CN107384965A

CN107384965A - 抑制烟粉虱携带传播双生病毒的药物、应用及控制双生病毒传播的方法

Info

Publication number: CN107384965A
Application number: CN201710571987.6A
Authority: CN
Inventors: 夏文强; 王晓伟
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-07-13
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2037-07-13
Also published as: CN107384965B

Abstract

本发明公开了一种抑制烟粉虱携带传播双生病毒的药物、应用及控制双生病毒传播的方法。所述药物包括早期内体运输抑制剂、细胞骨架抑制剂中的一种或组合。本发明经研究发现烟粉虱早期内体运输蛋白、细胞骨架蛋白及他们的编码基因可以作为抑制烟粉虱携带传播双生病毒的靶点，通过抑制剂BrefA或者将早期内体运输蛋白、细胞骨架蛋白的基因进行RNA干扰沉默表达后，能够有效抑制烟粉虱对双生病毒的携带和传播能力，从而可以有效控制双生病毒的田间传播。

Description

抑制烟粉虱携带传播双生病毒的药物、应用及控制双生病毒传播的方法

技术领域

本发明涉及双生病毒防治技术领域，特别是涉及抑制烟粉虱携带传播双生病毒的药物、应用及控制双生病毒传播的方法。

背景技术

双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链环状DNA病毒，侵染植物后可以导致作物减产，在全球范围内对农业生产造成严重的危害。这类病毒的传播主要依赖于媒介昆虫的取食，传统上种植者通常通过施用杀虫剂等手段控制媒介昆虫，保护植物不受病毒的侵害。然而由于昆虫的抗药性等原因，上述常规方法难以控制双生病毒的传播，因此开发新的替代策略逐渐成为研究的热点。

双生病毒科(Geminiviridae)主要包括曲顶病毒属(Curtovirus)、画眉草病毒属(Eragrovirus)、芜菁曲顶病毒属(Turncurtovirus)、甜菜曲顶病毒属(Becurtovirus)、玉米线条病毒属(Mastrevirus)、菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)等七个属。其中菜豆金黄花叶病毒属为最大的一个属，也是最具经济危害的一个属。菜豆金黄花叶病毒属的病毒仅能被烟粉虱[Bemisia tabaci(Gennadius)]传播，故又名粉虱传双生病毒。通常在烟粉虱大爆发后，其传播的双生病毒病也随之大发生。目前除化学防治外，对烟粉虱的防治手段还包括农业防治、物理防治和生物防治，但是上述方法均难以控制烟粉虱传播的双生病毒。

烟粉虱以持久性循环型的方式传播双生病毒。传播过程中，双生病毒需要经过烟粉虱的中肠、血淋巴以及唾液腺，最终随烟粉虱唾液一起被分泌至新的寄主植物。烟粉虱的中肠以及唾液腺是病毒粒子在烟粉虱体内的运输主要屏障，之前有研究证明双生病毒能够被烟粉虱传播与它能够穿过烟粉虱的中肠以及唾液腺屏障密切相关。

中肠以及唾液腺的上皮细胞可以限制体液与外界环境间的物质交换，维持生物内环境的稳定。双生病毒必须穿过烟粉虱中肠以及唾液腺的上皮细胞才能在植物间传播，如果能阻止病毒穿过上皮细胞很可能可以防止双生病毒在田间的传播。之前对其它循环型病毒的研究表明，病毒通过细胞内吞以及细胞外排的方式穿过上皮细胞。以昆虫肠道的上皮细胞为例，上皮细胞将肠腔与体内的血淋巴分开，上皮细胞的尖端面与肠腔内的食物接触，基底面与血淋巴接触。病毒粒子进入肠腔后，首先在上皮细胞的尖端面通过细胞内吞进入上皮细胞；随后病毒由尖端面被运往基底面；最后病毒粒子在基底面通过细胞外排被释放至血淋巴中。病毒在上皮细胞内的运输对于病毒的传播至关重要，然而双生病毒在细胞内的具体运输机制尚不清楚。细胞内的早期内体、晚期内体、循环内体、高尔基体等广泛参与细胞内物质的分拣、运输、循环、降解等，双生病毒可能利用这些细胞器帮助自身跨细胞运输。

目前已知烟粉虱在双生病毒的传播过程中起重要作用，因此田间主要通过化学农药以及物理阻碍的方法杀死或限制烟粉虱，从而切断双生病毒的传播途径。然而由于入侵烟粉虱MEAM1和MED具有较强的抗药性，较高的繁殖力，这些方法难以有效地控制双生病毒在田间的传播。本发明通过干扰双生病毒在烟粉虱细胞内的运输过程，降低烟粉虱传播双生病毒的效率，从而控制双生病毒在田间的发生。

发明内容

本发明针对现有技术中通过杀灭烟粉虱来控制双生病毒在田间传播的方法不是非常有效的问题，提供了一种新的抑制烟粉虱携带传播双生病毒的药物及控制双生病毒传播的方法。

本发明经研究发现，通过使用内体运输相关抑制剂Brefeldin A(BrefA)可以抑制双生病毒在烟粉虱体内的运输，从而达到抑制双生病毒田间传播的作用。同时，通过设计相关干扰序列对早期内体运输相关蛋白的基因以及细胞骨架相关蛋白的基因进行RNA干扰后，发现也能够达到降低烟粉虱传播双生病毒能力的目的。而对晚期内体、循环内体和高尔基体相关蛋白的基因进行RNA干扰后，却没有效果。可以合理推测抑制剂BrefA是通过抑制早期内体运输途径来抑制双生病毒在烟粉虱体内的运输的。

本发明又提供了烟粉虱早期内体运输蛋白、细胞骨架蛋白及他们的编码基因作为靶点在抑制烟粉虱携带传播双生病毒中的应用。

本发明又提供了抑制烟粉虱携带传播双生病毒的药物，包括早期内体运输抑制剂、细胞骨架抑制剂中的一种或组合。

所述早期内体运输抑制剂为化合物BrefA或引起基因Rab5、Vps9、Vps11、Vps33a中的其中一种或多种发生基因沉默的序列。引起基因沉默的序列可以是小干扰RNA(siRNA)，也可以是双链RNA(dsRNA)或者具有发夹结构的RNA等。将上述序列导入烟粉虱体内的方法可以是显微注射、病毒感染或者在寄主植物中表达等。

分别引起基因Rab5、Vps9、Vps11、Vps33a发生基因沉默的序列的编码序列如SEQID No.1～4所示。

所述细胞骨架抑制剂为引起基因Arp2或/和Arp3发生基因沉默的序列。

分别引起基因Arp2、Arp3发生基因沉默的序列的编码序列如SEQ ID No.5和6所示。

上述引起相关基因发生基因沉默的序列SEQ ID No.1～6，均能够在体外转录成双链RNA(dsRNA)，为siRNA的前体，dsRNA经酶切加工后成为siRNA，siRNA可以干扰相关基因的表达。

本发明还提供了所述的药物在通过抑制烟粉虱携带传播双生病毒来控制双生病毒传播中的应用。

本发明还提供了一种控制双生病毒传播的方法，通过使用所述的药物处理双生病毒的宿主烟粉虱。

本发明经研究发现烟粉虱早期内体运输蛋白、细胞骨架蛋白及他们的编码基因可以作为抑制烟粉虱携带传播双生病毒的靶点，通过抑制剂BrefA或者将早期内体运输蛋白、细胞骨架蛋白的基因进行RNA干扰后，能够有效抑制烟粉虱对双生病毒的携带和传播能力，从而可以有效控制双生病毒的田间传播。

附图说明

图1为实施例1中BrefA处理对烟粉虱获毒能力的影响结果图，其中“*”表示实验组与对照组在P<0.05水平上具有显著性差异，下同。

图2为实施例2中BrefA处理对血淋巴内病毒含量的影响结果图。

图3为实施例3中BrefA处理对烟粉虱传毒能力的影响结果图。

图4为实施例4中BrefA处理对烟粉虱获取其它双生病毒的影响结果图，其中A为中国番茄黄曲叶病毒(TYLCCNV)，B为中国番木瓜曲叶病毒(PalCuCNV)，“**”表示实验组与对照组在P<0.01水平上具有显著性差异，下同。

图5为RNA干扰早期内体相关基因对烟粉虱获取双生病毒的影响结果图，其中A为注射双链RNA后的基因沉默效率，B为沉默相应基因后对烟粉虱体内病毒含量的影响。

图6为RNA干扰细胞骨架相关基因对烟粉虱获取双生病毒的影响结果图，其中A为注射双链RNA后的基因沉默效率，B为沉默相应基因后对烟粉虱体内病毒含量的影响。

图7为RNA干扰晚期内体、循环内体和高尔基体相关基因对烟粉虱获取双生病毒的影响结果图，其中A为注射双链RNA后的基因沉默效率，B为沉默相应基因后对烟粉虱体内病毒含量的影响。

具体实施方式

实施例1

BrefA对烟粉虱获取番茄黄曲叶病毒能力的影响。

(1)将BrefA溶于乙醇，配置成浓度为5mg/ml的母液；

(2)将BrefA母液稀释于30％蔗糖溶液中，稀释比例为1∶1000，制成BrefA抑制剂溶液；

(3)通过双层Parafilm膜的方法对烟粉虱进行饲喂。在事先准备好的双通玻璃的一端覆上两层Parafilm膜，两层Parafilm膜中间夹有配置好的BrefA抑制剂溶液或含有等比例乙醇的对照溶液。然后将一定数量烟粉虱从另一端引入双通管中，并用纱网封住。

(4)饲喂24小时后，分别将饲喂含有抑制剂和不含抑制剂蔗糖溶液的烟粉虱转移到感染番茄黄曲叶病毒(TYLCV)的番茄上获毒48小时。

(5)收集处理组以及对照组烟粉虱，在液氮中冻死后快速鉴定雌雄。舍弃雄虫，并以每10头雌虫为一个重复，共4×3个重复。

(6)将雌虫至于200μL裂解液中(10mM Tris-HCl pH 8.4，50mM KCl，0.45％Tween-20，0.45％Nonidet P-40，0.2％gelatin(明胶)和60mg/L proteinase K(蛋白酶K))，并用匀浆机磨碎。

(7)简单离心后于56℃恒温水浴1小时，然后100℃水浴10分钟，12000rpm离心3分钟。

(8)通过qPCR鉴定烟粉虱体内双生病毒的含量。

结果如图1所示，抑制剂BrefA处理后烟粉虱从带毒植株上获得病毒的能力相比于对照组显著下降。

实施例2

BrefA对烟粉虱血淋巴中双生病毒含量的影响。

(1)将BrefA溶于乙醇，配置成浓度为5mg/ml的母液；

(4)饲喂24小时后，分别将饲喂含有抑制剂和不含抑制剂蔗糖溶液的烟粉虱转移到感染番茄黄曲叶病毒(TYLCV)的番茄植株上。

(5)分别于转移后的12，24，48小时，利用毛细管从雌性烟粉虱的胸部吸取血淋巴并转移至20μL裂解液中(10mM Tris-HCl pH 8.4，50mM KCl，0.45％Tween-20，0.45％Nonidet P-40，0.2％gelatin(明胶)和60mg/L proteinase K(蛋白酶K))。

(6)简单离心后于56℃恒温水浴1小时，然后100℃水浴10分钟，12000rpm离心3分钟。

(7)通过qPCR鉴定烟粉虱血淋巴内双生病毒的含量(重复次数n＝8-11)。

结果如图2所示，抑制剂BrefA处理后烟粉虱血淋巴内的病毒含量相比于对照组显著下降。

实施例3

BrefA对烟粉虱传播双生病毒的影响。

(1)将BrefA溶于乙醇，配置成浓度为5mg/ml的母液；

(4)饲喂24小时后，分别将饲喂含有抑制剂和不含抑制剂蔗糖溶液的烟粉虱转移到感染番茄黄曲叶病毒(TYLCV)的番茄上获毒12小时。

(5)分别将处理组和对照组烟粉虱转移到未感染病毒的3-4叶期的健康番茄上。每株植物上放置4头烟粉虱，传毒48h，然后将烟粉虱移除，并喷洒农药除掉烟粉虱的卵及若虫。

(6)30天后，通过植物发病症状以及PCR检测植株的发病情况(n＝30)。

结果如图3所示，抑制剂BrefA处理后烟粉虱的传毒能力显著低于对照组。

实施例4

BrefA对烟粉虱获取其它双生病毒的影响。

(1)将BrefA溶于乙醇，配置成浓度为5mg/ml的母液；

(3)通过双层Parafilm膜的方法对烟粉虱进行饲喂。在事先准备好的双通玻璃的一端覆上两层Parafilm膜，两层Parafilm中间夹有配置好的BrefA抑制剂溶液或含有等比例乙醇的对照溶液。然后将一定数量烟粉虱从另一端引入双通管中，并用纱网封住。

(4)饲喂24小时后，分别将饲喂含有抑制剂和不含抑制剂蔗糖溶液的烟粉虱转移到感染中国番木瓜曲叶病毒(PalCuCNV)或中国番茄黄曲叶病毒(TYLCCNV)的番茄上获毒48小时。

(8)通过qPCR鉴定烟粉虱体内双生病毒的含量。

结果如图4所示，抑制剂BrefA处理后显著抑制烟粉虱从带毒植物获取中国番木瓜曲叶病毒和中国番茄黄曲叶病毒的能力。

实施例5

RNA干扰内体运输对烟粉虱获毒的影响。

(1)根据如SEQ ID NO.1所示序列(引起基因Rab5发生基因沉默的序列的编码序列，下同)设计Rab5基因的特异性引物，并以cDNA为模板扩增得到双链DNA；

(2)以扩增得到的双链DNA为模板，利用体外转录的方法合成双链RNA；

(3)通过酚氯仿抽提的方法提纯得到双链RNA；

(4)利用毛细管，以显微注射的方式将双链RNA导入烟粉虱体内，以dsGFP作为对照；

(5)72小时后，分别取处理组及对照组烟粉虱，提取RNA，通过反转录定量PCR的方法检验基因的沉默效率，各4个重复，每个重复20头烟粉虱；

(6)将剩余处理组以及对照组烟粉虱分别转移到感染番茄黄曲叶病毒(TYLCV)的番茄上获毒48小时。

(7)收集处理组以及对照组烟粉虱，在液氮中冻死后快速鉴定雌雄。舍弃雄虫，并以每10头雌虫为一个重复，共4-8个重复。

(8)将雌虫至于200μL裂解液中(10mM Tris-HCl pH 8.4，50mM KCl，0.45％Tween-20，0.45％Nonidet P-40，0.2％gelatin(明胶)和60mg/L proteinase K(蛋白酶K))，并用匀浆机磨碎。

(9)简单离心后于56℃恒温水浴1小时，然后100℃水浴10分钟，12000rpm离心3分钟。

(10)通过qPCR鉴定烟粉虱体内双生病毒的含量。

根据上述相同方法检测干扰Vps8(SEQ ID NO.2)、Vps11(SEQ ID NO.3)、Vps33a(SEQ ID NO.4)基因后对烟粉虱获取病毒的影响。

结果如图5所示，通过显微注射双链RNA可以有效沉默烟粉虱早期内体相关基因的表达(图5A)，沉默早期内体相关基因后烟粉虱获取病毒的能力显著下降(图5B)。

实施例6

按实施例5中相同方法检测RNA干扰细胞骨架蛋白基因对烟粉虱获毒的影响。所选骨架蛋白基因分别是Arp2(SEQ ID NO.5)和Arp3(SEQ ID NO.6)，结果如图6所示，通过显微注射双链RNA可以有效沉默烟粉虱细胞骨架相关基因的表达(图6A)，沉默烟粉虱细胞骨架相关的基因后显著抑制烟粉虱获取病毒的能力(图6B)。

对比例1

按实施例5中相同方法检测RNA干扰细胞晚期内体、循环内体以及高尔基体相关基因对烟粉虱获毒的影响。所选晚期内体运输相关基因分别是Rab7(SEQ ID NO.7)和Vps39(SEQ ID NO.9)，循环内体运输相关基因为Rab11(SEQ ID NO.8)，高尔基体运输相关基因分别是Vps26(SEQ ID NO.10)、Vps29(SEQ ID NO.11)和Vps35(SEQ ID NO.12)。结果如图7所示，通过显微注射双链RNA可以有效沉默烟粉虱基因的表达(图7A)，沉默烟粉虱晚期内体、循环内体和高尔基体相关的基因后对烟粉虱获取病毒的能力没有显著影响(图7B)。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 抑制烟粉虱携带传播双生病毒的药物、应用及控制双生病毒传播的方法

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<170> PatentIn version 3.3

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actgtgtgcc tggaagatat gacagtcaaa tttgaaatct gggatactgc aggacaagaa 240

agatatcata gtttggcacc tatgtattat agaggcgctc aagcagctat agttgtgtat 300

gacattacaa atcaagatac ttttaaccgt gcaaaaacgt gggtcaaaga gttacaacgg 360

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gaaacttcag ctaaaacagc cgtgaatgtt aatgatgttt ttcttgccat tgcaaagaaa 540

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<400> 10

tggcgaaagt gtcagcggaa aggttaacat cactctgaaa aaacctggtt acaagcttga 60

acatcaaggt atcaagatcg aattcagtgg tcaaattgaa ctttactacg atagagggaa 120

tcattatgaa ttcacatcat tgactaaaga gctagctcgc cctggagagc tgactcaaaa 180

cacgagttac ccttttgagt tcctgaatgt ggagaaacct tttgaatcat atactggttc 240

aaatgttcgc cttaggtatt tattaagagt tacaatcgtt cggcgaatct cagacacagt 300

caaggaatta gacttagttg ttcacactct ctcctcatat ccagatatga acaacagtat 360

taaaatggaa gttggaattg aagattgcct tcatattgaa tttgagtata acaagtgcaa 420

gtatcatctg aaagatgtca ttgttggaaa aatttatttt cttcttgtaa gaatcaaact 480

aaagcatatg gaaatagcaa tcatcaaaaa agagaccact ggtactggag ccaatatgtt 540

cactgagagt gacaccatag ccaagtatga gataatggat ggtgctcccg ttcgcggaga 600

aagtattcca atcagagtat ttcttgcagg ttatgagctc acaccaacc 649

<210> 11

<211> 407

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgttggttt tagtgatagg ggacttacac attcctcatc gttgcagcag tctgcctagt 60

aaattcaaga agctattagt cccaggaaga atccagcata ttttatgtac tggcaatcta 120

tgcaccaaag agtcttatga ttatcttaaa acgctagcca gtgatgtcca cgttgttcga 180

ggggattttg atgagaactt caattaccct gagcaaaaaa tagttactgt cggccagttc 240

cgaataggcc tatgtcacgg acacggcact gttccatggg gtgatcctga atccttagct 300

ttgactcaac gacagctaga tgtagatatt ctcatttccg gccatacgca caaatacgaa 360

gcatacgagc atgaaaataa attctacatc aatcctggat ctgccac 407

<210> 12

<211> 553

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctgttggagg aattccggaa ggagcagaaa gatcgcaaaa tcccagacct ctacgaaata 60

gttcaatatg ctgggaatat agttccaagg ctgtatttgt taatcactgt tggcctagtc 120

cacattcaga caaactcatc ttcgaagaag gatttaatga aggatctggt agaaatgtgt 180

cgaggtgtac agcatccact gcgcggattg ttcctacgaa attacctgtt gcagtgcatg 240

cgcaatgtcc tcccggatac tcctgatgac cccaacgctg cggagacccc tgaaggaact 300

gtcagagact ctattgattt tgtactgatg aattttgctg agatgaacaa gctctgggtt 360

cgtatgcaac accagggaca ctcgagagag cgtgaaagac gcgaacaaga gcgggaggag 420

ctaaagattt tagttggaac caaccttgtt cggttatcac aattagactc agtcagtcta 480

gacttgtata agaagttggt tctgccggga attttagagc aagttgtcag ctgtagggat 540

gcaatagcac aag 553

Claims

1.烟粉虱早期内体运输蛋白、细胞骨架蛋白及他们的编码基因作为靶点在抑制烟粉虱携带传播双生病毒中的应用。

2.抑制烟粉虱携带传播双生病毒的药物，包括早期内体运输抑制剂、细胞骨架抑制剂中的一种或组合。

3.如权利要求2所述的药物，其特征在于，所述早期内体运输抑制剂为化合物BrefA或引起基因Rab5、Vps9、Vps11、Vps33a中的其中一种或多种发生基因沉默的序列。

4.如权利要求3所述的药物，其特征在于，分别引起基因Rab5、Vps9、Vps11、Vps33a发生基因沉默的序列的编码序列如SEQ ID No.1～4所示。

5.如权利要求2所述的药物，其特征在于，所述细胞骨架抑制剂为引起基因Arp2或/和Arp3发生基因沉默的序列。

6.如权利要求5所述的药物，其特征在于，分别引起基因Arp2、Arp3发生基因沉默的序列的编码序列如SEQ ID No.5和6所示。

7.如权利要求2～6任一所述的药物在通过抑制烟粉虱携带传播双生病毒来控制双生病毒传播中的应用。

8.一种控制双生病毒传播的方法，其特征在于，通过使用如权利要求2～6任一所述的药物处理双生病毒的宿主烟粉虱。