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CN107209181A - 靶分析工具和靶分析方法 - Google Patents

靶分析工具和靶分析方法 Download PDF

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CN107209181A
CN107209181A CN201680006697.0A CN201680006697A CN107209181A CN 107209181 A CN107209181 A CN 107209181A CN 201680006697 A CN201680006697 A CN 201680006697A CN 107209181 A CN107209181 A CN 107209181A
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和贺严
堀井克纪
秋富穰
金子直人
吉田嘉仁
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Japan Electrical Scheme Innovation Corp
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Abstract

本发明提供了允许容易地分析靶的靶分析工具和靶分析方法。本发明的第一靶分析工具包括第一室、第二室和第三室。所述第一室、第二室和第三室依次连续配置。第一室含有固定化的第一结合物质作为第一试剂，其通过将结合到靶的第一结合物质固定化到载体上获得。第二室含有标记的第二结合物质作为第二试剂，其通过将标记物质结合到与第一结合物质结合的第二结合物质来获得。第三室是检测区段，在其中检测标记的第二结合物质。在第一室与第二室之间提供有第一分隔壁。在第二室与第三室之间提供有第二分隔壁。第一室被构造成使得带有样本的持样器能够从第一室的外部插入到第一室的内部。第一分隔壁是在与插入到第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁。第二分隔壁是多孔分隔壁，固定化的第一结合物质不能通过它并且标记的第二结合物质能够通过它。

Description

靶分析工具和靶分析方法
技术领域
本发明涉及靶分析工具和靶分析方法。
背景技术
一般来说，靶分析使用对靶具有结合亲和性的结合物质来进行，所述靶的存在或不存在或所述靶的量，可以通过使所述结合物质与所述靶形成偶联物并直接或间接地检测由此形成的偶联物来分析(专利文献1和2)。
然而，以上述方式使用结合物质进行的分析方法需要将结合到所述靶的结合物质与未结合到所述靶的结合物质分离开的过程。因此，难以在单一分析工具中进行一系列过程并检测所述靶。
引文列表
专利文献
专利文献1：PCT国际申请公开号JP-T-2014-507670的日文译本
专利文献2：PCT国际申请公开号JP-T-2007-518994的日文译本
发明概述
本发明待解决的问题
考虑到上述情况，本发明的目的是提供一种用于容易地分析靶的靶分析工具。
解决问题的手段
本发明提供了第一靶分析工具，其包括第一室、第二室和第三室。所述第一室、第二室和第三室依次连续配置。所述第一室含有固定化的第一结合物质作为第一试剂，其通过将第一结合物质固定化到载体上来获得，所述第一结合物质结合靶。所述第二室含有标记的第二结合物质作为第二试剂，其通过将标记物质结合到第二结合物质来获得，所述第二结合物质结合第一结合物质。所述第三室是检测区段，在其中检测所述标记的第二结合物质。在所述第一室与第二室之间提供有第一分隔壁。在所述第二室与第三室之间提供有第二分隔壁。所述第一室被构造成使得带有样本的持样器可以从所述第一室的外部插入到所述第一室的内部。所述第一分隔壁是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁。所述第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第一结合物质不能通过它并且所述标记的第二结合物质可以通过它。
本发明还提供了使用所述第一靶分析工具的第一靶分析方法。所述第一靶分析方法包括下列步骤：将持留有样本的持样器插入到所述靶分析工具的第一室中；通过使所述样本与所述第一试剂在所述第一室中发生接触，将所述样本中的靶结合到作为所述第一试剂的固定化的第一结合物质；通过使所述第一室中的持样器与所述第一室与第二室之间的第一分隔壁发生接触以破裂所述分隔壁，将所述第一室中的所述样本与第一试剂的混合物引入到所述第二室；通过使所述样本与第一试剂的混合物在所述第二室中与第二试剂发生接触，将所述固定化的第一结合物质结合到作为所述第二试剂的标记的第二结合物质；通过所述第二室与第三室之间的第二分隔壁，将未结合的标记的第二结合物质引入到所述第三室；以及检测所述第三室中所述标记的第二结合物质中的标记物质。
本发明还提供了第二靶分析工具，其包括第一室、第二室和第三室。所述第一室、第二室和第三室依次连续配置。所述第一室含有标记的第一结合物质作为第一试剂，其通过将标记物质结合到第一结合物质来获得，所述第一结合物质结合靶。所述第二室含有固定化的第二结合物质作为第二试剂，其通过将第二结合物质固定化在载体上来获得，所述第二结合物质结合第一结合物质。所述第三室是检测区段，在其中检测所述标记的第一结合物质。在所述第一室与第二室之间提供有第一分隔壁。在所述第二室与第三室之间提供有第二分隔壁。所述第一室被构造成使得带有样本的持样器可以从所述第一室的外部插入到所述第一室的内部。所述第一分隔壁是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁，或者是所述第一室中的内含物可以通过它进入所述第二室的多孔分隔壁。所述第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第二结合物质不能通过它并且所述标记的第一结合物质可以通过它。
本发明还提供了使用所述第二靶分析工具的第二靶分析方法。所述第二靶分析方法包括下列步骤：将持留有样本的持样器插入到所述靶分析工具的第一室中；通过使所述样本在所述第一室中与所述第一试剂发生接触，将所述样本中的靶结合到作为所述第一试剂的标记的第一结合物质以形成第一偶联物；通过使所述样本和第一试剂的混合物在所述第二室中与所述第二试剂接触，将所述混合物中没有结合到所述靶的未结合的标记的第一结合物质结合到作为所述第二试剂的固定化的第二结合物质；通过所述第二室与第三室之间的第二分隔壁，将所述第一偶联物引入到所述第三室；以及检测所述第三室中所述第一偶联物中的标记的第一结合物质。
本发明还提供了第三靶分析工具，其包括第一室、第二室和第三室。所述第一室、第二室和第三室依次连续配置。所述第一室含有标记的第二结合物质作为第一试剂，其通过将标记物质结合到第二结合物质来获得，所述第二结合物质结合第一结合物质，所述第一结合物质结合靶。所述第二室含有固定化的第一结合物质作为第二试剂，其通过将所述第一结合物质固定化在载体上来获得。所述第三室是检测区段，在其中检测所述标记的第二结合物质。在所述第一室与第二室之间提供有第一分隔壁。在所述第二室与第三室之间提供有第二分隔壁。所述第一室被构造成使得带有样本的持样器可以从所述第一室的外部插入到所述第一室的内部。所述第一分隔壁是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁，或者是所述第一室中的内含物可以通过它进入所述第二室的多孔分隔壁。所述第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第一结合物质不能通过它并且所述标记的第二结合物质可以通过它。
本发明还提供了使用所述第三靶分析工具的第三靶分析方法。所述第三分析方法包括下列步骤：将持留有样本的持样器插入到所述靶分析工具的第一室中；通过使所述样本和第一试剂的混合物在所述第二室中与所述第二试剂发生接触，将所述样本中的靶结合到作为所述第二试剂的固定化的第一结合物质，并且也将没有结合到所述靶的未结合的固定化的第一结合物质结合到作为所述第一试剂的标记的第二结合物质；通过所述第二室与第三室之间的第二分隔壁，将所述未结合的标记的第二结合物质引入到所述第三室；以及检测所述第三室中所述标记的第二结合物质中的标记物质。
本发明还提供了第四靶分析工具，其包括第一室、第二室和第三室。所述第一室、第二室和第三室依次连续配置。所述第一室含有固定化的第二结合物质作为第一试剂，其通过将第二结合物质固定化到载体上来获得，所述第二结合物质结合第一结合物质，所述第一结合物质结合靶。所述第二室含有标记的第一结合物质作为第二试剂，其通过将标记物质结合到所述第一结合物质来获得。所述第三室是检测区段，在其中检测所述标记的第一结合物质。在所述第一室与第二室之间提供有第一分隔壁。在所述第二室与第三室之间提供有第二分隔壁。所述第一室被构造成使得带有样本的持样器可以从所述第一室的外部插入到所述第一室的内部。所述第一分隔壁是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁。所述第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第二结合物质不能通过它并且所述标记的第一结合物质可以通过它。
本发明还提供了使用所述第四靶分析工具的第四靶分析方法。所述第四靶分析方法包括下列步骤：通过将持留有样本的持样器插入到所述靶分析工具的第一室中，然后使所述持样器与所述第一室与第二室之间的第一分隔壁发生接触，将所述样本和第一试剂引入到所述第二室；通过使所述样本和第一试剂在所述第二室中与所述第二试剂接触，将所述样本中的靶结合到作为所述第二试剂的标记的第一结合物质以形成第一偶联物，并且也将没有结合到所述靶的未结合的标记的第一结合物质结合到作为所述第二试剂的固定化的第二结合物质；通过所述第二室与第三室之间的第二分隔壁，将所述第一偶联物引入到所述第三室；以及检测所述第三室中所述第一偶联物中的标记的第一结合物质。
本发明的效果
根据本发明的靶分析工具，可以容易地分析样本中的靶。
附图简述
[图1]图1是示出了本发明的第一靶分析工具的实例的示意图。
[图2]图2A至2C示意显示了使用本发明的第一靶分析工具的分析方法的实例。
[图3]图3是示出了本发明的第二靶分析工具的实例的示意图。
[图4]图4A至4C示意显示了使用本发明的第二靶分析工具的分析方法的实例。
[图5]图5是示出了本发明的第二靶分析工具的另一个实例的示意图。
[图6]图6是示出了在本发明的实施例1中测量到的吸光度的图。
[图7]图7是示出了在本发明的实施例1中测量到的吸光度的图。
[图8]图8是示出了在本发明的实施例2中收集到的标记的互补链的比例的图。
[图9]图9是示出了本发明的第二靶分析工具的又一个实例的示意图。
[图10]图10是示出了本发明的第三靶分析工具的实例的示意图。
[图11]图11A至11C示意显示了使用本发明的第三靶分析工具的分析方法的实例。
[图12]图12是示出了本发明的第四靶分析工具的实例的示意图。
[图13]图13A至13C示意显示了使用本发明的第四靶分析工具的分析方法的实例。
[图14]图14是示出了在本发明的实施例3中光发射的量的图。
[图15]图15是示出了在本发明的实施例4中光发射的量的图。
[图16]图16是示出了在本发明的实施例5中光发射的量的图。
[图17]图17是示出了在本发明的实施例6中光发射的量的图。
执行本发明的方式
在本发明的第一和第三靶分析工具中，所述固定化的第一结合物质中的载体可以是例如珠子。
在本发明的第一和第三靶分析工具中，所述标记的第二结合物质中的标记物质可以是选自例如酶、核酸、荧光物质、染料物质、发光物质、放射活性物质和电子供体的至少一种物质。
在本发明的第一和第三靶分析工具中，所述持样器可以包含棒状抓握部分和用于持留样本的持留部分，并且所述持留部分可以例如被提供在所述抓握部分的尖端处。
在本发明的第一和第三靶分析工具中，所述固定化的第一结合物质中的第一结合物质可以是例如适体。
在本发明的第一和第三靶分析工具中，所述标记的第二结合物质中的第二结合物质可以是例如与所述适体互补的核酸分子。
在本发明的第一和第三靶分析工具中，所述标记的第二结合物质中的标记物质可以是例如表现出催化功能的核酸分子。
在本发明的第一和第三靶分析工具中，所述表现出催化功能的核酸分子可以是例如DNA酶和RNA酶中的至少一者。
在本发明的第一和第三靶分析工具中，所述第二室可以含有吸附性载体，其吸附例如蛋白质和脂类中的至少一者。
在本发明的第一和第三靶分析工具中，所述吸附性载体可以是例如二氧化硅珠子。
在本发明的第一和第三靶分析工具中，所述固定化的第一结合物质中的第一结合物质可以是以靶作为抗原的抗体，并且所述标记的第二结合物质中的第二结合物质可以是以所述第一结合物质作为抗原的抗体。
本发明的第一和第三靶分析工具可以被构造成使得它包括外筒和内筒，所述内筒可以被放置在所述外筒内部，所述内筒具有所述第一室和第二室，并且当所述内筒被放置在所述外筒内部时，在所述外筒的底部与所述内筒的底部之间存在空间。
本发明的第一和第三靶分析工具可以被构造成使得例如它还包括预处理室，所述第一室在与所述第二室相反的一侧上与所述预处理室连续配置，其中所述预处理室被构造成使得所述持样器可以从所述预处理室的外部插入到所述预处理室的内部，所述预处理室含有用于从所述样本提取组分的提取剂，在所述预处理室与第一室之间提供有分隔壁，并且所述分隔壁是在与插入到所述预处理室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁。
在本发明的第一和第三靶分析工具中，所述预处理室可以包含盖子，其用于所述预处理室在与所述预处理室与第一室之间的分隔壁相反的一侧上的开口，并且所述盖子可以被构造成例如使得所述持样器可以从所述盖子的外部插入到所述预处理室的内部。
在本发明的第二和第四靶分析工具中，所述标记的第一结合物质中的第一结合物质可以是适体，并且所述固定化的第二结合物质中的第二结合物质可以是例如与所述适体互补的核酸分子。
在本发明的第二和第四靶分析工具中，所述标记的第一结合物质中的标记物质可以是例如选自酶、核酸、荧光物质、染料物质、发光物质、放射活性物质和电子供体的至少一种物质。
在本发明的第二和第四靶分析工具中，所述标记的第一结合物质中的标记物质可以是例如表现出催化功能的核酸分子。
在本发明的第二和第四靶分析工具中，所述表现出催化功能的核酸分子可以是例如DNA酶和RNA酶中的至少一者。
在本发明的第二和第四靶分析工具中，所述固定化的第二结合物质中的载体可以是例如珠子。
在本发明的第二和第四靶分析工具中，所述固定化的第二结合物质中的载体可以是例如所述第二室的内壁。
在本发明的第二和第四靶分析工具中，所述持样器可以包含棒状抓握部分和用于持留样本的持留部分，并且所述持留部分可以被提供在例如所述抓握部分的尖端处。
在本发明的第二和第四靶分析工具中，所述第二室可以含有吸附性载体，其例如吸附蛋白质和脂类中的至少一者。
在本发明的第二和第四靶分析工具中，所述吸附性载体可以是例如二氧化硅珠子。
本发明的第二和第四靶分析工具可以被构造成使得它例如包括外筒和内筒，所述内筒可以被放置在所述外筒内部，所述内筒具有所述第一室和第二室，并且当所述内筒被放置在所述外筒内部时，在所述外筒的底部与所述内筒的底部之间存在空间。
本发明的第二和第四靶分析工具可以被构造成使得例如它还包括预处理室，所述第一室在与所述第二室相反的一侧上与所述预处理室连续配置，其中所述预处理室被构造成使得所述持样器可以从所述预处理室的外部插入到所述预处理室的内部，所述预处理室含有用于从所述样本提取组分的提取剂，在所述预处理室与第一室之间提供有分隔壁，并且所述分隔壁是在与插入到所述预处理室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁。
在本发明的第二和第四靶分析工具中，所述预处理室可以包含盖子，其用于所述预处理室在与所述预处理室与第一室之间的分隔壁相反的一侧上的开口，并且所述盖子可以被构造成例如使得所述持样器可以从所述盖子的外部插入到所述预处理室的内部。
本发明的第二和第三靶分析方法还可以包括下述步骤：通过例如使所述第一室中的持样器与所述第一室和第二室之间的第一分隔壁发生接触以破裂所述分隔壁，将所述第一室中的样本与第一试剂的混合物引入到所述第二室。
本发明的第三靶分析方法还可以包括例如将所述持样器插入到所述第一室中，然后将所述样本与所述第一试剂混合的步骤。
本发明的第四靶分析方法还可以包括例如下述步骤：通过将所述持样器插入到所述第一室中，将所述样本与所述第一试剂混合；以及通过使所述第一室中的持样器与所述第一室和第二室之间的第一分隔壁发生接触以破裂所述分隔壁，将所述第一室中所述样本与第一试剂的混合物引入到所述第二室。
[第一靶分析工具和第一靶分析方法]
下面将具体描述符合本发明的第一靶分析工具和第一靶分析方法。除非另有陈述，否则关于下面将要描述的第二至第四靶分析工具和第二至第四靶分析方法的描述，也适用于所述第一靶分析工具和第一靶分析方法。
如上所述，符合本发明的第一靶分析工具是包括第一室、第二室和第三室的靶分析工具，其中所述第一室、第二室和第三室依次连续配置，所述第一室含有固定化的第一结合物质作为第一试剂，其通过将第一结合物质固定化到载体上来获得，所述第一结合物质结合靶，所述第二室含有标记的第二结合物质作为第二试剂，其通过将标记物质结合到第二结合物质来获得，所述第二结合物质结合第一结合物质，所述第三室是检测区段，在其中检测所述标记的第二结合物质，在所述第一室与第二室之间提供有第一分隔壁，在所述第二室与第三室之间提供有第二分隔壁，所述第一室被构造成使得带有样本的持样器可以从所述第一室的外部插入到所述第一室的内部，所述第一分隔壁是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁，并且所述第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第一结合物质不能通过它并且所述标记的第二结合物质可以通过它。
如上所述，符合本发明的第一靶分析方法是使用符合本发明的第一靶分析工具的靶分析方法，其包括下列步骤：将持留有样本的持样器插入到所述靶分析工具的第一室中；通过使所述样本与所述第一试剂在所述第一室中发生接触，将所述样本中的靶结合到作为所述第一试剂的固定化的第一结合物质；通过使所述第一室中的持样器与所述第一室与第二室之间的第一分隔壁发生接触以破裂所述分隔壁，将所述第一室中的所述样本与第一试剂的混合物引入到所述第二室；通过使所述样本与第一试剂的混合物在所述第二室中与第二试剂发生接触，将所述固定化的第一结合物质结合到作为所述第二试剂的标记的第二结合物质；通过所述第二室与第三室之间的第二分隔壁，将未结合的标记的第二结合物质引入到所述第三室；以及检测所述第三室中所述标记的第二结合物质中的标记物质。
根据本发明，首先，在所述第一室中，样本中的靶结合到作为所述第一试剂的固定化的第一结合物质。然后，所述持样器破裂所述第一室与第二室之间的第一分隔壁，由此允许所述第一室中的所述样本与第一试剂的混合物被引入到所述第二室。在所述第二室中，所述标记的第二结合物质结合到没有与所述靶结合的固定化的第一结合物质。所述第二室与第三室之间的第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第一结合物质不能通过它并且所述标记的第二结合物质可以通过它。因此，所述固定化的第一结合物质不通过所述分隔壁并因此保留在所述第二室中。也就是说，结合到所述固定化的第一结合物质的标记的第二结合物质保留在所述第二室中，没有移动到所述第三室。另一方面，处于游离状态没有结合到所述固定化的第一结合物质的标记的第二结合物质，通过所述分隔壁被引入到所述第三室。本发明的靶分析工具可以含有例如已知量的所述标记的第二结合物质。因此，未结合到所述固定化的第一结合物质的标记的第二结合物质的量，间接地对应于所述样本中靶的量。因此，通过检测引入到所述第三室的未结合的标记的第二结合物质，可以间接地分析所述样本中所述靶的存在或不存在或所述靶的量。
当在本发明中使用时，术语“分析”可以意味着例如确定靶的存在或不存在的定性分析或确定靶的量的定量分析。
在本发明中使用的结合到靶的第一结合物质不限于特定类型的结合物质，只要例如它们结合到所述靶即可。具体来说，所述第一结合物质可以是例如适体或抗体。下面将参考实例描述符合本发明的第一靶分析工具和第一靶分析方法，其中所述第一靶分析工具采取使用适体的第一A形式。
在本发明的第一A形式中，所述固定化的第一结合物质中的第一结合物质是适体。对所述适体没有限制，只要它们可以结合到所述靶即可。所述适体可以是例如DNA适体、RNA适体或含有DNA和RNA的嵌合适体。所述适体可以由天然核酸或非天然核酸构成，或者可以含有天然核酸和非天然核酸。所述适体可以是例如修饰的适体。所述适体可以例如是单链的。
对所述标记的第二结合物质中的第二结合物质没有限制，只要它们可以结合到所述适体即可，并且可以是例如与所述适体互补的核酸分子(在后文中也被称为“互补核酸分子”)。与所述适体互补的核酸分子不限于与所述适体100％互补的核酸分子，并且可以例如具有足以与所述适体或其部分序列杂交的互补性。所述互补性可以是例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。通过使用所述互补核酸分子作为所述第二结合物质，可以例如容易地引起所述第一偶联物与所述标记的第二结合物质之间的反应。因此，可以缩短反应时间，并且也可以获得更高的灵敏度和更宽的动态范围。优选地，所述互补核酸分子不结合到例如所述靶。
所述固定化的第一结合物质中的载体可以是例如珠子。对所述珠子的材料没有特别限制，并且可以是例如聚合物，如琼脂糖、琼脂糖凝胶或纤维素。所述珠子可以是例如磁珠。所述磁珠可以是例如由磁性材料构成的珠子、含有所述磁性材料的珠子或用所述磁性材料包被的珠子。所述磁性材料可以是例如可磁化物质，其具体实例包括γFe2O3和Fe3O4。对所述珠子的形状没有特别限制，并且可以例如是球形的，例如完全球形的。对所述珠子的平均直径没有特别限制，并且可以是例如1至10μm、10至100μm或100至1000μm。所述载体可以使用树脂例如Sepharose或Sephadex来形成。
在所述固定化的第一结合物质中，对被固定化在所述载体上的适体的量没有特别限制，并且可以是例如0.1fmol至100pmol、1fmol至10pmol或10fmol至1pmol每mm2载体表面积。
所述标记的第二结合物质中的标记物质可以是例如表现出催化功能的催化性核酸分子或酶。所述酶可以是例如萤光素酶、过氧化物酶例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶。在所述第一A形式中，所述标记物质优选为例如如上所述的催化性核酸分子，与所述第一结合物质和第二结合物质类似。
对所述催化性核酸分子没有特别限制，并且可以是例如DNA酶或RNA酶。所述标记的第二结合物质中的催化性核酸分子优选地例如表现出催化功能，不论所述靶是否已结合到所述标记的第二结合物质。对所述结合物质与所述催化性核酸分子之间的结合的形式没有特别限制，并且可以是例如磷酸二酯键。所述结合物质和所述催化性核酸分子可以直接或例如通过连接物间接结合在一起。所述连接物可以是例如由DNA和RNA中的至少一者构成的核酸分子。所述催化性核酸分子优选是例如单链的。当所述标记物质是催化性核酸分子时，所述催化性核酸分子可以充当所述标记物质和所述第二结合物质两者。也就是说，如果所述催化性核酸分子与所述第一结合物质互补，则所述催化性核酸分子可用作所述标记的第二结合物质。
对所述样本没有特别限制，并且可以是例如食品来源的样本。食品来源的样本的实例包括食品、食品成分、食品添加剂、食品加工厂、厨房等中的附着物质，以及在清洗食品加工厂、厨房等后获得的液体。对所述样本的形式没有特别限制，并且所述样本可以是例如液体或固体。当所述样本是固体时，所述样本可以采取例如使用溶剂制备的混合溶液、提取液、溶解液等的形式。对所述溶剂没有特别限制，并且可以是例如水、生理盐水或缓冲液。所述样本可以例如含有或者可以不含所述靶，或者所述样本是否含有所述靶可能是未知的。
在本发明的第一A形式中，例如，适体可以用作所述第一结合物质，互补核酸分子可以用作所述第二结合物质，并且催化性核酸分子可以用作标记物质。因此，例如，采取所述第一A形式的靶分析工具是热稳定的，并且可以更容易地储存。也可以例如使用酶例如萤光素酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶作为所述标记物质。因此，可以例如以高灵敏度分析靶。
如上所述，所述第一室与第二室之间的第一分隔壁是在与所述持样器的尖端接触后破裂的分隔壁。所述第一分隔壁是例如所述第一室的底部，并且也可以说所述第一分隔壁是所述第二室的顶部。对所述第一分隔壁的材料、性质等没有特别限制，只要所述第一分隔壁在与所述持样器接触后可以破裂即可。所述第一分隔壁可以例如由薄的金属薄膜(例如铝箔)、纸或合成纤维形成。
如上所述，所述第二室与第三室之间的第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第一结合物质不能通过它并且所述标记的第二结合物质可以通过它。所述第二分隔壁的孔眼尺寸可以例如根据所述固定化的第一结合物质和标记的第二结合物质的尺寸适合地设置。所述第二分隔壁的孔眼尺寸是例如0.2至100μm、0.2至50μm或0.5至10μm。
当催化性核酸分子被用作所述标记物质时，优选地，所述第二室还含有作为第二试剂的吸附蛋白质和脂类中的至少一者。当所述第二室含有所述吸附性载体时，所述吸附性载体在所述第二室中吸附蛋白质和脂类。这例如防止可能影响所述催化性核酸分子的催化功能的蛋白质和脂类被引入到所述第三室，使得所述第三室中的未结合的标记的第二结合物质可以更准确地检测。在所述第一A形式中，作为结合到靶的所述第一结合物质的所述适体和作为结合到所述第一结合物质的第二结合物质的所述互补核酸分子两者都是核酸。因此，通过使用所述吸附性载体将作为核酸之外的组分的蛋白质、脂类等保留在所述第二室中，可以更准确地进行靶分析。
对所述吸附性载体的材料没有特别限制，并且可以是例如二氧化硅、具有多孔结构的交联聚合物和活性炭。对所述吸附性载体的形状没有特别限制，并且所述吸附性载体可以是例如珠子。优选地，所述吸附性载体是例如二氧化硅珠子。对所述吸附性载体的尺寸没有特别限制。优选地，所述吸附性载体的尺寸使得例如所述吸附性载体不能通过所述第二分隔壁(多孔分隔壁)。所述吸附性载体可以具有例如与所述固定化的第一结合物质中的载体相同的尺寸。
当所述标记的第二结合物质中的标记物质是催化性核酸分子或酶时，优选地，所述第三室还含有例如用于所述催化性核酸分子或酶的催化功能的底物。作为所述底物，可以组合地使用ATP和萤光素，或者可以例如使用鲁米诺反应溶液。
下面将参考附图具体描述使用本发明的采取第一A形式的靶分析工具的靶分析方法的实例。然而，应该指出，本发明不限于该说明性实例。
图1示意显示了所述第一A形式的靶分析工具和使用这种靶分析工具的靶分析方法。靶分析工具1包括第一室11、第二室12和第三室13。在所述第一室11中，配置有通过将适体141固定化在珠子142上所获得的固定化的适体14。在所述第二室12中，配置有通过向与适体141互补的互补链151添加DNA酶152而获得的标记的互补链15和二氧化硅珠子16。在第一室11与第二室12之间提供有第一分隔壁111。在第二室12与第三室13之间提供有多孔第二分隔壁121。持样器17包括棒状抓握部分171和样本持留部分172，并且持留部分172被提供在抓握部分171的尖端处。持样器17使用持留部分172收集样本。样本中的靶18和所述靶之外的污染物19例如附着于持留部分172。
接下来，将参考图2A至2C描述使用图1中示出的靶分析工具1的分析方法。图2A至2C示意显示了使用靶分析工具1的方法。
首先，将在持留部分172中持留有样本的持样器17插入到靶分析工具1的第一室11，由此在第一室11中使所述样本中的靶18结合到固定化的适体14中的适体141。对用于结合它们的处理条件没有特别限制，并且可以例如如下：处理温度为4℃至45℃，处理时间为10秒至10分钟。用于结合它们的处理优选地在例如液体溶剂中进行，并且所述液体溶剂可以是例如水性溶剂，如水、缓冲溶液、生理盐水或其混合物。
接下来，持样器17破裂第一分隔壁111，由此将第一室11中的内含物引入到第二室12。然后，使标记的互补链15结合到固定化在珠子142上的适体141中没有结合到靶18的那些适体。对用于结合它们的处理条件没有特别限制，并且可以例如如下：处理温度为4℃至45℃，处理时间为10秒至30分钟。
第二分隔壁121是固定化的适体14不能通过并且标记的互补链15可以通过的多孔分隔壁。因此，在标记的互补链15中，只有未结合到固定化的适体14的那些通过第二分隔壁121被导入到第三室13。在第二室12中配置有二氧化硅珠子16。因此，例如，源自于所述样本的污染物19例如蛋白质和脂类被吸附在二氧化硅珠子16上，由此防止污染物19被引入到第三室13。然后，在第三室13中，通过对未结合的标记的互补链15进行DNA酶152的催化功能的测量，可以间接地分析所述样本中的靶。用于测量DNA酶152的催化功能的方法，可以根据DNA酶152的类型适合地确定。
本发明的第一靶分析工具还可以包括例如预处理室。对于所述预处理室来说，可以参考例如下文中给出的解释。
本发明的第一靶分析工具可以例如包括外筒和内筒。在这种情况下，所述内筒可以被放置在所述外筒内部，所述内筒具有所述第一室和第二室，并且当所述内筒被放置在所述外筒内部时，在所述外筒的底部与所述内筒的底部之间存在空间。当所述第一靶分析工具包括所述外筒和所述内筒时，可以通过在将未结合的标记的互补链从所述内筒中的第二室引入到所述外筒后拆掉所述内筒，将所述外筒用作所述第三室。
[第二靶分析工具和第二靶分析方法]
下面将具体描述符合本发明的第二靶分析工具和第二靶分析方法。除非另有陈述，否则关于第一、第三和第四靶分析工具和第一、第三和第四靶分析方法的描述，也适用于所述第二靶分析工具和第二靶分析方法。
如上所述，符合本发明的第二靶分析工具是包括第一室、第二室和第三室的靶分析工具，其中所述第一室、第二室和第三室依次连续配置，所述第一室含有标记的第一结合物质作为第一试剂，其通过将标记物质结合到第一结合物质来获得，所述第一结合物质结合靶，所述第二室含有固定化的第二结合物质作为第二试剂，其通过将第二结合物质固定化在载体上来获得，所述第二结合物质结合第一结合物质，所述第三室是检测区段，在其中检测所述标记的第一结合物质，在所述第一室与第二室之间提供有第一分隔壁，在所述第二室与第三室之间提供有第二分隔壁，所述第一室被构造成使得带有样本的持样器可以从所述第一室的外部插入到所述第一室的内部，所述第一分隔壁是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁，或者是所述第一室中的内含物可以通过它进入所述第二室的多孔分隔壁，并且所述第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第二结合物质不能通过它并且所述标记的第一结合物质(第一偶联物)可以通过它。
如上所述，符合本发明的第二靶分析方法是使用符合本发明的第二靶分析工具的靶分析方法，所述方法包括下列步骤：将持留有样本的持样器插入到所述靶分析工具的第一室中；通过使所述样本在所述第一室中与所述第一试剂发生接触，将所述样本中的靶结合到作为所述第一试剂的标记的第一结合物质以形成第一偶联物；通过使所述样本和第一试剂的混合物在所述第二室中与所述第二试剂接触，将所述混合物中没有结合到所述靶的未结合的标记的第一结合物质结合到作为所述第二试剂的固定化的第二结合物质；通过所述第二室与第三室之间的第二分隔壁，将所述第一偶联物引入到所述第三室；以及检测所述第三室中所述第一偶联物中的标记的第一结合物质。
根据本发明，首先，在所述第一室中，样本中的靶结合到作为所述第一试剂的标记的第一结合物质。然后，将所述第一室中所述样本与第一试剂的混合物引入到所述第二室。在所述第二室中，所述固定化的第二结合物质结合到所述标记的第一结合物质中未结合到所述靶的那些结合物质。所述第二室与第三室之间的第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第二结合物质不能通过它并且所述标记的第一结合物质可以通过它。因此，所述固定化的第二结合物质不通过所述分隔壁并因此保留在所述第二室中。也就是说，结合到所述固定化的第二结合物质的所述标记的第一结合物质保留在所述第二室中，没有移动到所述第三室。另一方面，处于游离状态没有结合到所述固定化的第二结合物质的标记的第一结合物质，即形成所述第一偶联物的标记的第一结合物质，通过所述分隔壁被引入到所述第三室。本发明的靶分析工具可以含有例如已知量的所述标记的第一结合物质。因此，未结合到所述固定化的第二结合物质的标记的第一结合物质的量，间接地对应于所述样本中靶的量。因此，通过检测引入到所述第三室的未结合的标记的第一结合物质，可以间接地分析所述样本中所述靶的存在或不存在或所述靶的量。
在本发明中，所述第一分隔壁可以例如是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁，或者是所述第一室中的内含物可以通过它进入所述第二室的多孔分隔壁。在前一种情况下，通过例如破裂所述第一分隔壁，所述第一室中的内含物可以移动到所述第二室。在后一种情况下，所述第一室中的内含物可以通过所述多孔分隔壁移动到所述第二室。在前一种情况下，可以使用可以以上述方式破裂的元件。在后一种情况下，可以使用例如具有所述第一室中的内含物可以通过的孔眼的膜。
当在本发明中使用时，术语“分析”可以意味着例如确定靶的存在或不存在的定性分析或确定靶的量的定量分析。
如上所述，在本发明中使用的结合到靶的第一结合物质不限于特定类型的结合物质，只要例如它们结合到所述靶即可。具体来说，所述第一结合物质可以是例如适体或抗体。下面将参考实例描述符合本发明的第二靶分析工具和第二靶分析方法，其中所述第二靶分析工具采取使用适体的第二A形式。
在本发明的第二A形式中，所述标记的第一结合物质中的第一结合物质是适体。所述适体与例如为所述第一A形式所描述的相同。
对所述固定化的第二结合物质中的第二结合物质没有限制，只要它们可以结合到所述适体即可，并且可以是例如与所述适体互补的核酸分子。与所述适体互补的核酸分子与例如为所述第一A形式所描述的相同。
所述标记的第一结合物质中的标记物质优选是例如表现出催化功能的催化性核酸分子或酶。所述催化性核酸分子和酶与例如为所述第一A形式所描述的相同。
所述固定化的第二结合物质中的载体可以是珠子，或者例如所述第二室的内壁可以充当所述固定化的第二结合物质的载体。所述珠子与例如为所述第一A形式所描述的相同。当所述载体是珠子时，对被固定化在所述载体(珠子)上的第二结合物质的量没有特别限制，并且可以是例如0.1fmol至100pmol、1fmol至10pmol或10fmol至1pmol每mm2珠子表面积。当所述第二室的内壁是载体时，对被固定化在所述载体(珠子)上的第二结合物质的量没有特别限制，并且可以是例如0.1fmol至100pmol、1fmol至10pmol或10fmol至1pmol每mm2第二室的内壁面积。
如上所述，在本发明的第二A形式中，适体可以用作所述第一结合物质，互补核酸分子可以用作所述第二结合物质，并且催化性核酸分子可以用作所述标记物质。因此，例如，采取所述第二A形式的靶分析工具是热稳定的，并且可以更容易地储存。也可以例如使用酶例如萤光素酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶作为所述标记物质。因此，可以例如以高灵敏度分析靶。
所述第一室与第二室之间的第一分隔壁和所述第二室与第三室之间的第二分隔壁与为所述第一A形式所描述的相同。
优选地，所述第二室还含有吸附蛋白质和脂类中的至少一者的吸附性载体作为所述第二试剂。所述吸附性载体与例如为所述第一A形式所描述的相同。
优选地，所述第三室还含有例如用于所述催化性核酸分子或酶的催化功能的底物。所述底物的实例包括用于过氧化物酶的底物和用于酶例如萤光素酶和碱性磷酸酶的底物。
下面将参考附图具体描述使用本发明的采取第二A形式的靶分析工具的靶分析方法的实例。然而，应该指出，本发明不限于该说明性实例。除非另有陈述，否则上面关于所述第一A形式的描述也适用于本发明的第二A形式。
图3示意示出了采取所述第二A形式的靶分析工具和使用这种靶分析工具的靶分析方法。在图3中，与图1中相同的部件被提供有相同的附图标记。靶分析工具2包括第一室11、第二室12和第三室13。在第一室11中配置有通过向适体241添加DNA酶242而获得的标记的适体24。在第二室12中，配置有通过将与适体241互补的互补链251固定化在珠子252上而获得的固定化的互补链25和二氧化硅珠子16。在第一室11与第二室12之间提供有第一分隔壁111。在第二室12与第三室13之间提供有多孔第二分隔壁121。
接下来，将参考图4A至4C描述使用图3中示出的靶分析工具2的分析方法。图4A至4C示意显示了使用靶分析工具2的方法。
首先，将在持留部分172中持留有样本的持样器17插入到靶分析工具2的第一室11，由此在第一室11中使所述样本中的靶18结合到标记的适体24中的适体241。对用于结合它们的处理条件没有特别限制，并且可以例如如下：处理温度为4℃至37℃，处理时间为10秒至30分钟。
接下来，持样器17破裂第一分隔壁111，由此将第一室11中的内含物引入到第二室12。然后，使标记的适体24中未结合到靶18的那些适体结合到固定化的互补链25。对用于结合它们的处理条件没有特别限制，并且可以例如如下：处理温度为4℃至37℃，处理时间为10秒至30分钟。
第二分隔壁121是固定化的互补链25不能通过并且标记的适体24可以通过的多孔分隔壁。因此，在标记的适体24中，只有未结合到固定化的互补链25的那些适体通过第二分隔壁121被导入到第三室13。在第二室12中配置有二氧化硅珠子16。因此，例如，源自于所述样本的污染物19例如蛋白质和脂类被吸附在二氧化硅珠子16上，由此防止污染物19被引入到第三室13。然后，在第三室13中，通过对未结合的标记的适体24进行DNA酶242的催化功能的测量，可以间接地分析所述样本中的靶。用于测量DNA酶242的催化功能的方法，可以根据DNA酶242的类型适合地确定。
图5示意显示了采取第二A形式的靶分析工具的另一个实例。除非另有陈述，否则图5与图3相同。在图5中，互补链251被固定化在第二室12的内壁上。由于互补链251被固定化在第二室12的内壁上，结合到固定化在第二室12的内壁上的互补链251的标记的适体24保留在第二室12中，不从第二室12移动到第三室13。
本发明的第二靶分析工具还可以包括例如预处理室。本发明的第二靶分析工具可以被构造成使得所述第一室在与所述第二室相反的一侧上与所述预处理室连续配置。也就是说，优选地，在本发明的第二靶分析工具中，所述预处理室、第一室、第二室和第三室被依次配置。
所述预处理室可以被构造成使得例如所述持样器可以从外部插入到所述预处理室的内部，并且所述预处理室含有用于从所述样本提取组分的提取剂。对所述提取剂没有特别限制，并且可以根据将要进行分析的样本的类型、待分析的组分的类型等适合地选择。
本发明的第二靶分析工具被构造成使得例如在所述预处理室与第一室之间提供有分隔壁，并且所述分隔壁是在与插入到所述预处理室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁。所述被破裂的分隔壁例如与上面所述相同，并且可以是例如铝箔等。
本发明的第二靶分析工具可以被构造成使得例如所述预处理室具有盖子，其用于所述预处理室在与所述第一室的分隔壁相反的一侧上的开口，并且所述持样器可以从所述盖子的外部插入到所述预处理室的内部。所述盖子优选地是在与所述持样器的尖端接触后破裂的分隔壁。所述分隔壁的实例包括上面作为分隔壁的实例给出的那些。
本发明的第二靶分析工具可以例如包括外筒和内筒。例如上面关于所述外筒和内筒的描述，也适用于所述第二靶分析工具中的外筒和内筒。
下面将参考图9，用实例描述本发明的第二靶分析工具和第二靶分析方法，其中所述第二靶分析工具采取还包括所述预处理室的第二B形式。这种第二B形式是所述第二A形式的变化形式。与所述第二A形式中相同，在所述第二B形式中，适体被用作所述第一结合物质，与所述适体互补的核酸分子被用作第二结合物质。除非另有陈述，否则上面关于所述第二A形式的描述也适用于所述第二B形式。
图9示意示出了采取所述第二B形式的靶分析工具。在图9中，与图3和4中的那些相同的部件被提供有相同的附图标记。靶分析工具10包括预处理室91、第一室92、第二室93和第三室94。在所述第一室92中，配置有通过向适体添加DNA酶而获得的标记的适体24。标记的适体24优选地处于干燥状态，因为例如可以更可靠地防止标记的适体24的降解。第二室93装填有通过将所述适体的互补链固定化在珠子(所述珠子可以由例如树脂形成)上而获得的固定化的互补链25。在第三室94中，配置有用于DNA酶的底物95。底物9优选地处于干燥状态。预处理室91具有盖子901，其用于覆盖预处理室91的上方开口。在预处理室91与第一室92之间提供有分隔壁911。在第一室92与第二室93之间提供有多孔的第一分隔壁921。在第二室93与第三室94之间提供有多孔的第二分隔壁931。预处理室91含有引入其中的提取剂96。
接下来，将描述使用图9中示出的靶分析工具10的分析方法。
首先，将持留有样本的持样器17插入到靶分析工具10，使得预处理室91的盖子901和分隔壁911被持样器17的尖端刺穿。这允许预处理室91中的提取剂96被引入到第一室92。然后，在第一室92中，所述样本中的靶18结合到标记的适体24。此时，优选地振摇所述靶分析工具以将靶18与标记的适体24混合。
持样器17中，第一分隔壁921是多孔的，使得第一室92的内含物通过第一分隔壁921的孔眼被引入到第二室93。然后，在标记的适体24中，那些未结合到靶18的适体结合到固定化的互补链25。
所述第二分隔壁931是多孔分隔壁，固定化的互补链25不通过它并且标记的适体24通过它。因此，在标记的适体24中，只有那些未结合到固定化的互补链25的适体通过第二分隔壁931被引入到第三室94。因此，在第三室94中，通过对未结合的标记的适体24进行DNA酶242的催化功能的测量，可以间接地分析所述样本中的靶。所述用于测量DNA酶242的催化功能和配置在第三室94中的底物95的方法，可以根据例如DNA酶242的类型适合地确定。
根据所述第二B形式，可以通过例如仅仅推动持样器17一次并任选地振摇持样器17，容易地进行分析。在这种实施方式中，当例如使用酶代替DNA酶时，可以以相同的方式分析所述靶。
[第三靶分析工具和第三靶分析方法]
下面将具体描述本发明的第三靶分析工具和第三靶分析方法。除非另有陈述，否则关于第一、第二和第四靶分析工具和第一、第二和第四靶分析方法的描述，也适用于所述第三靶分析工具和第三靶分析方法。
如上所述，符合本发明的第三靶分析工具是包括第一室、第二室和第三室的靶分析工具，其中所述第一室、第二室和第三室依次连续配置，所述第一室含有标记的第二结合物质作为第一试剂，其通过将标记物质结合到第二结合物质来获得，所述第二结合物质结合第一结合物质，所述第一结合物质结合靶，所述第二室含有固定化的第一结合物质作为第二试剂，其通过将所述第一结合物质固定化在载体上来获得，所述第三室是检测区段，在其中检测所述标记的第二结合物质，在所述第一室与第二室之间提供有第一分隔壁，在所述第二室与第三室之间提供有第二分隔壁，所述第一室被构造成使得带有样本的持样器可以从所述第一室的外部插入到所述第一室的内部，所述第一分隔壁是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁，或者是所述第一室中的内含物可以通过它进入所述第二室的多孔分隔壁，所述第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第一结合物质不能通过它并且所述标记的第二结合物质可以通过它。
如上所述，符合本发明的第三靶分析方法是使用符合本发明的第三靶分析工具的靶分析方法，所述方法包括下列步骤：将持留有样本的持样器插入到所述靶分析工具的第一室中；通过使所述样本和第一试剂的混合物在所述第二室中与所述第二试剂发生接触，将所述样本中的靶结合到作为所述第二试剂的固定化的第一结合物质，并且也将没有结合到所述靶的未结合的固定化的第一结合物质结合到作为所述第一试剂的标记的第二结合物质；通过所述第二室与第三室之间的第二分隔壁，将所述未结合的标记的第二结合物质引入到所述第三室；以及检测所述第三室中所述标记的第二结合物质中的标记物质。
根据本发明，首先，在所述第一室中，例如，将样本中的靶与作为所述第一试剂的标记的第二结合物质混合。然后，将所述第一室中所述样本与第一试剂的混合物引入到所述第二室。在所述第二室中，所述样本中的靶结合到作为所述第二试剂的固定化的第一结合物质，并且未结合到所述靶的固定化的第一结合物质结合到作为所述第一试剂的标记的第二结合物质。所述第二室与第三室之间的第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第一结合物质不能通过它并且所述标记的第二结合物质可以通过它。因此，所述固定化的第一结合物质不通过所述分隔壁并因此保留在所述第二室中。也就是说，结合到所述固定化的第一结合物质的标记的第二结合物质保留在所述第二室中，不移动到所述第三室。另一方面，处于游离状态没有被结合到所述固定化的第一结合物质的标记的第二结合物质，通过所述分隔壁被引入到所述第三室。本发明的靶分析工具可以含有例如已知量的所述标记的第二结合物质。因此，未结合到所述固定化的第一结合物质的标记的第二结合物质的量，间接地对应于所述样本中靶的量。因此，通过检测引入到所述第三室的未结合的标记的第二结合物质，可以间接地分析所述样本中所述靶的存在或不存在或所述靶的量。
在本发明中，所述第一分隔壁可以例如是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁，或者是所述第一室中的内含物可以通过它进入所述第二室的多孔分隔壁。在前一种情况下，通过例如破裂所述第一分隔壁，所述第一室中的内含物可以移动到所述第二室。在后一种情况下，所述第一室中的内含物可以通过所述多孔分隔壁移动到所述第二室。在前一种情况下，可以使用可以以上述方式破裂的元件。在后一种情况下，可以使用例如具有所述第一室中的内含物可以通过的孔眼的膜。
当在本发明中使用时，术语“分析”可以意味着例如确定靶的存在或不存在的定性分析或确定靶的量的定量分析。
如上所述，在本发明中使用的结合到靶的第一结合物质不限于特定类型的结合物质，只要例如它们结合到所述靶即可。具体来说，所述第一结合物质可以是例如适体或抗体。下面将参考实例描述符合本发明的第三靶分析工具和第三靶分析方法，其中所述第三靶分析工具采取使用适体的第三A形式。
在本发明的第三A形式中，所述固定化的第一结合物质中的第一结合物质是适体。所述适体与例如为所述第一A形式所描述的相同。
对所述标记的第二结合物质中的第二结合物质没有限制，只要它们可以结合到所述适体即可，并且可以是例如与所述适体互补的核酸分子。与所述适体互补的核酸分子与例如为所述第一A形式所描述的相同。
所述标记的第二结合物质中的标记物质优选为例如表现出催化功能的催化性核酸分子或酶。所述催化性核酸分子和酶与例如为所述第一A形式所描述的相同。
所述固定化的第一结合物质中的载体可以是珠子，或者例如所述第二室的内壁可以充当所述固定化的第二结合物质的载体。所述珠子与例如为所述第一A形式所描述的相同。当所述载体是珠子时，对被固定化在所述载体(珠子)上的适体的量没有特别限制，并且可以是例如0.1fmol至100pmol、1fmol至10pmol或10fmol至1pmol每mm2珠子表面积。当所述第二室的内壁是载体时，对被固定化在所述载体(珠子)上的适体的量没有特别限制，并且可以是例如0.1fmol至100pmol、1fmol至10pmol或10fmol至1pmol每mm2第二室的内壁面积。
如上所述，在本发明的第三A形式中，例如，适体可以用作所述第一结合物质，互补核酸分子可以用作所述第二结合物质，并且催化性核酸分子可以用作所述标记物质。因此，例如，采取所述第三A形式的靶分析工具是热稳定的，并且可以更容易地储存。也可以例如使用酶例如萤光素酶或碱性磷酸酶作为所述标记物质。因此，可以例如以高灵敏度分析靶。
所述第一室与第二室之间的第一分隔壁和所述第二室与第三室之间的第二分隔壁与为所述第一A形式所描述的相同。
优选地，所述第二室还含有吸附蛋白质和脂类中的至少一者的吸附性载体作为所述第二试剂。所述吸附性载体与例如为所述第一A形式所描述的相同。
优选地，所述第三室还含有例如用于所述催化性核酸分子或酶的催化功能的底物。所述底物的实例包括用于过氧化物酶的底物和用于酶例如萤光素酶和碱性磷酸酶的底物。
下面将参考附图具体描述使用本发明的采取第三A形式的靶分析工具的靶分析方法的实例。然而，应该指出，本发明不限于该说明性实例。除非另有陈述，否则上面关于所述第一A和第二A形式的描述也适用于本发明的第三A形式。
图10示意示出了采取所述第三A形式的靶分析工具和使用它的靶分析方法。在图10中，与图1中相同的部件被提供有相同的附图标记。靶分析工具3包括第一室11、第二室12和第三室13。在第一室11中配置有通过向与适体141互补的互补链151添加DNA酶152而获得的标记的互补链15。在第二室12中，配置有通过将适体141固定化在珠子142上而获得的固定化的适体14和二氧化硅珠子16。在第一室11与第二室12之间提供有第一分隔壁111。在第二室12与第三室13之间提供有多孔第二分隔壁121。
接下来，将参考图11A至11C描述使用图10中示出的靶分析工具3的分析方法。图11A至11C示意显示了使用靶分析工具3的方法。
首先，将在持留部分172中持留有样本的持样器17插入到靶分析工具3的第一室11，由此使所述样本中的靶18与标记的互补链15在第一室11中混合。对用于混合它们的处理条件没有特别限制，并且可以例如如下：处理温度为4℃至37℃，处理时间为10秒至30分钟。
接下来，持样器17破裂第一分隔壁111，由此将第一室11中的内含物引入到第二室12。然后，使所述内含物中的靶18结合到固定化的适体14，并且也使固定化的适体14中未结合到靶18的适体结合到标记的互补链15。对用于结合它们的处理条件没有特别限制，并且可以例如如下：处理温度为4℃至37℃，处理时间为10秒至30分钟。
第二分隔壁121是固定化的适体14不能通过并且标记的互补链15可以通过的多孔分隔壁。因此，在标记的互补链15中，只有未结合到固定化的适体14的那些通过第二分隔壁121被导入到第三室13。在第二室12中配置有二氧化硅珠子16。因此，例如，源自于所述样本的污染物19例如蛋白质和脂类被吸附在二氧化硅珠子16上，由此防止污染物19被引入到第三室13。然后，在第三室13中，通过对标记的互补链15进行DNA酶152的催化功能的测量，可以间接地分析所述样本中的靶。用于测量DNA酶152的催化功能的方法，可以根据DNA酶152的类型适合地确定。
本发明的第三靶分析工具还可以包括例如预处理室。上面关于所述预处理室的描述也适用于例如所述第三靶分析工具中的预处理室。本发明的第三靶分析工具可以包括例如外筒和内筒。上面关于外筒和内筒的描述也适用于例如所述第三靶分析工具中的外筒和内筒。
[第四靶分析工具和第四靶分析方法]
下面将具体描述本发明的第四靶分析工具和第四靶分析方法。除非另有陈述，否则关于第一至第三靶分析工具和第一至第三靶分析方法的描述，也适用于所述第四靶分析工具和第四靶分析方法。
如上所述，符合本发明的第四靶分析工具是包括第一室、第二室和第三室的靶分析工具，其中所述第一室、第二室和第三室依次连续配置，所述第一室含有固定化的第二结合物质作为第一试剂，其通过将第二结合物质固定化到载体上来获得，所述第二结合物质结合第一结合物质，所述第一结合物质结合靶，所述第二室含有标记的第一结合物质作为第二试剂，其通过将标记物质结合到所述第一结合物质来获得，所述第三室是检测区段，在其中检测所述标记的第一结合物质，在所述第一室与第二室之间提供有第一分隔壁，在所述第二室与第三室之间提供有第二分隔壁，所述第一室被构造成使得带有样本的持样器可以从所述第一室的外部插入到所述第一室的内部，所述第一分隔壁是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁，并且所述第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第二结合物质不能通过它并且所述标记的第一结合物质可以通过它。
如上所述，符合本发明的第四靶分析方法是使用符合本发明的第四靶分析工具的靶分析方法，所述方法包括下列步骤：通过将持留有样本的持样器插入到所述靶分析工具的第一室中，然后使所述持样器与所述第一室与第二室之间的第一分隔壁发生接触，将所述样本和第一试剂引入到所述第二室；通过使所述样本和第一试剂在所述第二室中与所述第二试剂接触，将所述样本中的靶结合到作为所述第二试剂的标记的第一结合物质以形成第一偶联物，并且也将没有结合到所述靶的未结合的标记的第一结合物质结合到作为所述第二试剂的固定化的第二结合物质；通过所述第二室与第三室之间的第二分隔壁，将所述第一偶联物引入到所述第三室；以及检测所述第三室中所述第一偶联物中的标记的第一结合物质。
根据本发明，首先，例如，在所述第一室中，将样本中的靶与作为第一试剂的固定化的第二结合物质混合。然后，将所述第一室中所述样本与第一试剂的混合物引入到所述第二室。在所述第二室中，所述样本中的靶结合到作为所述第二试剂的标记的第一结合物质，并将未结合到所述靶的标记的第一结合物质结合到作为所述第一试剂的固定化的第二结合物质。所述第二室与第三室之间的第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第二结合物质不能通过它并且所述标记的第一结合物质可以通过它。因此，所述固定化的第二结合物质不通过所述分隔壁并因此保留在所述第二室中。也就是说，结合到所述固定化的第二结合物质的所述标记的第一结合物质保留在所述第二室中，没有移动到所述第三室。另一方面，处于游离状态没有结合到所述固定化的第二结合物质的标记的第一结合物质，即形成所述第一偶联物的标记的第一结合物质，通过所述分隔壁被引入到所述第三室。本发明的靶分析工具可以含有例如已知量的所述标记的第一结合物质。因此，未结合到所述固定化的第二结合物质的标记的第一结合物质的量，间接地对应于所述样本中靶的量。因此，通过检测引入到所述第三室的未结合的标记的第一结合物质，可以间接地分析所述样本中所述靶的存在或不存在或所述靶的量。
当在本发明中使用时，术语“分析”可以意味着例如确定靶的存在或不存在的定性分析或确定靶的量的定量分析。
如上所述，在本发明中使用的结合到靶的第一结合物质不限于特定类型的结合物质，只要例如它们结合到所述靶即可。具体来说，所述第一结合物质可以是例如适体或抗体。下面将参考实例描述符合本发明的第四靶分析工具和第四靶分析方法，其中所述第四靶分析工具采取使用适体的第四A形式。
在本发明的第四A形式中，所述标记的第一结合物质中的第一结合物质是适体。所述适体与例如为所述第一A形式所描述的相同。
对所述固定化的第二结合物质中的第二结合物质没有限制，只要它们可以结合到所述适体即可，并且可以是例如与所述适体互补的核酸分子。与所述适体互补的核酸分子与例如为所述第一A形式所描述的相同。
所述标记的第一结合物质中的标记物质优选为例如表现出催化功能的催化性核酸分子或酶。所述催化性核酸分子和酶与例如为所述第一A形式所描述的相同。
所述固定化的第二结合物质中的载体可以是珠子。所述珠子与例如为所述第一A形式所描述的相同。当所述载体是珠子时，对被固定化在所述载体(珠子)上的适体的量没有特别限制，并且可以是例如0.1fmol至100pmol、1fmol至10pmol或10fmol至1pmol每mm2珠子表面积。
如上所述，在本发明的第四A形式中，例如，适体可以用作所述第一结合物质，互补核酸分子可以用作所述第二结合物质，并且催化性核酸分子可以用作所述标记物质。因此，例如，采取所述第四A形式的靶分析工具是热稳定的，并且可以更容易地储存。也可以例如使用酶例如萤光素酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶作为所述标记物质。因此，可以例如以高灵敏度分析靶。
所述第一室与第二室之间的第一分隔壁和所述第二室与第三室之间的第二分隔壁与为所述第一A形式所描述的相同。
优选地，所述第二室还含有吸附蛋白质和脂类中的至少一者的吸附性载体作为所述第二试剂。所述吸附性载体与例如为所述第一A形式所描述的相同。
优选地，所述第三室还含有例如用于所述催化性核酸分子或酶的催化功能的底物。所述底物的实例包括用于过氧化物酶的底物和用于酶例如萤光素酶和碱性磷酸酶的底物。
下面将参考附图具体描述使用本发明的采取第四A形式的靶分析工具的靶分析方法的实例。然而，应该指出，本发明不限于该说明性实例。除非另有陈述，否则上面关于所述第一至第三A形式的描述也适用于本发明的第四A形式。
图12示意示出了采取所述第四A形式的靶分析工具和使用它的靶分析方法。在图12中，与图3中相同的部件被提供有相同的附图标记。靶分析工具4包括第一室11、第二室12和第三室13。在第一室11中配置有通过将与适体241互补的互补链251固定化在珠子252上而获得的固定化的互补链25。在第二室12中，配置有通过向适体241添加DNA酶242而获得的标记的适体24和二氧化硅珠子16。在第一室11与第二室12之间提供有第一分隔壁111。在第二室12与第三室13之间提供有多孔第二分隔壁121。在第一室11和第二室12之间提供有第一分隔壁111。在第二室12与第三室13之间提供有多孔第二分隔壁121。
接下来，将参考图13A至13C描述使用图12中示出的靶分析工具4的分析方法。图13A至13C示意显示了使用靶分析工具4的方法。
首先，将在持留部分172中持留有样本的持样器17插入到靶分析工具4的第一室11，由此将所述样本中的靶18与固定化的互补链25在第一室11中混合。对用于混合它们的处理条件没有特别限制，并且可以例如如下：处理温度为4℃至37℃，处理时间为10秒至30分钟。
接下来，持样器17破裂第一分隔壁111，由此将第一室11中的内含物引入到第二室12。然后，使所述内含物中的靶18结合到标记的适体24，并且也使标记的适体24中未结合到靶18的那些适体结合到固定化的互补链25。对用于结合它们的处理条件没有特别限制，并且可以例如如下：处理温度为4℃至37℃，处理时间为10秒至30分钟。
第二分隔壁121是固定化的互补链25不能通过并且标记的适体24可以通过的多孔分隔壁。因此，在标记的适体24中，只有未结合到固定化的互补链25的那些适体通过第二分隔壁121被导入到第三室13。在第二室12中配置有二氧化硅珠子16。因此，例如，源自于所述样本的污染物19例如蛋白质和脂类被吸附在二氧化硅珠子16上，由此防止污染物19被引入到第三室13。然后，在第三室13中，通过对标记的适体24进行DNA酶242的催化功能的测量，可以间接地分析所述样本中的靶。用于测量DNA酶242的催化功能的方法，可以根据DNA酶242的类型适合地确定。
本发明的第四靶分析工具还可以包括例如预处理室。上面关于所述预处理室的描述，也例如适用于所述第四靶分析工具中的预处理室。本发明的第四靶分析工具可以包括例如外筒和内筒。上面关于所述外筒和内筒的描述，也例如适用于所述第四靶分析工具中的外筒和内筒。
实施例
(实施例1)
采取所述第一A形式的靶分析工具被构造成使得例如如图1和2中所述，二氧化硅珠子16被配置在第二室12中。使用这种构造，污染物例如蛋白质被吸附在二氧化硅珠子16上，由此可以防止所述污染物被引入到第三室13。因此，本实施例检查污染的蛋白质是否被二氧化硅珠子16移除。
(1)关于蛋白质移除的检查1
作为缓冲溶液，使用2×缓冲液(80mmol/l HEPES，250mmol/l NaCl，10mmol/lKCl，2mmol/l MgCl2和0.1％Tween 20)。将人α-凝血酶用作所述污染蛋白质。将所述人α-凝血酶以200ppm的浓度添加到50％甘油，以制备凝血酶溶液。以1g/ml的浓度向蒸馏水添加二氧化硅珠子(商品名：二氧化硅，SIGMA)以制备二氧化硅珠子溶液。
将所述凝血酶溶液添加到25μl所述缓冲溶液，使得所述人α-凝血酶的终浓度为100ppm。向其进一步添加5μl的所述二氧化硅珠子溶液，使得在所述混合溶液中，所述人α-凝血酶被吸附到二氧化硅珠子上。然后，将所述混合溶液离心(11,000G，1分钟)，通过除去所述二氧化硅珠子收集液体级分。检测所述液体级分中的人α-凝血酶。人α-凝血酶通过使用分光光度计(商品名：NanoDrop，Thermo SCIENTIFIC，其同样适用于后文)在230至330nm的波长下测量所述液体级分的吸光度来检测。作为对照，向25μl所述缓冲溶液添加25μl所述凝血酶溶液以制备含有100ppm人α-凝血酶的溶液，并测量该溶液的吸光度。
其结果示出在图6中。图6是示出了所述液体级分的吸光度的图。图6显示了对用二氧化硅珠子处理的液体级分获得的结果，以及对100ppm人α-凝血酶溶液获得的结果。正如可以在图6中看到的，100ppm人α-凝血酶溶液在280nm附近显示出吸收。相反，用二氧化硅珠子处理的液体级分在280nm附近没有显示出吸收。这些结果证实，人α-凝血酶被吸附在二氧化硅珠子上并因此被移除。
(2)蛋白质移除的检查2
在上述条目(1)中，发现污染的蛋白质可以被二氧化硅珠子移除。另一方面，存在着将核酸分子例如适体用作结合到靶的第一结合物质，并将与所述适体互补的核酸分子用作结合到所述第一结合物质的第二结合物质的情况。因此，进行本检查以便证实核酸分子不被二氧化硅珠子移除。
作为核酸分子，使用具有下述序列的DNA分子。
DNA分子(SEQ ID NO：1)
5’-AAAAACCAACCACACCAACC-3’
向25μl缓冲溶液添加25μl凝血酶溶液，使得人α-凝血酶的终浓度为100ppm。接下来，向其添加所述DNA分子，使得所述DNA分子的终浓度为25μmol/l。进一步向其添加5μl二氧化硅珠子溶液，使得在所述混合溶液中，人α-凝血酶被吸附到二氧化硅珠子上。然后，将所述混合溶液离心(11,000G，1分钟)，通过除去所述二氧化硅珠子收集液体级分。使用分光光度计在230至330nm的波长下测量所述液体级分的吸光度。作为对照1和2，分别对下述溶液进行吸光度测量：含有100ppm人α-凝血酶和25μmol/l的DNA分子的溶液1，通过向25μl缓冲溶液添加凝血酶溶液和DNA分子来制备；以及通过向50μl缓冲溶液添加DNA分子，使得DNA分子的终浓度为25μmol/l的溶液2。
其结果示出在图7中。图7是示出了液体级分的吸光度的图。图7显示了对用100ppm二氧化硅珠子处理的液体级分获得的结果，以及对对照1和2获得的结果。正如可以在图7中看到的，含有蛋白质(凝血酶)和核酸(DNA分子)的对照1(100ppm凝血酶+25μmol/l DNA)在宽泛的波长区域内显示出最高吸光度。相反，在用二氧化硅珠子处理含有蛋白质和核酸的混合溶液后收集的液体级分中，只有蛋白质被二氧化硅珠子移除。因此，所述液体级分的吸收曲线与只含核酸(25μmol/l DNA)的对照2的吸收曲线重叠，并且所述液体级分在260nm处显示出吸收。这证实了液体级分中的DNA可以被检测。
(实施例2)
采取所述第一A形式的靶分析工具被构造成使得例如如图2中所示，在第二室12中，使固定化的适体14中的适体141结合到与标记的互补链15互补的互补链151，并且在标记的互补链15中，只有未结合到固定化的适体14的那些被引入到所述第三室。因此，本实施例在靶蛋白存在下进行处理，并测量最终收集的互补链的量。
(1)固定化的适体
通过将适体结合到珠子来制备固定化的适体。作为珠子，使用向其添加链亲和素的磁珠(商品名：Dynabeads MyOne链亲和素C1，Invitrogen)。作为适体，使用与凝血酶结合的凝血酶适体(TA-3bio)。所述凝血酶适体由下述序列表示，并在3’末端处添加有生物素和5个胸腺嘧啶碱基。所述固定化的适体通过每2mg磁珠固定化1000pmol的凝血酶适体来制备。
凝血酶适体(SEQ ID NO：2)
5’-GGTTGGTGTGGTTGGTTTTT-3’
(2)互补链
制备与所述凝血酶适体互补的互补链。
互补链(SEQ ID NO：3)
5’-AAAAACCAACCACACCAACC-3’
(3)方法
向缓冲溶液添加所述固定化的适体以制备固定化的适体溶液。向蒸馏水添加所述互补链以制备互补链溶液。以1g/ml的浓度向蒸馏水添加二氧化硅珠子(商品名：二氧化硅，Sigma Chemical Co.)以制备二氧化硅珠子溶液。使用人α-凝血酶作为靶蛋白。向50％甘油添加人α-凝血酶以制备凝血酶溶液。
向25μl缓冲溶液添加100μl所述固定化的适体溶液，使得源自于所述固定化的适体的适体的量为1000pmol。向其添加25μl凝血酶溶液以便获得预定的人α-凝血酶终浓度(0、1、3、10、30和100ppm)。将每种得到的混合溶液在室温(25℃左右)搅拌10分钟，由此使所述固定化的适体结合到作为靶蛋白的人α-凝血酶。向该混合溶液进一步添加100μl互补链溶液(互补链：1000pmol)，以使得到的混合溶液含有与源自于所述固定化的适体的适体相同量的互补链(25μmol/l)。将得到的混合溶液在室温搅拌10分钟，由此使所述互补链结合到固定化的适体中没有与靶蛋白结合的适体。然后，收集50μl该混合溶液作为样品，并与5μl二氧化硅珠子溶液混合。然后，将所述混合溶液离心(11,000G，1分钟)，并通过移除二氧化硅珠子收集液体级分。使用分光光度计在230至330nm的波长下测量所述液体级分的吸光度。作为对照，向蒸馏水添加所述互补链以制备互补链终浓度为25μmol/l的互补链溶液，并测量该互补链溶液的吸光度。
所述收集的液体级分含有未结合到固定化的适体的互补链。因此，可以说所述液体级分的吸光度是未结合的互补链的吸光度(C)。另一方面，可以说互补链终浓度为25μmol/l的互补链溶液的吸光度对应于在与固定化的适体发生接触之前所有互补链的吸光度(I)。因此，通过用液体级分中收集的互补链的吸光度(C)除以在与固定化的适体反应之前所述互补链的吸光度(I)，确定收集到的互补链(C)相对于最初添加的互补链(I)的比例(100×[C/I]，单位：％)。
其结果示出在图8中。图8是示出了人α-凝血酶的浓度与上述比例(％)之间的关系的图。正如可以在图8中看到的，随着作为靶蛋白的凝血酶的浓度提高，收集到的互补链的量保持增加。这证实了可以通过使用适体和与所述适体互补的互补链来检测靶。
(实施例3)
采取第二A形式的靶分析工具被构造成使得例如如图4中所示，使被持样器17持留的样本中的靶18结合到第一室11中标记的适体24中的适体241，并且使标记的适体24中未结合到靶18的那些适体结合到第二室12中的固定化的互补链25。因此，本实施例检查是否可以通过用持样器17的棉拭子收集样本并以上述次序引起反应来测量靶的量。
(1)样本
将可商购的花生(种子)用碾磨机磨碎。将5g由此获得的粉末与20ml SB1T缓冲溶液混合，并将得到的混合溶液在室温(25℃左右，同样适用于下文)下，使用摇床以90至110rpm振摇1分钟。所述SB1T缓冲溶液具有下述组分：40mmol/l HEPES(pH7.4)，125mmol/lNaCl，5mmol/l KCl，1mmol/l MgCl2，和0.005(v/v)％20。
在振摇后将所述混合溶液在室温下以10000g离心30分钟。然后收集上清液，并将所述上清液通过滤膜(孔眼尺寸：0.8μm)过滤，以制备花生提取物。然后，使用蛋白浓度测量试剂盒(蛋白质测定试剂，Bio-Rad)定量所述花生提取物中的蛋白质浓度。
(2)标记的适体
通过将生物素化的适体结合到添加有链亲和素的萤光素酶(StreptavidinLucia，Invivogen)，来制备标记的适体。作为适体，使用与花生过敏原结合的花生适体。所述花生适体由下述序列表示，并在5’末端添加有生物素。所述标记的适体通过每100pmol链亲和素固定化400pmol所述适体来制备。
花生适体(SEQ ID NO：4)
5’-GGATATTGCCTCGCCACAGTTAAGTCAGGTGGTTGGTTATGGTTGGGACTGACTCTCTACAGGGAACGCTCGGATTATC-3’
(3)固定化的互补链
固定化的互补链通过将互补链结合到珠子来制备。作为珠子，使用添加有链亲和素的磁珠(MyOne SA Beads，Invirogen)。作为适体，使用各自由下述序列表示并在5’末端添加有生物素的互补链。所述固定化的互补链通过每mg磁珠固定化500pmol所述互补链来制备。
互补链(SEQ ID NO：5)
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAGAGAGTCAGTCCCAACCA-3’
(4)方法
向缓冲溶液添加所述标记的适体以制备标记的适体溶液。向蒸馏水添加所述固定化的互补链以制备固定化的互补链溶液。
通过将所述花生提取物用SB1T缓冲溶液稀释来制备样品，以便获得预定的花生蛋白浓度(0、1、10、100、1000和7700ppm)。将100μl每种样品施加到铝箔。然后，用棉拭子擦拭所述铝箔。将所述棉拭子与400μl SB1T缓冲溶液进行接触。将得到的混合溶液在室温下温育1分钟，由此提取被所述棉拭子持留的靶。因此，获得提取物。向25μl所述提取物添加25μl标记的适体溶液，使得源自于所述标记的适体的适体的量为1pmol。将得到的混合溶液在室温下搅拌1分钟，由此使所述标记的适体结合到作为靶蛋白的花生过敏原。向该混合溶液进一步添加4μl所述固定化的互补链溶液(互补链：40pmol)，使得所述得到的混合溶液含有与源自于所述标记的适体的适体相同量的互补链(10μmol/l)。将得到的混合溶液在室温下搅拌4分钟，由此使所述固定化的互补链结合到所述标记的适体中未结合到靶蛋白的适体。
接下来，将得到的混合溶液置于磁托架中，以将所述混合溶液分离成磁珠级分和磁珠之外的组分的级分，并收集后一种级分。然后，向30μl所述上清液添加30μl底物溶液(Quanti-Luc(注册商标)，Invivogen)，并用移液器吸取得到的混合溶液。随后，使用读板器(Infinite M1000Pro，TECAN)测量每个样品中光发射的量。
其结果示出在图14中。图14是示出了光发射的量的图。在图14中，水平轴指示通过将所述提取物与标记的适体混合而获得的混合溶液中花生蛋白质的浓度，并且竖直轴指示光发射的量。正如可以在图14中看到的，光发射的量以花生蛋白浓度依赖性方式增加。这证实了可以通过用持样器17的棉拭子收集样本并以上述次序引起反应，来测量靶的量。
(实施例4)
采取第二A形式的靶分析工具被构造成使得例如如图4中所示，使被持样器17持留的样本中的靶18在第一室11中结合到标记的适体24中的适体241，并使标记的适体24中未结合到靶18的那些适体在第二室12中结合到固定化的互补链25。随后，只有标记的适体24与靶18的第一偶联物被引入到所述第三室。因此，本实施例检查了是否可以通过以上述次序引起反应，然后使标记的适体24、固定化的互补链25和靶18的混合物通过第二分隔壁121的滤膜，并检测由此获得的溶液中的所述第一偶联物，来测量靶的量。
首先，以与实施例3中相同的方式制备花生提取物、标记的适体溶液和固定化的互补链溶液，区别在于代替所述磁珠，使用添加有链亲和素的树脂珠子(Pierce(注册商标)Streptavidin Plus UltraLink(注册商标)树脂，PIERCE)。
通过将所述花生提取物用SB1T缓冲溶液稀释来制备样品，以便获得预定的花生蛋白浓度(0、0.002、0.01、0.05、0.25、1.25和6.25ppm)。向25μl所述提取物添加25μl标记的适体溶液，使得源自于所述标记的适体的适体的量为1pmol。将得到的混合物在室温下搅拌1分钟，由此使所述标记的适体结合到作为靶蛋白的花生过敏原。向该混合溶液进一步添加10μl所述固定化的互补链溶液(互补链：40pmol)，使得所述得到的混合溶液含有与源自于所述标记的适体的适体相同量的互补链(4μmol/l)。将得到的混合溶液在室温下搅拌4分钟，由此使所述固定化的互补链结合到所述标记的适体中未结合到靶蛋白的适体。使用过滤板(孔眼尺寸：0.22μm，Millipore Corporation)对得到的混合溶液进行离心过滤。向30μl由此获得的滤液添加30μl底物溶液，并用移液器吸取得到的混合溶液。随后，使用读板器测量每个样品中光发射的量。
其结果示出在图15中。图15是示出了光发射的量的图。在图15中，水平轴指示花生蛋白质的浓度，并且竖直轴指示光发射的量。正如可以在图15中看到的，光发射的量以花生蛋白浓度依赖性方式增加。这证实了可以通过以上述次序引起反应，然后使标记的适体24、固定化的互补链25和靶18的混合物通过第二分隔壁121的滤膜，并检测由此获得的溶液中的所述第一偶联物，来测量靶的量。
(实施例5)
采取所述第四A形式的靶分析工具被构造成使得例如如图13中所述，将被持样器17持留的样本中的靶18在第一室11中与固定化的互补链25混合，并且在第二室12中，使第一室11中的内含物中的靶18结合到标记的适体24，并且使标记的适体24中未结合到靶18的那些适体结合到固定化的互补链25。因此，本实施例检查了是否可以通过以上述次序引起反应来测量靶的量。
首先，以与实施例3中相同的方式制备花生提取物、标记的适体溶液和固定化的互补链溶液。
通过将所述花生提取物用SB1T缓冲溶液稀释来制备样品，以便获得预定的花生蛋白浓度(0、0.002、0.01、0.05、0.25、1.25和6.25)。由此制备了样品。向25μl每个样品添加25μl固定化的互补链溶液，使得源自于所述固定化的互补链的互补链的量为1pmol，并将得到的混合溶液在室温下搅拌1分钟。向该混合溶液进一步添加4μl所述标记的适体溶液(适体：40pmol)，使得所述得到的混合溶液含有与源自于所述固定化的互补链的互补链相同量的适体(10μmol/l)。将得到的混合溶液在室温下搅拌4分钟，由此使所述标记的适体结合到作为靶蛋白的花生过敏原，并且也使所述固定化的互补链结合到所述标记的适体中未结合到靶蛋白的适体。
接下来，将得到的混合溶液置于磁托架中，以将所述混合溶液分离成磁珠级分和磁珠之外的组分的级分，并收集后一种级分。然后，向30μl所述上清液添加30μl底物溶液，并用移液器吸取得到的混合溶液。随后，使用读板器测量每个样品中光发射的量。
其结果示出在图16中。图16是示出了光发射的量的图。在图16中，水平轴指示花生蛋白质的浓度，并且竖直轴指示光发射的量。正如可以在图16中看到的，光发射的量以花生蛋白浓度依赖性方式增加。这证实了可以通过以上述次序引起反应，来测量靶的量。
(实施例6)
采取所述第二A形式的靶分析工具被构造成使得例如如图4中所示，在第一室11中，使被持样器17持留的样本中的靶18结合到标记的适体24中的适体241，并且使标记的适体24中未结合到靶18的那些适体在第二室12中结合到固定化的互补链25。随后，只有标记的适体24与靶18的第一偶联物被引入到所述第三室。因此，本实施例检查了是否可以通过以上述次序引起反应，然后使标记的适体24、固定化的互补链25和靶18的混合物通过第二分隔壁121的滤膜，并检测由此获得的溶液中的第一偶联物，来测量靶的量。
以与实施例3中相同的方式制备花生提取物2并定量其中的蛋白质浓度，区别在于将所述花生粉末与SB1T缓冲溶液混合，然后将得到的混合溶液振摇过夜(约16小时)。此外，标记的适体溶液和固定化的互补链溶液也以与实施例3中相同的方式制备。
通过将所述花生提取物2用SB1T缓冲溶液稀释来制备花生稀释溶液，以便在与所述标记的适体溶液和固定化的互补链溶液混合后获得的反应溶液中获得预定的蛋白质浓度(0、1.25、5、20和80ppm)。接下来，通过向试管添加40μl所述固定化的互补链溶液和160μl所述SB1T缓冲溶液来制备稀释的固定化的互补链溶液。向另一个试管添加250μl所述标记的适体溶液，并进一步添加250μl每种花生稀释溶液。在所述添加后，将试管搅拌。进一步向所述试管添加200μl稀释的固定化的互补链溶液。随后将所述试管搅拌，然后在室温下温育1分钟。
在所述温育后，使用5ml注射器和滤膜(孔眼尺寸：0.45μm)将反应溶液过滤，并将滤液收集在已事先添加有800μl底物溶液的测量容器中。在收集后，将所述测量容器搅拌，并温育30秒至1分钟。然后，使用照度计(Clean-Trace(注册商标)，3M Co.)测量所述测量容器中每个测量样品中的光发射的量。
其结果示出在图17中。图17是示出了光发射的量的图。在图17中，水平轴指示蛋白质的浓度，并且竖直轴指示光发射的量。正如可以在图17中看到的，光发射的量以花生蛋白浓度依赖性方式增加。这证实了可以通过以上述次序引起反应，然后使标记的适体24、固定化的互补链25和靶18的混合物通过第二分隔壁121的滤膜，并检测由此获得的溶液中的第一偶联物，来测量靶的量。
尽管上面已参考说明性实施方式和实施例对本发明进行了描述，但本发明绝不仅限于此。对本领域技术人员来说可能变得显而易见的各种不同改变和修改，可以在本发明的构造和详情中做出，而不背离本发明的范围。
本申请要求2015年1月22日提交的日本专利申请号2015-010514和2015年7月22日提交的日本专利申请号2015-145280的优先权。所述日本专利申请的全部公开内容通过参考并入本文。
工业实用性
根据本发明，可以容易地分析样本中的靶。
附图标记的解释
1、2、3、4、10：靶分析工具
11、92：第一室
12、93：第二室
13、94：第三室
14：固定化的适体
15：标记的互补链
24：标记的适体
25：固定化的互补链
141、241：适体
142、252：珠子
151、251：互补链
152、242：DNA酶
16：二氧化硅珠子
17：持样器
171：抓握部分
172：持留部分
18：靶
19：污染物
91：预处理室
95：底物
96：提取剂
111、921：第一分隔壁
121、931：第二分隔壁
901：盖子
911：分隔壁。
序列表
<110> 日本电气方案创新株式会社
<120> 靶分析工具和靶分析方法
<130> 1010100036
<150> JP 2015-010514
<151> 2015-01-22
<150> JP 2015-145280
<151> 2015-07-22
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide
<400> 1
aaaaaccaac cacaccaacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aptamer
<400> 2
ggttggtgtg gttggttttt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> complementary polynucleotide
<400> 3
aaaaaccaac cacaccaacc 20
<210> 4
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aptamer
<400> 4
ggatattgcc tcgccacagt taagtcaggt ggttggttat ggttgggact gactctctac 60
agggaacgct cggattatc 79
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> complementary polynucleotide
<400> 5
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tagagagtca gtcccaacca 40

Claims (45)

1.一种靶分析工具，其包含：
第一室；
第二室；和
第三室，
其中所述第一室、第二室和第三室依次连续配置，
所述第一室含有固定化的第二结合物质作为第一试剂，其通过将第二结合物质固定化到载体上来获得，所述第二结合物质结合第一结合物质，所述第一结合物质结合靶，
所述第二室含有标记的第一结合物质作为第二试剂，其通过将标记物质结合到所述第一结合物质来获得，
所述第三室是检测区段，在其中检测所述标记的第一结合物质，
在所述第一室与第二室之间提供有第一分隔壁，
在所述第二室与第三室之间提供有第二分隔壁，
所述第一室被构造成使得带有样本的持样器能够从所述第一室的外部插入到所述第一室的内部；
所述第一分隔壁是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁；
所述第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第二结合物质不能通过它并且所述标记的第一结合物质能够通过它。
2.权利要求1的靶分析工具，其中
所述标记的第一结合物质中的第一结合物质是适体，并且所述固定化的第二结合物质中的第二结合物质是与所述适体互补的核酸分子。
3.权利要求1或2的靶分析工具，其中
所述标记的第一结合物质中的标记物质是选自酶、核酸、荧光物质、染料物质、发光物质、放射活性物质和电子供体的至少一种物质。
4.权利要求1至3任一项的靶分析工具，其中
所述固定化的第二结合物质中的载体是珠子。
5.权利要求1至4任一项的靶分析工具，其中
所述持样器包含棒状抓握部分和用于持留样本的持留部分，并且
所述持留部分被提供在所述抓握部分的尖端处。
6.权利要求1至5任一项的靶分析工具，其中
所述靶分析工具包含外筒和内筒，
所述内筒能够被放置在所述外筒内部，
所述内筒具有所述第一室和第二室，并且
当所述内筒被放置在所述外筒内部时，在所述外筒的底部与所述内筒的底部之间存在空间。
7.权利要求1至6任一项的靶分析工具，其还包含预处理室，所述第一室在与所述第二室相反的一侧上与所述预处理室连续配置，其中
所述预处理室被构造成使得所述持样器能够从所述预处理室的外部插入到所述预处理室的内部，
所述预处理室含有用于从所述样本提取组分的提取剂，
在所述预处理室与第一室之间提供有分隔壁，并且
所述分隔壁是在与插入到所述预处理室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁。
8.权利要求7的靶分析工具，其中
所述预处理室包含盖子，其用于所述预处理室在与所述预处理室与第一室之间的分隔壁相反的一侧上的开口，并且
所述盖子被构造成使得所述持样器能够从所述盖子的外部插入到所述预处理室的内部。
9.一种靶分析方法，其使用权利要求1至8任一项的靶分析工具，所述靶分析方法包括下列步骤：
通过将持留有样本的持样器插入到所述靶分析工具的第一室中，然后使所述持样器与所述第一室与第二室之间的第一分隔壁发生接触，将所述样本和第一试剂引入到所述第二室；
通过使所述样本和第一试剂在所述第二室中与所述第二试剂接触，将所述样本中的靶结合到作为所述第二试剂的标记的第一结合物质以形成第一偶联物，并且也将没有结合到所述靶的未结合的标记的第一结合物质结合到作为所述第二试剂的固定化的第二结合物质；
通过所述第二室与第三室之间的第二分隔壁，将所述第一偶联物引入到所述第三室；以及
检测所述第三室中所述第一偶联物中的标记的第一结合物质。
10.权利要求9的靶分析方法，其还包括下列步骤：
通过将所述持样器插入到所述第一室中，将所述样本与第一试剂混合；以及
通过使所述第一室中的持样器与所述第一室与第二室之间的第一分隔壁发生接触以破裂所述分隔壁，将所述第一室中的所述样本与第一试剂的混合物引入到所述第二室。
11.一种靶分析工具，其包含：
第一室；
第二室；和
第三室，
其中所述第一室、第二室和第三室依次连续配置，
所述第一室含有标记的第一结合物质作为第一试剂，其通过将标记物质结合到第一结合物质来获得，所述第一结合物质结合靶，
所述第二室含有固定化的第二结合物质作为第二试剂，其通过将第二结合物质固定化在载体上来获得，所述第二结合物质结合第一结合物质，
所述第三室是检测区段，在其中检测所述标记的第一结合物质，
在所述第一室与第二室之间提供有第一分隔壁，
在所述第二室与第三室之间提供有第二分隔壁，
所述第一室被构造成使得带有样本的持样器能够从所述第一室的外部插入到所述第一室的内部；
所述第一分隔壁是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁，或者是所述第一室中的内含物能够通过它进入所述第二室的多孔分隔壁；
所述第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第二结合物质不能通过它并且所述标记的第一结合物质能够通过它。
12.权利要求11的靶分析工具，其中
所述标记的第一结合物质中的第一结合物质是适体，并且所述固定化的第二结合物质中的第二结合物质是与所述适体互补的核酸分子。
13.权利要求11或12的靶分析工具，其中
所述标记的第一结合物质中的标记物质是选自酶、核酸、荧光物质、染料物质、发光物质、放射活性物质和电子供体的至少一种物质。
14.权利要求11至13任一项的靶分析工具，其中
所述固定化的第二结合物质中的载体是珠子。
15.权利要求11至14任一项的靶分析工具，其中
所述固定化的第二结合物质中的载体是第二室的内壁。
16.权利要求11至15任一项的靶分析工具，其中
所述持样器包含棒状抓握部分和用于持留样本的持留部分，并且
所述持留部分被提供在所述抓握部分的尖端处。
17.权利要求11至16任一项的靶分析工具，其中
所述靶分析工具包含外筒和内筒，
所述内筒能够被放置在所述外筒内部，
所述内筒具有所述第一室和第二室，并且
当所述内筒被放置在所述外筒内部时，在所述外筒的底部与所述内筒的底部之间存在空间。
18.权利要求11至17任一项的靶分析工具，其还包含预处理室，所述预处理室与所述第一室连续配置在与所述第二室相反的一侧上，其中
所述预处理室被构造成使得所述持样器能够从所述预处理室的外部插入到所述预处理室的内部，
所述预处理室含有用于从所述样本提取组分的提取剂，
在所述预处理室与第一室之间提供有分隔壁，并且
所述分隔壁是在与插入到所述预处理室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁。
19.权利要求18的靶分析工具，其中
所述预处理室包含盖子，其用于所述预处理室在与所述预处理室与第一室之间的分隔壁相反的一侧上的开口，并且
所述盖子被构造成使得所述持样器能够从所述盖子的外部插入到所述预处理室的内部。
20.一种靶分析方法，其使用权利要求11至19任一项的靶分析工具，所述靶分析方法包括下列步骤：
将持留有样本的持样器插入到所述靶分析工具的第一室中；
通过使所述样本在所述第一室中与所述第一试剂发生接触，将所述样本中的靶结合到作为所述第一试剂的标记的第一结合物质以形成第一偶联物；
通过使所述样本和第一试剂的混合物在所述第二室中与所述第二试剂接触，将所述混合物中没有结合到所述靶的未结合的标记的第一结合物质结合到作为所述第二试剂的固定化的第二结合物质；
通过所述第二室与第三室之间的第二分隔壁，将所述第一偶联物引入到所述第三室；以及
检测所述第三室中所述第一偶联物中的标记的第一结合物质。
21.权利要求20的靶分析方法，其还包括下列步骤：
通过使所述第一室中的持样器与所述第一室与第二室之间的第一分隔壁发生接触以破裂所述分隔壁，将所述第一室中的所述样本与第一试剂的混合物引入到所述第二室。
22.一种靶分析工具，其包含：
第一室；
第二室；和
第三室，
其中所述第一室、第二室和第三室依次连续配置，
所述第一室含有标记的第二结合物质作为第一试剂，其通过将标记物质结合到第二结合物质来获得，所述第二结合物质结合第一结合物质，所述第一结合物质结合靶，
所述第二室含有固定化的第一结合物质作为第二试剂，其通过将所述第一结合物质固定化在载体上来获得，
所述第三室是检测区段，在其中检测所述标记的第二结合物质，
在所述第一室与第二室之间提供有第一分隔壁，
在所述第二室与第三室之间提供有第二分隔壁，
所述第一室被构造成使得带有样本的持样器能够从所述第一室的外部插入到所述第一室的内部；
所述第一分隔壁是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁，或者是所述第一室中的内含物能够通过它进入所述第二室的多孔分隔壁；并且
所述第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第一结合物质不能通过它并且所述标记的第二结合物质能够通过它。
23.权利要求22的靶分析工具，其中
所述固定化的第一结合物质中的载体是珠子。
24.权利要求22或23的靶分析工具，其中
所述标记的第二结合物质中的标记物质是选自酶、核酸、荧光物质、染料物质、发光物质、放射活性物质和电子供体的至少一种物质。
25.权利要求22至24任一项的靶分析工具，其中
所述持样器包含棒状抓握部分和用于持留样本的持留部分，并且
所述持留部分被提供在所述抓握部分的尖端处。
26.权利要求22至25任一项的靶分析工具，其中
所述固定化的第一结合物质中的第一结合物质是适体。
27.权利要求26的靶分析工具，其中
所述标记的第二结合物质中的第二结合物质是与所述适体互补的核酸分子。
28.权利要求22至25任一项的靶分析工具，其中
所述固定化的第一结合物质中的第一结合物质是以靶作为抗原的抗体，并且所述标记的第二结合物质中的第二结合物质是以所述第一结合物质作为抗原的抗体。
29.权利要求22至28任一项的靶分析工具，其中
所述靶分析工具包含外筒和内筒，
所述内筒能够被放置在所述外筒内部，
所述内筒具有所述第一室和第二室，并且
当所述内筒被放置在所述外筒内部时，在所述外筒的底部与所述内筒的底部之间存在空间。
30.权利要求22至29任一项的靶分析工具，其还包含预处理室，所述第一室在与所述第二室相反的一侧上与所述预处理室连续配置，其中
所述预处理室被构造成使得所述持样器能够从所述预处理室的外部插入到所述预处理室的内部，
所述预处理室含有用于从所述样本提取组分的提取剂，
在所述预处理室与第一室之间提供有分隔壁，并且
所述分隔壁是在与插入到所述预处理室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁。
31.权利要求30的靶分析工具，其中
所述预处理室包含盖子，其用于所述预处理室在与所述预处理室与第一室之间的分隔壁相反的一侧上的开口，并且
所述盖子被构造成使得所述持样器能够从所述盖子的外部插入到所述预处理室的内部。
32.一种靶分析方法，其使用权利要求22至31任一项的靶分析工具，所述靶分析方法包括下列步骤：
将持留有样本的持样器插入到所述靶分析工具的第一室中；
通过使所述样本和第一试剂的混合物在所述第二室中与所述第二试剂发生接触，将所述样本中的靶结合到作为所述第二试剂的固定化的第一结合物质，并且也将没有结合到所述靶的未结合的固定化的第一结合物质结合到作为所述第一试剂的标记的第二结合物质；
通过所述第二室与第三室之间的第二分隔壁，将未结合的标记的第二结合物质引入到所述第三室；以及
检测所述第三室中所述标记的第二结合物质中的标记物质。
33.权利要求32的靶分析方法，其还包括下列步骤：
通过使所述第一室中的持样器与所述第一室与第二室之间的第一分隔壁发生接触以破裂所述分隔壁，将所述第一室中的所述样本与第一试剂的混合物引入到所述第二室。
34.权利要求32或33的靶分析方法，其还包括下列步骤：
将所述持样器插入到所述第一室中，然后将所述样本与所述第一试剂混合。
35.一种靶分析工具，其包含：
第一室；
第二室；和
第三室，
其中所述第一室、第二室和第三室依次连续配置，
所述第一室含有固定化的第一结合物质作为第一试剂，其通过将第一结合物质固定化到载体上来获得，所述第一结合物质结合靶，
所述第二室含有标记的第二结合物质作为第二试剂，其通过将标记物质结合到第二结合物质来获得，所述第二结合物质结合第一结合物质，
所述第三室是检测区段，在其中检测所述标记的第二结合物质，
在所述第一室与第二室之间提供有第一分隔壁，
在所述第二室与第三室之间提供有第二分隔壁，
所述第一室被构造成使得带有样本的持样器能够从所述第一室的外部插入到所述第一室的内部；
所述第一分隔壁是在与插入到所述第一室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁；并且
所述第二分隔壁是多孔分隔壁，所述固定化的第一结合物质不能通过它并且所述标记的第二结合物质能够通过它。
36.权利要求35的靶分析工具，其中
所述固定化的第一结合物质中的载体是珠子。
37.权利要求35或36的靶分析工具，其中
所述标记的第二结合物质中的标记物质是选自酶、核酸、荧光物质、染料物质、发光物质、放射活性物质和电子供体的至少一种物质。
38.权利要求35至37任一项的靶分析工具，其中
所述持样器包含棒状抓握部分和用于持留样本的持留部分，并且
所述持留部分被提供在所述抓握部分的尖端处。
39.权利要求35至38任一项的靶分析工具，其中
所述固定化的第一结合物质中的第一结合物质是适体。
40.权利要求39的靶分析工具，其中
所述标记的第二结合物质中的第二结合物质是与所述适体互补的核酸分子。
41.权利要求35至40任一项的靶分析工具，其中
所述固定化的第一结合物质中的第一结合物质是以靶作为抗原的抗体，并且所述标记的第二结合物质中的第二结合物质是以所述第一结合物质作为抗原的抗体。
42.权利要求35至41任一项的靶分析工具，其中
所述靶分析工具包含外筒和内筒，
所述内筒能够被放置在所述外筒内部，
所述内筒具有所述第一室和第二室，并且
当所述内筒被放置在所述外筒内部时，在所述外筒的底部与所述内筒的底部之间存在空间。
43.权利要求35至42任一项的靶分析工具，其还包含预处理室，所述第一室在与所述第二室相反的一侧上与所述预处理室连续配置，其中
所述预处理室被构造成使得所述持样器能够从所述预处理室的外部插入到所述预处理室的内部，
所述预处理室含有用于从所述样本提取组分的提取剂，
在所述预处理室与第一室之间提供有分隔壁，并且
所述分隔壁是在与插入到所述预处理室中的持样器的尖端接触后破裂的分隔壁。
44.权利要求43的靶分析工具，其中
所述预处理室包含盖子，其用于所述预处理室在与所述预处理室与第一室之间的分隔壁相反的一侧上的开口，并且
所述盖子被构造成使得所述持样器能够从所述盖子的外部插入到所述预处理室的内部。
45.一种靶分析方法，其使用权利要求35至44任一项的靶分析工具，所述靶分析方法包括下列步骤：
将持留有样本的持样器插入到所述靶分析工具的第一室中；
通过使所述样本在所述第一室中与所述第一试剂发生接触，将所述样本中的靶结合到作为所述第一试剂的固定化的第一结合物质；
通过使所述第一室中的持样器与所述第一室与第二室之间的第一分隔壁发生接触以破裂所述分隔壁，将所述第一室中的所述样本与第一试剂的混合物引入到所述第二室；
通过使所述样本与第一试剂的混合物在所述第二室中与所述第二试剂发生接触，将所述固定化的第一结合物质结合到作为所述第二试剂的标记的第二结合物质；
通过所述第二室与第三室之间的第二分隔壁，将未结合的标记的第二结合物质引入到所述第三室；以及
检测所述第三室中所述标记的第二结合物质中的标记物质。
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