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CN107278896A - 一种快速获得脱毒大蒜的方法 - Google Patents

一种快速获得脱毒大蒜的方法 Download PDF

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郭江洪
杨斌
潘少坤
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Abstract

本发明公开了一种快速获得脱毒大蒜的方法，包括以下步骤：(1)茎尖诱导培养；(2)花序轴培养：花序轴培养基为B5+BA 1.5‑2.0mg/L+NAA0.05‑0.15mg/L；(3)诱导试管鳞茎：以MS培养基为基础培养基，还包括以下成分：BA 1mg/L、KT 0‑0.5mg/L和NAA 0.1‑1.5mg/L；(4)用试管鳞茎驯化植株；(5)病毒检测。本发明将热处理茎尖培养和花序轴继代培养结合起来，可加快脱毒株系的繁殖，然后经过诱导试管鳞茎后再种植于田地，其成活率为89％，完全脱去OYDV、LYSV、GCLV和SLV四种病毒的脱毒率为30.3％。

Description

一种快速获得脱毒大蒜的方法
技术领域
本发明属于大蒜脱毒技术领域，具体涉及一种快速获得脱毒大蒜的方法。
背景技术
大蒜气味辛温，含有丰富的蛋白质、脂肪、糖、钙、铁和维生素A、B、C等营养物质，并具有较高的药用价值，有“消炎、理胃、温中、除邪痹毒气”之功效。大蒜头还是常用的调料，在煮瓜、菜、鱼、肉时，放入几瓣，芳香可口。
大蒜是无性繁殖植物，即依靠鳞茎进行繁殖，在繁殖过程中病毒会通过蒜种逐年累积并代代相传，导致品种种性严重退化，蒜头弱小，严重制约了大蒜的大规模生产和持续健康发展。
但目前没有对大蒜茎尖诱导、继代培养、鳞茎培养、驯化植株等方面进行一系列的脱毒研究。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种快速获得脱毒大蒜的方法，能有效去除大蒜携带的病毒，并经过脱毒后的大蒜可直接大规模栽植，成活率高，脱毒效果好。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种快速获得脱毒大蒜的方法，包括以下步骤：
(1)茎尖诱导培养
选取0.1-0.2mm茎尖置于茎尖诱导培养基中，在培养温度为23-26℃，光照强度为1800-2200lx，每天光照10-12h条件下培养30-35天；其中，茎尖诱导培养基以MS或B5培养基为基础培养基，还包括以下成分：BA 1.5-3mg/L、KT0-0.5mg/L和NAA 0.01-0.1mg/L；
(2)花序轴培养
取刚伸出叶鞘的花苞，消毒后切取花序轴接种于花序轴培养基中诱导，培养，培养温度为24-26℃，光照强度为2000-2200lx，每天光照10-12h条件下培养25-30天，得组培苗；花序轴培养基为B5+BA 1.5-2.0mg/L+NAA0.05-0.15mg/L；
(3)诱导试管鳞茎
将继代培养获得的组培苗繁殖系置于鳞茎诱导培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度为1800-2200lx，每天光照10-12h条件下培养65-70天；其中，鳞茎诱导培养基以MS培养基为基础培养基，还包括以下成分：BA 1mg/L、KT0-0.5mg/L和NAA 0.1-1.5mg/L；
(4)用试管鳞茎驯化植株
将试管鳞茎种植于消毒的营养土中，用40目尼龙网罩全覆盖，后期按常规方法管理，获得驯化植株；其中营养土包括以下重量份的组分：草炭3-5份、蛭石1-3份和菜园土4-5份；
(5)病毒检测
收获步骤(4)所得植株叶片，进行脱毒检测。
进一步地，步骤(1)中茎尖通过以下方法制备得到：将蒜头于30℃热处理30天后，剥茎尖，制得。
进一步地，步骤(1)中在培养温度为25℃，光照强度为2000lx，每天光照12h条件下培养30天。
进一步地，步骤(2)中花序轴培养基为B5+BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L。
进一步地，步骤(3)中在培养温度为25℃，光照强度为2000lx，每天光照12h条件下培养65天。
进一步地，步骤(4)中营养土包括以下重量份的组分：草炭4份、蛭石2份和菜园土4份。
本发明提供的快速获得脱毒大蒜的方法，具有以下有益效果：
(1)MS培养基或B5培养基具有维持离体植物细胞基本生命所需要的大部分营养成分，本发明研究大蒜每个生长阶段所需的营养物质及生长过程，尤其是对每个生长阶段所需培养基成分进行研究与验证，筛选出简单有效的培养基成分，其培养基配方简单，用量少，但能有效提高大蒜出芽茎尖数和芽诱导率，增殖倍数，鳞茎诱导率以及种植于土壤后成活率。
(2)本发明从茎尖培养和花序轴继代培养及试管鳞茎诱导相结合，将获得的鳞茎种植于田地中获得驯化植株，每个阶段的生长对病毒的降低都起着关键性作用，经过科学合理的处理，再经多次验证，最终快速获得脱毒大蒜，其脱毒率高，成活率高，并且该大蒜可大规模种植，提供了其经济价值。
具体实施方式
实施例1茎尖诱导培养
以云顶早、二水早、彭县早和温江红七星(简称温江蒜)作为研究对象，将其大蒜头经30℃热处理30天后，剥茎尖，分别选取0.1-0.2mm茎尖置于茎尖诱导培养基中，在培养温度为25℃，光照强度为2000lx，每天光照10-12h条件下培养30-35天。
云顶早茎尖诱导培养基的筛选过程：
(1)云顶早的茎尖诱导培养基以B5+BA 2-3.5mg/L+KT 0.3-0.6mg/L+NAA0.05-0.15mg/L作为筛选基础，其中，BA含量按0.25mg/L的浓度梯度变化，KT按0.1mg/L的浓度梯度变化，NAA按0.025mg/L的浓度梯度变化，进行正交试验，得出多芽诱导率较高的培养基B5+BA 3mg/L+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L，标号为G1，诱导率为50％。
(2)云顶早的茎尖诱导培养基以MS+BA 1.5-3.5mg/L+NAA 0.01-0.15mg/L作为筛选基础，其中，BA含量按0.25mg/L的浓度梯度变化，NAA按0.025mg/L的浓度梯度变化，进行正交试验，得出多芽诱导率较高的培养基MS+BA2.5mg/L+NAA 0.1mg/L，标号为G12，诱导率为57.5％。
二水早茎尖诱导培养基的筛选过程：
二水早的茎尖诱导培养基以B5+BA 2-3.5mg/L+KT 0.3-0.6mg/L+NAA0.01-0.15mg/L作为筛选基础，其中，BA含量按0.25mg/L的浓度梯度变化，KT按0.1mg/L的浓度梯度变化，NAA按0.025mg/L的浓度梯度变化，进行正交试验，得出多芽诱导率较高的培养基B5+BA 3mg/L+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L，标号为G1，诱导率为42.8％和B5+BA 3mg/L+KT0.1mg/L+NAA 0.1mg/L，标号为G8，诱导率为59.4％。
温江红七星茎尖诱导培养基的筛选过程：
温江红七星的茎尖诱导培养基以MS+BA 1.5-3.5mg/L+NAA 0.01-0.15mg/L作为筛选基础，其中，BA含量按0.25mg/L的浓度梯度变化，NAA按0.025mg/L的浓度梯度变化，进行正交试验，得出多芽诱导率较高的培养基MS+BA1.5mg/L+NAA 0.1mg/L，标号为G14，和MS+BA2mg/L+NAA 0.01mg/L，标号为G18，其诱导率分别为46.7％和50％。
彭县早茎尖诱导培养基的筛选过程：
(1)彭县早的茎尖诱导培养基MS+BA 1-3mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L作为筛选基础，其中，BA含量按0.25mg/L的浓度梯度变化，NAA按0.025mg/L的浓度梯度变化，进行正交试验，得出多芽诱导率较高的培养基MS+BA 2mg/L+NAA0.3mg/L，标号为G19，其诱导率分别为56.0％
(2)彭县早的茎尖诱导培养基以MS+KT 1-3mg/L+NAA 0.01-0.5mg/L作为筛选基础，其中，KT含量按0.25mg/L的浓度梯度变化，NAA按0.025mg/L的浓度梯度变化，进行正交试验，得出多芽诱导率较高的培养基MS+KT0.1mg/L+NAA 0.1mg/L，标号为G26，诱导率为42.8％。
采用上述筛选出的培养基诱导茎尖，其结果见表1：
表1茎尖诱导培养基诱导结果
实施例2继代培养
1、茎尖继代培养
将实施例1获得的茎尖培养物进行继代培养获得试管苗，培养过程中若培养基成分及含量不同，茎尖培养物继代可不定向地产生苗、根、愈伤组织，有的仅仅变绿，甚至死亡，因此继代培养基成分及含量非常重要，该培养基以MS或B5培养基为基础培养基，还包括以下成分：BA、KT和NAA，变化BA、KT和NAA的含量，筛选出如下培养基，并计算其增殖倍数，具体见表2。
G2(B5+BA 3.5mg/L+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L)和G21(MS+KT1mg/L+NAA 0.5mg/L)适宜云顶早的继代培养；G8(B5+BA 3mg/L+KT0.1mg/L+NAA 0.1mg/L)和G3(B5+BA 4mg/L+KT0.5mg/L+NAA 0.1mg/L)适宜二水早的继代培养；G18(MS+BA 2mg/L+NAA 0.01mg/L)适宜温江蒜的继代培养；G5(B5+BA 2mg/L+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L)适宜彭县早的继代培养。
表2茎尖继代培养增殖倍数
2、花序轴培养
按照熊正琴等(2000年)的方法，取刚伸出叶鞘的花苞，消毒后切取花序轴接种于花序轴培养基中，培养基成分及含量为B5+BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L，诱导幼苗，调查增殖系数。
在花序轴培养基上培养，其增殖系数幅度为9～34，平均增殖系数分别为27.3、7.8和22.8，一次性平均增殖26，比茎尖培养增殖系数高8.7倍。
由上述可知，茎尖培养继代增殖系数较低，而花序轴培养增殖系数较高，而将热处理茎尖培养和花序轴培养二者结合可加快脱毒株系的繁殖。
实施例3诱导试管鳞茎
将继代培养获得的组培苗繁殖系置于鳞茎诱导培养基中，在培养温度为25℃，光照强度为2000lx，每天光照12h条件下培养65天；其中，鳞茎诱导培养基以MS培养基为基础培养基，还包括以下成分：BA 0.5-1.5mg/L、KT0-0.5mg/L和NAA 0.1-1.5mg/L；其中，BA含量按0.1mg/L的浓度梯度变化，KT按0.05mg/L的浓度梯度变化，NAA按0.1mg/L的浓度梯度变化，进行正交试验，得出有利于4个品种的鳞茎诱导培养基为MS+BA 1mg/L+NAA 1.5mg/L和MS+NAA 0.1mg/L+KT 0.5mg/L，其诱导率分别为76.5％和73.9％。
将上述诱导的二水早、云顶早、彭县早和温江蒜的鳞茎于8-10月种植于消毒的营养土中，用40目尼龙网罩全覆盖，后期按常规方法管理，如长叶时补充2％尿素，提供氮源，长鳞茎时补充2％磷酸二氢钾，提供磷和钾，于次年4-5月收获，获得脱毒原原种鳞茎，其中营养土包括以下重量份的组分：草炭4份、蛭石2份和菜园土4份。
计算其成活率，二水早、云顶早、彭县早和温江蒜的成活率分别为89％、88％、88％和89％。
实施例4病毒检测
选取33个经茎尖培养驯化成活的大蒜苗样品，检测OYDV、LYSV、GCLV和SLV四种病毒，检测出10个样品完全脱去OYDV、LYSV、GCLV和SLV四种病毒，脱毒率为30.3％，与脱毒前，SLV的检出率几乎为100％，OYDV的检出率为41.8％，LYSV的检出率为56.5％，GCLV的检出率很低相比，可说明本发明方法脱毒效果好。
本发明将热处理茎尖培养和花序轴继代培养结合起来，可加快脱毒株系的繁殖，若将获得的继代培养组培苗直接栽植，其成活率较低，约为20％，而经过诱导试管鳞茎后再种植，其成活率为89％。

Claims (6)

1.一种快速获得脱毒大蒜的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)茎尖诱导培养
选取0.1-0.2mm茎尖置于茎尖诱导培养基中，在培养温度为23-26℃，光照强度为1800-2200lx，每天光照10-12h条件下培养30-35天；其中，茎尖诱导培养基以MS或B5培养基为基础培养基，还包括以下成分：BA 1.5-3mg/L、KT 0-0.5mg/L和NAA 0.01-0.1mg/L；
(2)花序轴培养
取刚伸出叶鞘的花苞，消毒后切取花序轴接种于花序轴培养基中培养，培养温度为24-26℃，光照强度为2000-2200lx，每天光照10-12h条件下培养25-30天，得组培苗；所述花序轴培养基为B5+BA 1.5-2.0mg/L+NAA 0.05-0.15mg/L；
(3)诱导试管鳞茎
将继代培养获得的组培苗置于鳞茎诱导培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度为1800-2200lx，每天光照10-12h条件下培养65-70天；其中，鳞茎诱导培养基以MS培养基为基础培养基，还包括以下成分：BA 1mg/L、KT 0-0.5mg/L和NAA 0.1-1.5mg/L；
(4)用试管鳞茎驯化植株
将试管鳞茎种植于消毒的营养土中，用40目尼龙网罩全覆盖，后期按常规方法管理，获得驯化植株；其中营养土包括以下重量份的组分：草炭3-5份、蛭石1-3份和菜园土4-5份；
(5)病毒检测
收获步骤(4)所得植株叶片，进行脱毒检测。
2.根据权利要求1所述的快速获得脱毒大蒜的方法，其特征在于，步骤(1)中茎尖通过以下方法制备得到：将蒜头于30℃热处理30天后，剥茎尖，制得。
3.根据权利要求1所述的快速获得脱毒大蒜的方法，其特征在于，步骤(1)中在培养温度为25℃，光照强度为2000lx，每天光照12h条件下培养30天。
4.根据权利要求1所述的快速获得脱毒大蒜的方法，其特征在于，步骤(2)中花序轴培养基为B5+BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L。
5.根据权利要求1所述的快速获得脱毒大蒜的方法，其特征在于，步骤(3)中在培养温度为25℃，光照强度为2000lx，每天光照12h条件下培养65天。
6.根据权利要求1所述的快速获得脱毒大蒜的方法，其特征在于，步骤(4)中所述营养土包括以下重量份的组分：草炭4份、蛭石2份和菜园土4份。
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