CN107338198A - 一种植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物乳杆菌及其应用，命名为植物乳杆菌GRLP‑25，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址武汉大学，保藏日期为2016年4月18日，保藏编号为CCTCC M NO：2016197，植物乳杆菌GRLP‑25可以对水产动物养殖中出现的病原菌具有敏感的抑菌活性，并且能提高水产动物免疫功能，提高动物健康水平，还可以降低养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的含量，改善养殖生态环境，使养殖生产良性发展，提高水产养殖的产率，取得更好的经济效益和生态效益。

Description

一种植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明提供一种植物乳杆菌及其在水产养殖中的应用，获得一种降氨氮亚硝酸盐及抗菌的功能菌，属于水产养殖技术及生态环境保护技术领域。

背景技术

罗氏沼虾养殖业是我国长三角地区村镇经济的重要产业。但目前其饲料蛋白质含量高，养殖模式粗犷，饲料蛋白利用率低，养殖废水具有氮磷含量高的特点。高密度养殖环境下，其养殖废水的污染物包括残饵、粪便和排泄物中所含的营养物质即N、P等。据报道，在喂食过程中10-20%的高蛋白饲料未被鱼虾吸收利用，直接进入养殖水体，同时被摄入体内的80-90%的利用，只有20-25%的营养物用作合成整体自身蛋白质，有60-65%营养物随粪便排出，进入水体。在养殖过程中，有约70-85%的营养物通过直接和间接方式排入水体，排泄物和残饵沉积于水中，在适宜的温度下被迅速分解，使水体中氨氮和亚硝酸盐等含量升高，进而使养殖池水生态环境恶化，容易导致其病害发生的加重，这样也就容易造成水产动物药物使用量的增加，药物残留，食品安全等一系列的问题。同时，养殖废水的无序排放已经成为周边水体富营养化的重要成因，严重影响了村镇居民生活和生产用水质量与安全，并成为制约养殖业健康可持续发展的限制性因素。因此，研制开发提高饲料利用率，降低水体氨氮以及亚硝酸盐的产品是一项迫在眉睫的任务。

要解决集约化养殖中最常见的病害和水质问题，常用的解决方法有注射免疫疫苗、在饲料中添加免疫促进剂和微生态制剂。但是，疫苗因其操作繁琐，发展受到一定的阻碍，免疫促进剂也仅仅局限于动物机体免疫增强，对水体改变的作用很少。

发明内容

本发明提供一种从罗氏沼虾肠道中分离得到的植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌GRLP-25，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址武汉大学，保藏日期为2016年4月18日，保藏编号为CCTCC NO：M2016197。

植物乳杆菌GRLP-25可净化养殖水质，改善和恢复养殖水体的生态环境；能够有效抑制肠道病菌和提高水产动物免疫机能，提高动物的抗病能力，并且能提高水产动物对饲料的消化吸收和促进生长。

获得植物乳杆菌GRLP-25的具体步骤如下：

一、植物乳杆菌的分离及鉴定

1.1 菌株的分离纯化

将罗氏沼虾肠道组织匀浆用无菌生理盐水采用10倍稀释法进行稀释后，取10^-5～10^-8稀释范围的稀释液涂布于MRS固体培养基平板上。30℃恒温培养48h，挑取典型单菌落，反复划线分离至获得纯菌株。

1.2 生理生化鉴定

对菌株菌落形态进行观察，革兰氏染色，显微镜观察。并参照文献提供的方法对菌株进行过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、甲基红试验（MR试验）、吲哚试验、硫化氢试验、糖发酵试验（微量发酵管法）。

1.3 16S rRNA序列分析

应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，按说明书操作。应用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R（TACCTTGTTA

CTT)扩增细菌的16S rDNA基因，扩增体系参照文献进行。扩增程序：95 ℃预变性5 min后进入PCR循环，95 ℃变性30 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环，72 ℃延伸5min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳并进行回收纯化，引物合成和序列测定委托上海英骏生物工程技术有限公司完成。将序列提交GenBank数据库，利用BLASTN 搜索同源序列，下载同源序列，应用软件Meg 4．0进行系统发育分析，BioEdit软件分析同一性，鉴定菌株。

2结果与分析

2.1 菌株分离

应用MRS培养基从罗氏沼虾肠道中分离到一株乳酸菌，菌落成乳白色半透明凸起，边缘整齐光滑；革兰氏染色镜检呈革兰氏阳性，杆状，有酸味，将其编号为GRLP-25。

2.2 生理生化特征

菌株GRLP-25的生理生化鉴定结果见表1，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版），初步鉴定其为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

表1 菌株GRLP-25和标准菌株的生理生化特性

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应，（+）表示迟钝反应。

2.3 16S rRNA基因的PCR 扩增结果与系统发育分析

经PCR扩增得到16S rRNA片段，经测序为1448bp，GenBank登陆号为JQ319663。应用BLASTN 比对，Clustal X 构建Neighbor-Joining 树，结果见附图1。

由附图1可知，菌株GRLP-25的16S rRNA与已知的植物乳杆菌(L.plantarum)聚在一个分支上，相似性为100%。综合形态特征观察、生理生化试验、分子生物学测序结果，从罗氏沼虾肠道中分离得到的菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌GRLP-25（Lactobacillus plantarum GRLP-25）。

分离得到的植物乳杆菌GRLP-25，主要有如下几个方面的应用：

1.对水产动物病原菌的抑菌作用，尤其是抑制罗氏虾养殖过程中罗氏沼虾致病菌；

优选可以抑制水产动物病原菌有罗氏沼虾致病菌阴沟肠杆菌GY52、嗜水气单胞菌SHB1、费氏柠檬酸杆菌GYB8和普通变形杆菌HZL2；

2.提高罗氏沼虾免疫功能；

作为优选，采用植物乳杆菌GRLP-25的发酵液来提高罗氏沼虾的免疫功能，将发酵液添加入饵料制成药饵喂养罗氏沼虾。

3.降低水产养殖水体中氨氮和亚硝酸盐

本发明提供的植物乳杆菌GRLP-25，可以对水产动物养殖中出现的病原菌具有敏感的抑菌活性，并且能提高水产动物免疫功能，提高动物健康水平，还可以降低养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的含量，改善养殖生态环境，使养殖生产良性发展，提高水产养殖的产率，取得更好的经济效益和生态效益。

附图说明

附图1为菌株GRLP-25 基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明作进一步详细说明。

实施例1：

植物乳杆菌GRLP-25对水产动物病原菌的抑菌作用

1. 方法

1.1 无细胞发酵上清液的制备：

将植物乳杆菌GRLP-25活化培养后，以4%接种量接种于MRS液体培养基中，30℃静置培养到稳定期（24h～36h），12000*g，4℃离心15min，收集上清液，上清液用0.22μm滤膜过滤，除去菌体及其他杂质即得无菌发酵上清液。置4℃冰箱保存备用。

1.2对水产病原菌的抑菌活性试验：

本研究以实验室保藏的水产病原菌株嗜水气单胞菌SHB1、BSK-10、罗氏沼虾致病菌阴沟肠杆菌GY52、费氏柠檬酸杆菌GYB8、普通变形杆菌HZL2、副溶血弧菌DHY0708、哈维氏弧菌GYC1108-1、无乳链球菌L4为受试菌株，采用琼脂平板打孔法：在无菌平皿中倒入10ml加热融化的琼脂培养基(适宜受试菌生长)，待其充分冷却凝固后，放入已灭菌的牛津杯数个。取30mlTSA培养基加热融化，待其冷却至50℃左右，接入0.15μl过夜培养的受试菌菌液，迅速混合均匀，倒入平皿。冷却后，无菌镊子取出牛津杯。无菌操作下吸取200μl待测上清样品加入牛津杯孔中，30℃培养24h，测定抑菌圈直径（mm）。

2. 结果

如表2所示，植物乳杆菌所产细菌素对罗氏沼虾致病菌阴沟肠杆菌GY52、费氏柠檬酸杆菌GYB8H、普通变形杆菌HZL2、嗜水气单孢菌SHB1以及水产病原菌气单胞菌BSK-10都具有敏感的抑菌活性，对副溶血弧菌和哈维氏弧菌也具有较强的抑菌活性，对无乳链球菌L4的抑菌活性较弱。

表2 植物乳杆菌GRLP-25所产细菌素的抗菌谱

实施例2：

植物乳杆菌GRLP-25发酵液对罗氏沼虾免疫功能的影响

1.方法

将植物乳杆菌GRLP-25发酵液按1%、2%、4%、8%的质量分数添加入饵料制成药饵分别投喂平均初始重为 (21.05 ±3.18) g的5组三重复的罗氏沼虾，其中一组罗氏沼虾投喂无添加植物乳杆菌饵料作对照，每组10-12尾。实验在容积为80L的 15只循环式水族箱中进行。实验水温为 (25±1) ℃。连续投喂8周，间隔4周和8周后检测罗氏沼虾血液超氧化物歧化酶活性（SOD）、酸性磷酸酶活性（ACP）和碱性磷酸酶活性（AKP），以研究该细菌细胞成分及代谢产物对罗氏沼虾免疫功能的影响。SOD、ACP、AKP酶活性均参照购自南京建成科技有限公司的试剂盒进行测定。

2.结果

饲喂8周后，各植物乳杆菌GRLP-25发酵液添加组对罗氏沼虾血液中SOD、ACP、AKP免疫酶指标影响作用见表3，对数据进行方差分析及p检验方法处理。结果表明：血液SOD酶活力无添加对照组为（44.5±3.4）U/ml，2%和4%剂量组分别为（54.6±3.5）U/ml和（56.6±6.1）U/ml，与对照组相比有显著差异（p＜0.05），8%剂量组为（65.9±3.7）U/ml，差异极为显著（p＜0.01）；ACP酶活力各剂量组与对照组均无显著性差异；AKP酶活力无添加对照组为（2.7±0.5）金氏单位/100ml，1%～4%剂量组分别为（4.1±0.2、4.4±0.3、4.5±0.4）金氏单位/100ml，与对照组相比有显著差异（p＜0.05），8%剂量组为（4.8±0.3）金氏单位/100ml，经T检验，差异极为显著（p＜0.01）。可见，植物乳杆菌GRLP-25对罗氏沼虾的免疫功能具有一定的提高作用。

表3植物乳杆菌GRLP-25对罗氏沼虾血液各免疫酶活性的影响

注：*表示与对照组相比有显著差异（p＜0.05），**表示差异极为显著（p＜0.01）

实施例3：

植物乳杆菌GRLP-25对氨氮和亚硝酸盐的作用

1 材料与方法 1.1 植物乳杆菌 由本实验室分离自罗氏沼虾肠道，并进行静置培养，使用前用平板计数法测定制剂中细菌数量。

1.2 口服植物乳杆菌对水体中氨氮和亚硝酸盐的作用

利用粉碎机将罗氏沼虾饲料粉碎后分别加入0.2×10⁷、2×10⁸、2×10⁹和5×10⁹cfu/g的植物乳杆菌。罗氏沼虾适应性养殖1周后，随机分成5组放置在养殖水槽中，每个水槽放置5只罗氏沼虾，每个水槽放置经曝气的地下水5L，试验设置3个水平重复。每组每天灌胃1次（上午9:0-10:00），每次灌胃不同浓度的含植物乳杆菌的饲料0.1毫升，对照组灌胃0.1毫升的生理盐水，同时每天投喂体重5%投喂2次饲料。连续口灌10天。灌胃时间为每天上午9:00-9:30，并于每天下午16:00采集每个水槽中的水体，并测定水体中氨氮和亚硝酸盐的含量，结果见表4。

1.3数理统计方法

试验数据以均值±标准误(Mean±SE) 表示。用SPSS11.5 软件进行单因子方差分析(One-wayANOVA)，以检验不同实验组间各指标平均值是否存在显著性差异。如有显著差异(P<0.05)，则作Duncan 多重比较分析。

2. 结果

表4水体中亚硝酸盐的含量（mg/L）

由表4可知，各添加浓度组与空白组相比，其亚硝酸盐的含量均有降低，第7天时， 2.5×10⁹ cfu/g浓度组显著降低（P＜0.05），1×10⁹ cfu/g浓度组亚硝酸盐的含量降低了23.5%。第10天时除1×10⁷ cfu/g浓度组外，其余组别与对照组相比均显著降低（P＜0.05）。由此可见，虽然各浓度组的亚硝酸盐的含量一直处于上升阶段，但与对照相比其含量可显著降低，说明口服植物乳杆菌能降低养殖罗氏沼虾水体中亚硝酸盐的含量。

表5水体中氨氮的含量（mg/L）

由表5可知，各添加浓度组与对照组相比的含量变化不大，第7天时， 2.5×10⁹ cfu/g浓度组显著降低（P＜0.05），10⁹ cfu/g浓度组亚硝酸盐的含量降低了42.6%。第10天时，除1×10⁷和1×10⁸ cfu/g浓度组外，其余组别与对照组相比均显著降低（P＜0.05）。同时，由表4可知虽然各浓度组的氨氮的含量一直处于上升阶段，但与对照相比其含量可显著降低，说明口服植物乳杆菌能降低养殖罗氏沼虾水体中氨氮的含量。这可能是饲料中添加植物乳杆菌饲喂罗氏沼虾后，其在肠道定植可能会产生加速饲料分解的酶类而提高了饲料的利用率，也可能是部分植物乳杆菌通过水产动物粪便而排入水体，加速粪便分解，减少粪便对水体的污染，抑或是其本身就具有降解氨氮或亚硝酸盐的功能。因此，本专利中的植物乳杆菌能在一定程度改善水体水质，且通过口服方式不仅减少养殖户的工作强度，节约了成本，而且可以提高饲料的利用率，具有很大的推广应用前景。

Claims (9)

1.一种植物乳杆菌，名称为植物乳杆菌GRLP-25，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年4月18 日，保藏编号为CCTCC NO：M 2016197。

2.根据权利要求1所述一种植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌是从罗氏沼虾肠道中分离得到。

3.如权利要求1所述一种植物乳杆菌的应用，其特征在于，用于水产动物病原菌的抑菌作用。

4.根据权利要求3所述一种植物乳杆菌的应用，其特征在于，用于抑制罗氏沼虾致病菌。

5.根据权利要求3所述一种植物乳杆菌的应用，其特征在于，所述水产动物病原菌有弧菌、嗜水气单孢菌TPS-30和嗜水气单孢菌BSK-10。

6.如权利要求1所述一种植物乳杆菌的应用，其特征在于，用于改善罗氏沼虾的免疫功能。

7.根据权利要求1所述一种植物乳杆菌的应用，其特征在于，采用所述植物乳杆菌的发酵液用于提高罗氏沼虾的免疫功能。

8.如权利要求1所述一种植物乳杆菌的应用，其特征在于，用于降低养殖水产动物水体中亚硝酸盐的含量。

9.如权利要求1所述一种植物乳杆菌的应用，其特征在于，用于降低养殖水产动物水体中氨氮的含量。