞留时间及数量不变达至少28天(图2，A及B区)，此指示此等两种胜肽相当稳定。相比之下，8R15Q部分可溶，而8R20Q不溶，且两者的滞留时间及数量在HPLC分析期间经历时间相关性减少(图2，A及B区)，此指示其等高稳定性。因此，考虑到8R10Q的优异生物化学性质而选择其作为针对后续研究的前导胜肽。

表2：这些治疗胜肽的序列及生物化学性质。

s8R10Q：扰码8R10Q

表2中的序列自上至下对应于SEQ ID NOs:11-19。

藉由PolyR-PolyQ胜肽减少mHtt聚集

8R10Q结合至109QmHtt的能力藉由判定其与109QmHtt聚集的位置重迭检查。以羧基四甲基罗丹明(TAMRA)染料(图3，A区)标记所述8R10Q胜肽，并添加至表达25QHtt或109QmHtt的Neuro2a细胞中。所述TAMRA染料单独无法与109QmHtt聚集体结合，及经标记的8R10Q亦无法符合25QHtt的模式。相比之下，所述经TAMRA标记的8R10Q胜肽与这些聚集体位置重迭(图3，B区)。此等结果如预期明确验证8R10Q与mHtt相互作用的能力。

为探究胜肽对mHtt聚集体的影响的细节，使用全内反射荧光(TIRF)显微镜术可视化并量测这些mHtt聚集体的参数。如图3(C区)中所示，可在经水、8R或扰码胜肽(s8R10Q)治疗的Neuro2a细胞中容易观察到大固体109QmHtt聚集体；然而，可在经如此保留于整个测试时间点处的8R10Q治疗的细胞中看见主要小点状聚集体。定量数据显示经水、8R或扰码胜肽治疗的细胞的聚集体的平均尺寸分别是3.6μm²、3.3μm²、1.7μm²；同时彼等经8R10Q或8R15Q治疗的细胞者分别显著减小至0.3μm²及0.2μm²(图3，D区)。显而易见，前者对照组中的聚集体的子集大于10μm²，此在后者中从未识别。亦计算20个细胞内的聚集体数量。8R10Q及8R15Q增加聚集体数量4至5倍(图3，E区)。此等结果表明8R10Q或8R15Q阻止小点状结构形成109QmHtt大聚集物。

使用活细胞成像24小时追踪这些小聚集体。不出所料，一个细胞内的多个小点状物随时间推移而彼此融合，及最终形成一个显性或若干个大聚集体。8R10Q或8R15Q治疗揭示此等点状物在整个观察时间内无变化。

接着研究这些胜肽是否可调节mHtt的聚集倾向。如图4(A及C区)中所示，藉由过滤器陷阱分析，当相较于水或8R胜肽对照时，在转染后8小时(T1)或8加24小时(T1+T2)添加的20μM胜肽8R10Q或8R15Q显著减少聚集的109QmHtt。然而，当单独在24小时添加所述胜肽时，未观察到明显的作用。此等结果显示8R10Q及8R15Q胜肽有效阻止mHtt聚集。

为进一步表征，将Neuro2a溶解物分为RIPA可溶(sol)及不溶(ins)部分(图4，B区)。当相较于水、8R或扰码(s8R10Q)对照(图4，D区)时，8R10Q胜肽降低在可溶及不溶片段两者中的mHtt浓度。由于先前已显示泛蛋白蛋白酶体系统(UPS)对mHtt降解是重要的(Martin-Aparicio,J Neurosci(2001)21:8772-81；Jana,Hum Mol Genet(2001)10:1049-59)，因此使用MG132(UPS的抑制剂)以阻断由胜肽引起的mHtt减少。MG132逆转胜肽组(图4，E区)中的109QmHtt浓度。定量分析显示MG132治疗提高跨所有组的mHtt浓度，此指示UPS基础性转化109QmHtt。然而，针对经8R10Q治疗的样品的MG132:DMSO 109QmHtt的比率更高(图4，F区)。此等结果指示所述胜肽通过藉由UPS增强mHtt降解来减少mHtt。

藉由双链胜肽保护细胞抵抗109QmHtt及H₂O₂的神经毒性

已长期报告HD病患具有与由mHtt引起的粒线体功能障碍相关的较高程度的氧化应力。Browne,Brain Pathol(1999)9:147-63；及Tasset,Revista de Neurologia(2009)49:424-9。于HD中，mHtt及氧化应力可形成自强化恶性循环。在本研究中，约83％经具有或不具有扰码或双链治疗胜肽的50μM H₂O₂治疗的表达25QHtt的Neuro2a细胞存活(图5，A区)。另一方面，表达109QmHtt的Neuro2a细胞的存活率降低至～72％，此指示表达109QmHtt的细胞更易受到H₂O₂的氧化应力的侵害。8R10Q或8R15Q治疗使所述存活率增加至超过80％的程度(图5，A区)。

109QmHtt的表达减少Neuro2a细胞的生长，及如此达成H₂O₂的较低浓度(12.5μM)(图5，B区)。当相较于8R或扰码对照时，胜肽8R10Q减轻不仅由109QmHtt的毒性亦由H₂O₂的毒性引起的生长的减少。

视网酸(RA)引起具有轴突赘疣的Neuro2a细胞的分化。109QmHtt相对于25QHtt减少携带RA引起的轴突的细胞的数量(图5，C及D区)。当相较于水或扰码对照时，8R10Q治疗显著逆转由109QmHtt引起的轴突赘疣的缺陷。所述8R胜肽在某种程度上亦自此毒性挽救细胞，但这些结果非统计学显著。此等结果明确显示这些双链胜肽可保护Neuro2a细胞抵抗由109QmHtt及/或由H₂O₂引起的毒性。

8R10Q对R6/2转基因小鼠的治疗作用

为测试所述胜肽在活体内的治疗作用，所述8R10Q胜肽通过鼻内吸入或连续以Alzet渗透性微型泵进入新纹状体中，6天/周递送入野生型(WT)或R6/2转基因小鼠中。通过任一途径经8R10Q治疗的WT或R6/2小鼠的体重堪比彼等经PBS治疗者。如图6(A区)中所示，藉由R6/2小鼠的滚轮运动评估的运动退化自11周龄变得显著，但8R10Q治疗有效延迟所述表现型直至13周。实际上，经8R10Q治疗的R6/2小鼠表现甚至好于平均11周大经PBS治疗的小鼠。脑内递送的8R10Q胜肽显示与鼻内给予的8R10Q胜肽极其类似的治疗作用。此等结果显示投与途径不影响此作用。此外，鼻内8R10Q亦修正如T型迷宫测试中所示的13周大的R6/2小鼠的记忆力减退(图6，B区)。先前报告这些R6/2小鼠患有糖尿病。Bjorkqvist等人，HumMol Genet(2005)14:565-74；及Hunt等人，Experimental Brain Res(2005)166:220-9。8R10Q胜肽的鼻内投与延迟血糖升高并降低血糖浓度(图6，C区)。同样，脑内给予的8R10Q亦显著修正糖尿病表现型。最后，所有经PBS治疗的R6/2小鼠在16周龄前或在16周龄时死亡；然而，鼻内给予的8R10Q阻止16周龄时的过早死亡达41％(图6，D区)。综上所述，所述8R10Q胜肽有效延迟疾病的发病并减轻病理学表现型。

藉由8R10Q胜肽减少神经病理学

R6/2转基因小鼠因皮质神经元的损失而显示皮质厚度的减小。有趣地，8R10Q胜肽阻止皮质变薄(图7，A及B区)，表明此胜肽可自死亡中挽救神经元。确实，神经元计数揭示鼻内8R10Q治疗显著阻止R6/2小鼠的皮质(图7，C及D区)及纹状体(图7，E及F区)两者中的神经元的损失。

为关联有利作用与mHtt聚集体，可进行免疫组织化学以计算每单位面积(150μm²)中聚集体占据的面积。选择所述方法的原因在于这些聚集体频繁聚集为聚集物而使聚集体数量的精确计数非常困难。如图8(A及B区)中所示，当相较于PBS对照时，所述8R10Q胜肽在皮质及纹状体两者中减小聚集面积达～60％。此外，两个区域中的8R10Q胜肽亦显著降低表示聚集体中mHtt数量的强度。当相较于PBS时，相应的西方墨点转渍法分析揭示8R10Q胜肽减少RIPA不溶或聚集部分。针对神经元损失及聚集的挽救作用伴随经8R10Q治疗的R6/2小鼠的皮质中的GFAP阳性星形神经胶质细胞(图8，C及D区)及Iba-1-阳性微神经胶质(图8，E及F区)的数量的显著减少。此外，这些R6/2小鼠相较于WT小鼠具有弱tau讯号，但8R10Q治疗在皮质及纹状体两者中显著增强tau讯号，此指示轴突过程的恢复。总之，此等结果显示所述8R10Q胜肽有效减少聚集的mHtt物质，并阻止mHtt引起的神经毒性。

讨论

在本研究中，显示诸如8R10Q的双链治疗胜肽结合至mHtt聚集体，降低mHtt介导的毒性，及延迟HD模型中神经功能障碍的发病及进展。此外，在瞬态表现mHtt的小鼠细胞系、R6/2转基因小鼠及人类HD iPS衍生的神经元中观察到8R10Q的治疗作用；其治疗作用独立于mHtt中的polyQ的动物种类或长度。

在所述双链胜肽设计中，所述带电序列在阻止所述治疗胜肽本身或错误折迭目标/胜肽混合物聚集中起至关重要的作用。为识别可降低mHtt毒性的胜肽，先前已进行使用各种方法的研究，这些方法诸如噬菌体显示(Kawasaki等人，Biosci,Biotech,and Biochem(2012)76:762-6；Lecerf等人，Proc Natl Acad Sci USA(2001)98:4764-9；Nagai等人，HumMol Genet(2003)12:1253-9；Magai等人，J Biol Chem(2000)275:10437-42)或其他筛选方法(Arribat等人，PLoS One(2013)8:e68775；Lakhani等人，PLoS Computational Biol(2010)6:e1000772；Skogen等人，BMC Neurosci(2006)7:65)及序列修饰(Lanning等人，Biochem(2010)49:7108-18；Kazantsev等人，Nat Genet(2002)30:367-76)。相较于彼等方法，将带电序列的互斥力纳入胜肽设计中提供若干优点。第一，先前研究主要目标或疾病特异性。相比之下，本研究藉由选择对受关注的疾病的错误折迭蛋白/衍生物具有特异性亲和性的合作序列使设计抗各种神经退化性疾病的治疗胜肽成为可能。此可能性受各别研究支持，所述各别研究显示藉由相同原理设计的治疗胜肽于APP/PS1转基因小鼠(针对AD广泛使用的小鼠模型)中产生类似有利结果。第二，可显著简化针对治疗胜肽寻找或修饰候选序列所耗费的工作。先前方法要求技术人员寻找既可结合至错误折迭蛋白/衍生物且同时亦可阻止后者聚集的双功能胜肽，此可需要大量努力。而且，针对不同疾病将很可能需要重新投入此等努力。在本设计中，如已于这些研究的两者中证实，这些亲和性序列可直接取自受关注的特定疾病的错误折迭蛋白/衍生物。因此，可排除大量工作。此外，所述策略可应用于先前研究中识别的胜肽以进一步增强其治疗作用。

实例2：用于延迟APP/PS1转基因小鼠的疾病发病的例示性双链治疗胜肽

成年神经退化性疾病(NDs)包括特征在于藉由错误折迭胜肽/蛋白形成的疾病特异性包涵体(IBs)的神经性疾病的异质组。阿兹海默氏症(AD)是最常见的成年神经退化性疾病，具有特征性的包涵体、类淀粉斑块及神经纤维缠结。目前认为错误折迭类淀粉β(Aβ)胜肽及其变体的制造及清除的失衡是阿兹海默氏症的发病原理的主要原因。下文讨论组合聚精胺酸(PolyR)与衍生自形成包涵体的病原胜肽/蛋白的胜肽的模块化胜肽设计。预期经设计的双链胜肽具有专一目标亲和性及可藉由PolyR赋予的电荷互斥阻止错误折迭胜肽/蛋白自聚集。藉由圆偏光二色性及电子显微镜术发现经设计的双链胜肽R₈-Aβ(25-35)及其D型衍生物^DR₈-Aβ(25-35)阻止Aβ₄₀形成类淀粉纤维。当以1:1的比率混合时，两种胜肽显著降低Aβ₄₀对Neuro2a细胞的毒性。如莫氏水迷宫测试证实，相较于经PEI治疗的对照组，自4月龄每日鼻内投与经PEI结合的R₈-Aβ(25-35)胜肽显著减轻8个月大APP×PS1双转基因小鼠的记忆力减退。显著降低皮质及海马区中的总Aβ₄₀及Aβ₄₂的浓度及持续地降低类淀粉斑块的数量。总之，组合polyR与来自病原胜肽/蛋白的胜肽的所述模块化设计(诸如R₈-Aβ(25-35))产生所需的治疗作用，且可易于应用于针对其他以包涵体表征的疾病的治疗胜肽的设计。

方法及材料

胜肽合成

藉由批次茀甲氧羰基(fmoc)-聚酰胺方法制造这些胜肽。Chen等人，Protein Sci(2001)10:1794-1800。Aβ40的序列：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(SEQ IDNO:20)。R8Aβ25-35的序列：RRRRRRRRGSNKGAIIGLM(SEQ ID NO:3)；^DR8Aβ25-35具有与R8Aβ25-35相同的序列，但L-型精胺酸以D-型精胺酸置换。使用Rink Amide AM树脂(Novabiochem,Billerica,MA,USA)作为固体载体，使用六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-参-吡咯啶-鏻(4当量)及4.45％(v/v)N-甲基吗啉于二甲基甲酰胺(DMF)中将Fmoc-氨基酸衍生物(4当量)(Anaspec,Freemont,CA,USA)的C端羧基酰胺化并偶合于所述树脂(1当量)上，再使用20％哌啶于DMF中进行所述Fmoc裂解步骤。最后藉由所述树脂与9.4ml三氟乙酸、0.25ml水、0.25ml乙二硫醇及0.1ml三异丙基硅烷的混合物在室温搅拌1至2小时同时进行侧链去保护及自所述树脂裂解胜肽，然后藉由使所述反应混合物通过G2玻璃漏斗移除所述树脂。加入三倍体积的冰冷甲基第三丁基醚(MTBE)并以4℃，2000g离心15分钟后，滤液中的沉淀即为胜肽的粗制物。粗制物再以MTBE清洗两次，并在真空下干燥。藉由逆相HPLC使用Vydac C18管柱(10mm x 250mm)及含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水混合物纯化沉淀的胜肽。收集HPLC图谱中的波峰所对应的样品后以基质辅助的雷射脱附离子化(MALDI)质谱仪分析后，再将正确的产物以冷冻干燥法冻干并储存于-20℃。因为合成的R₈-Aβ(25-35)胜肽的C端羧基将接合上PEI，在合成时需使用Fmoc-Met-Wang树脂(Anaspec)作为固体载体。此外，为避免胜肽N端的胺基干扰后续的PEI接合反应，在合成的最终步骤中需使用4倍当量的乙酸酐取代所述氨基酸衍生物并将所述胜肽的N端基团乙酰化。

圆偏光二色性(CD)光谱术

将胜肽样品溶解于75％三氟乙醇中作为1.4mM原液，接着以150mM KCl(pH 7)将其稀释于20mM磷酸钠缓冲液中至使得最终浓度为30μM并在25℃下培养。培养一段时间后，将所述样品放置于1-mm比色皿中并于J-715CD分光计(JASCO,Japan)上记录200与250nm间的CD光谱。带宽设定为2nm及所述步骤分辨率是0.05nm。每个样品扫描两次并将记录的光谱平均化以获得最终光谱。

穿透式电子显微镜术

将样品沉积于经碳涂覆的300目铜栅极上，培养3min以待吸收，最后则以水冲洗。接着以2％乙酸氧铀染色1.5min进行阴性染色。风干后，使用Hitachi H-7000电子显微镜(Hitachi,Tokyo,Japan)观察这些样品。

细胞存活率分析

在37℃及5％CO₂的条件下以含有10％胎牛血清(FBS；HyClone,USA)的杜贝卡氏改良伊格培养基(DMEM)(HyClone,USA)培养小鼠N2a神经母细胞瘤细胞(ATCC)。为了分析细胞的存活率，收取细胞后以每毫升350,000个细胞的密度将N2a细胞悬浮于DMEM中，并将100μL的样品加入96孔细胞培养盘(Corning,USA)的各孔中。因为细胞毒性实验持续长达4天，所以使用无FBS的培养基阻断细胞增殖。将细胞培养盘置于37℃及5％CO₂的条件下培养24h以待细胞完成贴盘的步骤。将这些胜肽溶解于DMSO中作为6mM原液，吸取5μL的6mM胜肽原液并以95μL PBS(20mM磷酸钠缓冲液、150mM KCl,pH 7.0)稀释，然后将所述稀释液立即添加至900μL新鲜DMEM培养液中使得最终胜肽浓度为30μM。为测试所述胜肽抑制剂的效力，将所述胜肽原液以等体积的Aβ40溶液混合然后再稀释于PBS，使得最终胜肽浓度各为30μM。将稀释后的胜肽溶液置于室温下振荡(50rpm)培养24h。以100μL含胜肽的培养液置换培养孔中的培养液后再将所述培养盘培养48h。使用MTT溴化(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓)毒性分析判定细胞存活率。Shearman等人，J Neurochem(1995)65:218-27。将10μL(浓度为5mg/mL)的MTT溶液(溶于PBS中)添加至各孔中，培养4h后，移除所述培养液并将MTT晶体溶解于100μL 90％异丙醇、0.5％SDS及40mM HCl中，量测其溶液在570nm下的吸收。将含有胜肽样品的吸光值除以无添加任何胜肽的控制组吸光值后即可计算细胞存活率。所述实验至少重复四次及针对各独立实验中的各样品及对照使用八个重复孔。

经PEI结合的胜肽的合成

将三毫克的乙酰化R₈-Aβ(25-35)溶解于2.5mL二甲亚砜(DMSO)中，缓慢地依序加入150μL的1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺溶液(EDC)(600mM，溶于0.1M MES、0.5MNaCl中，pH 6)及150μL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(1200mM，溶于0.1M MES、0.5M NaCl中，pH6)溶液，并将所述反应混合液于室温下震荡(70rpm)反应30min。于所述混合液中添加180μL聚乙烯亚胺(PEI)后置于室温下振荡(70rpm)反应整夜。藉由逆相HPLC使用Vydac C18管柱(10mm x 250mm)及含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水混合物将名为R₈-Aβ(25-35)-PEI的所述经PEI结合的胜肽分离自未反应的PEI及R₈-Aβ(25-35)。收集HPLC图谱中的波峰所对应的样品后以基质辅助的雷射脱附离子化(MALDI)质谱仪分析后，再将正确的产物以冷冻干燥法冻干并储存于-20℃。

鼻内投药

APP×PS1转基因小鼠(B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax购买自JacksonLaboratories(USA)，饲养及基因型的分析则是遵照供货商提供的方法。Borchelt等人，Neuron(1996)17:1005-13；及Jankowsky等人，Biomol Eng(2001)17:157-65。实验过程中，这些小鼠可随意获取食物及水及保持12:12h光–暗循环。将PEI及R₈-Aβ(25-35)-PEI溶解于100mM NaH₂PO₄/138mM KCl(pH 5)中并调整最终浓度至400μM。以鼻内投药而言，当这些小鼠4月龄时，每周六次向小鼠的每个鼻孔各投以2.5μL PEI或R₈-Aβ(25-35)-PEI直至其等是8月龄。然后以莫氏水迷宫测试小鼠。水迷宫测试的6周中断后重新开始治疗，及持续直至这些小鼠是12月龄。

针对总Aβ40及Aβ42的ELISA分析

小鼠脑均质液中的Aβ40及Aβ42的浓度以ELISA酵素结合免疫吸附分析法(Invitrogen,MD,USA)分析，步骤则是遵循制造商所建议的流程。简而言之，秤取少量小鼠的皮质或海马区组织并在4℃下以厂商提供的细胞萃取液(另添加有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma,St.Louis,USA))均质化。将均质液以13000rpm离心10min(4℃)，吸取上方澄清液后再以微型BCA蛋白分析(Thermo,IL,USA)量测蛋白浓度。根据蛋白浓度调整类淀粉前驱蛋白(APP)浓度。

不溶性Aβ40及Aβ42的ELISA分析

秤取少量小鼠的皮质或海马区组织，以400μL的冰冷TBS缓冲溶液(添加有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(P8340,Sigma))均质化，随后将这些均质液转移至1.5mL Eppendorf管中，并在4℃下以20000g离心20min。所述上清液为可溶性Aβ，而TBS不溶物即含有不溶性Aβ蛋白。以70％甲酸溶液回溶所述TBS不溶物，再以超音波震荡1min，最后于4℃下以20000g离心20min。最终上清液以20倍体积的1M Tris碱中和，并使用Bradford蛋白分析(Bio-Rad#500-0006)定量已被中和的最终上清液中所含经溶解的「不溶」Aβ蛋白浓度。

莫氏水迷宫任务

以直径为120cm并含有40cm高壁的白色不透明塑料制造所述迷宫。在25℃下用牛奶/水填充所述水迷宫。将小逃避平台(10×6.5×21.5cm)放置于一个象限的中心的距周边25cm的固定位置并隐藏在水表面下1cm。所述空间在壁上含有大量固定的目视提示。获得试验阶段由5个训练日(第1至5天)组成，每天四个试验，每次试验间隔15min。沿所述池的圆周均匀隔开的四个点(北、南、东及西)充当起始位置，跨每天四个试验将其等随机化。若动物未于90s内到达平台，则引导其至所述平台，让其在所述平台保持15s。记录路线长度及寻找平台时间(n＝10只每组)。藉由双向重复量测ANOVA分析获取数据诸如到达寻找平台所需时间及路线长度。在完成三个试验后的第5天，进行探测试验以评估这些小鼠的空间记忆。自所述迷宫移除所述平台并容许这些动物自由游泳90s及记录并分析游泳路线。

流式珠粒数组

使用流式珠粒数组(CBA，小鼠发炎套组；BD Biosciences)以定量量测对照及经治疗的小鼠脑组织溶解物中的细胞介素表达浓度。亦进行CBA以量测不同脑区域(皮质及海马区)的细胞介素。此方法定量可溶颗粒，在此情况下，使用基于荧光的侦测机制定量细胞介素。使涂覆所需细胞介素(IL-6及IL-1β)的珠粒与测试溶解物及标准物反应，然后向其中添加荧光染料。根据制造商的说明书进行所述分析并于FACS Calibur(Becton Dickinson)上分析。使用容许计算未知样品中的细胞介素浓度的CBA软件进行分析。Soldan等人，JNeuroimmunol(2004)146:209-15。

硫代黄素S染色

以冰冷PBS(136.89mM NaCl、2.68mM KCl、1.62mM KH₂PO₄及10.14mM Na₂HPO₄，pH7.4)缓冲液及4％多聚甲醛(PFA)/PBS灌流小鼠。然后将这些经灌流的小鼠的脑后固定于4％PFA/PBS中并于室温下振荡并反应24小时。固定后，用PBS缓冲液清洗这些脑样品并保藏于70％乙醇溶液中。使用半封闭式实验台组织处理器(Leica TP1020)使经PFA固定的脑组织脱水。以Leica EG1150H将经脱水的脑样品包埋于石蜡中。使用显微切片机(LeicaRM2235)切出厚度为5μm厚度的切片。以毛刷将两片脑切片移至水面上，待其展平后即可以载玻片捞起，再将其置于于34℃下风干数小时。依序使用二甲苯、绝对乙醇、95％乙醇、70％乙醇及水将石蜡切片脱蜡及复水。在室温下给予经复水的石蜡切片1％(w/v)硫代黄素S(ThS)溶液10min，同时避光。用80％乙醇及水清洗这些石蜡切片以移除过量ThS染剂并促进染剂的可视化。然后使用针对绿荧光的评估配备的荧光显微镜将ThS阳性讯号可视化，及藉由ImageJ分析类淀粉斑块的数量、总面积及平均面积。

[¹¹C]PIB的放射性合成

藉由使用[¹¹C]三氟甲磺酸甲酯根据具有最小修改的前文描述的方法进行[¹¹C]PIB的放射性合成。Takalo等人，Am.J.Neurodeger.Dis.(2013),2:1-14。简而言之，藉由[¹¹C]甲烷的多程溴化制造[¹¹C]溴甲烷。随后，将[¹¹C]溴甲烷冲提出并藉由通过经预热的三氟甲磺酸银柱转化为[¹¹C]三氟甲磺酸甲酯。藉由氦气流(20ml/min)将[¹¹C]三氟甲磺酸甲酯携载入350μL含有1.5mg 2-(4’-胺基苯基)-6-羟基苯并噻唑的无水甲基乙基酮中。完成陷阱设置后，在75℃下将所述反应混合物加热2min及然后于所述反应混合物中添加0.4mlHPLC移动相以用于后续的HPLC纯化。以Waters Bondapak管柱(10m,7.8mm ID×300mm)及乙腈/0.01M H₃PO₄(40/60)作为移动相(流速为5.0ml/min)进行HPLC纯化。将对应于[¹¹C]PIB的放射性溶离份收集于含有30ml纯水的瓶中并通过C18Sep-Pak Plus匣，然后用10ml纯水清洗，用1ml乙醇及10ml无菌正常生理盐水洗提，并通过0.22μm无菌过滤器以进行质量分析及动物实验。如藉由分析性HPLC测定，放射性化学纯度大于99％。合成结束时的特异性活性是152±52GBq/μmol。

活体内小动物正电子发射断层摄影术成像

使用Triumph临床前三模态(LabPET/X-SPECT/X-O CT)成像系统(TriFoilImaging,USA)进行所有PET扫描，所述系统为LabPET子系统提供31个相距1.175mm(中心至中心)的横断部分、100mm横断FOV及37mm轴向FOV。数字APD侦测器技术递送优于1mm的高空间分辨率及高恢复系数。扫描前，用加热灯保持所有小鼠温暖。引入2.0％异氟烷后，放置这些小鼠使得其等头部位于视野中心并以俯卧姿势固定。经由尾部静脉进行[¹¹C]PIB(36.7±2.6MBq；体积<0.25ml)注射后，在于20min时在具有350-650keV的能量窗的3D列表模式中进行20min静态数据采集。针对示踪剂衰变时间标准化及修正辐射数据。所有列表模式数据储存于3D正弦图中，然后将其等单片Fourier重排为2D正弦图。使用MLEM算法重新构造[¹¹C]PIB注射后的20至40min的求和影像，且所得影像体积由240×240×31的三维像素组成，且三维像素尺寸为0.25×0.25×1,175mm³。

PET资料分析

使用PMOD 3.5软件套装(Pmod Technologies,Zürich,Switzerland)处理并分析所有成像数据。在标准化至注射剂量(ID)的[¹¹C]PIB及动物的身体质量前使用幻象衍生的校准因子将所述PET影像数据组转化为放射性浓度的绝对量度(kBq/cc)。此标准化使得能够比较不同体重的动物的脑放射性浓度。静态PET影像是与基于PMOD作为解剖对照的小鼠T2加权的MRI脑图册共登记。影像来源根据MRI图册设定为Bregma(0,0)且使用所述图册用于VOI定义。在受关注的4个区域(命名为：皮质、海马区、杏仁核及嗅球)内评估[¹¹C]PIB摄取。藉由平均[¹¹C]PIB活性除以注射剂量及体重(公克除以公克)获得各VOI的经标准化的摄取值(SUV)。此后，藉由作为参照区域的小脑中的[¹¹C]PIB摄取标准化目标区域内的区域性[¹¹C]PIB摄取(相对于小脑的比率)。Manook等人，PLoS One(2012)7:e31310；Poisnel等人，Neurobiol Aging(2012)33:2561-71。

结果

针对治疗胜肽的亲和性正电荷模块化设计

提出合成治疗胜肽的合理设计，这些治疗胜肽可减少跨各种神经退化性疾病的毒性错误折迭蛋白/衍生物。所述设计建立于具有亲和性及电荷的序列的模块化组装件的原理。推测胜肽包含一侧或两侧侧悬带电氨基酸延伸物的衍生自错误折迭蛋白/衍生物的自聚集区域的亲和性序列。此设计背后的基本原理是所述亲和性序列因其聚集倾向而促进治疗胜肽结合至错误折迭蛋白/衍生物；所述带电序列则藉由电荷互斥力阻止治疗胜肽本身及错误折迭蛋白/胜肽混合物聚集(图1)。就理论而言，具有正电荷或负电荷的氨基酸皆可达成所述目的。在本设计中，选择带正电的精胺酸，因为已显示聚精胺酸(poly-Arg)促进治疗胜肽穿透进入目标细胞或器官的细胞质及细胞核隔室中。Mitchell等人，J Pept Res(2000)56:318-25。

Aβ₄₀、R₈-Aβ(25-35)及^DR₈-Aβ(25-35)的构形研究

经聚乙烯亚胺(PEI)阳离子化的蛋白可跨细胞膜转导。Futami等人，J BiosciBioeng(2005)99:95-103；Futami等人，Expert Opin Drug Discov(2007)2:261-9；Kitazoe等人，J Biochem(2005)137:693-701；Kitazoe等人，Biotechnol J(2010)5:385-92；Murata等人，J Biochem(2008)144:447-55；Murata等人，J Biosci Bioeng(2008)105:34-8。PEI是蛋白酶抵抗剂且相较于poly-Arg或聚离胺酸片段具有更高电荷密度。经PEI结合的绿荧光蛋白可藉由鼻内投与穿过血脑障壁，并进入脑部。Loftus等人，Neurosci(2006)139:1061-7。

为研究此等涉及类淀粉形成的胜肽的生物物理性质，在25℃下个别培养溶解于20mM具有150mM KCl的磷酸钠缓冲液(pH 7)中的Aβ₄₀、R₈-Aβ(25-35)及^DR₈-Aβ(25-35)。在如指示的各种时间点下记录这些圆偏光二色性(CD)光谱。如预期，在Aβ₄₀光谱的218nm下的负椭圆率的强度随时间增强(图10，A区)，与如藉由穿透式电子显微镜术(TEM)显示的其已知的形成类淀粉纤维的能力一致(图10，D区)。相比之下，R₈-Aβ(25-35)的CD光谱在200nm下显示负椭圆率，此指示无规线圈结构(图10，B区)。同样地，所述^DR₈-Aβ(25-35)亦具有与无规线圈结构一致的CD光谱，其因所述胜肽中存在八个D-型精胺酸而在200nm下缺乏强负椭圆率(图10，C区)。两种胜肽的CD光谱随培养时间流逝而仍在很大程度上保持不变。所述TEM显示R₈-Aβ(25-35)及^DR₈-Aβ(25-35)在相同条件下形成无定形的聚集体(图10，E及F区)。未观察到类淀粉纤维。

为检查R₈-Aβ(25-35)或^DR₈-Aβ(25-35)是否可干扰Aβ₄₀的类淀粉形成，量测与R₈-Aβ(25-35)或^DR₈-Aβ(25-35)以1:1比率混合的Aβ₄₀的CD光谱。如显示于图10中(G及H区)，当R₈-Aβ(25-35)或^DR₈-Aβ(25-35)与Aβ₄₀共培养时，于218nm下的讯号几乎不变。图10中(I区)的类淀粉形成的运动踪迹表明R₈-Aβ(25-35)或^DR₈-Aβ(25-35)的存在极大地增加延迟时间。长时间培养后，这些胜肽混合物的TEM影像显示纤维及无定形的聚集体的混合物(图10，J及K区)。此等结果显示R₈-Aβ(25-35)及^DR₈-Aβ(25-35)可与Aβ₄₀相互作用并干扰其自聚集，因此显著延迟或减少Aβ₄₀类淀粉纤维的形成。

藉由R₈-Aβ(25-35)及^DR₈-Aβ(25-35)的Aβ₄₀细胞毒性的减弱

为测试R₈-Aβ(25-35)或^DR₈-Aβ(25-35)是否可减弱Aβ₄₀的细胞毒性，进行MTT分析以量测经指定胜肽处理的Neuro2a细胞(小鼠神经母细胞瘤细胞系)的存活率。Aβ₄₀(μM)表达明显的细胞毒性及仅30％的细胞存活。相比之下，R₈-Aβ(25-35)及^DR₈-Aβ(25-35)两者对N2a细胞无可侦测的毒性(图11，A区)。R₈-Aβ(25-35)及^DR₈-Aβ(25-35)两者皆减小Aβ₄₀毒性并将细胞存活率自30％增加至70至75％。就比较而言，当Aβ40与Aβ(25-35)混合时，未观察到细胞存活率的显著变化。数据显示R₈-Aβ(25-35)及^DR₈-Aβ(25-35)胜肽两者在类淀粉诱发的毒性中具有治疗潜力。

R₈-Aβ(25-35)在APP/PS1转基因小鼠中的治疗作用

为测试R₈-Aβ(25-35)阻止活体内记忆力退化的作用，自3至4月龄开始，鼻内给予野生型或APP/PS1转基因小鼠经PEI或PEI结合的R₈-Aβ(25-35)。当小鼠到达8月龄时进行水迷宫分析。如图12(A区)中所示，经PEI及R₈-Aβ(25-35)-PEI治疗的野生型小鼠在寻找隐藏平台的学习曲线中未显示明确差异。另一方面，经R₈-Aβ(25-35)治疗的APP/PS1小鼠相较于经PEI治疗的转基因小鼠显示明显更快的学习。此外，经R₈-Aβ(25-35)胜肽治疗的APP/PS1小鼠相较于彼等经PEI治疗者在探测实验中表现更佳(图12，B区)，此由在其中使用所述探测的象限中通过次数的增加(图12，C区)及更长时间证实。

接着藉由ELISA检查Aβ胜肽的浓度的变化。如图13中所示，相较于经PEI治疗的转基因小鼠，在经R₈-Aβ(25-35)胜肽治疗的APP/PS1小鼠的皮质中的Aβ₄₀及Aβ₄₂的浓度在8月龄时分别下降86％及30％。同样地，相较于后者，前者小鼠的海马区中的Aβ₄₀及Aβ₄₂的浓度分别下降73％及60％。

一致地，经硫代黄素S化学荧光染料染色的组织部分显示多重绿荧光类淀粉斑块在8个月大经PEI治疗的APP×PS1小鼠的皮质及海马区两者中的沉积，此在年龄匹配的经胜肽治疗的APP×PS1小鼠中显著减少(图14，A区)。如图14(B区)中所示，相较于在经PEI治疗的小鼠的相应区域中，斑块数量在经胜肽治疗的小鼠的皮质及海马区中显著减少。在经胜肽治疗的小鼠的皮质及海马区两者中相对于在经PEI治疗的对照的皮质及海马区两者中，类淀粉斑块的总面积相应减小(图14，C区)。为进一步消除由个别脑部分的尺寸的变化所引起的可有助于正结果的影响，计算具有类淀粉斑块的皮质及海马区的面积百分率；相较于PEI对照治疗，胜肽治疗再次显著减小两个区域的类淀粉斑块面积的百分率(图14，D区)。接着检查藉由治疗是否改变斑块的平均面积；如图14(E区)中所示。尽管胜肽治疗减小个别斑块的平均面积，但所述差异无法达到统计学显著。数据指示胜肽治疗有效减缓类淀粉斑块的积聚及记忆力的临床损伤。类淀粉沉积引起神经炎症，其重要地有助于此等小鼠中的疾病。R₈-Aβ(25-35)-PEI有效降低皮质中的促炎症性细胞介素(介白素(IL)-6及IL-1β)的浓度(图15)。

暂停4周后的胜肽的治疗作用

在水迷宫测试期间，所述治疗中止约4周。为检查所述治疗作用在治疗暂停后是否可保持或重新开始，重新开始PEI或胜肽的投与并持续直至此等小鼠达到12月龄。以微型PET使用示踪剂Pittsburg化合物B(PiB)定量类淀粉斑块负荷。如图16(A及B区)中所示，如相较于经PEI治疗的小鼠，经R₈-Aβ(25-35)胜肽治疗的APP×PS1小鼠在皮质、海马区、杏仁体及嗅球中具有低得多的讯号，其与在此年龄的有利的治疗作用一致。ELISA分析显示皮质及海马区中的总Aβ₄₀分别减少16％及21％(图17，A及D区)，但总Aβ₄₂的浓度无统计差异。在经肽胜肽治疗的APP×PS1小鼠的皮质或海马区中，不溶性Aβ₄₀及Aβ₄₂减少25～30％(图17，C及D区)，与微型PET(17～35％减少)的结果一致。

讨论

在本研究中，证实胜肽R₈-Aβ(25-35)或其D-型对应体可藉由活体外Aβ₄₀胜肽减少活体内类淀粉纤维及类淀粉斑块的形成及疾病表现。R₈-Aβ(25-35)胜肽的鼻内投与亦在APP/PS1转基因小鼠中显示有利的治疗作用。因此，数据指示可预见基于本文描述的亲和性/带电模块化原理设计的治疗胜肽在治疗神经退化性疾病(特别是彼等涉及异常蛋白聚集者)中治疗有效。

在本设计中，所述带电序列不仅增强这些双链胜肽的细胞渗透性及生物利用率，亦可藉由提供互斥力以阻止错误折迭目标进一步聚集而在胜肽治疗中起至关重要的作用。在所述胜肽的N及C端引入这些带电部分。藉由胍基在poly-Arg的侧链中引入N端正电荷；同时藉由以聚乙烯亚胺化学修改C端羧基引入C端正电荷。此外，相较于另一Aβ聚集-抑制的经PEI结合的V24P(10-40)胜肽，R₈-Aβ(25-35)表现更佳。

尽管已设计许多治疗胜肽，但仅其等中的少数在活体内测试(Shukla等人，FASEBJ(2013)27:174-86；Frydman-Marom等人，Angew Chem Int Ed(2009)48:1981-6；Funke等人，ACS Chem Neurosci(2010)1:639-48；Permanne等人，FASEB J(2002)16:860-2；vanGroen等人，ChemMedChem(2008)3:1848-52)。在本研究中，证实通过鼻内途径的治疗胜肽前药的投与的可行性。当与递送技术组合时，所述研究显示针对神经退化性疾病通过鼻内递送的治疗原理的证明。此研究中使用的剂量估算为每天2nmol，所述剂量相较于先前研究相当低。Frydman-Marom等人，Angew Chem Int Ed(2009)48:1981-6；Funke等人，ACS ChemNeurosci(2010)1:639-48；Permanne等人，FASEB J(2002)16:860-2；van Groen等人，ChemMedChem(2008)3:1848-52。考虑到类淀粉斑在活体内形成异常迅速及甚至可能快至1至2天的事实(Meyer-Luehmann等人，Nature(2008)451:720-4)，很可能中断治疗4周后，沉积于经R₈-Aβ(25-35)-PEI-治疗的小鼠中的类淀粉斑已接近或达到经PEI治疗的小鼠中的浓度。令人鼓舞地是在12个月大的小鼠中，重新开始胜肽治疗仍可看到效果。此等发现指出在中断一段时间后仍可阻止类淀粉斑沉积。实际上，针对肝及肾功能的测试发现在接受这些胜肽的小鼠中无明显毒性。总之，经设计的双链胜肽的鼻内投与提供治疗由聚集引起的神经退化性疾病的有效且使用者友好的预防及治疗方法。

实例3：双链胜肽的鼻内递送减少APP/PS1转基因小鼠的脑中的类淀粉负荷

经设计以减少脑内的Aβ积聚的「清除者胜肽」V24P(10-40)结合至聚乙烯亚胺(PEI)，并作为在此研究中针对阿兹海默氏症(AD)的预防及/或治疗策略进行测试。此经PEI结合的V24P(10-40)胜肽作为鼻滴剂经鼻递送至4月龄的APP/PS1双转基因小鼠中，历时四个月。相较于对照值，胜肽治疗减少Aβ胜肽的量在海马区中达72％的Aβ40及40％的Aβ42，及在皮质中达87％的Aβ40及32％的Aβ42。治疗8个月后，如藉由Pittsburg化合物B微型PET成像定量的类淀粉负荷在海马区、皮质、杏仁核及嗅球中显著减小。数据证实经鼻递送的清除者胜肽有效减少脑中的Aβ斑块形成。胜肽滴剂的鼻内施用是使用者友好的，且可经进一步开发以用于针对AD及其他神经退化性疾病(包含彼等本文描述者)的预防及治疗目的。

材料及方法

经PEI结合的胜肽的合成

藉由分批茀甲氧羰基(fmoc)-聚酰胺方法合成所有胜肽。Chen等人，Protein Sci(2001)10:1794-1800。为合成经PEI结合的V24P(10-40)胜肽，将所述胜肽的C端羧基接合上PEI。为避免胜肽N端的胺基干扰后续的PEI接合反应并提供抵抗外胜肽酶的保护，因此在合成的最终步骤中则是使用4倍当量的乙酸酐将所述V24P(10-40)胜肽的N端基团乙酰化。将4.8mg的乙酰化V24P(10-40)胜肽溶解于4mL二甲亚砜中，缓慢地依序加入240μL的1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺(600mM，溶于0.1M MES、0.5M NaCl中，pH 6)溶液及240μL胜肽N-羟基琥珀酰亚胺(1200mM，溶于0.1M MES、0.5M NaCl中，pH 6)溶液，并将所述反应混合物于室温下震荡(70rpm)反应30min。于所述混合液中添加288μL聚乙烯亚胺(PEI)后置于室温下振荡(70rpm)反应整夜。藉由逆相HPLC将经PEI结合的胜肽(V24P(10-40)-PEI)分离自未反应的PEI及V24P(10-40)。

动物实验

APP×PS1转基因小鼠(B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax购买自JacksonLaboratories(USA)，饲养及基因型的分析则是遵照供货商提供的方法。Jankowsky等人，Biomol Eng(2001)17:157-65；Borchelt等人，Neuron(1996)17:1005-13。这些小鼠可随意获取食物及水及保持12:12h光–暗循环。将PEI及V24P(10-40)-PEI以溶解于100mM NaH₂PO₄、138mM KCl(pH 5)中并调整最终浓度至400μM，当这些小鼠4月龄时，每周六次向小鼠的每个鼻孔投以2.5μL PEI或R₈-Aβ(25-35)-PEI直至其等是8月龄。针对Aβ40及Aβ42的ELISA分析

小鼠脑均质液中的Aβ40及Aβ42浓度以ELISA酵素结合免疫吸附分析法(Invitrogen,MD,USA)分析。简而言之，秤取少量经PEI治疗或经V24P(10-40)-PEI治疗的APP/PS1小鼠的皮质或海马区组织并在4℃以厂商提供的细胞萃取液(添加有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma,St.Louis,USA))均质化，将均质液以15000g(13000rpm)离心10min(4℃)，吸取上方澄清液后再以微型BCA蛋白分析(Thermo,IL,USA)量测蛋白浓度。将这些上清液稀释10倍后即可以ELISA测量其Aβ40及Aβ42浓度，所测得的数据再除以蛋白浓度并以每毫克蛋白有几奈克Aβ表示。

活体内微型PET

使用具有最小修改的前文描述的方法使用[¹¹C]三氟甲磺酸甲酯产生[¹¹C]PIB。Manook等人，PLoS One(2012)7:e31310。使用Triumph临床前三模态(LabPET/X-SPECT/X-OCT)成像系统(TriFoil Imaging,USA)进行PET扫描。扫描前，用加热灯保持所有小鼠温暖。引入2.0％异氟烷后，放置这些小鼠使得其等头部位于视野中心并以俯卧姿势固定，及然后经由尾部静脉注射新近合成的[¹¹C]PiB(36.7±2.6MBq；体积<0.25mL)。20min后，于具有350-650keV能量窗的3D列表模式中进行20min静态数据的获取。针对示踪剂衰变时间标准化及修正辐射数据。所有列表模式数据储存于3D正弦图中，然后将其等单片Fourier重排为2D正弦图。使用MLEM算法重新构造[¹¹C]PIB注射后的20至40min的求和影像。

使用PMOD 3.5软件套装(Pmod Technologies,Zürich,Switzerland)处理并分析所有成像数据。在标准化至注射剂量(ID)的[¹¹C]PIB及动物的身体质量前使用幻象衍生的校准因子将所述PET影像数据组转化为放射性浓度的绝对量度(kBq/cc)。静态PET影像是与基于PMOD作为解剖对照的小鼠T2加权的MR脑图册共登记。影像来源根据MRI图册设定为Bregma(0,0)且使用所述图册用于VOI定义。在皮质、海马区、杏仁核及嗅球内评估[¹¹C]PIB摄取。藉由平均[¹¹C]PIB活性除以注射剂量及体重(以公克计)获得各VOI的经标准化的摄取值(SUV)。此后，藉由作为参照区域的小脑中的[¹¹C]PIB摄取标准化目标区域内的区域性[¹¹C]PIB摄取。Manook等人，PLoS One(2012)7:e31310；Poisnel等人，Neurobiol Aging(2012)33:2561-71。

结果

设计并合成若干种具有不同N-及C端截断的突变的Aβ40胜肽(表3)。首先藉由圆偏光二色性(CD)光谱术、硫代黄素T(ThT)结合分析及穿透式电子显微镜术(TEM)检查其结构性质，及然后使用小鼠神经母细胞瘤Neuro2a(N2a)细胞中的细胞存活率分析进行其对Aβ40纤维的形成及Aβ40细胞毒性的影响的检查。

表3：本研究中所使用的经合成的胜肽。^DP表示D-脯胺酸

表3中的这些序列自上至下对应于SEQ ID NOs:20-25。

C端截断的胜肽V24P(1-28)

根据Aβ40类淀粉纤维的结构模型(Petkova等人，Proc Natl Acad Sci(2002)99:16742-7)，K28是位于第二β股的开端。K28以下无C端疏水性尾部，V24P(1-28)相较于Aβ40具有增加亲水性。将V24P(1-28)溶解于20mM含有150mM KCl的磷酸钠缓冲液(pH 7，(培养缓冲液)中及然后在25℃下培养。在不同的时间点(第0天是一经溶解后的时间)下，记录ThT结合后的其CD光谱及荧光光谱。30μM V24P(1-28)溶液的CD光谱是无规线圈结构的典型及在所有测试时间点(0至12天)下相同(图18，A区，左)；一致地，荧光的量测显示无ThT结合(图18，B区，左)。当所述胜肽浓度增加至60μM时，V24P(1-28)在第0至3天保持无规结构，但如藉由增强荧光(图18，B区，右)显示，逐渐形成结合ThT的β片状结构(图18，A区，右)。TEM显示60μMV24P(1-28)形成类淀粉纤维(图18，E区，左)。这些纤维可是直的及横向结合，与通常针对Aβ40类淀粉纤维报告的扭曲形态学形成对比。Chang等人，J Mol Biol(2009)385:1257-65；Meinhardt等人，J Mol Biol(2009)386:869-77；Goldsbury等人，J Struct Biol(2000)130:217-31。

N端截断的胜肽V24P(10-40)

Aβ40的N端区域是亲水性的及经报告不涉及类淀粉跨β结构。Petkova等人，ProcNatl Acad Sci USA(2002)99:16742-7。为证实此亲水性片段在胜肽抑制剂的设计中是否重要，化学合成前9个N端氨基酸残基截断的V24P突变体胜肽(表示为V24P(10-40))并将其溶解于培养缓冲液中。不同于形成无规线圈结构的30μM V24P(Chang等人，J Mol Biol(2009)385:1257-65)，30μM V24P(10-40)的CD光谱显示特征性β折版讯号，即218nm的负椭圆率(图18，C区，左)，并于ThT结合分析出现在487nm的荧光发射(图18，D区，左)结果相符。此等数据显示V24P(10-40)相较于V24P更易聚集。在60μM的浓度下，形成更多的β聚集体(图18，C及D区，右)。TEM显示V24P(10-40)形成的无定形聚集体(图18，E区，右)。

对较短胜肽的结构性研究

为针对自聚集判定最短序列，设计具有较短长度的额外三种胜肽(V24P(13-36)、V24P(16-33)及V24P(19-30))，及检查其等一经以30、60及90μM的浓度溶解后立即结合ThT后的CD光谱及荧光光谱。

所述CD光谱显示V24P(13-36)在30μM时形成无规线圈结构(图19，A区，顶部)及ThT荧光光谱显示在90μM时形成β聚集体(图19，B区，顶部)。V24P(13-36)缺乏若干个存在于V24P(10-40)中的疏水性残基(Y10、V12、V39、V40)，及因此相较于V24P(60μM)或V24P(10-40)(30μM)需要更高胜肽浓度(90μM)以形成β-聚集体。

相比之下，V24P(16-33)的CD光谱在204nm下显示强峰值及在228nm处显示波谷(图19，A区，中央区)，此指示I型β转变的图案(Kelly等人，Curr Protein Pept Sci(2000)1:349-84；Kelly等人，BBA-Protein Proteom(2005)1751:119-39)。90μM V24P(16-33)的弱荧光表明仅形成少量β-聚集体(图19，B区，中央)。

V24P(19-30)显示无规线圈结构。当所述胜肽浓度是60μM或更高时，所述CD光谱在220nm周围显示峰值(图19，A区，底部)，其类似于经延伸的3₁₀螺旋或聚(Pro)II螺旋的CD光谱(Kelly等人，BBA-Protein Proteom(2005)1751:119-3930)。在任何浓度下于487nm下未观察到荧光发射(图19，B区，底部)，此表明L17、V18、I31及I32负责使ThT结合至V24P(16-33)聚集体。

清除者胜肽的选择

Aβ40中的单取代(V24→^DP)显著影响Aβ40的结构性行为并降低其毒性。(Chang等人，J Mol Biol(2009)385:1257-65)。图20A区显示经测试的所有含^DP胜肽的细胞毒性远小于Aβ40。相较于V24P，V24P(10-40)形成较低胜肽浓度的β–聚集体，此表明其具有极高聚集倾向且可对Aβ40细胞毒性具有较大抑制作用。在细胞毒性分析中，当Aβ40胜肽与V24P(10-40)以等莫耳比率混合时，所述Aβ40胜肽具有最低细胞毒性(图20，B区)。因此，在下列动物研究中选择V24P(10-40)作为清除者胜肽。

V24P(10-40)对类淀粉形成的抑制作用是对Aβ40具有特异性

基于诸如「KLVFF」(SEQ ID NO:26)的短识别序列设计许多胜肽抑制剂，但很少检查此序列对不同的形成类淀粉的胜肽的特异性。因此，使用仓鼠普立昂蛋白胜肽PrP(108-144)以探测V24P(10-40)的结合特异性。当培养于20mM NaOAc缓冲液(pH 3.7)/140mM NaCl中时，PrP(108-144)形成类淀粉纤维。Chen等人，Proc Natl Acad Sci USA(2002)99:12633-8。如图21中所示，无论是否添加等莫耳V24P(10-40)，ThT结合分析中的荧光强度增加显示PrP(108-144)在培养期间形成类淀粉纤维，及V24P(10-40)无法抑制PrP(108-144)的类淀粉形成。此等结果指示V24P(10-40)的抑制作用具有目标特异性。

清除者胜肽V24P(10-40)减少APP/PS1转基因小鼠脑内的Aβ积聚

在胜肽抑制剂的设计中，通常使用酰胺氢的D-型氨基酸、封端及甲基化以抵抗血清中的外胜肽酶及内胜肽酶的消解以延长胜肽在活体内的寿命。Findeis等人，Biochem(1999)38:6791-800；Gordon等人，Biochem(2001)40:8237-45；Gordon等人，J Pept Res(2002)60:37-55。已使用对腐胺(天然生成的聚胺)的修饰以增强经设计的胜肽D-YiAβ11跨血脑障壁的能力。Poduslo等人，J Neurobiol(1999)39:371-82。亦发现经聚乙烯亚胺(PEI)阳离子化的蛋白可跨细胞膜。Futami等人，J.Biosci.Bioeng.(2005)99(2):95-103；Futami等人，Expert.Opin.Drug.Discov.(2007)2:261-269；Kitazoe等人，J.Biochem.(2005)137:693-701；Kitazoe等人，Biotechnol.J.(2010)5:385-392；Murata等人，J.Biochem.(2008)144:447-455；Murata等人，J.Biosci.Bioeng.(2008)105:34-38。

在本研究中，向所述清除者胜肽V24P(10-40)的C端添加PEI。向4个月大的APP/PS1转基因小鼠的两个鼻孔(每个鼻孔1nmol或4μg)中经鼻滴剂每周六次单独投与V24P(10-40)-PEI或PEI。然后于4个月后牺牲这些小鼠并藉由ELISA分析脑的Aβ含量。如图22中所示，经V24P(10-40)-PEI治疗的小鼠在皮质(A区)及海马区(B区)两者中已明确具有下降Aβ40及Aβ42浓度，所述作用对于Aβ40更大，很可能是因为清除者胜肽不含有残基41及42。

使用微型正电子发射断层摄影术(微型PET)及经放射性示踪剂¹¹C标记的结合至Aβ斑块的Pittsburg化合物B([¹¹C]PiB)于自4月至12月龄经V24P(10-40)-PEI或PEI治疗的APP/PS1小鼠中检查清除者胜肽对减少类淀粉斑块积聚的影响。拍摄于治疗结束时的这些微型PET影像(图23，A区)显示藉由所述胜肽治疗显著减少Aβ斑块斑沉积。在具有或不具有胜肽治疗的APP/PS1小鼠的皮质、海马区、杏仁核及嗅球中的[¹¹C]PiB浓度的定量显示胜肽治疗导致在全部四个脑区域中的类淀粉斑块的形成显著减少(图23，B区)。

讨论

具有V24→^DP置换的所有胜肽对N2a细胞的毒性小于Aβ40，此表明V24是Aβ40形成毒性物质的重要残基。此外，数据显示，无C端疏水性尾部，V24P(1-28)仍保留作为Aβ40胜肽形成类淀粉纤维的能力，而无N端亲水性尾部的胜肽增强V24P(10-40)形成类淀粉样β–聚集体的聚集倾向。较短胜肽V24P(13-36)、V24P(16-33)及V24P(19-30)具有较低聚集倾向且其等需要较高胜肽浓度以形成类淀粉样β–聚集体。

此等于本文描述的转基因小鼠模型中经测试的胜肽抑制剂的结果汇总并比较于表4。在本研究中，使用非侵入性鼻内投与及较少胜肽(每只小鼠每月～200μg V24P(10-40)-PEI)。四个月的治疗导致海马区的Aβ40及Aβ42含量分别减少72％及40％。就转基因小鼠模型中所使用的总胜肽而言，使用0.8mg V24P(10-40)-PEI，而先前研究使用2.5mg iAβ5p(侧脑室输注)、24mg iAβ5p(ip)、0.27mg D3(海马区输注)、28-56mg D3(经口)或3mg D-Trp-Aib。当经由非侵入性途径投与时，本发明的胜肽可以低得多的剂量显著降脑中的Aβ浓度及类淀粉积聚两者。因此本发明数据显示本文描述的双链胜肽对延迟发病及/或减少AD的进展的治疗作用。

胜肽治疗有免疫原性、低稳定性、低可溶性、差生物利用率及低BBB渗透性的问题。本研究证实鼻内投与是一种将胜肽药物递送入脑内的有效方法。由于此投与途径可每日投药，相较于诸如脑内输注或腹膜内注射的侵略性途径更有利于使用者。鼻内胜肽投与法也可用于递送其他功能的其他肽抑制剂进入脑内，例如，衍生自p35(cdk5活化剂)的24-aa胜肽TFP5，其已被报告可经由腹膜内注射减少小鼠中的cdk5超活化并抑制tau蛋白高度磷酸化。Shukla等人，FASEB J(2013)27:74-86。

表4：用于APP转基因小鼠中的不同胜肽的比较。

^a脑室内(icv)；腹膜内(ip)

^b藉由ELISA定量

^c藉由微型PET定量

^d藉由免疫组织化学定量

^e藉由硫代黄素S染色定量

⁴⁰Permanne等人，FASEB J.(2002)16(8):860-862。

⁴²van Groen等人，ChemMedChem(2008)3:1848-1852。

⁴³Funke等人，ACS Chem.Neurosci.(2010)1(9):639-648。

⁴⁴Frydman-Marom等人，Angew.Chem.Int.Ed(2009)48:1981-1986。

(此等文献的相关教义以引用的方式并入本文中)

微型PET影像显示嗅球中的类淀粉负荷显著减少。已有报告指出老化斑块及神经纤维缠结聚集于嗅球中且在AD的早期阶段损害嗅觉。Christen-Zaech等人，Can J NeurolSci(2003)30:20-5；Arnold等人，Ann Neurol(2010)67:462-9。在APP转基因小鼠中，于嗅球中可早于其他脑区域侦测到非纤维状Aβ沉积，且嗅觉功能障碍与Aβ负荷相关。Wesson等人，J Neurosci(2010)30:505-14。因此，嗅觉上皮细胞中的Aβ沉积可充当临床前阶段的阿兹海默症病患的生物标记。Attems等人，Acta Neuropathol(2014)127:459-75。由于本发明胜肽经鼻递送至脑内，因此其具有在阿兹海默症进展的早期阶段抑制嗅球中的Aβ沉积的优点。

其他实施例

揭示于本说明书中的所有特征可以任何组合方式进行组合。揭示于本说明书中的各特征可经用于相同、等效或类似目的的替代特征置换。因此，除非另有明确规定，否则所揭示的各特征仅是一般系列的等效或类似特征的实例。

熟习此项技术者自上述中可易于确定本发明的基本特征，且在不脱离其精神及范围的情况下，可对本发明作出各种改变及修改以使其适用于各种用途及条件。因此，其他实施例亦在申请专利范围中。

序列表

<110> 中央研究院

<120> 双链分子(BIPARTITE)及其于治疗异常蛋白聚集的用途

<130> A0988.70072WO00

<140> 尚未指定

<141> 目前

<150> US 62/029,030

<151> 2014-07-25

<160> 26

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 1

Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met

1 5 10

<210> 2

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 2

Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Asp Pro

1 5 10 15

Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val

20 25 30

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 3

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

1 5 10 15

Gly Leu Met

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (19)..(19)

<223> 甲硫氨酸 经聚乙烯亚胺结合

<400> 4

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

1 5 10 15

Gly Leu Met

<210> 5

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (15)..(15)

<223> Xaa 是脯氨酸的D形式

<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(31)

<223> 缬氨酸是经聚乙烯亚胺结合

<400> 5

Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Xaa Gly

1 5 10 15

Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val

20 25 30

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 6

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Asp Gln Gln Gln Gln Gln Gln

1 5 10 15

Gln Gln Gln Gln

20

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 7

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Asp Gln Gln Gln Gln Gln Gln

1 5 10 15

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

20 25

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 8

Arg Pro Arg Thr Arg Leu His Thr His Arg Asn Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 9

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 10

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 11

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Asp

1 5 10

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 12

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Asp Gln Gln Gln Gln Gln

1 5 10 15

<210> 13

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 13

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Asp Gln Gln Gln Gln Gln Gln

1 5 10 15

Gln Gln Gln Gln

20

<210> 14

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 14

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Asp Gln Gln Gln Gln Gln Gln

1 5 10 15

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

20 25

<210> 15

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 15

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Asp Gln Gln Gln Gln Gln Gln

1 5 10 15

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

20 25 30

<210> 16

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 16

Arg Gln Gln Arg Arg Gln Gln Asp Gln Arg Gln Trp Gln Arg Gln Arg

1 5 10 15

Gln Gln Arg

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> 精胺酸是经TAMRA标记的

<400> 17

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Asp

1 5 10

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> 精胺酸是经TAMRA标记的

<400> 18

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Asp Gln Gln Gln Gln Gln Gln

1 5 10 15

Gln Gln Gln Gln

20

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(1)

<223> 精胺酸是经TAMRA标记的

<400> 19

Arg Gln Gln Arg Arg Gln Gln Asp Gln Arg Gln Trp Gln Arg Gln Arg

1 5 10 15

Gln Gln Arg Arg

20

<210> 20

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 20

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val

35 40

<210> 21

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(24)

<223> Xaa 是脯氨酸的D形式

<400> 21

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Xaa Gly Ser Asn Lys

20 25

<210> 22

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (15)..(15)

<223> Xaa 是脯氨酸的D形式

<400> 22

Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Xaa Gly

1 5 10 15

Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val

20 25 30

<210> 23

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa 是脯氨酸的D形式

<400> 23

His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Xaa Gly Ser Asn Lys

1 5 10 15

Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val

20

<210> 24

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (9)..(9)

<223> Xaa 是脯氨酸的D形式

<400> 24

Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Xaa Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile

1 5 10 15

Ile Gly

<210> 25

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa 是脯氨酸的D形式

<400> 25

Phe Phe Ala Glu Asp Xaa Gly Ser Asn Lys Gly Ala

1 5 10

<210> 26

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 26

Lys Leu Val Phe Phe

1 5

Claims (23)

1.一种双链(bipartite)分子，其包括：

(i)一种胜肽，其结合与疾病相关的异常蛋白聚集体或所述异常蛋白聚集体的组分；及

(ii)至少一个带电部分；

其中所述胜肽及所述至少一个带电部分是共价结合。

2.如权利要求1的双链分子，其中所述异常蛋白聚集体与神经退化性疾病相关。

3.如权利要求1或2的双链分子，其中所述神经退化性疾病是阿兹海默氏症(AD)、杭丁顿氏(Huntington’s)舞蹈症(HD)、帕金森氏症(PD)、路易氏体(Lewy body)失智(DLB)、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性-TDP-43蛋白症、额颞叶变性-Tau蛋白症(Tauopathy)、具有泛素化包涵体的额颞叶变性(FTLD-U)、匹克氏(Pick’s)症、皮质基底变性、进行性核上性麻痹、FTDP-17或库贾氏(Creutzfeldt-Jacob)症(CJD)。

4.如权利要求1至3中任一项的双链分子，其中所述胜肽包括类淀粉β或TDP-43的片段，其干扰类淀粉β或TDP的蛋白聚集。

5.如权利要求4的双链分子，其中所述胜肽包括氨基酸序列GSNKGAIIGLM(SEQ ID NO:1)；或YEVHHQKLVFFAED^DPGSNKGAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO:2)。

6.如权利要求1至3中任一项的双链分子，其中所述胜肽是聚麸酰胺酸(PolyQ)片段。

7.如权利要求6的双链分子，其中所述PolyQ片段由约5至20个麸酰胺酸残基组成。

8.如权利要求1至7中任一项的双链分子，其中所述带电部分是聚精胺酸(PolyR)片段或聚乙烯亚胺(PEI)。

9.如权利要求1至7中任一项的双链分子，其中所述分子包括两个带电部分，其中一者是polyR片段及另一者是聚乙烯亚胺(PEI)。

10.如权利要求1的双链分子，其中所述分子选自由以下组成的群：

RRRRRRRRGSNKGAIIGLM(SEQ ID NO:3)；

RRRRRRRRGSNKGAIIGLM-PEI(SEQ ID NO:4)；

YEVHHQKLVFFAED^DPGSNKGAIIGLMVGGVV-PEI(SEQ ID NO:5)；

RRRRRRRRWDQQQQQQQQQQ(SEQ ID NO:6)；及

RRRRRRRRWDQQQQQQQQQQQQQQQ(SEQ ID NO:7)。

11.一种医药组合物，其包括如权利要求1至10中任一项的双链分子及医药上可接受的载剂。

12.一种用于治疗与异常蛋白聚集体相关的疾病的医药组合物，所述医药组合物包括如权利要求1至10中任一项的双链分子及医药上可接受的载剂。

13.如权利要求12的医药组合物，其中所述与异常蛋白聚集体相关的疾病是神经退化性疾病。

14.如权利要求13的医药组合物，其中所述神经退化性疾病选自由以下组成的群：阿兹海默氏症(AD)、杭丁顿氏舞蹈症(HD)、帕金森氏症(PD)、路易氏体失智(DLB)、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性-TDP-43蛋白症、额颞叶变性-Tau蛋白症、具有泛素化包涵体的额颞叶变性(FTLD-U)、匹克氏症、皮质基底变性、进行性核上性麻痹、FTDP-17及库贾氏症(CJD)。

15.一种如权利要求1至10中任一项的双链分子的用途，其用以制造用于治疗与异常蛋白聚集体相关的疾病的药物。

16.一种方法，其用于治疗与异常蛋白聚集体相关的疾病，所述方法包含向有需要的个体投与治疗有效量的如权利要求11的医药组合物。

17.如权利要求16的方法，其中所述个体为患有神经退化性疾病、处于患有神经退化性疾病的风险或被怀疑患有神经退化性疾病的人类病患。

18.如权利要求17的方法，其中所述神经退化性疾病选自由以下组成的群：阿兹海默氏症(AD)、杭丁顿氏舞蹈症(HD)、帕金森氏症(PD)、路易氏体失智(DLB)、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性-TDP-43蛋白症、额颞叶变性-Tau蛋白症、具有泛素化包涵体的额颞叶变性(FTLD-U)、匹克氏症权利要求、皮质基底变性、进行性核上性麻痹、FTDP-17及库贾氏症(CJD)。

19.如权利要求18的方法，其中所述神经退化性疾病是阿兹海默氏症(AD)，且所述双链分子包括一种胜肽，所述胜肽包括氨基酸序列GSNKGAIIGLM(SEQ ID NO:1)或YEVHHQKLVFFAED^DPGSNKGAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO:2)。

20.如权利要求16的方法，其中所述双链分子是：

RRRRRRRRGSNKGAIIGLM(SEQ ID NO:3)；

RRRRRRRRGSNKGAIIGLM-PEI(SEQ ID NO:4)；或

YEVHHQKLVFFAED^DPGSNKGAIIGLMVGGVV-PEI(SEQ ID NO:5)。

21.如权利要求16的方法，其中所述神经退化性疾病是杭丁顿氏舞蹈症，且所述双链分子包括一种胜肽，所述胜肽包括PolyQ片段。

22.如权利要求20的方法，其中所述双链分子是：

RRRRRRRRWDQQQQQQQQQQ(SEQ ID NO:6)；或

RRRRRRRRWDQQQQQQQQQQQQQQQ(SEQ ID NO:7)。

23.如权利要求16至22中任一项的方法，其中所述药物是通过鼻内途径投与。