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CN107205968A - 修饰的线粒体‑二甲双胍化合物及其合成和使用方法 - Google Patents

修饰的线粒体‑二甲双胍化合物及其合成和使用方法 Download PDF

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CN107205968A CN201580055683.3A CN201580055683A CN107205968A CN 107205968 A CN107205968 A CN 107205968A CN 201580055683 A CN201580055683 A CN 201580055683A CN 107205968 A CN107205968 A CN 107205968A
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Abstract

本发明提供了线粒体‑二甲双胍化合物，其药物组合物，和癌症治疗中使用线粒体‑二甲双胍化合物的方法。

Description

修饰的线粒体-二甲双胍化合物及其合成和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年8月14日提交的美国临时专利申请62/037,143的优先权，该申请通过引用全部纳入本文以用于所有目的。
关于联邦资助研究或开发的声明
不适用。
发明领域
本发明一般涉及线粒体-靶向阳离子型药物，具体涉及线粒体-二甲双胍化合物，和使用线粒体-二甲双胍化合物治疗癌症的方法。
背景技术
二甲双胍，来自山羊豆(Galega officinalis)的双胍，是用于FDA批准治疗糖尿病的药物，其抑制肝糖异生。二甲双胍在生理pH下以亲水性阳离子存在并且靶向线粒体，尽管是相当低效的。二甲双胍已经在临床中使用超过50年并且具有非常好的安全性概况(糖尿病患者每天容许2-3克的剂量)。然而，其抗肿瘤作用机制知之甚少，并且其分子靶标仍不清楚。盛行的观点是二甲双胍的抗肿瘤和抗糖尿病效果是由于其螯合至线粒体中并激活“AMPK/mTOR途径”的能力，该途径参与调控细胞代谢、能量内稳态和细胞生长。
先前改善并增强二甲双胍的功效的尝试已经包括通过接合烷基或芳基增加其疏水性(丁二胍，苯乙双胍)。然而，这些先前的努力导致明显的不良副作用，并且还未成功。
因此，存在对有效抑制肿瘤形成(即，降低癌症症状的严重性或减缓其进展)的化合物的需求，其在较低剂量下有增加的功效同时也减轻对化疗和放疗的耐受性。
发明内容
在一个实施方式中，本发明包括选自下组的修饰的二甲双胍化合物：线粒体(mito)-二甲双胍、线粒体-苯乙双胍、线粒体-PEG-二甲双胍、线粒体-cy-二甲双胍或吡双胍(pyrformin)。
在一个实施方式中，本发明包括以下结构的线粒体-二甲双胍(mito-met)化合物：
n＝1-线粒体-二甲双胍-C2
5-线粒体-二甲双胍-C6
9-线粒体-二甲双胍-C10
11-线粒体-二甲双胍-C12
在替代实施方式中，本发明包括以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体12-二甲双胍。
在替代实施方式中，本发明包括以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体10-二甲双胍。
在替代实施方式中，本发明包括以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体6-二甲双胍。
在替代实施方式中，本发明包括以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体2-二甲双胍。
在替代实施方式中，本发明包括以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体-苯乙2双胍。
在替代实施方式中，本发明包括以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
吡双胍。
在替代实施方式中，本发明包括以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体-苯乙双胍。
在替代实施方式中，本发明包括以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体-PEG2-二甲双胍。
在替代实施方式中，本发明包括以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体-Cy-二甲双胍。
在替代实施方式中，本发明也包括抑制对象中肿瘤形成的方法，包括向该对象给予治疗有效量的包含至少一种上述线粒体-二甲双胍化合物的组合物。
在替代实施方式中，本发明包括包含至少一种上述线粒体-二甲双胍化合物、药学上可接受的运载体或稀释剂、和说明材料的试剂盒。
在替代实施方式中，本发明包括包含至少一种上述线粒体-二甲双胍化合物、药学上可接受的运载体或稀释剂、和说明材料的试剂盒。
根据以下详细说明、权利要求和图片之后，本发明的其他特征将显而易见。
附图说明
图1A-B。线粒体-二甲双胍-C10和二甲双胍(对照)对PDAC增殖的影响。用线粒体-二甲双胍-C10(A)或二甲双胍(mM)(B)处理MiaPaCa2细胞并且使用IncuCyte酶标仪连续监测细胞生长直至各实验结束(第0天-第6天)。细胞汇合(confluence)的变化用作细胞增殖的替代标志物。值是平均±SD(n＝6)。
图2A-B。仅用放射或用二甲双胍(Met)类似物处理的PDAC细胞的集落形成试验。在电离辐射(0-6Gy)前24小时用1mM Met(A)或1μM线粒体-二甲双胍(B)处理MiaPaCa2细胞并且确定克隆源性细胞存活。集落允许在培养基中在连续14天没有处理下形成。值是平均±SD。*，在相同辐射条件下，与对照相比，P≤0.05(n＝3-6独立实验)。
图3。人胰腺癌细胞对二甲双胍的细胞摄入。使用LC-MS/MS对具有不同碳链长度的mito-met类似物和双胍苯乙双胍的细胞摄入进行定量。值是平均±SD，n＝3。
图4。线粒体-二甲双胍-处理的PDAC细胞中的AMPK活化。MiaPaCa2(顶部)和鼠FC1199(底部)细胞中磷酸化(p)和总AMPK的免疫印迹。细胞未刺激(对照)或用1μM线粒体-二甲双胍(MM)、1mM Met、或1μg/ml寡霉素(Oligo)作为阳性对照处理30分钟。数据表示3个生物重复。
图5A-B。测量用二甲双胍和线粒体-二甲双胍(C10)处理24小时后MiaPaCa2细胞中的集落形成的克隆源性试验。结果显示，二甲双胍和线粒体-二甲双胍(C10)确定的IC50值是1.3mM和1.1μM，表明mito-met-C10在抑制MiaPaCa-2细胞增殖上比二甲双胍有效接近1000倍。
图6。测量用二甲双胍和线粒体-二甲双胍C10、C6、C2和苯乙双胍处理24小时后MiaPaCa2细胞中的集落形成的克隆源性试验。
图7。线粒体-二甲双胍-C6和二甲双胍(对照)对PDAC增殖的影响。用线粒体-二甲双胍-C6(μM)或二甲双胍(mM)处理MiaPaCa2细胞并且使用IncuCyte酶标仪连续监测细胞生长直至各实验结束(第0天-第6天)。细胞汇合的变化用作细胞增殖的替代标志物。值是平均±SD(n＝6)。
图8。苯乙双胍-C6和二甲双胍(对照)对PDAC增殖的影响。用苯乙双胍(μM)或二甲双胍(mM)处理MiaPaCa2细胞并且使用IncuCyte酶标仪连续监测细胞生长直至各实验结束(第0天-第6天)。细胞汇合的变化用作细胞增殖的替代标志物。值是平均±SD(n＝6)。
图9。线粒体-二甲双胍-C2和二甲双胍(对照)对PDAC增殖的影响。用线粒体-二甲双胍-C2(μM)或二甲双胍(mM)处理MiaPaCa2细胞并且使用IncuCyte酶标仪连续监测细胞生长直至各实验结束(第0天-第6天)。细胞汇合的变化用作细胞增殖的替代标志物。值是平均±SD(n＝6)。
图10A-D。二甲双胍和线粒体-二甲双胍对PDAC增殖的影响。(A)二甲双胍和类似物的化学结构。(B)Mito-Met10和二甲双胍对PDAC增殖的影响。用Mito-Met10(0-1μM)或二甲双胍(0-2,000mM)处理MiaPaCa2细胞并且使用IncuCyte酶标仪连续监测细胞生长直至各实验结束(第0天-第6天)。细胞汇合的变化用作细胞增殖的替代标志物。Met(左)或Mito-Met10(右)对细胞汇合的剂量响应。刚好在治疗前，年龄匹配的细胞在20％或≤1％氧中三次传代培养。(C)线粒体-二甲双胍和二甲双胍对MiaPaCa-2细胞中集落形成的影响。用Mito-Met10(0.1-10μM)或二甲双胍(1μM-10mM)处理MiaPaCa-2细胞并且对形成的集落进行计数。(D)用Mito-Met10(0.1-10μM)或二甲双胍(1μM-10mM)滴定MiaPaCa-2细胞，并且在上述相同条件下计算的存活分数针对浓度作图。实线表示用于确定细胞存活的IC50值的拟合曲线。(A)中的数据代表6个独立研究。值是平均±SD(n＝6)。
图11A-B。Mito-Met10和二甲双胍对PDAC球状生长的影响。(A)每天用各种浓度的Mito-Met10或Met个新鲜培养基处理MiaPaCa-2细胞3D球体。值是平均±SD(n＝4)。***＝P≤0.001。(B)在第3、7和14天用0.5μM Mito-Met10或10mM二甲双胍处理的MiaPaCa-2的代表性图像。也显示了没有处理的PDAC球体(载剂)。比例尺：100μm。
图12A-D。二甲双胍和Mito-Met10对胰腺癌细胞和正常细胞增殖的影响：人胰腺癌细胞对二甲双胍的细胞摄入。(A)在与图10B相同的条件下Mito-Met10(顶部)和二甲双胍(底部)对增殖的影响。用Mito-Met10或二甲双胍处理MiaPaCa-2、MCF-10A和HaCaT细胞并且使用IncuCyte连续监测细胞生长直至各实验结束。(B)细胞汇合百分比(对照组达到90％汇合时)针对浓度作图。虚线表示用于确定IC50值的拟合曲线。(C)用不同碳链长度的Mito-Met类似物(Mito-Met2、Mito-Met6和Mito-Met10)、二甲双胍或苯乙双胍处理MiaPaCa-2细胞24小时并且对形成的集落进行计数。计算的存活分数针对浓度作图。实线表示用于确定IC50值的拟合曲线。显示的数据表示平均±SD(n＝6)。(D)使用LC-MS/MS对具有不同碳链长度的Mito-Met类似物(Mito-Met2，Mito-Met6，and Mito-Met10)和双胍苯乙双胍的细胞摄入进行定量。数值为均值±SEM；n＝3。
图13A-B。在MiaPaCa-2细胞中处理后即刻和24小时后观察到的Met、Mito-Met和苯乙双胍对线粒体生物能量学的影响。(A)在添加Met、Mito-Met类似物(Mito-Met10、Mito-Met6、Mito-Met2)和苯乙双胍后即刻测量的氧消耗速率(OCR)，和(B)与(A)相同条件下24小时后测量的OCR。
图14A-D。仅用辐射或用二甲双胍(Met)类似物处理的MiaPaCa-2细胞或正常MCF-10A细胞的集落形成试验和线粒体-二甲双胍-处理的PDAC细胞中的AMPK活化。(A)在电离辐射(0-6Gy)前24小时用1,000μM Met(左)或1μM Mito-Met10(中和右)处理细胞并确定克隆源性存活分数。集落允许在培养基中在连续14天没有处理下形成。值是平均±SD。*，与辐射剂量相比，对照相比，P≤0.05(n＝6独立实验)。(B)MiaPaCa-2(顶部)和鼠FC1199(底部)细胞中磷酸化(p)和总AMPK的免疫印迹。细胞未刺激(对照)或用1μM线粒体-二甲双胍(MM)、1mMMet、或1μg/ml寡霉素(Oligo)作为阳性对照处理30分钟。数据表示3个生物重复。(C)肿瘤和正常细胞中Mito-Met10的胞内保留。(D)提出的模型显示Mito-Met10如何通过降低的复合物I活性抑制PDAC增殖。
图15A-G。Mito-Met和二甲双胍抑制丙酮酸盐/酯-驱动的，而非琥珀酸盐/酯-驱动的呼吸，并且Mito-Met10强效抑制体内肿瘤生长和进展。(A)和(B)提供MAS缓冲液中10mM丙酮酸盐/酯和1.5mM苹果酸盐/酯的透化的MiaPaCa-2细胞的代表性实验。快速加入鱼藤酮、丙二酸盐/酯或Mito-Met10、Mito-Met6、Mito-Met2、和二甲双胍并且立即测量OCR。(C)在该试验之前用二甲双胍或Mito-Met10预处理细胞24小时。(D)将线粒体复合物I氧消耗(琥珀酸盐/酯注射前的最后OCR读取)针对浓度作图。虚线表示用于确定IC50值的拟合曲线。琥珀酸盐/酯(10mM)和抗霉素A(20μM)都如所示那样注射。显示的数据为平均±SD，n＝4。(E)全血生物发光成像显示相对于Met(1mg/kg)处理的小鼠，在Mito-Met10(1mg/kg)处理的小鼠中肿瘤生长降低。(F)单个FC1242-luc自体移植物的总生物发光值(辐射发光单位，RLU)。虚线表示单个小鼠。实线是载剂(黑线)、Met10(红线)或Mito-Met(蓝线)处理的动物的二次回归拟合曲线。(G)使用卡钳测量的切下的原发FC1242肿瘤的肿瘤体积。数据是值±SD。
图16A-D。(A)线粒体-二甲双胍-C2的合成。0.1g部分的溴化(2-氨基乙基)三苯基膦(0.26mmol)溶解在CH2Cl2(3mL)中并且混合物冷却至0℃。逐滴加入336μL部分的二乙醚(0.33mmol)中的HCl的1.0M溶液。在室温下90分钟后，真空去除溶剂。加入BuOH(3mL)中的二氰胺钠(0.026g，0.31mmol)。混合物过夜加热回流，之后蒸发溶剂并且通过HPLC纯化残留物以得到线粒体-二甲双胍21(0.030g，25％)。31P NMR，(600.13)：δ21.61.1H NMR，(600.13MHz)：δ7.93-7.73(15H，m)，3.80-3.76(2H，m)，3.38-3.34(2H，m).13C NMR(75.47MHz)λ158.3(s)，158.1(s)，135.1(s)，133.7(s)，133.6(s)，130.3(s)，131.2(s)，117.6(d，J＝85)，35.1(s)，20.6(d，J＝47).HRMS针对C22H25N5P[C22H25N5P]+计算为390.1842，实际为390.1842。(B)线粒体-二甲双胍-C6。0.1g部分的溴化(6-氨基己基)三苯基膦(0.23mmol)溶解在CH2Cl2(3mL)中并且混合物冷却至0℃。逐滴加入453μL部分的二乙醚(0.45mmol)中的HCl的1.0M溶液。在室温下90分钟后，真空去除溶剂。加入BuOH(3mL)中的二氰胺钠(0.028g，0.33mmol)。混合物过夜加热回流，之后蒸发溶剂并且通过HPLC纯化残留物以得到线粒体-二甲双胍6(0.020g，17％)。31P NMR，(600.13)：δ24.6.1H NMR，(600.13MHz)：δ7.93-7.88(3H，m)，7.81-7.77(12H，m)，3.60-3.46(2H，m)，3.05-3.00(2H，m)，1.55-1.48(2H，m)，1.48-1.42(2H，m)，1.41-1.35(2H，m)，1.31-1.24(2H，m).13C NMR(75.47MHz)δ158.2(s)，157.9(s)，134.9(s)，133.6(s)，133.5(s)，130.3(s)，130.2(s)，118.2(d，J＝86)，40.0(s)，30.0(s)，29.5(s)，25.9(s)，22.2(d，J＝3)，20.5(d，J＝49).HRMS针对C26H33N5P[C26H33N5P]+计算为446.2468，实际为446.2467。(C)线粒体-二甲双胍-C10。0.2g部分的溴化(10-氨基癸基)三苯基膦2(0.4mmol)溶解在CH2Cl2(3mL)中并且混合物冷却至0℃。逐滴加入500μL部分的二乙醚(0.5mmol)中的HCl的1.0M溶液。在室温下1小时后，真空去除溶剂并且加入BuOH(2mL)中的双氰胺(0.034g，0.4mmol)。混合物过夜加热回流，之后蒸发溶剂并且通过HPLC纯化残留物以得到线粒体-二甲双胍103(0.060g，30％)。31P NMR，(400.13)：δ23.77.1H NMR，(400.13MHz)：δ7.91-7.73(15H，m)，3.42-3.33(2H，m)，3.25-3.20(2H，m)，1.69-1.51(6H，m)，1.40-1.21(10H，m).HRMS针对C30H41N5P[C30H41N5P]+计算为502.3094，实际为502.3094。
图17A-C。Mito-Met10、二甲双胍和其他MTA对MiaPaCa-2细胞中胞内ATP水平和细胞死亡的影响。MiaPaCa2细胞如所示那样处理。(A)在24小时后胞内ATP水平针对浓度作图。(B，C)通过Sytox Green染色实时监测细胞死亡并且实时细胞死亡曲线被作图。显示的数据为平均±SD，n＝4。
图18A-B。线粒体-二甲双胍-C2和二甲双胍(对照)对PDAC增殖的影响。(A)用线粒体-二甲双胍-C2(μM)或二甲双胍(mM)处理MiaPaCa2细胞并且使用IncuCyte酶标仪连续监测细胞生长直至各实验结束(第0天-第6天)。细胞汇合的变化用作细胞增殖的替代标志物。值是平均±SD(n＝6)。(B)线粒体-二甲双胍-C6和二甲双胍(对照)对PDAC增殖的影响。用线粒体-二甲双胍-C6(μM)或二甲双胍(mM)处理MiaPaCa2细胞并且使用IncuCyte酶标仪连续监测细胞生长直至各实验结束(第0天-第6天)。细胞汇合的变化用作细胞增殖的替代标志物。值是平均±SD(n＝6)。
图19。FC1242-luc原位移植小鼠模型中Mito-Met的体内组织累积。每天用Mito-Met10(1mg/kg)处理FC1242-luc原位移植小鼠持续2周。在最后处理后3天进行组织收获和提取。在标准化至组织湿重后Mito-Met浓度的定量数据表示为平均±SD，n＝5。
图20A-C。Mito-Met和二甲双胍抑制丙酮酸盐/酯-驱动的，而不是琥珀酸盐/酯-驱动的呼吸。提供MAS缓冲液中10mM丙酮酸盐/酯和1.5mM苹果酸盐/酯的透化的MiaPaCa-2细胞的代表性实验。Mito-Met10(A)或二甲双胍(B)骤然加入并且立即测量OCR。(C)来自A和B的线粒体复合物I氧消耗(琥珀酸盐/酯注射前的最后OCR读取)针对浓度作图。虚线表示用于确定IC50值的拟合曲线。琥珀酸盐/酯(10mM)和抗霉素A(20μM)都如所示那样注射。显示的数据为平均±SD，n＝4。
图21。Mito-Met和二甲双胍，但不是对照化合物(H-TPP+)抑制丙酮酸盐/酯-驱动的呼吸。在复合物I活性试验之前，二甲双胍、Mito-Met10或对照化合物(H-TPP+)预处理24小时(与图15D相同的实验条件)。线粒体复合物I氧消耗(琥珀酸盐/酯注射前的最后OCR读取)针对浓度作图。虚线表示用于确定IC50值的拟合曲线。显示的数据为平均±SD，n＝4。
图22。二甲双胍和Mito-Met10对小鼠胰腺癌细胞增殖的影响。在与图10B相同的条件下Mito-Met10(左)和二甲双胍(右)对增殖的影响。用Mito-Met10或二甲双胍处理小鼠胰腺癌细胞FC1242并且使用IncuCyte连续监测细胞生长直至各实验结束。(底部)细胞汇合百分比(对照组达到90％汇合时)针对浓度作图。虚线表示用于确定IC50值的拟合曲线。显示的数据表示平均±SD(n＝4)。
图23A-B。Mito-Met和二甲双胍抑制N27细胞中丙酮酸盐/酯-驱动的，而不是琥珀酸盐/酯-驱动的呼吸。(A)提供MAS缓冲液中10mM丙酮酸盐/酯和1.5mM苹果酸盐/酯的透化的N27细胞的代表性实验。实验条件与图15A-G中所示的相同。(B)在该试验之前用二甲双胍或Mito-Met10预处理24小时。线粒体复合物I氧消耗(琥珀酸盐/酯注射前的最后OCR读取)针对浓度作图。虚线表示用于确定IC50值的拟合曲线。显示的数据为平均±SD，n＝4。
发明详述
综述。描述本发明材料和方法之前，应理解，本发明不限于所述具体方法、方案、材料和试剂，这些可发生变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不应用来限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
必须注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非上下文另有明确说明。同样，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。还应当注意，术语“包括”、“包含”、和“具有”可以互换使用。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。本文具体提及的所有出版物和专利都通过引用全文纳入本文用于所有目的，包括描述和公开在出版物中报道的可与本发明关联使用的化学物质、细胞系、载体、动物、工具、统计分析和方法。本说明书引用的所有参考文献都应看作对本领域技术水平的指示。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些公开内容。
本发明。在一个实施方式中，本发明提供了经修饰以选择性并协同性抑制癌症增殖和进展的新线粒体-二甲双胍(mito-met)化合物。具体地，发明人已经显示，与常规处理相比，将带正电基团接合至二甲双胍在非常低的剂量上极大地增强了化合物的抗肿瘤功效。
在一个实施方式中，本发明的mito-met化合物包含经修饰以包括烷基阳离子部分的二甲双胍。在其他实施方式中，本发明的mito-met化合物包含选自苯乙双胍、PEG、cy-二甲双胍或吡双胍的二甲双胍化合物。
具体地，发明人已经显示线粒体-靶向的二甲双胍类似物(mito-met)在抑制胰腺癌细胞增殖上比二甲双胍更强效。二甲双胍(Met)是FDA-批准的抗糖尿病药物，其目前正被赋予有前景的抗肿瘤药物的新用途。Met靶向线粒体时，虽然不是非常有效，我们推测通过接合带正电亲脂取代基增加其线粒体靶向潜力将产生具有增强的抗肿瘤潜力的更强效mito-met。为此，合成并表征偶联至变化的烷基链长度的含有三苯基膦阳离子(TPP+)的mito-met类似物。结果显示，通过10-碳脂肪侧链将TPP+接合至Met合成的Mito-Met类似物(例如，Mito-Met10)在抑制胰腺导管腺瘤细胞(PDAC)增殖上比Met有效接近1000倍。Mito-Met10在抑制MiaPaCa-2细胞中的线粒体复合物I-介导的氧消耗上比Met有效2000倍(Mito-Met10的IC50≈0.43μM并且Met的IC50≈1,088μM)。Mito-Met10(1mg/kg)在消除体内肿瘤生长上比Met明显更强效。结果也显示用比Met低1000倍浓度的Mito-Met预处理PDAC增强辐射敏化，如克隆源性试验所测量。增强的Met的线粒体靶向与增强的辐射敏化功效的组合可在治疗胰腺癌上更有益，胰腺癌是侵略性人类癌症，对于改善存活的化疗和放疗选项有限。
在一个实施方式中，本发明的mito-met化合物如下：
n＝1-线粒体-二甲双胍-C2
5-线粒体-二甲双胍-C6
9-线粒体-二甲双胍-C10
11-线粒体-二甲双胍-C12
在一个具体实施方式中，本发明的mito-met化合物包括以下结构：
线粒体12-二甲双胍。
在一个具体实施方式中，本发明的mito-met化合物包括以下结构：
线粒体10-二甲双胍。
在一个具体实施方式中，本发明的mito-met化合物包括以下结构：
线粒体6-二甲双胍。
在一个具体实施方式中，本发明的mito-met化合物包括以下结构：
线粒体2-二甲双胍。
在一个具体实施方式中，本发明的mito-met化合物包括以下结构：
吡双胍。
在一个具体实施方式中，本发明的mito-met化合物包括以下结构：
线粒体-Cy-二甲双胍。
在一个具体实施方式中，本发明的mito-met化合物包括以下结构：
线粒体-PEG2-二甲双胍。
在一个具体实施方式中，本发明的mito-met化合物包括以下结构：
线粒体-苯乙双胍。
在一个具体实施方式中，本发明的mito-met化合物包括以下结构：
线粒体-苯乙2双胍。
合成方法。通过在100-180℃下将相应的溴化氨基烷基三苯基膦与双氰胺反应来制备本发明的mito-met化合物。随后，产物通过快速色谱或在HPLC上纯化。
在一个实施方式中，本发明的mito-met化合物包含糖酵解、谷氨酰胺、和/或线粒体代谢抑制物的组合，其与标准治疗一起治疗癌症。
使用方法。在一个实施方式中，本发明提供治疗对象中癌症的方法，包括向该对象给予治疗有效量的包含至少一种本发明的mito-met化合物的组合物。在一个实施方式中，该组合物包含本发明的mito-met化合物，但在替代实施方式中，可给予多种本发明的mito-met化合物。
使用中，本发明的mito-met化合物对于癌细胞比非癌细胞更有细胞毒性。发明人已经证明本发明的线粒体-二甲双胍化合物通过选择性抑制肿瘤而非正常细胞强效抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞毒性。另外，本发明的mito-met化合物在比使用二甲双胍的常规治疗所需的剂量低得多的剂量下更有效。
具体地，本发明的mito-met化合物在抑制胰腺癌细胞增殖上比二甲双胍有效接近1000倍(图5)。另外，本发明的mito-met化合物在比二甲双胍低1000倍的浓度下协同增强辐射诱导的胰腺癌细胞杀伤(图2)。
在一个实施方式中，Mito-Met10(图10A)在抑制PDAC增殖上比Met有效接近1000倍，并且在消除PDAC肿瘤生长上比Met有效至少100倍。在其他实施方式中，Mito-Met10在抑制MiaPaCa-2细胞中的线粒体复合物I-介导的氧消耗上比Met有效2000倍(Mito-Met10的IC50≈0.43μM并且Met的IC50≈1,088μM)。Mito-Met10(1mg/kg)在消除体内肿瘤生长上比Met明显更强效。我们显示Mito-Met10产生与Met(1mM)相同程度的放射敏感性增强，但在低1000倍的浓度(1μM)下。这证明相对无毒的线粒体-靶向的二甲双胍类似物单独或与放疗组合可消除胰腺癌细胞增殖。另外，本发明的mito-met化合物比苯乙双胍有效至少20倍(图6)。
本发明还提供治疗性组合物，其包含至少一种本发明的mito-met化合物和药学上可接受的赋形剂或运载体。该治疗性组合物可优选在生理上可接受的pH下溶于水性溶液中。
在一个实施方式中，本发明的mito-met化合物提供治疗癌症的有效方法。在一个实施方式中，本发明的mito-met化合物强效抑制肿瘤形成。在其他实施方式中，本发明的mito-met化合物可与电离辐射组合以抑制肿瘤细胞形成。
在其他实施方式中，本发明的mito-met化合物在与常规治疗方案组合时可增加常规癌症治疗的效果。
“肿瘤”表示组织的任何异常增殖，包括实体瘤和非实体瘤。例如，本发明的组合物和方法可用于治疗癌症，其表现为实体瘤如胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、皮肤癌等。本发明的组合物和方法也可用于治疗非实体瘤癌症，如非霍奇金淋巴瘤、白血病等。
“对象”表示哺乳动物和非哺乳动物。“哺乳动物”指的是任意的哺乳动物纲成员，包括但不限于人类、非人灵长类，例如大猩猩和其他猿类和猴类；农场动物，例如牛、马、山羊、绵羊和猪；家养动物，例如兔、狗和猫；实验室动物，包含啮齿动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠；等等。非哺乳动物的示例包括但不限于鸟、鱼等。术语“对象”不表示特定年龄或性别。
“治疗”表示处于对抗疾病、病症或紊乱的目的管理和护理对象。所述术语包括预防性治疗(即预防)和缓解性治疗。治疗包括给予本发明的化合物以防止、减轻和/或改善所述症状或并发症的发作、缓解所述症状或并发症、或消除所述疾病、病症、或紊乱。
“减轻”、“缓解”、“改善”等表示可检测的改善或符合对象中或至少少数对象中出现的改善的可检测变化，例如，至少约2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、100％或这些值中任意两个之间的范围。与不用本发明的mito-met化合物治疗的对象相比，治疗的对象中可观察到这种改善或变化，其中未治疗的对象具有相同或相似疾病、病症、症状等，或者是发展相同或相似疾病、病症、症状等的对象。可主观或客观确定疾病、病症、症状或试验参数的缓解，例如，对象自我评价，通过临床医师评价或通过进行适当的试验或测量，包括，例如，生物质量评价，疾病或病症的缓慢进展，疾病或病症的降低的严重性，或生物分子、细胞的活性或水平的合适试验，或通过检测对象内的细胞迁移。缓解可以是暂时的、延长的或永久的，或者其可在本发明的mito-met化合物给予对象或用于本文或参考文献所述的其他方法或试验中期间或之后的相关时间上可变，例如，在给予或使用本发明的mito-met化合物的约1小时内至对象已接受本发明的mito-met化合物后的约3、6、9个月或更久。
“调节”，例如，症状，分子的生物活性或水平，病原体复制、细胞响应、细胞活性等表示可检测地增加或降低细胞水平或活性。与不用本发明的mito-met化合物治疗的对象相比，治疗的对象中可观察到这种增加或减少，其中未治疗的对象具有相同或相似疾病、病症、症状等，或者是发展相同或相似疾病、病症、症状等的对象。这种增加或减少可以是至少约2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、1000％或更多或约这些值中任意两个之间的任意范围内。可主观或客观确定调节，例如，通过对象自我评价，通过临床医师的评价或通过进行适当试验或测量，包括，例如，生活质量评价或针对分子、细胞的活性或水平或对象内细胞迁移的合适试验。调节可以是暂时的、延长的或永久的，或者其可在本发明的mito-met化合物给予对象或用于本文或参考文献所述的其他方法或试验中期间或之后的相关时间上可变，例如，在给予或使用本发明的mito-met化合物的约1小时内至对象已接受本发明的mito-met化合物后的约3、6、9个月或更久。
“给予”表示向体内导入本发明的mito-met化合物的任何手段，优选导入全身循环。示例包括但不限于口服、口颊、舌下、经肺、透皮、经粘膜，以及皮下、腹膜内、静脉内、和肌内注射。
“治疗有效量”表示在所需剂量和持续所需时间有效实现所需治疗结果(如减少或逆转癌症中的血管形成，或减少或抑制自身免疫疾病中的T-细胞)的量。在一个实施方式中，治疗有效量的范围是约5-50mg/kg。本发明的mito-met化合物的治疗有效量可根据以下因素变化，如疾病状态、年龄、性别、和对象体重，以及mito-met化合物在对象中引发所需响应的能力。可调节剂量方案以提供最佳治疗响应。治疗有效量也是其中本发明的mito-met化合物的治疗有益效应胜过任何毒性或有害效应的量。
“预防有效量”是指在所需剂量并持续所需时间有效实现所需预防结果，如防止或抑制肿瘤转移率的量。可如上述针对治疗有效量所述确定预防有效量。一般而言，由于预防剂量在疾病的早期或之前用于对象，预防有效量将小于治疗有效量。
试剂盒。在另一个实施方式中，本发明提供了包含药物组合物和说明材料的试剂盒，该药物组合物包含本发明的mito-met化合物。“说明材料”表示发表物、记录、图表、或任何其他表达媒介，其用于向人传递针对本文所述目的之一的本发明药物组合物的实用性。说明材料也能描述例如本发明药物组合物的合适的剂量。例如，可将试剂盒的指导材料粘附至含有本发明的药物组合物的容器中，或与含有药物组合物的容器一起运输。或者，所述说明材料能与本发明的容器分开运送，从而所述说明材料和所述药物组合物能由接收者配合使用。
实施例
当然，提供以下实施例仅用于说明目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。实际上，根据前述说明和后述实施例，本发明所示和描述以外的各种变化对本领域技术人员显而易见，所述变化也包括在所附权利要求书的范围之内。
实施例1.吡双胍化合物的合成
按照以下反应合成本发明的吡双胍化合物：
方案试剂和条件：i，EtOH，回流；ii，二氰胺钠，纯，180℃。
实施例2.线粒体-cy-二甲双胍化合物的合成。
按照以下反应合成本发明的线粒体-cy-二甲双胍化合物：
线粒体-Cy-二甲双胍
方案试剂和条件：i，PPh3，ACN，回流；ii，NH2-NH2，EtOH，回流；iii，HCl，二氰胺钠，纯，180℃。
实施例3.线粒体-PEG-二甲双胍化合物的合成。
按照以下反应合成本发明的线粒体-PEG-二甲双胍化合物：
线粒体-PEG2-二甲双胍(n＝1)
线粒体-PEG3-二甲双胍(n＝2)
方案试剂和条件：i，PBr3；ii，邻苯二甲酰亚胺钾，DMF；iii，PPh3，ACN，回流；iv，NH2-NH2，EtOH，回流；v，HCl，二氰胺钠，纯，180℃。
实施例4.线粒体-苯乙双胍化合物的合成。
按照以下反应合成本发明的线粒体-苯乙双胍化合物：
线粒体-苯乙双胍(n＝1)
线粒体-苯乙2双胍(n＝2)
试剂和条件：i，邻苯二甲酰亚胺钾，DMF；ii，PPh3，ACN，回流；iii，NH2-NH2，EtOH，回流；iv，HCl，二氰胺钠，纯，180℃。
实施例5.线粒体-二甲双胍化合物的合成。
按照以下反应合成本发明的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体2-二甲双胍(n＝1)
线粒体6-二甲双胍(n＝5)
线粒体10-二甲双胍(n＝10)
线粒体12-二甲双胍(n＝11)
方案试剂和条件：i，PPh3，CAN，回流；ii，NH2-NH2，EtOH，回流；iii，HCl，二氰胺钠，纯，180℃。
实施例6：线粒体2-二甲双胍1的合成
线粒体2-二甲双胍1
0.1g部分的溴化(2-氨基乙基)三苯基膦(0.26mmol)溶解在CH2Cl2(3mL)中并且混合物冷却至0℃。逐滴加入336μL部分的二乙醚(0.33mmol)中的HCl的1.0M溶液。在室温下1小时30分钟后，真空去除溶剂。加入BuOH(3mL)中的二氰胺钠(0.026g，0.31mmol)。混合物过夜加热回流，之后蒸发溶剂并且通过HPLC纯化残留物以得到线粒体2-二甲双胍1(0.030g，25％)。
31P NMR，(600.13)：δ21.61.1H NMR，(600.13MHz)：δ7.93-7.73(15H，m)，3.80-3.76(2H，m)，3.38-3.34(2H，m).13C NMR(75.47MHz)λ158.3(s)，158.1(s)，135.1(s)，133.7(s)，133.6(s)，130.3(s)，131.2(s)，117.6(d，J＝85)，35.1(s)，20.6(d，J＝47).HRMS针对C22H25N5P[C22H25N5P]+计算为390.1842，实际为390.1842。
实施例7.线粒体6-二甲双胍4的合成：
溴化(6-苯邻二甲酰亚胺基)三苯基膦2。含有乙腈(60mL)中溴邻苯二甲酰亚胺(5g，0.016mol)和三苯基膦(4.2g，0.019mol)的混合物回流15小时。减压蒸馏溶剂。通过在硅胶(CH2Cl2/EtOH 80：20)上的快速色谱纯化粗产物得到白色固体2(5.7g，62％)。
31P NMR，(400.13)：δ24.38.1H NMR，(400.13MHz)：δ7.90-7.66(15H，m)，3.90-3.75(2H，m)，3.65-3.55(2H，m)，1.72-1.55(6H，m)，1.40-1.28(2H，m).13C NMR(75.47MHz)δ168.1(s)，134.84(s)，134.80(s)，133.7(s)，133.4(s)，133.3(s)，131.7(s)，130.4(s)，130.2(s)，122.8(s)，118.5(s)，118.4(s)，37.4(s)，29.2(d，J＝16.5)，26.0(s)，22.2(d，J＝4.4)，18.2(s).
溴化(6-氨基己基)三苯基膦3。向EtOH(70mL)中2(5.2g，0.009mol)的溶液添加10mL的THF中的1M肼。混合物回流18小时。通过在硅胶(CH2Cl2/EtOH 80：20)上的快速色谱纯化产物得到黄色固体3(3g，75％)。
31P NMR，(400.13)：δ23.73.1H NMR，(400.13MHz)：δ7.90-7.66(15H，m)，3.46-3.39(2H，m)，2.91(2H，t，J＝7.5)，1.72-1.55(6H，m)，1.40-1.28(2H，m).13C NMR(75.47MHz)δ136.4(s)，136.3(s)，134.9(s)，134.8(s)，133.0(s)，131.7(s)，131.6(s)，130.9(s)，127.0(s)，120.4(s)，119.6(s)，40.8(s)，31.2(d，J＝16.1)，29.0(s)，26.9(s)，23.5(d，J＝4.4)，23.0(s)，22.5(s).
线粒体6-二甲双胍4
0.1g部分的溴化(6-氨基己基)三苯基膦(0.23mmol)溶解在CH2Cl2(3mL)中并且混合物冷却至0℃。逐滴加入453μL部分的二乙醚(0.45mmol)中的HCl的1.0M溶液。在室温下1小时30分钟后，真空去除溶剂。加入BuOH(3mL)中的二氰胺钠(0.028g，0.33mmol)。混合物过夜加热回流，之后蒸发溶剂并且通过HPLC纯化残留物以得到线粒体6-二甲双胍4(0.020g，17％)。
31P NMR，(600.13)：δ24.6.1H NMR，(600.13MHz)：δ7.93-7.88(3H，m)，7.81-7.77(12H，m)，3.60-3.46(2H，m)，3.05-3.00(2H，m)，1.55-1.48(2H，m)，1.48-1.42(2H，m)，1.41-1.35(2H，m)，1.31-1.24(2H，m).13C NMR(75.47MHz)δ158.2(s)，157.9(s)，134.9(s)，133.6(s)，133.5(s)，130.3(s)，130.2(s)，118.2(d，J＝86)，40.0(s)，30.0(s)，29.5(s)，25.9(s)，22.2(d，J＝3)，20.5(d，J＝49).HRMS针对C26H33N5P[C26H33N5P]+计算为446.2468，实际为446.2467。
实施例8.线粒体10-二甲双胍7的合成：
溴化(10-苯邻二甲酰亚胺基)三苯基膦5。含有乙腈(60mL)中溴邻苯二甲酰亚胺(7g，0.019mol)和三苯基膦(5g，0.019mol)的混合物回流15小时。减压蒸馏溶剂。通过在硅胶(CH2Cl2/EtOH 80：20)上的快速色谱纯化粗产物得到白色固体5(9g，73％)。MS针对[C36H39NO2P]+，Br-；[C36H39NO2P]+计算为548.3，实际为548.3。
溴化(10-氨基癸基)三苯基膦6。向EtOH(70mL)中5(7g，0.0108mol)的溶液添加肼(0.54mL，0.0108mol)。混合物回流15小时。蒸馏溶剂并且使用混合物Et2O/EtOH(100mL+45mL)使杂质结晶。通过在硅胶(CH2Cl2/EtOH 80：20)上的快速色谱纯化产物得到黄色固体6(4g，73％)。31PNMR(121.49MHz)δ24.61.1H NMR(300.13MHz)δ7.95-7.73(15H，m)，3.70-3.55(2H，m)，2.80-2.70(2H，m)，1.60-1.40(6H，m)，1.35-1.10(10H，m).MS针对[C28H37NP]+，Br-；[C28H37NP]+计算为418.2，实际为418.2。
线粒体10-二甲双胍7。0.2g部分的溴化(10-氨基癸基)三苯基膦2(0.4mmol)溶解在CH2Cl2(3mL)中并且混合物冷却至0℃。逐滴加入500μL部分的二乙醚(0.5mmol)中的HCl的1.0M溶液。在室温下1小时后，真空去除溶剂并且加入BuOH(2mL)中的双氰胺(0.034g，0.4mmol)。混合物过夜加热回流，之后蒸发溶剂并且通过HPLC纯化残留物以得到线粒体10-二甲双胍3(0.060g，30％)。
31P NMR，(400.13)：δ23.77.1H NMR，(400.13MHz)：δ7.91-7.73(15H，m)，3.42-3.33(2H，m)，3.25-3.20(2H，m)，1.69-1.51(6H，m)，1.40-1.21(10H，m).HRMS针对C30H41N5P[C30H41N5P]+计算为502.3094，实际为502.3094。
实施例9.线粒体-二甲双胍(Mito-Met)是肿瘤形成的强效抑制物。
在该实施例中，发明人显示本发明的mito-met化合物的抗增殖效力。采用IncuCyteTM活细胞成像分析仪(埃森生物科学公司(Essen Bioscience))使用无标记物的非侵入性细胞汇合试验来测量细胞增殖。该系统基于高分辨相衬图像的划分提供实时细胞汇合数据。MiaPaCa2(1,000个细胞/孔)过夜接种在96孔板上，置于保持在37℃下的XL-3孵育箱中，并且每2小时通过IncuCyte软件对细胞进行成像并计算汇合。用Met(1和2mM)或Mito-Met-C10(1-2μM)处理MiaPaCa2细胞。显示了由记录的细胞汇合动力学和代表性相衬图像测量的细胞增殖曲线(图1)。
本发明的其他mito-met化合物也是有效的(参见图6、7和9)。
实施例10.Mito-Met抑制肿瘤形成。
在该实施例中，发明人已经显示用一定浓度范围的本发明的mito-met化合物处理的MiaPaCa2细胞的生长被有效抑制(图1-3)。初步数据显示，一种通过接合含TPP+部分的十碳侧链形成的Met的合成衍生物Mito-Met-C10强效抑制PDAC增殖和线粒体呼吸。显示了本发明的mito-met化合物对能量代谢肿瘤细胞增殖和迁移、以及体外肿瘤生长和代谢的影响。
实施例11.Mito-Met化合物的细胞摄入增加。
在该实施例中，发明人显示MiaPaCa2细胞中通过LC-MS测量的各种mito-met化合物的相对胞内摄入。随着碳-碳侧链增加，Mito-Met细胞摄入显著增加。具体地，Mito-Met-C10摄入是苯乙双胍(一种Met类似物)的接近100倍(图3)。另外，来自两个独立细胞生长试验的结果表明，本发明的mito-met化合物在抑制PDAC细胞增殖比仅二甲双胍有效接近1000倍。
实施例12.Mito-Met化合物的增加的功效。
在该实施例中，发明人显示本发明的mito-met化合物在增强PDAC辐射敏感性上比仅二甲双胍更强效。MiaPaCa2细胞(1000个细胞/孔)在96孔板中一式四份过夜培养，并改到新鲜培养基中。对照细胞和用1mM二甲双胍处理24小时的细胞都经受增加剂量的X-辐射。在使用克隆源性试验测量时(图2)，二甲双胍预处理增加了辐射敏化，在辐射后MiaPaCa2细胞生长降低。
实施例13.癌细胞中增加的AMPK活化。
在该实施例中，发明人已经显示本发明的mito-met化合物在癌细胞中导致增加的AMPK活化。在初步实验中(图4)，用1μM mito-met(MM)、1mM Met、或寡霉素阳性对照处理30分钟的人MiaPaCa2和鼠FC1199 PDAC细胞裂解，并且在SDS-PAGE上尺寸分离蛋白质，转移到PVDF，并且用针对磷酸化AMPK Thr-172的抗体探测。活性蛋白质的水平测量为活性磷酸化蛋白质相对于总蛋白质的比率，显示出mito-met化合物在比仅二甲双胍低1000倍的浓度下在人和鼠PDAC细胞中都诱发活性AMPK的1.5-2.5倍增加。
实施例14.有效抑制物。
二甲双胍(Met)，一种天然产生的化合物山羊豆碱的合成类似物，是FDA-批准的抗糖尿病药物，其抑制肝糖异生并且在具有胰腺癌的糖尿病患者中显示抗癌效果。Met在生理pH下以亲水性阳离子(图10A)存在并且弱靶向线粒体。流行的观点是Met通过使细胞AMP/ATP比率提高并活化5-AMP-活化的激酶(AMPK)/mTOR途径和/或通过降低循环胰岛素水平(和血糖水平)来发挥抗肿瘤效果。Met也抑制线粒体电子转移链中的复合物I，导致抑制肿瘤线粒体呼吸。更近期，显示二甲双胍通过抑制线粒体甘油磷酸脱氢酶来阻遏糖异生(gluroneogenesis)。有机阳离子转运体(OCT)负责将Met摄入肿瘤细胞，而其他亲脂Met类似物(例如，苯乙双胍)通过其他机制被摄入细胞。苯乙双胍显示在抑制胰腺肿瘤细胞增殖上比Met更强效。苯乙双胍的显著缺陷在于，由于在抗糖尿病治疗中报道的增加的酸中毒发生率，其退出美国市场。然而，最近的研究推荐其他临床研究将苯乙双胍重新赋予强效抗肿瘤药物的用途。
之前的报道表明，线粒体靶向的阳离子型试剂在肿瘤细胞中诱导抗增殖和细胞毒性效果，而没有明显影响正常细胞。例如，通过脂肪侧链将氮氧化物、醌、色满醇(chromanol)或维生素E偶联至三苯基膦(TPP+)基团增加了其在肿瘤细胞中的抗增殖效果。与正常细胞相比对肿瘤细胞的选择性毒性归因于肿瘤细胞线粒体中增强的含TPP+化合物的摄入和停留。Met已经在临床中使用超过50年并且具有非常好的安全性概况(糖尿病患者每天容许2-3克的剂量)。改善并增强Met功效的努力包括通过接合烷基或芳基来修饰结构(例如，丁二胍，苯乙双胍)(图10A)。
我们现在显示通过接合带正电的亲脂取代基改善对Met的线粒体靶向将产生具有显著增加的抗肿瘤潜力的新线粒体靶向药物类别。为此，我们合成并表征与含有TPP+部分的烷基取代基偶联的几种Met类似物(例如，Mito-Met2，Mito-Met4，Mito-Met10)(图16A-D)，并且本发明的结果显示Mito-Met类似物(例如，Mito-Met10)(图10A)在抑制PDAC增殖上比Met有效接近1000倍，并且在消除PDAC肿瘤生长上有效至少100倍。报道表明Met(1mM)预处理后的辐射增加了辐射敏化，导致增强的癌细胞杀伤。
在该实施例中，我们显示Mito-Met10产生与Met(1mM)相同程度的放射敏感性增强，但在低1000倍的浓度(1μM)下。该研究的显著性是证明相对无毒的线粒体-靶向的二甲双胍类似物单独或与放疗组合可消除胰腺癌细胞增殖。
材料和方法细胞培养。MiaPaCa-2和MCF-10A细胞系获自美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州玛纳萨斯(Manassas，VA，USA))，它们在那里经定期验证。HaCaT和N27细胞系储存在液氮中并在冻融后6个月内使用。FC-1242细胞系衍生自C57BL/6(B6)KPC转基因小鼠，其自发发展胰腺肿瘤。这些细胞系经工程改造以表达荧光素酶(KPC-1242-luc)，其使得能够进行肿瘤生长监测。之前报道了细胞培养的详细内容。
完整和透化细胞中的呼吸酶活性。使用Seahorse XF96胞外通量分析仪(海马生物科学公司(Seahorse Bioscience)，美国马萨诸塞州比尔里卡(North Billerica，MA，USA))测量完整和透化胰腺癌细胞中的线粒体功能。除非另有说明，如之前所述进行完整细胞中的试验。按照生产商的说明(海马生物科学公司)在透化的细胞中进行对线粒体呼吸复合物的测量。简言之，在刚好通过XF96的氧消耗率(OCR)测量之前使用1nM质膜透化剂(PMP，海马生物科学公司)来透化完整细胞。通过向线粒体提供不同底物来测量衍生自线粒体复合物I或复合物II活性的氧消耗，例如，针对复合物1是丙酮酸盐/酯/苹果酸盐/酯，并且针对复合物II活性是琥珀酸盐/酯。鱼藤酮、丙二酸盐/酯和抗霉素A被分别用作线粒体复合物I、II和III活性的特定抑制物。
克隆源性试验。细胞如所述接种在6孔板中并用Mito-Met10或二甲双胍处理24小时。板保持在孵育器中并且每3-4天更换培养基直至对照细胞形成足够大的克隆。如前所述计算细胞存活分数。
IncuCyte分析仪-实时测量细胞增殖。通过IncuCyte活细胞成像系统(埃森生物科学公司，美国密歇根州安娜堡(Ann Arbor，MI，USA)；IncuCyte FLR)使用无标记非侵入性细胞汇合试验来测量细胞增殖。该系统使得能够在几天内在2小时间隔上收集活细胞图像。IncuCyte分析仪基于高分辨相衬图像的划分提供实时细胞汇合数据。细胞增殖表示为细胞汇合百分比增加。
PDAC的三维球状细胞培养。MiaPaCa-2细胞(5000)接种在含有用作支架的基质胶(康宁公司(Corning))的96孔板中。这种典型的3D-细胞培养系统使得球体在基质内形成。板在含5％CO2的潮湿气氛中在37℃下孵育，并且培养基每两天用不同浓度处理(0-1000μMMitoMet10或0-10,000μM二甲双胍)替换。在第3、7和14天，通过亮场显微术观察孔，并且在Nikon Eclipse Ti倒置显微镜(美国纽约州的尼康仪器公司(Nikon instrument Inc.，NY，USA))上获取图像。使用Nikon NIS元素成像软件(尼康)对球体形成细胞进行计数。数据表示为球体数量的平均和SD。
细胞毒性试验。为了确定Mito-Met类似物和与长链脂肪烃偶联的其他TPP+的细胞毒性，我们如前所述使用Sytox试验。MiaPaCa-2细胞处理24小时，并且在200nM SytoxGreen(英杰公司)存在下监测死细胞。Sytox方法标记死细胞的核产生绿色荧光。用装配设为37℃和5％CO2：95％空气的气氛控制器的酶标仪(BMG实验室技术公司)使用485nm(激发)和535nm(发射)的荧光检测在4小时后每15分钟实时获取96孔板中死细胞的荧光强度。为了测量总细胞数，在Sytox Green存在下，通过添加曲通X 100(0.065％)对各处理组中的所有样品进行透化3小时，并且最大荧光强度取为100％。在标准化至各组的总细胞数之后，数据表示为死细胞百分比。
免疫印迹。MiaPaCa-2PDAC细胞(1x106)在60mm盘中接种至80％汇合，然后血清饥饿5小时。在无血清培养基中进行用二甲双胍或Mito-Met10的刺激。用寡霉素刺激细胞作为阳性对照。在刺激后，细胞在冷PBS中洗涤2次并且使用改性的RIPA缓冲液裂解。裂解物针对蛋白质浓度标准化，使用还原SDS-PAGE进行尺寸分离，电转至PVDF膜(密理博公司(Millipore))并且然后使用一抗和辣根过氧化物酶偶联的二抗探测。针对总或磷酸化5′AMP-活化的蛋白激酶(AMPK)的抗体购自细胞信号转导技术公司(Cell SignalingTechnology)(马萨诸塞州丹佛(Danvers，MA))并且按照生产商推荐的稀释使用。蛋白质通过用自曝光的化学发光可视化并且通过使用来自细胞生物科学公司(加利福尼亚州圣克拉拉(Santa Clara，CA))的FluorChem HD2的密度计量分析定量。
通过LC-MS/MS对胞内Mito-Met类似物的定量。细胞在10cm盘上生长并且在完全培养基中用化合物处理24小时。从细胞中提取Mito-Met类似物的方案与之前针对使用二氯甲烷∶甲醇(2∶1)混合物的Mito-维生素E所述相同，但不添加丁基羟基甲苯(BHT)，一种亲脂链-断裂抗氧化剂。使用由含0.1％甲酸的水：乙腈混合物(4∶1)平衡的Kinetex Phenyl-Hexyl柱(50mm×2.1mm，1.7μm，菲罗门公司(Phenomenex))进行LC-MS/MS分析。通过在4分钟内将乙腈含量从20％增加至100％来洗脱化合物，并使用MRM模块检测。
辐射实验。以5×105接种在6-cm盘的MiaPaCa-2和MCF-10A细胞用Mito-Met10或二甲双胍处理24小时。然后用0、2、4和6Gy的X-辐射处理细胞。在合适的情况下用相同浓度的载剂(0.1％DMSO)处理对照细胞。放射后，细胞悬浮并以各种密度(100-8,000个细胞/孔)接种到6孔板中用于如上所述的克隆源性试验。板保持在孵育器内并且每3-4天更换培养基持续2周。选择具有10-50个足够大的克隆的孔来计算细胞存活分数。
体内研究和生物发光成像。使用原位同源移植模型来评价用二甲双胍或线粒体-二甲双胍-C10处理后的转移寻靶和肿瘤进展。用异氟烷麻醉6-8周龄的C57BL/6小鼠并且接种1x106个表达荧光素酶的FC1242细胞。为了生成表达荧光素酶的FC1242细胞，萤火虫荧光素酶基因被克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1/使用Lipofectamine 2000转染试剂(生命技术公司(Life Technologies))转染hygro(-)细胞。通过在补充500ug/mL潮霉素的生长培养基中培养细胞并进行有限稀释克隆来生成稳定表达萤火虫荧光素酶的细胞系。扩增名为FC1242-luc的稳定克隆以生成冻存母液。细胞用Met(1000μM)或Mito-Met10(0.5μM)预处理48小时，然后原位移植到胰腺，如之前定义针对人胰腺癌细胞。从植入当天开始，每天用通过腹膜内注射给予的200μL体积的1mg/kg Met或Mito-Met10处理小鼠。在第1、7和13天使用生物发光成像(Lumina IVIS 100，加利福尼亚州阿拉米达的帕金埃尔默公司(PerkinElmer，Alameda，CA))来监测肿瘤生长和转移。在13天后，处死小鼠，并且使用卡钳测量原发肿瘤生长。使用生物发光成像离体评价向肝、肠系膜淋巴结、脾和肺的转移。
统计学分析。所有统计学分析使用GraphPad Prism 4(加利福尼亚州圣迭戈(SanDiego，CA))进行。使用斯氏t-检验来计算配对分析。使用单项ANOVA和图基事后(Tukeypost-hoc)分析来分析多重比较以鉴定不同实验组之间的配对差异。统计学显著性定义为P≤0.05。
结果-不同侧链长度的线粒体-靶向的二甲双胍类似物的合成和表征。通过NMR和HR-MS分析来合成和表征线粒体-二甲双胍类似物(图16A-D)。通过在180℃下用氨基烷基膦衍生物的相应盐酸盐与纯二氰胺反应来获得Mito-Met(n＝2，6，10，和12)。通过反相制备型-HPLC来纯化Mito-Met。试剂和条件是：i)PPh3，ACN，回流；ii)NH2-NH2，EtOH，回流；iii)Et2O中1M HCl，二氰胺钠，纯，180℃(图16D)。
Mito-Met抑制PDAC细胞和PDAC球体生长比Met更强效。采用IncuCyteTM活细胞成像分析仪使用无标记物的非侵入性细胞汇合试验来测量细胞增殖。用Met(100-2,000μM)或Mito-Met10(0.1-1μM)处理MiaPaCa-2细胞。由记录的细胞汇合动力学和代表性相衬图像测量的细胞增殖曲线(图10B)。对照细胞在5-6天内达到100％汇合。Mito-Met10处理(0.2和1μM)分别抑制细胞生长70％和超过90％(图10B)。相反，二甲双胍在高1000倍的浓度(1,000μM)下抑制细胞生长80％(图10B)。在20％和1％氧中观察到相似趋势(图10B)。
我们也监测相似条件下用Met或Mito-Met10处理24小时后在MiaPaCa-2细胞中的集落形成。用所示浓度范围处理MiaPaCa-2细胞(图10C)，并且对形成的集落数量进行计数。在用3μM的Mito-Met10和3mM的Met处理的细胞中几乎没有检测到集落形成(图10C)。存活分数分析(图10D)显示Met和Mito-Met10确定的IC50值分别是1.3mM和1.1μM。因此，来自两个独立细胞生长试验的结果显示，Mito-Met10在抑制MiaPaCa-2细胞增殖上比Met有效接近1000倍。
通过Sytox Green染色检测细胞死亡诱导，如之前所示。MiaPaCa-2细胞用Mito-Met10(100μM)、Mito-CP(100μM)、或Met(30mM)和其他对照处理24小时并且实时监测细胞死亡。如图17所示，甚至在高10到100倍浓度(100μM)的用于细胞增殖实验的Mito-Met10存在下没有可检测的细胞死亡(图10B)。然而，其他线粒体-靶向抗增殖剂(包括，例如，且不限于，Mito-CP、Mito-Q、Mito-CP-Ac、Mito-4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶(Tempol)、和Mito-色满醇)在这些条件下明显更有毒性。在这些条件下测量的胞内ATP水平(图17B)。
我们测试了Mito-Met和Met在多细胞球体模型中的抗增殖效果(图11A)。MiaPaCa-2细胞在基质胶中培养14天并用Mito-Met10和Met处理。如图11B所示，与Met(10,000μM)相比，Mito-Met(0.5μM)强效抑制PPAC球体生长。2D和3D细胞生长试验都表明Mito-Met在抑制PDAC增殖上比Met有效接近1000至10000倍。
Mito-Met类似物在正常细胞和癌细胞中的效果：微调烷基侧链长度和效力。我们比较了其他Mito-Met类似物(Mito-Met2，和Mito-Met6)与Mito-Met10、苯乙双胍、和二甲双胍在正常细胞和癌细胞中的相对抗增殖效力。图12A显示Mito-Met10和二甲双胍在MiaPaCa-2和非恶性对照细胞，MCF-10A，和HaCaT中的实时细胞汇合数据。与MiaPaCa-2或FC1242胰腺癌细胞相反，非恶性乳腺上皮细胞(MCF-10A)或角质形成细胞(HaCaT)并没有响应Mito-Met10和二甲双胍治疗而受到显著影响(图12A，顶部和底部轨迹)。与正常细胞(HaCaT和N27)相比，Mito-Met10和二甲双胍在MiaPaCa-2细胞中更强效抑制细胞汇合(图12B)。图12C显示了Mito-Met类似物(Mito-Met2、Mito-Met6、和Mito-Met10、苯乙双胍、和二甲双胍)在抑制MiaPaCa-2细胞存活上的相对效力。Mito-Met10的IC50值是0.84μM并且二甲双胍的IC50值是1.1mM(图12B)。接着，我们研究了不同Mito-Met类似物(Mito-Met2、Mito-Met6、和Mito-Met10)和苯乙双胍在MiaPaCa-2细胞中的相对摄入(图12D)。用相应Mito-Met类似物(1μM)处理细胞1小时。细胞在洗涤后裂解并且通过LC-MS分析Mito-Met类似物。如图12D所示，随着碳-碳侧链长度增加，Mito-Met细胞摄入显著增加。如图12D所示，Mito-Met10摄入比苯乙双胍高接近100倍。在这些处理条件下，二甲双胍摄入明显低于苯乙双胍。
Met和Mito-Met类似物对MiaPaCa-2细胞中线粒体生物能量的影响。使用SeahorseBioscience XF96胞外通量分析仪，氧消耗率(OCR)和胞外酸化率(ECAR)测量为线粒体功能和糖酵解的读数。我们比较了响应不同浓度的Met、Mito-Met2、Mito-Met6、Mito-Met10、和苯乙双胍的中间OCR变化(例如，由克隆源性试验确定的IC50或更高值)(图13A)。二甲双胍在较高浓度(≈1-10mM)下剂量依赖性地降低氧消耗。相反，亲脂苯乙双胍在低10倍的浓度下相同程度地(与Met相同)抑制OCR(图13A)。在亚微摩尔浓度下最强效抑制增殖的Mito-Met10在1μM浓度下不抑制OCR，虽然在较高浓度(≈10μM)Mito-Met10下处理MiaPaCa-2细胞时有轻微抑制。用Mito-Met6和Mito-Met2观察到类似结果(图13A)。
接着，我们监测用Met、Mito-Met类似物和苯乙双胍处理24小时，之后洗去处理并回到新鲜细胞培养基后的MiaPaCa-2细胞中的线粒体OCR变化。与图13A中所示结果相反，在用这些试剂处理24小时后的细胞中观察到OCR的明显降低(图13B)。在24小时处理后，Mito-Met10(1μM)而非二甲双胍和甲基-TPP+最强效抑制OCR(未显示)。在这些条件下(图13B)，ECAR保持几乎不变，虽然在ECAR中响应这些试剂有初始的增加，尽管是轻微的(未显示)。这些结果证明OCR抑制依赖于链长度并且Mito-Met10在1μM浓度下抑制OCR与Mito-Met2在25μM下的抑制相当(图13B)。Mito-Met类似物抑制OCR的程度随着烷基接头的长度增加而增加(Mito-Met10＞MitoMet6＞Mito-Met2)。
Mito-Met和Met对PDAC辐射敏感性的影响。在X-放射之前，对照细胞和细胞都用1mM Met或Mito-Met(1μM)预处理24小时。通过克隆源性试验来测量细胞存活。如图14A所示，Met预处理增加了辐射敏化，MiaPaCa-2细胞生长在放射后减少。这些结果验证了之前报道的用Met和放射增强PDAC细胞杀伤的发现。结果显示1μM Mito-Met在诱导PDAC辐射敏感性上与1mM Met一样有效(图14A)，而在用Mito-Met10预处理的正常细胞(MCF-10A)中没有观察到辐射敏感性(图14A)。LC-MS数据显示MiaPaCa-2和MCF-10A细胞中Mito-Met的胞内摄入和停留存在4倍差异(图14C)。
Mito-Met和Met-处理的PDAC细胞中的AMPK活化。已经报道了线粒体-靶向的阳离子药物活化生物能量应激信号转导通路。我们研究了Mito-Met10和Met活化AMPK-mTOR能量信号转导机制的相对能力。用Mito-Met10(1μM)或Met(1mM)处理30分钟的人MiaPaCa-2和鼠FC199PDAC细胞经裂解、在SDS-PAGE上蛋白质尺寸分离，转移至PVDF，并用针对磷酸化的AMPK苏氨酸-172的抗体探测。测量为活性磷酸化蛋白质相对于总蛋白质的比率的活性蛋白质的水平显示，Mito-Met10在比Met低接近1000倍的浓度下在人和鼠PDAC细胞中都诱发活性AMPK的1.5-2.5倍增加(图14B)。
Mito-Met类似物和二甲双胍对复合物I活性的影响。使用在补充丙酮酸的MAS缓冲液中透化的MiaPaCa-2细胞测量氧消耗率。使用透化的细胞避免了化合物细胞摄入上的差异。图15A显示了在对照透化的细胞和在鱼藤酮或丙二酸盐/酯处理的细胞中的OCR变化。鱼藤酮(复合物I抑制物)极大地消除了OCR，其由添加的琥珀酸盐/酯恢复。然而，在丙二酸盐/酯(复合物II抑制物)存在下，添加琥珀酸盐/酯并不刺激OCR(图15A)。抗霉素A降低了琥珀酸盐/酯-诱导OCR。这些研究建立了透化的MiaPaCa-2细胞在生物能量功能试验中的用途。接着，我们使用该模型来探测二甲双胍和线粒体-二甲双胍类似物。Mito-Met10在比Met低得多的浓度下抑制OCR(10μM对比3000μM)(图15B和图20A-C)。Met和Mito-Met10的IC50值分别确定为792和2μM(图20C)。我们测试了使用透化的模型用Mito-Met10或Met预处理细胞的效果。MiaPaCa-2细胞用Met和Mito-Met10处理24小时并且在透化后在这些细胞中进行氧消耗研究。与图15B中所示的结果相反，在用对于抑制复合物I低得多的浓度(0.75μM)下的Mito-Met10处理24小时后在透化的细胞中观察到OCR的显著减少(图15C-D)。在透化的细胞模型中确定的Met和Mito-Met10的IC50值分别是1.1mM和0.4μM。Mito-Met10增加的抑制复合物I活性的效力与Mito-Met10相比Met增强超过1000倍的抗增殖效果相一致。
Mito-Met抑制体内KPC自体抑制物的肿瘤生长。体内数据显示线粒体-二甲双胍在临床前小鼠模型中强效停止肿瘤生长(图15E-G)。在初步概念证明实验中，表达萤火虫荧光素酶(FC1242-luc)的同源KPC细胞被原位植入C57BL/6小鼠的胰腺并且使用生物发光成像来监测肿瘤生长(图15F)。用FC1242-luc细胞原位自体移植的小鼠每天用1mg/kg或150mg/kg Met、或1mg/kg Mito-Met处理。与细胞培养数据相一致，Mito-Met在消除PDAC生长上比Met明显更有效(图10B)并且在实验完成时导致明显更小的原发肿瘤(图6E-F)。收集来自这些动物的血清，并且分别使用标准AST、ALT、AP、和BUN试验来测试肝和肾毒性。如从细胞培养数据预测的那样(图10A-D)，Met或线粒体-靶向类似物Mito-Met都没有引发体内毒性(表1)。
表1.毒性。
肝 肝 肾
AST[IU/L] ALT[IU/L] BUN[mg/kg]
对照 85±15 17±2 22±3
Met[1mg/kg] 189±117 35±15 30±7
Mito-Met[1mg/kg] 89±16 26±10 27±4
Met[150mg/kg] 127±24 19±3 22±2
在FC1242-luc原位小鼠中给予Mito-Met10持续2周后，我们检测到这种化合物在肝、肾、脾和肿瘤中增加的积累(图19)。总体来说，来自这些体内实验的结果表明Mito-Met的治疗指数比Met大接近1000倍，具有可忽略的脱靶毒性。
讨论。人胰腺导管腺癌(PDAC)是胰腺癌的最严重和最有侵袭性的形式，其改善存活的化疗和放疗选项有限。目前的标准护理化疗提供有有限的存活益处。对在胰腺癌中减轻治疗耐受性机制并最大化多峰治疗方法的新治疗方法存在严重未满足的需求。在该研究中，我们已经开发了新的线粒体-靶向的二甲双胍类似物，其单独或与放疗组合与二甲双胍相比显著抑制PDAC增殖。这些线粒体-靶向的二甲双胍类似物可在PDAC治疗中有显著的临床和转化潜力。
线粒体-二甲双胍在胰腺癌细胞中的抗增殖效果。电子移位亲脂性阳离子(DLC)通过在线粒体内积累和抑制线粒体呼吸来抑制肿瘤细胞增殖。已经显示肿瘤线粒体膜电势远高于正常(非转化)细胞(内部更负)。我们之前报道了连接到烷基链的阳离子化合物优先在肿瘤线粒体中积累，取决于烷基侧链长度。与芳族和杂环偶联的TPP+-连接的试剂(Mito-色满醇，Mito-CP)也在各种肿瘤细胞中显示出选择性细胞生长抑制和细胞毒性效果。该研究的目的是将亲水性阳离子型二甲双胍修饰成亲脂性二甲阳离子类似物。二甲双胍通过改变细胞生物能量而自身不经过任何可检测到的代谢来发挥生物活性。癌细胞线粒体生物能量的选择性靶向是新兴的化疗策略。
虽然几种二甲双胍的亲脂性变体经合成并显示发挥增加的抗肿瘤效力，这些修饰都没有增强线粒体靶向阳离子功能。在该研究中，我们首次显示并表征通过接合连接至不同烷基链长度的TPP+基团对二甲双胍的微调是合成上可行的，并且这些修饰的二甲双胍愈加靶向肿瘤线粒体。与增强的胞内摄入相一致，线粒体-二甲双胍类似物抑制胰腺肿瘤细胞增殖的能力比二甲双胍更强效。Mito-Met类似物的抗增殖功效随着烷基接头的长度增加而增加(Mito-Met10＞Mito-Met8＞Mito-Met2)(图12C和18A-B)。肿瘤细胞中Mito-Met类似物的选择性抗增殖效果的主要原因是由于与非转化(正常)细胞相比，其在肿瘤细胞中优先积累。
提出的PDAC中增强的抗增殖和辐射敏化效果的机制。现在，导致Mito-Met在癌细胞中增强的抗增殖和辐射敏化效果的机制还未知。线粒体-靶向的二甲双胍类似物可能通过靶向能量传感生物能量途径在PDAC中发挥抗增殖作用。在MiaPaCa-2细胞中，Mito-Met10活化AMP-活化的蛋白激酶(AMPK)比二甲双胍强效接近1000倍(图14A-C)。AMPK，一种细胞能量内稳态的主要调节物，一般由增强的胞内AMP活化。在其中胞内ATP水平降低伴随着AMP同时增加的条件下(增强的AMP-至-ATP比率)，AMPK通过其苏氨酸-172残基的磷酸化活化。之前的研究已经显示AMPK通过抑制AKT/FOXO3信号转导级联阻遏Forkhead Box M1(FOXM1)转录因子表达，导致阻遏宫颈癌细胞生长。因此，设想Mito-Met10和相关类似物作用于AKT/FOXO3/FOXM1信号转导途径。
线粒体-靶向的二甲双胍类似物的增强的辐射敏感性可归因于由Mito-Met诱导的增加的肿瘤氧化(即，减少缺氧)。肿瘤缺氧(pO2＜10mmHg)，包括胰腺癌的多种实体瘤的固有性质，来自氧输送和氧消耗之间的失衡。研究表明用药物降低氧消耗是增加肿瘤氧化并进而增加辐射敏感性的更有效途径。最近的报道表明二甲双胍(1-10mM)改善了肿瘤氧化并增强肿瘤辐射敏感性。本发明的结果显示在24小时后Mito-Met10降低MiaPaCa-2细胞中的线粒体呼吸(图13B)。Mito-Met10在微摩尔水平抑制肿瘤呼吸，而二甲双胍在毫摩尔水平以相似程度抑制呼吸。Mito-Met10可能在比二甲双胍低1000倍的浓度下刺激肿瘤氧化。Mito-Met10降低线粒体呼吸的合理机制是由于Mito-Met10在线粒体中增强的积累，导致对线粒体电子传递链中复合物I的增强的抑制。
在辐射和Mito-Met10类似物存在下，可能有2种或更多种机制运作。AMPK-活化药物增强肿瘤辐射敏感性。辐射本身活化AMPK能量传感通路。然而，对AMPK诱导肿瘤氧化和辐射敏感性的程度仍然知之甚少。
最近，报道了虽然二甲双胍抑制雷帕霉素(mTOR)途径的哺乳动物靶标和胶质细胞瘤细胞生长，但发现效果与AMPK无关。另外，相同的研究表明AMPK可潜在发挥肿瘤生长支持物的功能。二甲双胍-修饰的mTOR抑制和胶质瘤增殖的阻遏归因于增强的PRAS40与RAPTOR的结合。显而易见，Met和Mito-Met的抗增殖作用机制可能并不简单地与AMPK活化和其他机制(即，也应该考虑PRAS40/RAPTOR结合的活化)相关。
PDACS的增强的辐射敏化。二甲双胍对比线粒体-二甲双胍。如之前所报道，我们发现用Met预处理增加了辐射敏化并降低MiaPaCa-2细胞增殖(图21、22和23A-B)。本发明的数据表明Mito-Met在刺激PDAC辐射敏感性上比Met更有效(图14A-D)。流行的观点表明Met的抗增殖效果由AMPK途径的活化和/或改善的肿瘤氧化(即，减少缺氧)介导，由于抑制线粒体，导致在经辐射的肿瘤中降低的肿瘤细胞呼吸。肿瘤缺氧(pO2＜10mmHg)由氧输送和氧消耗之间的失衡导致。研究表明用降低氧消耗是增加肿瘤氧化并进而增加辐射敏感性的更有效途径。AMPK-活化药物已经显示增强肿瘤放射敏感性。Mito-Met在比二甲双胍低1000倍的浓度下抑制线粒体呼吸并活化AMPK(图14B)。
显而易见，这是令人激动的发现，其具有明显的临床转化潜力并且需要涉及信号转导和分光光度研究的其他机制研究。更近期，显示在二甲双胍的常规抗糖尿病剂量下，在晚期胰腺癌患者中没有明显的治疗效果。研究者表示更强效的双胍应用于癌症的代谢治疗，由于通常在用二甲双胍治疗的糖尿病癌症患者中检测到的大大降低的血浆浓度。Mito-Met10显示出比二甲双胍高1000倍的效力，因此在癌症患者中实现治疗有效的血浆浓度。

Claims (13)

1.一种选自下组的修饰的二甲双胍化合物：线粒体-二甲双胍、线粒体-苯乙双胍、线粒体-PEG-二甲双胍、线粒体-cy-二甲双胍或吡双胍。
2.一种以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
n＝1-线粒体-二甲双胍-C2
5-线粒体-二甲双胍-C6
9-线粒体-二甲双胍-C10
11-线粒体-二甲双胍-C12。
3.一种以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体12-二甲双胍。
4.一种以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体10-二甲双胍。
5.一种以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体6-二甲双胍。
6.一种以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体2-二甲双胍。
7.一种以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体-苯乙2双胍。
8.一种以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
吡双胍。
9.一种以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体-苯乙双胍。
10.一种以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体-PEG2-二甲双胍。
11.一种以下结构的线粒体-二甲双胍化合物：
线粒体-Cy-二甲双胍。
12.一种抑制对象中肿瘤形成的方法，包括向所述对象给予治疗有效量的包含至少一种权利要求1所述的线粒体-二甲双胍化合物的组合物。
13.一种试剂盒，包含至少一种权利要求1所述的线粒体-二甲双胍化合物、药学上可接受的运载体或稀释剂、和说明材料。
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