CN107349244B

CN107349244B - 丙二酰基人参皂苷的提取方法

Info

Publication number: CN107349244B
Application number: CN201710763361.5A
Authority: CN
Inventors: 刘志; 孙光芝; 阮长春
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2017-08-30
Filing date: 2017-08-30
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2037-08-30
Also published as: CN107349244A

Abstract

本发明提供了一种丙二酰基人参皂苷的提取方法和治疗糖尿病肾病中的应用，以鲜人参或西洋参为原料，经纤维素酶酶解处理后，超声提取，减压回收溶剂，浓缩为水溶液，再用NKA‑12吸附树脂进行分离，乙醇和磷酸缓冲盐溶液梯度洗脱，葡聚糖凝胶除盐后得到丙二酰基人参皂苷。此方法高效地利用纤维素酶降解人参和西洋参的细胞壁，从而提高了丙二酰基人参皂苷的提取率，具有操作简单、快速、成本低廉和提取效率高等特点；经动物实验证明丙二酰基人参皂苷对2型糖尿病肾病有着显著的预防和治疗作用，可应用于保健食品或药品的制备。

Description

丙二酰基人参皂苷的提取方法

技术领域

本发明涉及中药材提取物的制备方法及其制备药物中的应用，尤其是公开一种丙二酰基人参皂苷的提取方法，同时还提供了其在制备预防和治疗糖尿病肾病的应用，属于中医中药技术领域。

背景技术

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最为严重的并发症之一，也是导致临床上糖尿病患者死亡的主要原因之一。据报道，Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病患者中大约有20%～40% 会发展为肾病；在我国，糖尿病肾病的发病率大约为40％。糖尿病肾病的发生是由多因素共同作用的结果：糖代谢紊乱、肾脏血流动力学的改变、多种细胞因子以及遗传背景均起非常重要的作用。当临床上出现持续性蛋白尿时，肾脏病变已不属早期，肾脏已出现了不可逆的病变，至今尚无有效的措施阻止其发生与发展。目前，糖尿病肾病的治疗措施主要包括：控制血糖，控制血压，蛋白质摄入限制，控制血脂，透析，肾移植等。但这些治疗措施取得的效果并不理想，不能有效地抑制糖尿病肾病的发展。

人参和西洋参是我国最为名贵的中草药，具有多种生物活性，在我国有悠久的药用和滋补保健历史。人参皂苷是这两种药用植物的主要成分，可分为中性皂苷(人参皂苷-Rb₁, -Rb₂ , -Rc, -Rd, -Rg₁, -Re, -Rg₃, -Rg₂, -Rh₁等)和酸性皂苷（丙二酰基人参皂苷-Rb₁, -Rb₂, -Rc, -Rd, -Rg₁和-Re等）。目前已经从人参和西洋参中共分离鉴定了100多种人参皂苷。丙二酰基人参皂苷（Malonyl- ginsenosides）是一种酸性皂苷，熔点（mp）一般为150_~161℃之间，易溶于水、甲醇，难溶于乙醇、正丁醇，不溶于氯仿、乙醚。丙二酰基人参皂苷的含量很高，在人参中约占人参总皂苷的50%，然而由于这类皂苷的极性较强，难于分离鉴定，目前对其化学成分和药理活性研究报道较少。

目前已有大量涉及人参和西洋参治疗糖尿病肾病的报道。人参对糖尿病大鼠氧化应激或AGEs形成引起的肾损害具有保护作用；人参不但能够降低糖尿病大鼠的血糖和糖基化蛋白水平，同时还能降低肌酸酐和尿蛋白水平（Biol.Pharm.Bull.2016,29(8):1678-1684）。西洋参叶20s-原人参二醇组皂苷可以降低糖尿病肾病大鼠血糖, 降低肾脏细胞基质,减少系膜细胞增生,保护肾脏细胞的超微结构,改善大鼠糖尿病引起的肾脏病理损害，其机制可能与其降低肾脏GLUT-1功能有关（《吉林大学学报：医学版》，2007，33（5）：845-848.《中国病理生理杂志》，2008,24（6）：1237-1239）。单体人参皂苷Rb₁可以改善DN大鼠肾脏功能、减轻肾脏病理损害,其具体机制可能与下调大鼠肾组织MCP-1 mRNA及蛋白表达水平有关。（《中国中西医结合肾病杂志》, 2008(7): 578-581）。人参皂苷Rg₁能降低TNF-α、ED-1、TGF-β1、MCP-1的水平，改善糖尿病肾病大鼠足细胞及肾脏的病理损害，能显著减少糖尿病大鼠24h尿蛋白和血肌酐，具有一定的肾保护作用 (《四川大学学报：医学版》 2009，40（3）：466-471.《生物医学工程学杂志》，2010，27（2）：342-347)。人参皂甙Rg₃能显著降低糖尿病大鼠血糖、血肌酐、24h尿蛋白, 肾小球基底膜增厚程度减轻,细胞外基质堆积减少,能改善糖尿病大鼠肾脏的病理损害。（《现代生物医学进展》，2014，36：7015-7018）。

但到目前为止，未见有关丙二酰基人参皂苷对糖尿病肾病治疗作用的研究报道。

在丙二酰基人皂苷的制备方法上，中国专利（申请号200510016845.0）公开了一种利用鲜人参制备丙二酰基人参皂苷的方法，该方法使用高浓度的乙醇冷㓎提取，然后用水饱和正丁醇进行萃取，最后利用大孔树脂分离得到丙二酰基人参皂苷。然而人参中的有效成分大多被富含纤维素的细胞壁包裹，导致人参皂苷的提取效率较低，提取时间较长。另外, 由于丙二酰基人参皂苷是一种酸性皂苷，使用常规的乙醇-水溶剂系统很难实现丙二酰基人参皂苷与中性皂苷的分离，造成其制备的纯度较低，得率也较低。

发明内容

本发明公开一种丙二酰基人参皂苷的提取纯化方法，解决了现有制备工艺提取率低、分离纯化困难和高纯度丙二酰基人参皂苷得率低等缺点。

本发明进一步提供了丙二酰基人参皂苷在治疗糖尿病及其引起的肾病中的医用用途，可以通过纤维素酶酶解人参和西洋参的细胞壁，高效绿色的提取纯化丙二酰基人参皂苷，为人参和西洋参有效成分的开发利用提供了技术支持。

本发明的一种丙二酰基人参皂苷的提取纯化方法，包括以下步骤：

1）以鲜人参或西洋参为原料，切碎，加入1-10倍量的蒸馏水；

2）加入样品质量1%-20%的纤维素酶，于20-60℃恒温振荡水浴1-12h；

3）酶解后加入乙醇和水，使乙醇的浓度达到0-80%，超声提取3-5次，每次提取0.5-4h,提取溶剂的用量为10-50倍；

4）将提取液在40℃下减压回收溶剂，浓缩为水溶液；

5）将步骤4）提取物用NKA-12吸附树脂进行分离，洗脱液为乙醇和磷酸缓冲盐溶液梯度洗脱，分别收集洗脱流份，采用薄层色谱法检测，收集、合并与丙二酰基人参皂苷阳性对照品Rf 值相同的流份溶液，减压回收溶剂，浓缩液使用葡聚糖凝胶除盐，冷冻干燥得到丙二酰基人参皂苷粉末；丙二酰基人参皂苷的纯度在70%以上，得率可达60%。

本发明丙二酰基人参皂苷制备方法步骤（1）优选：鲜人参或西洋参切碎后，加入3-5倍量的蒸馏水；然后加入样品质量5%的纤维素酶。

本发明丙二酰基人参皂苷的制备方法步骤（2）优选：纤维素酶酶解的温度为40℃，恒温振荡水浴4h。

本发明丙二酰基人参皂苷的制备方法步骤（3）优选：酶解后加入乙醇和水，使乙醇的浓度达到0-20%，溶剂的用量为20-30倍，然后超声提取3次，每次提取1h。

本发明丙二酰基人参皂苷的制备方法步骤（5）优选：磷酸缓冲盐溶液选自：NaH₂PO₄、 KH₂PO₄、Na₂HPO₄、K₂HPO₄。

丙二酰基人参皂苷在制备治疗糖尿病药物中的医用用途。

丙二酰基人参皂苷在制备治疗由糖尿病引起的肾病中的医用用途。

本发明还提供了据有很强的药理活性的一类丙二酰基人参皂苷制剂。

本发明丙二酰基人参皂苷的药物含有治疗有效量的提取物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

另外，应该特别指出的是，可以根据需要在发明的药物组合中加入一种或多种天然或合成的其它与本活性物质具有协同或辅助作用的成分，这些可能被加入的天然或合成的辅助成分是本领域技术人员已知的和可以想象到的。可将所说的组合物配制成经口给药的剂型，如片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂等。

为了制备适于口服给药的片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂等，可以使用蔗糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、微晶纤维、滑石粉等作为载体或赋形剂。在这些经口给药的剂型中，还可以含有合适的其它添加剂，诸如崩解剂、润滑剂、填充剂、黏合剂、矫味剂、防腐剂、分散剂、表面活性剂、着色剂等。

本发明药物组合物最优选的给药途径是各种口服给药的剂型，例如片剂、颗粒剂、胶囊剂或丸剂，这些经口给药剂型的每日剂量一般含有10-1000mg 本活性物质。

本发明的积极效果在于：采用新方法对鲜人参和西洋参中丙二酰基人参皂苷进行提取纯化。与现有制备工艺相比，采用纤维素酶酶解提取的方法可以使丙二酰基人参皂苷的提取率提高1倍；同时分离纯化工艺上采用NKA-12吸附树脂和乙醇-磷酸缓冲盐洗脱系统克服了丙二酰基人参皂苷和中性皂苷分离较困难的缺点，提高了丙二酰基人参皂苷的纯度和得率。本发明充分利用了人参资源，最大限度地提取、富集丙二酰基人参皂苷，达到简单、快速、环保、低成本富集的目的，为工业化生产、新药制备提供方法保证。

附图说明

图1：酶解温度对丙二酰基人参皂苷提取率的影响；

图2：加酶量对丙二酰基人参皂苷提取率的影响；

图3：酶解时间对丙二酰基人参皂苷提取率的影响；

图4：乙醇浓度对丙二酰基人参皂苷提取率的影响。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

以鲜人参（须根、支根、根茎、主根等）为原料，切碎，加入2倍量的蒸馏水；然后加入人参样品质量1%的纤维素酶，于20℃恒温振荡水浴2h。酶解后加入适量的蒸馏水，使溶剂的用量为10倍，然后超声提取3次，每次提取0.5h。将提取液在40℃下减压回收溶剂，浓缩为水溶液；然后用NKA-12吸附树脂进行分离，洗脱液为乙醇和0.01mol/L K₂HPO₄梯度洗脱，分别收集洗脱流份，采用薄层色谱法检测，收集、合并与丙二酰基人参皂苷阳性对照品Rf 值相同的流份溶液，减压回收溶剂，浓缩液使用葡聚糖凝胶除盐，冷冻干燥得到丙二酰基人参皂苷粉末。

实施例2

以鲜人参的须根、支根和主根为原料，切碎，加入3倍量的蒸馏水；然后加入人参样品质量5%的纤维素酶，于40℃恒温振荡水浴4h。酶解后加入适量的乙醇和水，使乙醇的浓度为20%，溶剂的用量为30倍，然后超声提取4次，每次提取1h。将提取液在40℃下减压回收溶剂，浓缩为水溶液，然后用NKA-12吸附树脂进行分离，洗脱液为乙醇和0.02mol/L KH₂PO₄梯度洗脱，分别收集洗脱流份，采用薄层色谱法检测，收集、合并与丙二酰基人参皂苷阳性对照品Rf 值相同的流份溶液，减压回收溶剂，浓缩液使用葡聚糖凝胶除盐，冷冻干燥得到丙二酰基人参皂苷粉末。

实施例3

以鲜西洋参为原料，切碎，加入5倍量的蒸馏水；然后加入西洋参样品质量10%的纤维素酶，于60℃恒温振荡水浴6h。酶解后加入适量的乙醇和水，使乙醇的浓度为40%，溶剂的用量为50倍，然后超声提取5次，每次提取2h。将提取液在40℃下减压回收溶剂，浓缩为水溶液；然后用NKA-12吸附树脂进行分离，洗脱液为乙醇和0.05mol/L Na₂HPO₄梯度洗脱，分别收集洗脱流份，采用薄层色谱法检测，收集、合并与丙二酰基人参皂苷阳性对照品Rf 值相同的流份溶液，减压回收溶剂，浓缩液使用葡聚糖凝胶除盐，冷冻干燥得到丙二酰基人参皂苷粉末。

实施例4

以鲜西洋参根茎为原料，切碎，加入1倍量的蒸馏水；然后加入西洋参样品质量20%的纤维素酶，于30℃恒温振荡水浴8h。酶解后加入适量的乙醇和水，使乙醇的浓度为60%，溶剂的用量为20倍，然后超声提取3次，每次提取4h。将提取液在40℃下减压回收溶剂，浓缩为水溶液；然后用NKA-12吸附树脂进行分离，洗脱液为乙醇和0.03mol/L NaH₂PO₄梯度洗脱，分别收集洗脱流份，采用薄层色谱法检测，收集、合并与丙二酰基人参皂苷阳性对照品Rf 值相同的流份溶液，减压回收溶剂，浓缩液使用葡聚糖凝胶除盐，冷冻干燥得到丙二酰基人参皂苷粉末。

实施例5

以人参的茎叶、花蕾和果为原料，切碎，加入5倍量的蒸馏水；然后加入人参样品质量3%的纤维素酶，于35℃恒温振荡水浴5h。酶解后加入适量的乙醇和水，使乙醇的浓度为5%，溶剂的用量为40倍，然后超声提取5次，每次提取2h。将提取液在40℃下减压回收溶剂，浓缩为水溶液；然后用NKA-12吸附树脂进行分离，洗脱液为乙醇和0.04mol/L KH₂PO₄梯度洗脱，分别收集洗脱流份，采用薄层色谱法检测，收集、合并与丙二酰基人参皂苷阳性对照品Rf 值相同的流份溶液，减压回收溶剂，浓缩液使用葡聚糖凝胶除盐，冷冻干燥得到丙二酰基人参皂苷粉末。

实施例6

以鲜西洋参茎叶、花蕾和果为原料，切碎，加入2倍量的蒸馏水；然后加入西洋参样品质量8%的纤维素酶，于45℃恒温振荡水浴3h。酶解后加入适量的乙醇和水，使乙醇的浓度为15%，溶剂的用量为30倍，然后超声提取3次，每次提取1h。将提取液在40℃下减压回收溶剂，浓缩为水溶液；然后用NKA-12吸附树脂进行分离，洗脱液为乙醇和0.1mol/L NaH₂PO₄梯度洗脱，分别收集洗脱流份，采用薄层色谱法检测，收集、合并与丙二酰基人参皂苷阳性对照品Rf 值相同的流份溶液，减压回收溶剂，浓缩液使用葡聚糖凝胶除盐，冷冻干燥得到丙二酰基人参皂苷粉末。

实施例7

取方案1、方案2或方案5制备的丙二酰基总皂苷1kg，加入赋形剂药用环糊精10kg，干燥淀粉适量，羧甲基纤维素适量，滑石粉适量，蔗糖适量。蔗糖与滑石粉用于包糖衣，混匀，制粒压片，制得片剂重0.50g，每片含丙二酰基总皂苷100mg。

实施例8

取方案3、方案4或方案6制备的丙二酰基总皂苷1kg，加入玉米淀粉20kg，环糊精适量，混匀，装入胶囊，每片含丙二酰基总皂苷100mg。

为了进一步说明本发明方法中丙二酰基人参皂苷的提取纯化工艺及其治疗糖尿病肾病的药物用途，下列实验进一步证明了本发明药物的制备工艺和药理作用：

试验例1

1 实验材料和试剂

鲜人参（Panax ginseng C.A.Meyer）五年生的根，购买于抚松万良市场；纤维素酶购于上海伯奥生物技术有限公司；STZ为Sigma产品，血糖检测试剂盒购于北京利德曼生化技术有限公司；微量尿白蛋白酶免检测试剂盒购于南京信帆生物科技有限公司。人参皂苷Rb₁、Rb₂、Rc、Rd、Re和Rg₁购买于中国食品药品检定研究院；丙二酰基人参皂苷-Rb₁、-Rb₂、-Rc和-Rd为自制经HPLC、NMR、MS等标定纯度为99%。色谱级乙腈（美国Fisher公司），其他试剂为分析纯。

2 实验动物

健康SD大鼠100只，雄性，体重200-220g，由吉林大学实验动物中心提供。

实验方法

2.1纤维素酶对人参样品的处理

鲜人参根切碎后，精密称取5g样品若干份，置于250ml三角瓶中，分别考察温度（20℃，30℃，40℃，50℃，60℃）、纤维素酶加酶量（0,1%，5%，10%，20%）、酶解时间（1h，2h，4h，6h，8h）和乙醇浓度（0，20%，40%，60%，80%）对丙二酰基人参皂苷的提取率的影响。

2.2 标准品溶液的配置

精密称取各单体人参皂苷标准品各适量，置于同一容量瓶内，加80%乙醇溶解并定容，配制成各人参皂苷对照品的浓度均为1 mg/ml，摇匀，得混合标准品储备液。精密吸取0.2 ml储备液溶液置于1ml容量瓶中，用80%乙醇水溶液稀释至刻度，得混合对照品溶液，4℃存储，备用。

2.3 待测供试样品的制备

鲜人参样品经纤维素酶酶解处理后超声提取3次，每次提取0.5h，40℃下减压浓缩，然后用80%甲醇定容于25 mL容量瓶中; 摇匀，过0.45 μm滤膜，用于HPLC定量分析。

2.4色谱条件

色谱柱Cosmosil 5 C₁₈-MS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05 mol/l磷酸二氢钾水溶液（B）；洗脱梯度：0-20 min，22%A；20-25 min，22%-29%A；25-45 min，29%A；45-55 min，29%-35%A；55-60 min，35%-50%A；柱温：25 ℃；检测波长：203 nm；流速：1 ml/min；进样量：20μl；分析时间：60 min。

2.5 标准曲线的绘制

精密吸取人参对照品储备液适量，分别稀释至7个不同浓度的混合对照品溶液，精确吸取20 μl，按照上述条件进样分析，记录各个峰的峰面积，以峰面积Y对质量浓度X (mg/ml）进行线性回归，各单体皂苷在0.010 mg/ml-0.640 mg/ml范围内线性关系良好，得回归方程、线性范围和相关系数。

2.6丙二酰基人参皂苷的纯化

纤维素酶处理的人参样品经超声法提取后，40℃下减压浓缩，浓缩液上NKA-12吸附树脂进行分离，考察不同溶剂系统（乙醇-水、乙醇-磷酸二氢钾水溶液）对丙二酰基皂苷的分离纯化。

2.7 丙二酰基人参皂苷对2型糖尿病肾病大鼠的影响

SD大鼠，雄性，适应性平衡饲养5d后，用于实验。实验大鼠禁食12h后，用10％水合氯醛腹腔麻醉下行左侧肾脏结扎术，结扎方法为：沿肾缔同时结扎肾脏动静脉及输尿管。术后2周，大鼠禁食不禁水24h，一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）50mg/kg（用0.1 mol/L，pH4.4 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制成0.1mol/L），注射药物后大鼠自由摄食水。以造模72h非空腹尾静脉血糖水平≥13.8mmol/L 作为糖尿病肾病大鼠模型成功的选择标准。成模DN大鼠随机分成4组，空白对照组、模型组、丙二酰基人参皂苷高低剂量组（实施例1 制备纯化的干粉，50，100mg/kg/d）；每组12 只，各组均为灌胃给药。实验中观察各组大鼠的体重、进食水量、尿量、毛发等，连续给药8周后，大鼠置于代谢笼内接12h尿量,大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉, 腹主动脉取血, 并取左肾去除包膜, 称重以计算脏器系数(肾重/体重)。

结果与讨论

4.1单因素试验考察纤维素酶对丙二酰基人参皂苷提取率的影响

4.1.1酶解温度对丙二酰基人参皂苷提取率的影响

精密称取15份鲜人参根样品，每份5g，分别置于250ml三角瓶中，加入25ml的蒸馏水后，加入样品质量5%的纤维素酶，分别在20℃，30℃，40℃，50℃和60℃下，酶解1h；酶解处理后，加入适量的乙醇和蒸馏水，使乙醇的浓度达到80%，超声提取3次，每次提取0.5h。提取后样品定容于25 mL容量瓶中，用于HPLC定量分析。酶解温度对丙二酰基人参皂苷提取率的影响见图1。由图1 可知，40℃时，丙二酰基人参皂苷的提取效果最佳，随着介质温度升高，丙二酰基人参皂苷提取率反而呈下降趋势。

4.1.2加酶量对丙二酰基人参皂苷提取率的影响

称取5g鲜人参根样品15份，置于250ml三角瓶中，加入25ml的蒸馏水后，分别加入样品质量为0,1%，5%，10%，20%的纤维素酶，在40℃下，酶解1h；酶解处理后，加入适量的乙醇和蒸馏水，使乙醇的浓度达到80%，超声提取3次，每次提取0.5h。提取后的样品用于HPLC定量分析。结果见图2，随着加酶量的增加，提取率呈增加的趋势，但当加酶量达到10%以后，提取率无明显增加，为降低成本选择加酶量为人参样品质量的5%。

4.1.3酶解时间对丙二酰基人参皂苷提取率的影响

称取15份鲜人参根样品，每份5g，置于250ml三角瓶中，加入25ml的蒸馏水后，加入样品质量5%的纤维素酶，在40℃下，分别酶解1h，2h，4h，6h，8h；酶解处理后，加入适量的乙醇和蒸馏水，使乙醇的浓度达到80%，超声提取3次，每次提取0.5h。提取后的样品用于HPLC定量分析。结果展示了丙二酰基人参皂苷随酶解时间的延长，开始一段时间提取率不断增加，当酶解时间在4 h 以后，随提取时间的延长，提取率增幅不明显，因此最佳的酶解时间为4h（图3）。

4.1.4乙醇浓度对丙二酰基人参皂苷提取率的影响

称取15份鲜人参根样品，每份5g，置于250ml三角瓶中，加入25ml的蒸馏水后，加入样品质量5%的纤维素酶，在40℃下，酶解4h；酶解处理后，加入适量的乙醇和蒸馏水，使乙醇的浓度分别达到0，20%，40%，60%，80%，超声提取3次，每次提取0.5h。提取后的样品用于HPLC定量分析。结果展示了高浓度的乙醇有利于中性皂苷的提取，而低浓度的乙醇有利于丙二酰基人参皂苷的提取；因此最佳的提取溶剂为0-20%乙醇（图4）。

4.2不同溶剂系统对丙二酰基皂苷分离纯化的影响

采用NKA-12吸附树脂考察不同溶剂系统（乙醇-水、乙醇-磷酸二氢钾水溶液）对丙二酰基皂苷的分离纯化的影响。结果展示了乙醇-100 mmol/l磷酸二氢钾水溶液梯度洗脱可以将丙二酰基人参皂苷与中性皂苷分离，丙二酰基人参皂苷的纯度可达78.6%，得率为62.4%，而乙醇-水溶剂系统梯度洗脱很难将丙二酰基人参皂苷与中性皂苷分离。

4.3 丙二酰基人参皂苷对糖尿病肾病大鼠的治疗作用

实验结果参见表1，DN模型组大鼠的血糖、尿白蛋白、HbAlC、肌酐、BUN 和肾重/体重等指标与正常对照组相比明显升高，且具有显著性差异（p＜0.01）；与模型组比较，本发明的丙二酰基人参皂苷高低剂量组处理8周后，均能明显降低大鼠空腹血糖(p＜0.01或p＜0.05)，尿白蛋白总排出量也显著性降低(p＜0.01)。另外丙二酰基人参皂苷高剂量组明显的降低了大鼠HbAlC和肌酐的量，对BUN 和肾重/体重也有降低的趋势。这些结果说明了丙二酰基人参皂苷对糖尿病肾病具有较好的预防和治疗作用。

表1 丙二酰基人参皂苷对大鼠糖尿病肾病的改善作用(±s)

与正常对照组比^##p＜0.01,^#p＜0.05 ; 与模型对照组比**p＜0.01,*p＜0.05。

Claims

1.一种丙二酰基人参皂苷的提取纯化方法，包括以下步骤：

（ 1）以鲜人参或西洋参为原料，切碎，加入1-10倍量的蒸馏水；

（ 2）加入样品质量1%-20%的纤维素酶，于20-60℃恒温振荡水浴1-12h；

（ 3）酶解后加入乙醇和水，使乙醇的浓度达到0-80%，超声提取3-5次，每次提取0.5-4h,提取溶剂的用量为10-50倍；

（ 4）将提取液在40℃下减压回收溶剂，浓缩为水溶液；

（ 5）将步骤（ 4）提取物用NKA-12吸附树脂进行分离，洗脱液为乙醇和磷酸缓冲盐溶液梯度洗脱，分别收集洗脱流份，采用薄层色谱法检测，收集、合并与丙二酰基人参皂苷阳性对照品Rf 值相同的流份溶液，减压回收溶剂，浓缩液使用葡聚糖凝胶除盐，冷冻干燥得到丙二酰基人参皂苷粉末。

2.根据权利要求1所述的一种丙二酰基人参皂苷的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述鲜人参或西洋参切碎后，加入3-5倍量的蒸馏水；然后加入样品质量5%的纤维素酶。

3.根据权利要求1所述的一种丙二酰基人参皂苷的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述纤维素酶酶解的温度为40℃，恒温振荡水浴4h。

4.根据权利要求1所述的一种丙二酰基人参皂苷的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述酶解后加入乙醇和水，使乙醇的浓度达到0-20%，溶剂的用量为20-30倍，然后超声提取3次，每次提取1h。

5.根据权利要求1所述的一种丙二酰基人参皂苷的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述的磷酸缓冲盐溶液选自： NaH₂PO₄、 KH₂PO₄、Na₂HPO₄、K₂HPO₄。