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CN107385040A - 用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应 - Google Patents

用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应 Download PDF

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CN107385040A
CN107385040A CN201710627329.4A CN201710627329A CN107385040A CN 107385040 A CN107385040 A CN 107385040A CN 201710627329 A CN201710627329 A CN 201710627329A CN 107385040 A CN107385040 A CN 107385040A
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Abstract

本发明公开了一种扩增和检测多核苷酸的方法，该方法可以在相对短的时间内提供对来自临床样本的多种靶标的灵敏的、特异性的检测。

Description

用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应
本申请是国际申请号PCT/US2009/039552，国际申请日2009年4月3日，中国申请号200980118968.1，发明名称为“用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应”的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年4月3日申请的美国临时专利申请号61/042,259的优先权权益。
发明领域
本发明总体上涉及用于扩增核酸的方法。更具体地，本发明涉及用于使用聚合酶链式反应来扩增多种核酸序列的方法。
发明背景
聚合酶链式反应(PCR)的开发使得能够使用DNA扩增用于多种应用，包括分子诊断测试。然而存在许多与PCR用于分子鉴别诊断(MDD)测定的应用相关的挑战。PCR利用特异性的引物或引物组、温度条件和酶。PCR反应可能容易被污染，引物结合对于不同的引物可能需要不同的条件，引物应该对于靶序列特异以便仅扩增该靶序列，等等。这使得其更难以从单个样品中扩增多种序列。
过去，诊断测试临床样品以发现一种或多种疾病病原体需要分离和培养微生物。然而，这可能需要几天，并且在许多情况下，如果要挽救患者的生命，诊断必须在几小时内作出。分析单个临床样品以鉴定多种生物体从而确定哪一种或哪几种可能是疾病的(多种)病原体是期望用于MMD的方法，并且已经开发了许多方法来较好地实现该目标。例如，已经开发了多重PCR法以扩增样品内的多种核酸以便产生足够的DNA/RNA从而能够检测和鉴定多种生物体。然而，多重PCR具有一些缺点。例如，多重PCR反应中的每种靶标需要其自己的最佳反应条件，因此增加靶标的数目需要每种单个靶标的反应条件不是最佳条件。此外，体系中的多组高浓度引物经常产生引物二聚体或获得非特异性的本底扩增。这种特异性的缺乏也需要PCR后提纯和多次杂交后洗涤的额外步骤。密集的引物由于需要利用酶和消耗底物而降低扩增效率。扩增效率的差异可能导致扩增子产量的显著差异。例如，一些基因座可能非常有效地扩增，而另一些则扩增的效率很低或根本不能扩增。这种不均一扩增的可能性也使得难以至不可能准确地进行终点定量分析。
一种方法利用以非常低的浓度使用的嵌套式基因特异性引物以在初始PCR循环期间富集靶标。之后，使用共用引物来扩增所有靶标。整个反应在一个试管中进行，不需要额外轮次的PCR，并且不需要专门的仪器，但代替地，可以使用常规的热循环仪来进行。然而，此方法有缺点。例如，因为使用低浓度的引物在初始循环期间富集靶标，因此测定的灵敏度最终降低，初始的富集循环的每次循环需要较长的退火时间，并且在经过扩增靶标所需的循环次数后酶很有可能变得不太有效。
对于更灵敏的、更快速的和更有效的用于扩增来自多种靶标的DNA和/或RNA以促进那些靶标的快速鉴定的方法仍然存在着需求。
发明概述
本发明涉及用于扩增核酸从而能够检测那些核酸的方法，该方法包括以下步骤：在第一次扩增反应中使用高浓度、靶标特异性引物扩增一种或多种靶核酸，从而产生至少一种含有至少一个共用引物结合位点的核酸扩增子；拯救所述至少一种核酸扩增子；以及在第二次扩增反应中使用与所述至少一个共用引物结合位点结合的共用引物扩增所述至少一种核酸扩增子。本发明的一个方面利用嵌套式靶标特异性引物。靶核酸可以包括DNA和/或RNA，并且可以包括病毒、细菌和/或真菌来源的DNA和/或RNA，以及人或其他动物来源的基因组DNA和/或RNA。扩增可以通过聚合酶链式反应(PCR)和/或RT-PCR进行。靶核酸的来源可以是来自一份或多份临床、环境、或食品样品，并且该方法可以以广泛多样的方式使用，包括，例如，临床诊断、环境采样、植物检测、食品安全性分析、检测遗传病症、和/或检测疾病状况。该方法可以用于人和/或兽的医学诊断。
附图简要说明
图1是本发明的方法的图示，其中Fo代表正向-外侧引物；Fi代表带有正向共用引物标签(结合序列)的正向-内侧引物；Cf代表正向共用引物；Ri代表带有反向共用引物标签(结合序列)的反向-内侧引物；Ro代表反向-外侧引物；Cr代表反向共用引物；Fa代表附加正向引物；和Ra代表附加反向引物，这些引物通常如所指示的那样定位。
详述
本发明人已经开发了一种用于扩增核酸的新方法，该方法可以用来检测来自病毒、细菌、真菌、植物和/或动物细胞的核酸的存在，和存在的相对量，从而用于医学、环境、食品、和其他样品的评价以鉴定那些样品内的微生物和其他因子(agent)。该方法在本文中称为扩增子拯救多重聚合酶链式反应(″arm-PCR″)。在此方法中，靶核酸的PCR扩增相继地在两个不同的反应体系中进行。这些体系可以包括独立的柱、反应容器或芯片的部分，例如，含有一种或多种靶核酸、引物、酶、核苷酸(例如，dNTP)和缓冲液，它们是扩增所述一种或多种靶核酸以产生扩增子所必需的。通过在第一次扩增反应中使用高浓度的引物并且拯救在该反应期间形成的扩增子以用于在不同的反应体系中的第二次扩增反应中，本发明人已经开发了一种增加灵敏度和特异性，减少产生可检测结果所必需的时间，并且容易使其适于自动化操作的方法。
要理解的是，如本文所使用的术语“包括”可以用术语“基本上由......组成”和“由......组成”代替。当使用术语“反应体系”时，其意在描述向其中置入了必需的引物、酶、核苷酸、缓冲液和/或其他试剂以便进行至少一种聚合酶链式反应的一个或多个循环的Eppendorf管、反应室或其他容纳装置。因此不同的“反应体系”可以指相同的反应容纳容器，但不同的用于进行所需的扩增步骤的试剂组分(尤其是引物)。“反应容纳容器”意在指具有充足的内部容积以容纳提供反应体系所必需的引物、酶、核苷酸、缓冲液和/或其他试剂的试管、板孔或其他容器。术语“拯救”意在指将扩增子与第一次扩增的至少一部分引物分离。“PCR”意在指聚合酶链式反应，并且可以包括PCR和/或RT-PCR步骤。
在该方法的第一个步骤中，使用高浓度的靶标特异性的嵌套引物来进行靶标特异性的第一次扩增步骤。引物选自病毒、细菌、真菌和/或期望使用核酸检测进行鉴定的其他靶标的已知序列，并且对于那些靶核酸和/或密切相关的靶核酸是特异的。靶标特异性引物可以用来扩增，例如，细菌、病毒、真菌和/或其他来源的一种或多种(和优选多种)靶核酸。嵌套引物浓度通常可以为5-50pmol。如图1中所示，选择的引物用附加的核苷酸进行“标记”以提供对一种或多种靶核酸不特异的附加序列，使得用此引物对靶核酸的扩增也会在所生成的扩增子中加入共用引物的结合位点，该共用引物与靶标特异性引物不同，其可以用来进一步扩增不相关的靶核酸扩增子(见图1中的A和B)。扩增进行大致10-15个循环，反应终止，并且从反应混合物中拯救生成的扩增子用于第二个不依赖靶标的扩增步骤中，包括由共用引物引发的聚合酶链式反应，该反应将以相对无差别的方式提供不相关核苷酸序列的扩增，所述不相关核苷酸序列由从靶标特异性反应中拯救的多种扩增子代表。
然后进行扩增子拯救以尽量减少或清除第一次反应的引物，同时提供用于使用共用引物的第二次扩增中的扩增子。扩增子拯救可以以多种方式进行。例如，可以取来自完成的第一次扩增反应的小样品以提供用于第二次扩增的扩增子。当取得小样品时，其提供足够数目的用于第二次扩增的扩增子，同时显著地减少(例如，稀释)剩余数目的第一次扩增的引物。扩增子拯救也可以通过如下步骤来进行：去除第一次扩增的反应体系的大部分内容物并且向剩余的内容物中加入一种或多种共用引物和必需的一种或多种酶、核苷酸、一种或多种缓冲液和/或其他试剂以进行第二次扩增，所述第二次扩增利用所述一种或多种共用引物在第二反应体系中扩增拯救的扩增子。分离技术也可以用来拯救扩增子。这些技术可以依靠引物和扩增子之间的尺寸差异，依靠已经连接在扩增子、引物或两者上的标签，或本领域技术人员已知的其他方法。一旦被分离，所有拯救的扩增子或一部分拯救的扩增子可以用于第二次扩增中。
第二次扩增在不同的反应体系中进行，其可以利用或可以不利用相同的反应容纳容器。第二次扩增使用新鲜的缓冲液、核苷酸和一种或多种共用引物扩增拯救的扩增子。选择共用引物以提供对拯救的扩增子的有效扩增从而在第二次扩增结束时提供大量拷贝数的那些扩增子。
通过将反应分成第一次靶标特异性的引物驱动的扩增和第二次不依赖靶标的共用引物驱动的扩增，本发明人已经开发了一种方法，该方法通过使用靶标特异性引物仅扩增存在于特定靶标中的核酸种类和数目来提供特异性，和通过使用嵌套引物、高浓度靶标特异性引物实现灵敏度，并且使用一种或多种共用引物以提供较高拷贝数的非特异性(不依赖靶标的)扩增。此外，在第一次扩增中使用高浓度引物，紧接着进行扩增子拯救，尤其是当通过分离一部分第一次扩增产物进行扩增拯救时，所述分离通过去除该部分并将其置于新的反应体系中或通过去除大部分的第一次扩增产物并向其加入必需的试剂以形成用于第二次不依赖靶标的扩增的第二反应体系而进行，这使其适于自动化操作。不仅这些步骤可以在相对密闭的反应体系(该体系限制了污染的可能性)内进行，而且由该方法提供的第一次扩增、扩增子拯救和第二次扩增的组合产生了在少于2小时的时间内的特异性的、灵敏的用于来自多个样品的多种靶标的检测方法。
靶核酸可以通过本领域技术人员已知的多种方式分离自其各自来源。由该方法产生的扩增子的检测也可以通过本领域技术人员公知的多种方式来进行，诸如将来自第二扩增步骤的扩增子应用至用于杂交和检测的印刷阵列。共用引物序列可以包括将有效地提供扩增反应的有效启动的任何序列。这些序列和用于设计它们的方法对于本领域技术人员是已知的。本发明人已经发现选自SEQ ID NO：1(5′-TTCTTAGCGTATTGGAGTCC-3′)、SEQ ID NO：2(5′-AATGTACAGTATTGCGTTTTG-3′)或二者组合的引物在第二次扩增反应中提供非常好的结果。
本发明还提供了用于PCR扩增靶核苷酸的引物试剂盒，所述试剂盒包括选自下列各项组成的组的引物：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ IDNO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ IDNO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ IDNO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ IDNO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ IDNO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92和它们的组合。
用于该方法的自动化操作的方法的一个实例可以这样提供，其中使用在密闭系统中的“芯片实验室(lab-on-chip)”装置来进行扩增、分离和检测。例如，第一次靶标特异性的扩增可以在第一反应体系(PCR1)中进行，其中嵌套的、未标记的高浓度靶标特异性引物可以与dNTP、缓冲液和酶一起预先加入，以进行所需的PCR或RT-PCR扩增。在允许第一次扩增进行所需的循环次数后，未使用的引物可以利用毛细管电泳而与核苷酸扩增子分离，其借助于PCR1(负极)和废液室(正极)之间的活化电极使引物与扩增子分离。在引物移动至废液室时，废液室中的电极可以关闭并且第二反应体系(PCR2)带正电。因此较大分子量的扩增子可以移动至PCR2室，在此它们与预先加入的共用引物和新鲜的酶、dNTP和缓冲液混合。在PCR2中进行第二次扩增后，PCR产物(扩增子)可以经电泳移动至检测室，与共价固定在珠子上的探针杂交，所述珠子在阵列中的位置代表特定的分子靶标。因此靶标检测可以通过成像分析来进行，例如，其中阳性结果可以由发光的珠子来指示，因为扩增子产物可以用荧光染料或其他化学/生物化学标记物来标记。然后未使用的PCR产物和引物可以被去除和沉积在废液室中。
在一些实施方案中，PCR芯片可以包括与废液槽和第二反应体系两者流体连接的第一反应体系，所述废液槽和第二反应体系各另外地包括至少一个电极，所述电极包括用于分离由所述第一反应体系产生的扩增子的装置。所述第二反应体系可以与杂交和检测室流体连接，所述杂交和检测室包括微球体，或珠子，所述珠子被配置成使得珠子的物理位置是借助于芯片分析的样品中特定靶多核苷酸的存在的指示。
芯片可以预先加入试剂，或试剂可以由用户加入。在一个实施方案中，预先加入的试剂可以包括用于第一反应体系的嵌套的、高浓度的靶标特异性引物、dNTP、聚合酶和一种或多种缓冲液。第二反应体系可以与共用引物、dNTP、缓冲液和聚合酶一起预先加入。使用该芯片，例如，患者样品可以通过将该样品通过覆盖芯片的全部或一部分的软橡胶样聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料注射而加入至至少一个第一反应体系中。在第一反应体系中，对于第一次扩增可以进行第一系列的PCR循环以扩增靶序列并且将共用引物结合序列引入至所生成的扩增子的至少一部分中。然后来自第一反应体系的扩增子产物可以通过在微流体通道中进行的芯片上电泳来分离，所述第一反应体系与至少一个第二反应体系和至少一个废液槽流体连接，每个第二反应体系和废液槽另外包括至少一个电极，所述电极促进来自第一扩增反应的扩增子和未使用的引物分别移动至第二反应体系和废液槽。移动至第二PCR反应体系的扩增子然后可以使用共用引物进行第二次扩增以扩增在第一反应体系中的第一次扩增期间已经向其中引入了至少一个共用引物结合位点的扩增子。在第二反应体系中完成所需的扩增循环后，PCR产物(扩增子)可以通过微流体电泳从第二反应体系移动至至少一个杂交和检测室，第二反应体系与至少一个杂交和检测室流体连接。在所述杂交和检测室内，可以存在微球体或珠子，其形成阵列，所述珠子的物理位置指示用于检测的特定靶标。珠子阵列可以包含约1-约200个靶标，每个靶标由约1-约100个珠子代表。如果特定的靶标不由第一次扩增反应中适当的引物代表，则可以使用软件掩膜(mask)来覆盖相关的珠子使得它们将不会干扰分析。杂交和检测室可以与至少一个洗涤室和至少一个检测室流体连接，所述洗涤室包含辅助去除未使用的标记的引物和探针以减少本底的试剂，且所述检测室包含用于标记扩增的DNA以进行成像分析的试剂诸如链霉亲和素-量子点(streptavidine-Quantum dots)，或链霉亲和素-PE。
本发明的方法还可以使用标准的或改良的PCR热循环仪来进行。例如，核苷酸、缓冲液和引物可以加入至用于第一次扩增的第一台热循环仪的标准PCR试管中。所述管的内容物可以通过手工或自动装置去除从而拯救扩增子，并且刚分离的扩增子可以放置在第二个扩增管中，其中引入了缓冲液、核苷酸和一种或多种酶，从而在第一台或第二台热循环仪中进行第二次扩增，所述热循环仪被编程从而通过适当的温度使反应循环所需的时间长度。应该理解循环时间和循环次数可以发生变化，并且可以由本领域技术人员来确定。
嵌套引物的使用似乎改善聚合酶的结合亲和力，在第一次扩增反应期间产生显著较多的扩增子。这些扩增子可以使用高浓度靶标特异性引物，由样品内多种靶多核苷酸产生。通过在第一次扩增期间将用于至少一个共用引物的至少一个结合位点引入至所述扩增子的至少一部分中，则有可能在第二次扩增期间甚至更显著地增加由该扩增过程所产生的扩增子的数目。针对其在第二次扩增期间的结合亲和力和引发扩增的能力来选择共用引物。通过使用此三步法(第一扩增步骤，扩增子拯救，第二扩增步骤)，因此可能增加用于从含有多种生物体的样品中鉴定一种或多种靶生物体的PCR方法的特异性和灵敏度。本发明人已经发现此方法与先前所述的PCR方法相比，的确显著地增加特异性和灵敏度两者。
使扩增-分离-扩增过程自动化能够在1-3小时的时间内鉴定大量的靶标，并且已经显示有效地在1.5小时的时间内扩增来自多种微生物的靶核酸，使得能够快速地鉴定疾病的可能病原体，从而能够立即针对用于限制与传染性病原体、生物恐怖剂(bioterroragent)等接触的处理、分离、公众卫生计划的实施采取措施。
为进行PCR反应，样品可以通过本领域技术人员已知的多种方式进行制备。例如，这些方法可以作为由包含缓冲液和酶的PCR试剂盒提供的使用说明来提供，或使用说明可以获自各种期刊或专利出版物。在用于PCR扩增步骤的制备前处理样品的方法对于本领域技术人员来说也是已知的，并且可以根据样品的来源而发生变化。
用于扩增的酶是商购的，并且可以包括，例如，Qiagen Multiplex mix或QiagenHot Start mix。缓冲液也是商购的，核苷酸(dNTPs)和其他试剂也如此。热循环仪由多个公司制造并分销，这些公司包括，例如，Applied Biosystems(应用生物系统)和Bio-Rad。PCR试剂盒也可以获自多种来源，包括，例如，Qiagen(盖瑟斯堡(Gaithersburg)，马里兰)。
本发明提供了一种方法，该方法适合于例如，从可能含有多种微生物的样品中鉴定一种微生物或多种微生物。这样的样品可以获自临床标本(例如，血液、唾液、组织)，获自环境样品(例如，水、土壤)，获自食物样品，或其他来源。可以被鉴定的微生物可以包括细菌、病毒的多种属和种，以及其他含有DNA和/或RNA的生物体。
为了鉴定微生物，可以利用诸如Luminex 技术的方法，并且检测步骤可以与扩增一起合并至自动化系统中，使得该自动化系统实现第一次扩增、扩增子拯救、第二次扩增和检测。在Luminex 系统中，例如，混悬液中的微球体提供探针结合的固体支持，其也称为“液体芯片”或“悬浮阵列(suspension array)”。采用技术，分子反应发生在颜色编码的微球体的表面上。对于每种病原体，靶标特异性俘获探针可以共价地连接至特定组的颜色编码的微球体。标记的PCR产物在杂交混悬液中被结合珠子的俘获探针俘获。微流体系统将悬浮杂交反应混合物递送至双激光器检测装置。红色激光器通过其颜色编码鉴定每个珠子，而绿色激光器检测与每个珠子相关的杂交信号。使用软件来采集数据并且以秒的方式报告结果。所述数据以平均荧光强度(MPS)的形式报告。
本文所述的方法能够使本领域技术人员将高特异性、高灵敏度扩增和检测结合在一个自动化系统中。使用这样的系统，可能在较短的时间周期内以比以前采用现有系统可能达到的灵敏度更高的灵敏度分析一个或多个临床样品。
本发明可以通过下列非限制性的实施例进一步描述：
实施例1
设计arm-PCR反应以扩增和检测造成食源性疾病的病原体。对于每种病原体使用的靶基因列举在下面的表1中。
表1
对于每种靶标生成的引物列举在表2中。SupF和SupR表示共用引物序列。形成用于靶标特异性引物的标签的共用引物序列以粗体字母显示。Fo，Fi，Ri和Ro表示用于每种扩增靶标的嵌套引物，而D低聚物表示与扩增子内特定序列杂交的检测探针。探针与用于使用Luminex 仪器检测的颜色编码的珠子共价连接。
表2
引物混合物含有表2中Fo，Fi，Ri和Ro引物各10pmol。对于此扩增，仅包含一种靶标模板，空肠弯曲杆菌。该模板稀释为10pg/μl，1pg/μl，0.1pg/μl，0.01pg/μl和0.001pg/μl。使用Qiagen Multiplex PCR试剂盒来制备样品，所述样品含有44μl Multiplex Mix，5μl引物混合物和1μl模板。循环条件如下：
95℃，15分钟
94℃，15秒
55℃，15秒
72℃，15秒
重复这三个循环，2-20次(对于此实施例总计重复15次)
94℃，15秒
70℃，15秒
重复这两个循环，对于此实施例总计重复6次。
72℃，3分钟
保持在4℃
在如上所述完成第一次扩增时，将样品加入至分子量截留值(cut-off)为50kd的Millipore柱，并且以13k RPM旋转11分钟以去除主要部分的引物(分子量通常低于30kd)，在滤器的顶部拯救分子量通常高于70kd的扩增子。翻转该柱并且在新的收集管中旋转大约30秒以回收用于下一轮扩增的扩增子。
将来自该收集管的10μl样品加入至15μl Multiplex Mix，1μl共用引物(正向共用引物为10pmol，反向共用引物40pmo1)和14μl H2O中。然后将样品置于热循环仪(AppliedBiosystems(应用生物系统)，福斯特城(Foster City)，加利福尼亚)中，并且通过下列的循环运行：
95℃，15分钟(热激活酶)
94℃，15秒
55℃，15秒x30循环
72℃，15秒
72℃，3分钟
保持在4℃
使用加入至35μl珠子(微球体)混合物中的5μl PCR产物进行杂交，并在52℃下杂交10分钟。10分钟后，将10μl SA-PE(2x SA-PE，GenacoBiomedical Sciences，Inc.，用1XTMAC以1∶2稀释)加入至每个样品中，并在52℃下杂交5分钟。5分钟后，将120μl 52℃终止缓冲液加入至每个样品中，并且使用Luminex200机器分析样品。
arm-PCR和tem-PCR反应的平均荧光强度(MFI)数值显示在表3中。
表3
这些结果表明尽管当使用低浓度嵌套引物时在高模板浓度下信号较强，但高浓度嵌套引物法的灵敏度高约两个对数级。如果例如，阳性信号截留值为250MFI，则该方法可以检测到小至0.001pg//μl，而本领域以前描述的方法对于低浓度嵌套引物的结果在0.1pg/μl和0.01pg/μl之间为阴性。整个过程所需的时间在使用低浓度嵌套引物时为约210分钟，且在使用高浓度嵌套引物时为约150分钟。
序列表
<110> 哈森阿尔法生物技术研究院
韩建
<120> 用于扩增核酸的方法
<130> HAI-001
<160> 92
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(20)
<400> 1
ttcttagcgt attggagtcc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(21)
<400> 2
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<210> 3
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<400> 4
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<210> 5
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<212> DNA
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<220>
<221> 引物_结合
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<400> 5
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<220>
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<400> 6
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<211> 18
<212> DNA
<213> 空肠弯曲杆菌
<220>
<221> 引物_结合
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<211> 20
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<213> 结肠弯曲杆菌
<220>
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<400> 10
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<220>
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<400> 12
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(20)
<400> 18
cgattacgcg aaagataccg 20
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<212> DNA
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<220>
<221> 引物_结合
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<400> 19
ttcttagcgt attggagtcc ccaggcttcg tcacagttgc 40
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 引物_结合
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<400> 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 引物_结合
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ttttcggaat catagaacgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
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<213> 鼠伤寒沙门氏菌
<220>
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ttcttagcgt attggagtcc ctggtactaa tggtgatgat c 41
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<220>
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<220>
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<213> 弗氏志贺氏菌
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 弗氏志贺氏菌
<220>
<221> 引物_结合
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
<221> 引物_结合
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<220>
<221> 引物_结合
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<212> DNA
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<220>
<221> 引物_结合
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<212> DNA
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<220>
<221> 引物_结合
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<220>
<221> 引物_结合
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<400> 51
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<212> DNA
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<220>
<221> 引物_结合
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<220>
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<220>
<221> 引物_结合
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<220>
<221> 引物_结合
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 引物_结合
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ccaaaattaa cacgatacca 20
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<211> 17
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 引物_结合
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
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<220>
<221> 引物_结合
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<400> 59
ttcttagcgt attggagtcc gtgtctgtta ttaaccacac 40
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<212> DNA
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<220>
<221> 引物_结合
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<220>
<221> 引物_结合
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<213> 大肠杆菌
<220>
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 引物_结合
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<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 霍乱弧菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(18)
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<213> 大肠杆菌
<220>
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ctttttcacc tttcgctcag 20
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<213> 大肠杆菌
<220>
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<400> 79
ttcttagcgt attggagtcc gatgctaaac cagcagggtc 40
<210> 80
<211> 41
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(41)
<400> 80
aatgtacagt attgcgtttt gcaattcaca gcagtaattg c 41
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(20)
<400> 81
ccggtacaag caggattaca 20
<210> 82
<211> 18
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(18)
<400> 82
agtagtcctg aaagcatg 18
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(20)
<400> 83
gattcgtttg acggacgcag 20
<210> 84
<211> 40
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(40)
<400> 84
ttcttagcgt attggagtcc catgttgatg acactgccag 40
<210> 85
<211> 41
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(41)
<400> 85
aatgtacagt attgcgtttt gcgatctctt cttgtgttga g 41
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(20)
<400> 86
caagcacttt cgcacgaatt 20
<210> 87
<211> 18
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(18)
<400> 87
aaagcgcctc agtttaag 18
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(20)
<400> 88
aagagcacgg tttcgtgaac 20
<210> 89
<211> 40
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(40)
<400> 89
ttcttagcgt attggagtcc gacatcaacc gctcatcgtc 40
<210> 90
<211> 41
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(41)
<400> 90
aatgtacagt attgcgtttt gcagaacaca aacttctcag c 41
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(20)
<400> 91
cggtgagttg ctgttgttgg 20
<210> 92
<211> 18
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1)..(18)
<400> 92
atgtacaccc acgcattg 18

Claims (8)

1.一种多重PCR方法，包括
在第一次扩增反应中使用靶标特异性嵌套引物对扩增多种靶核酸，所述嵌套引物对包括针对每个靶核酸的正向-内侧引物，正向-外侧引物，反向-内侧引物，反向-外侧引物，其中嵌套引物的浓度是100-1000nM，并且其中所述正向-内侧引物和反向-内侧引物包括附加的核苷酸以提供对所述多种靶核酸不特异的附加序列，使得用此引物对靶核酸的扩增也会在所生成的扩增子中加入共用引物的结合位点，该共用引物与靶标特异性引物不同，其可以用来进一步扩增不相关的靶核酸扩增子，从而产生含有共用引物结合位点的核酸扩增子；
拯救所述核酸扩增子；以及
在第二次扩增反应中使用与所述共用引物结合位点结合的共用引物扩增所述核酸扩增子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸选自由病毒、细菌和真菌核酸组成的组。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸获自人临床样品。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸获自来自动物的临床样品。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述共用引物选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和其组合组成的组。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述拯救所述核酸扩增子的步骤还包括从在第一反应体系中完成的扩增中取小样品以提供用于在第二反应体系中第二次扩增的扩增子。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述靶标特异性嵌套引物选自由下列各项组成的组：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91和它们的组合。
8.一种用于进行权利要求1-7中任一项所述方法的引物试剂盒，其中所述引物试剂盒包括SEQ ID Nos：1-2，SEQ ID NOs：3-6，8-11，13-16，18-21，23-26，28-31，33-36，38-41，43-46，48-51，53-56，58-61，63-66，68-71，73-76，78-81，83-86和88-91所示的引物和SEQID NOs：7，12，17，22，27，32，37，42，47，52，57，62，67，72，77，82，87和92所示的探针。
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