CN107354116B - 一种发酵乳杆菌优化培养基及其培养方法 - Google Patents
一种发酵乳杆菌优化培养基及其培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种发酵乳杆菌优化培养基，包括如下组分，酵母蛋白胨13.0～30.0g/L、葡萄糖15.0～35.0g/L、蔗糖8.0～16.0g/L、乳糖15.0～35.0g/L、酵母浸出物8.0～12.0g/L、乙酸钠3.0～8.0g/L、硫酸镁0.02～0.1g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、低聚异麦芽糖1.5～3.0g/L、柠檬酸1.8～4.0g/L、余量为无菌水。通过利用该优化培养基可达到发酵乳杆菌增殖培养、活菌数量大、菌体收率高的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种发酵乳杆菌优化培养基及其培养方法。
背景技术
在人的肠道中存在着几百种、数百亿个细菌，在肠内构成菌丛。迄今为止，人们已知这些肠道细菌分三类：一类是能够合成某些维生素、对有害细菌的增殖有抑制作用、对免疫功能有刺激和促进的效果，这就是以双歧杆菌和乳杆菌为主的有益菌，这些细菌通过调整肠道生态系统可保持人体的健康，减少疾病，延缓衰老，因此被称为益生菌；另一类是在肠道内会构成腐败、产生有害或致癌物质的有害菌，如梭状芽胞杆菌、拟杆菌属和真细菌属等；另外还有一类既有有害作用，又有有益作用的细菌，如胨球菌。
2011年发酵乳杆菌列入我国《可用于食品的菌种名单》，2016年发酵乳杆菌列入《可用于婴幼儿食品的菌种名单》。发酵乳杆菌广泛分布于植物以及动物的胃肠道中，是宿主肠道、口腔和阴道的的正常菌群，能在人体胃液低pH和肠道高胆汁酸环境中存活，能够调节宿主体内微生物菌群的平衡，改善宿主体内系统环境，对宿主健康具有促进作用。
发酵乳杆菌属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性，兼性厌氧。菌种为棒状，直径0.5～0.9μm，长度的差异比较大，大多数是单个生长，也有成对出现。在MRS琼脂培养基生长时，菌落直径约1mm，有光泽、圆顶形、不透明，并且当用接种环接触时显示有粘性；不产芽孢，过氧化氢酶阴性，非运动性，能利用葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、蜜二糖、果糖、核糖、海藻糖、棉子糖、甘露糖和L-阿拉伯糖产酸；接触酶阴性、明胶液化阴性、硫化氢试验阴性、淀粉水解阴性、产氨阴性、硝酸还原阴性、V.P.反应阴性，是人类肠道中主要的异型发酵乳杆菌，对胃酸、胆汁和胰腺分泌物具有很强的耐受性，发酵碳水化合物的能力强，在食品发酵和医疗保健领域的应用前景广泛。因此，提供一种活菌数量大、收率高、成本低的发酵乳杆菌的优化培养基及其培养方法是非常重要的。
发明内容
本发明目的是提供一种发酵乳杆菌优化培养基及其培养方法，达到发酵乳杆菌增殖培养、活菌数量大、菌体收率高的目的。
本发明采用的技术方案为：
一种发酵乳杆菌优化培养基，包括如下组分，酵母蛋白胨13.0～30.0g/L、葡萄糖15.0～35.0g/L、蔗糖8.0～16.0g/L、乳糖15.0～35.0g/L、酵母浸出物8.0～12.0g/L、乙酸钠3.0～8.0g/L、硫酸镁0.02～0.1g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、低聚异麦芽糖1.5～3.0g/L、柠檬酸1.8～4.0g/L、余量为无菌水。
所述发酵乳杆菌优化培养基的制备方法，按照配方比例称量各组分，混合、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.30～6.80，115℃下灭菌30min，得发酵乳杆菌优化培养基。
所述发酵乳杆菌优化培养基的培养方法，包括如下步骤：
1)菌种划线培养：将发酵乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于MC培养基上分区划线，划线结束后，平皿倒置，35℃培养箱恒温培养40～72小时；
2)一级纯化培养：挑取平皿上溶钙圈较大的单菌落接种至装有MRS液体培养基的试管中，试管密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；
3)二级纯化培养：按3～5％接种量，将一级纯化培养好的菌悬液接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；
4)菌种保存：对二级纯化培养得到的菌悬液进行离心，12000rpm离心10分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于混合液中，得菌泥混合液，将菌泥混合液分装在已灭菌的冻存管中，封口膜密封，冻存于-40～-80℃低温冰箱内，得发酵乳杆菌菌泥冻存管，备用；
5)冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内的发酵乳杆菌菌泥冻存管，立即放入35℃水浴锅内进行菌种复苏，30～45s，至冻存管内液体全部融化；
6)菌种一级培养：将复苏好的1～2ml菌泥混合液直接接种至装有基础培养基的三角瓶A中，三角瓶A密封，35℃培养箱恒温静置培养16～24小时；
7)菌种二级培养：按照2～6％接种量，将一级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的三角瓶B中，三角瓶B密封，35℃培养箱恒温静置培养16～24小时；
8)菌种三级培养：按照2～6％接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养7～12小时；
9)菌种四级发酵：按照2～8％接种量，将三级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养，在发酵开始3小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH为4.80～5.30，培养周期6～12小时，直至监测到菌液OD600值停止增长或呈负增长，立即停止发酵；
10)发酵液离心：四级发酵结束后，将发酵罐罐体温度调低，当罐内发酵液温度低于20℃时准备离心，离心设备采用管式离心机，离心前对转鼓进行蒸汽灭菌30min，离心转速为10000～15000rpm；
11)菌泥收集：离心结束后，收集转鼓内的菌泥。
所述的培养方法，步骤3)中MRS液体培养基的体积占三角瓶容积的40％～60％。
所述的培养方法，步骤4)中混合液与离心前二级纯化培养得到的菌悬液的体积比为1:10。
所述的培养方法，步骤4)中混合液由MRS液体培养基与50％甘油溶液按体积比为1:1～1.5的比例配制混合而成。
所述的培养方法，步骤6)、7)中基础培养基的配制，按照配方比例为：酵母蛋白胨15.0～30.0g/L、葡萄糖25.0～35.0g/L、酵母浸出物3.0～6.0g/L、乙酸钠4.0～6.0g/L、硫酸镁0.1～0.3g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、柠檬酸3.0～6.0g/L、余量为无菌水，称量各组分，混合、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.40～6.70，于115℃下灭菌30min。
所述的培养方法，步骤7)中基础培养基的体积占三角瓶B容积的40％～60％。
所述的培养方法，步骤8)、9)中优化培养基装液的体积占发酵罐容积的40％～60％。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
1、本发明使用的优化培养基碳源采用一种单糖——葡萄糖和两种双糖——蔗糖和乳糖，经试验证明这三种糖配合使用，能提高菌体收率及活菌数；优化培养基中添加益生元低聚异麦芽糖，能够促进发酵乳杆菌的增殖，提高菌体收率。
2、本发明为实现发酵乳杆菌增殖培养、富集高活菌数的菌体用于生产作为食品添加剂的冻干粉目的，针对发酵乳杆菌纯化培养和菌种发酵分别采用了不同的、更适于菌体不同生长阶段的基础培养基和优化培养基，并且培养基采用的组分原料均为食品级。
3、在本发明中，用于发酵的菌种采用离心菌泥的收集方式，较于现在普遍应用的斜面和菌悬液的方式，获得的菌悬液的收率和活菌数更高。
4、采取分级扩大培养方式促使菌体数量快速增加，通过流加食品级NaOH溶液来控制发酵过程中pH恒定，在短时间里得到大量的菌体，并且菌种稳定，变异、退化少。
5、采用管式离心机分离收集发酵乳杆菌菌泥，菌泥收率可达到1.5％以上，活菌数高达1012CFU/g以上，并且管式离心机的转鼓可用蒸汽灭菌，有效地防止了在离心过程中染菌。
6、本发明技术制备的发酵乳杆菌，活菌数高，存活率高。
附图说明
图1为实施例1一种发酵乳杆菌优化培养基的培养方法流程图。
图2为对比例1采用不同基础培养基配方对OD600和收率的影响的对比图。
具体实施方式
实施例1一种发酵乳杆菌优化培养基及其培养方法
一、优化培养基配方：酵母蛋白胨20.0g/L、葡萄糖22.0g/L、蔗糖10.0g/L、乳糖22.0g/L、低聚异麦芽糖22.0g/L、酵母浸出物10.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.06g/L、吐温80 0.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、柠檬酸2.5g/L、余量为无菌水，pH值6.50。
二、制备：按照配方比例称量、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.50，115℃下灭菌30min；注：培养基中各组分原料均为食品级。
三、培养方法，如图1所示包括如下步骤：
1、发酵用菌种的制备
1)菌种划线培养：发酵乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于MC培养基上四区划线，划线结束后，平皿倒置，35℃培养箱恒温培养50小时；
2)一级纯化培养：挑取平皿上溶钙圈较大的单菌落接种至装有5ml MRS液体培养基的试管中，试管密封，35℃培养箱恒温静置培养15小时；
3)二级纯化培养：按3％接种量，将一级纯化培养好的菌悬液接种至装有100mlMRS液体培养基的250ml三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养18小时；
4)菌种保存：对二级纯化培养得到的100ml菌悬液进行离心，12000rpm离心10分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于10ml混合液(混合液由5ml MRS液体培养基与5ml 50％甘油溶液混合均匀配制而成)中，得菌泥混合液，将菌泥混合液分装在已灭菌的1ml冻存管中，封口膜密封，冻存于-80℃低温冰箱内，得发酵乳杆菌菌泥冻存管，备用；
注：1)—4)操作均必需在无菌操作台和无菌间内执行；
2、菌种的发酵
5)冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内的发酵乳杆菌菌泥冻存管，立即放入35℃水浴锅内进行菌种复苏，30～45s，至冻存管内液体全部融化；
6)菌种一级培养：将复苏好的1ml菌泥混合液直接接种至装有10ml基础培养基的50ml三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养20小时；
7)菌种二级培养：按照4％接种量，将一级培养结束的菌悬液接种至装有100ml基础培养基的250ml三角瓶中，按此接种4瓶，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养20小时；
8)菌种三级培养：按照5％接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至装有7.2L实施例1制备的优化培养基的12L发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养10小时；
9)菌种四级发酵：按照5％接种量，将三级培养结束的菌悬液接种至装有120L实施例1制备的优化培养基的200L发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养，在发酵开始3小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH为5.10±0.1，培养至10小时时，监测到菌液OD600值停止增长，立即停止发酵；
其中：步骤6)、7)基础培养基的配方为：酵母蛋白胨22.0g/L、葡萄糖28.0g/L、酵母浸出物4.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.2g/L、吐温80 0.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、柠檬酸4.0g/L、余量为无菌水，pH值6.50。制备：按照配方比例称量、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.50，115℃下灭菌30min；
10)发酵液离心：四级发酵结束后，将发酵罐罐体温度调低，当罐内发酵液温度低于20℃时准备离心，离心设备采用管式离心机，离心前对转鼓进行蒸汽灭菌30min，离心转速为12000rpm；
11)菌泥收集，离心结束后，收集到转鼓内的菌泥1.824kg，菌泥收率为1.52％。
注：5)—11)操作均需在10万级净化车间内进行。
对比例1基础培养基配方的对比实验
配方A：酵母蛋白胨22.0g/L、葡萄糖28.0g/L、酵母浸出物4.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.2g/L、吐温80 0.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、余量为无菌水。
配方B：蔗糖30.0g/L、酵母浸出物4.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.2g/L、吐温800.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、柠檬酸4.0g/L、余量为无菌水。
配方C：酵母蛋白胨22.0g/L、葡萄糖10.0g/L、蔗糖18.0g/L、酵母浸出物4.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.2g/L、吐温80 0.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、柠檬酸4.0g/L、余量为无菌水。
配方D(实施例1配方)：酵母蛋白胨22.0g/L、葡萄糖28.0g/L、酵母浸出物4.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.2g/L、吐温80 0.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、柠檬酸4.0g/L、余量为无菌水。
分别按照配方A、B、C和D配制基础培养基，并在与实施例1相同的培养条件下培养发酵乳杆菌，菌种二级培养结束后，检测菌悬液的OD600和收率，结果如图1所示。由图1显示可知，基础培养基采用配方D即实施例1配方培养发酵乳杆菌，培养结束后测得菌悬液的OD600和收率均高于配方A、B和C。
对比例2优化培养基配方的对比实验
配方Ⅰ：酵母蛋白胨20.0g/L、葡萄糖22.0g/L、蔗糖10.0g/L、棉子糖22.0g/L、酵母浸出物10.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.06g/L、吐温80 0.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、柠檬酸2.5g/L、余量为无菌水。
配方Ⅱ：酵母蛋白胨20.0g/L、葡萄糖22.0g/L、蔗糖10.0g/L、低聚果糖22.0g/L、酵母浸出物10.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.06g/L、吐温80 0.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、柠檬酸2.5g/L、余量为无菌水。
配方Ⅲ：酵母蛋白胨20.0g/L、葡萄糖22.0g/L、蔗糖10.0g/L、低聚异麦芽糖22.0g/L、酵母浸出物10.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.06g/L、吐温80 0.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、柠檬酸2.5g/L、余量为无菌水。
配方Ⅳ：酵母蛋白胨20.0g/L、葡萄糖22.0g/L、蔗糖10.0g/L、菊粉12.0g/L、酵母浸出物10.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.06g/L、吐温80 0.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、、柠檬酸2.5g/L、余量为无菌水。
配方Ⅴ：酵母蛋白胨20.0g/L、葡萄糖22.0g/L、蔗糖10.0g/L、乳糖22.0g/L、酵母浸出物10.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.06g/L、吐温80 0.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、柠檬酸2.5g/L、余量为无菌水。
配方Ⅵ(实施例1配方)：酵母蛋白胨20.0g/L、葡萄糖22.0g/L、蔗糖10.0g/L、乳糖22.0g/L、低聚异麦芽糖22.0g/L、酵母浸出物10.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.06g/L、吐温80 0.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、柠檬酸2.5g/L、余量为无菌水。
分别按照配方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ配制优化培养基，并在与实施例1相同的培养条件下进行发酵乳杆菌发酵，菌种四级发酵结束后，检测菌悬液的活菌数，离心收集菌泥，观察菌泥的颜色，检测收率，结果如表1所示。由表1可知，优化培养基采用配方Ⅵ即实施例1配方进行发酵乳杆菌发酵，菌悬液的活菌数和收率均高于配方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。
表1采用不同优化培养基配方对活菌数、收率和菌泥颜色的影响。
| 配方编号 | 收率/％ | 活菌数/cfu/mL | 菌泥颜色 |
| 配方Ⅰ | 1.178 | 3.35×10<sup>9</sup> | 菌泥乳白，表面偏深黄色，有黑点 |
| 配方Ⅱ | 1.229 | 2.60×10<sup>9</sup> | 菌泥乳白，表面偏深黄色 |
| 配方Ⅲ | 1.310 | 3.80×10<sup>9</sup> | 菌泥乳白，表面偏深黄色 |
| 配方Ⅳ | 1.277 | 2.80×10<sup>9</sup> | 菌泥乳白，表面偏深黄色 |
| 配方Ⅴ | 1.395 | 2.85×10<sup>9</sup> | 菌泥乳白，表面偏深黄色 |
| 配方Ⅵ | 1.520 | 3.75×10<sup>9</sup> | 菌泥乳白，表面偏深黄色 |
Claims (4)
1.一种发酵乳杆菌优化培养基的培养方法，其特征在于，发酵乳杆菌优化培养基的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)菌种划线培养：将发酵乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于MC培养基上分区划线，划线结束后，平皿倒置，35℃培养箱恒温培养40～72小时；
2)一级纯化培养：挑取平皿上溶钙圈较大的单菌落接种至装有MRS液体培养基的试管中，试管密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；
3)二级纯化培养：按3～5％接种量，将一级纯化培养好的菌悬液接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；
4)菌种保存：对二级纯化培养得到的菌悬液进行离心，12000rpm离心10分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于混合液中，得菌泥混合液，将菌泥混合液分装在已灭菌的冻存管中，封口膜密封，冻存于-40～-80℃低温冰箱内，得发酵乳杆菌菌泥冻存管，备用；
5)冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内的发酵乳杆菌菌泥冻存管，立即放入35℃水浴锅内进行菌种复苏，30～45s，至冻存管内液体全部融化；
6)菌种一级培养：将复苏好的1～2ml菌泥混合液直接接种至装有基础培养基的三角瓶A中，三角瓶A密封，35℃培养箱恒温静置培养16～24小时；
7)菌种二级培养：按照2～6％接种量，将一级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的三角瓶B中，三角瓶B密封，35℃培养箱恒温静置培养16～24小时；
8)菌种三级培养：按照2～6％接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养7～12小时；
9)菌种四级发酵：按照2～8％接种量，将三级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养，在发酵开始3小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH为4.80～5.30，培养周期6～12小时，直至监测到菌液OD600值停止增长或呈负增长，立即停止发酵；
10)发酵液离心：四级发酵结束后，将发酵罐罐体温度调低，当罐内发酵液温度低于20℃时准备离心，离心设备采用管式离心机，离心前对转鼓进行蒸汽灭菌30min，离心转速为10000～15000rpm；
11)菌泥收集：离心结束后，收集转鼓内的菌泥；
所述的优化培养基包括如下组分，酵母蛋白胨20.0g/L、葡萄糖22.0g/L、蔗糖10.0g/L、乳糖22.0g/L、酵母浸出物10.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.06g/L、吐温80 0.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、低聚异麦芽糖22.0g/L、柠檬酸2.5g/L、余量为无菌水；
所述优化培养基的制备方法：按照配方比例称量各组分，混合、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.30～6.80，115℃下灭菌30min，得发酵乳杆菌优化培养基。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤6)、7)中基础培养基的配制，按照配方比例为：酵母蛋白胨15.0～30.0g/L、葡萄糖25.0～35.0g/L、酵母浸出物3.0～6.0g/L、乙酸钠4.0～6.0g/L、硫酸镁0.1～0.3g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、柠檬酸3.0～6.0g/L、余量为无菌水，称量各组分，混合、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.40～6.70，于115℃下灭菌30min。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤7)中基础培养基的体积占三角瓶B容积的40％～60％。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤8)、9)中优化培养基装液的体积占发酵罐容积的40％～60％。
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