CN107148429A

CN107148429A - 抗‑pdgf‑b抗体和使用方法

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Publication number: CN107148429A
Application number: CN201580058634.5A
Authority: CN
Inventors: 马克·贝杜沙; 塞巴斯蒂安·布罗伊尔; 斯特凡·登格尔; 克里斯蒂安·加斯纳; 盖伊·乔治; 萨拜因·格吕纳; 古伊多·哈特曼; 彼得·迈克尔·许尔斯曼; 约尔格·默勒肯; 奥拉夫·蒙迪戈; 约尔格·托马斯·雷古拉; 芭芭拉·魏泽尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2017-09-08
Anticipated expiration: 2035-11-06
Also published as: AU2015345322A1; AR102593A1; JP2017534645A; RU2017120361A3; KR20170082520A; EP3218400A1; TW201630934A; JP6946184B2; SG11201703426PA; BR112017009792A2; WO2016075036A1; RU2017120361A; MX2017005975A; CA2963723A1; US10087246B2; IL251286A0; CN107148429B; US20170247440A1

Abstract

本文报道了抗‑PDGF‑B抗体及其在眼科学中的应用。

Description

抗-PDGF-B抗体和使用方法

发明领域

本发明涉及抗-PDGF-B抗体和使用其的方法。

背景

眼血管疾病，如年龄相关的黄斑变性(age related macular degeneration，AMD)和糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)，分别是由于异常的脉络膜或视网膜新血管形成所导致。它们是工业化国家中视觉丧失的主要原因。由于视网膜由界限明确的神经元、神经胶质和血管元件层组成，相对小的干扰，如在血管增生或水肿中观察到的那些，可以导致显著的视功能丧失。遗传性视网膜变性，诸如色素性视网膜炎(RetinitisPigmentosa，RP)也与血管异常相关，诸如小动脉狭窄和血管萎缩。它们多至在每3,500名个体中影响1人，并且特征在于进行性的夜盲(progressive night blindness)、视野丧失(visual field loss)、视神经萎缩(optic nerve atrophy)、小动脉变细(arteriolarattenuation)和通常进展为完全的失明的中央视觉丧失(central loss of vision)。

缺血性视网膜病变(ischemic retinopathies)特征在于视网膜血管的丧失或功能障碍，其引起血流减少和缺氧。视网膜通过产生生长新血管的信号来响应缺氧，但是这些新血管通常是脆弱的和无组织性的。由于它们可能渗漏、导致出血或导致可能引起视网膜脱离的瘢痕，因此，正是这些异常新血管的生长产生大部分的视觉威胁。目前对于缺血性视网膜病变的治疗寻找终止病理性血管生长，但是没有解决推动其生长的潜在的缺血。此外，对糖尿病性视网膜病变(一种影响数百万人的缺血性视网膜神经病变)的标准治疗包括用激光破坏一部分视网膜，以尝试终止新血管生长并且保持中央视觉。已经应用一些策略来阻断血管内皮生长因子(VEGF)的功能，血管内皮生长因子是血管生长的主要促进剂。短期内，抗-VEGF治疗可以改善视觉，但是其没有解决潜在的缺血，并且事实上，由于其抑制所有的血管生长，包括有益的侧支的生长，可能加重这种病症。在老年人和/或糖尿病患者(在缺血性的脑、心脏或肢体中可能需要新血管生长)中，还存在对于系统性暴露于这些药物的严重的关注。

典型地，对于眼部疾病，通常使用通过玻璃体内应用的较小的抗体片段，如Fab或Fab₂，原因在于其具有低血清半衰期，并且系统性毒性的危险较低。然而，这种较小的片段通常也具有较低的玻璃体内半衰期(例如，由于较快地扩散到血清中)并且必须通常更频繁地给药。

WO 2009/080252和Schaefer，W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108(2011)11187-11191(其结合在本文中作为参考文献)中记载了在一个结合臂中具有结构域替换/交换(CrossMabVH-VL)的多特异性抗体。它们明显地减少由针对第一抗原的轻链与针对第二抗原的错误重链的错配引起的副产物(与不具有所述结构域交换的方法相比较)。然而，其制备没有完全不含副产物。主要的副产物是基于Bence-Jones-型相互作用。还参见Schaefer，W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108(2011)11187-11191；在补充说明中的图S1I中。

WO 2014/072876中报道了血小板来源的生长因子B特异性抗体及其组合物与应用。WO 2005/087812中报道了VEGF/PDGF家族生长因子的多价抗体物质和方法。Vassbotn，F.S.，等人.(Biochim.Biophys.Acta.Mol.Cell Res.1054(1990)246-249)报道了针对PDGFB-链的单克隆抗体抑制C3H成纤维细胞中PDGF-诱导的DNA合成并且防止PDGF与其受体结合。

概述

本发明提供抗-PDGF-B抗体和使用其的方法。在具体的实施方案中，所述抗体是人源化的抗体。

本文报道的一方面是分离的与PDGF-B结合的抗体，其中所述抗体是鼠抗体的人源化变体，其中所述鼠抗体包含SEQ ID NO：01的重链可变结构域和SEQ ID NO：06的轻链可变结构域。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述人源化抗体在重链可变结构域中进一步包含在位置27的酪氨酸氨基酸残基，在位置40的精氨酸氨基酸残基，在位置43的组氨酸氨基酸残基和在位置73的色氨酸氨基酸残基(按照Kabat编号)。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述人源化抗体在重链可变结构域中进一步包含在位置78的丙氨酸氨基酸残基(按照Kabat编号)。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述人源化抗体在重链可变结构域中进一步包含在位置43的组氨酸氨基酸残基，在位置71的丙氨酸氨基酸残基，和在位置78的丙氨酸氨基酸残基(按照Kabat编号)。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述人源化抗体在轻链可变结构域中进一步包含在位置43的氨基酸残基脯氨酸，和在位置68的氨基酸残基精氨酸(按照Kabat编号)。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述人源化抗体在轻链可变结构域中进一步包含在位置43的氨基酸残基脯氨酸(按照Kabat编号)。

本文报道的一方面是特异性结合人PDGF-B的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：02的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3。

在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-L3。

本文报道的一方面是与包含下述的抗体特异性结合相同的人PDGF-B表位的抗体：(a)包含SEQ ID NO：02的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-L3。

本文报道的一方面是特异性结合人PDGF-B的抗体，其中所述抗体包含：

a)(i)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H3，或

b)(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-H3，或

c)(i)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H3，或

d)(i)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的HVR-H3，或

e)(i)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3，或

f)(i)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-H2和(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3。

在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：

a)(vi)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L2，(vi)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HVR-L3，或

b)(vi)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的HVR-L2，(vi)包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的HVR-L3，或

c)(vi)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的HVR-L2，(vi)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-L3，或

d)(vi)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L2，(vi)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，所述抗体包含：

a)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的可变重链结构域，或

b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的可变重链结构域，或

c)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的可变重链结构域，或

d)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的可变重链结构域，或

e)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的可变重链结构域，或

f)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的可变重链结构域。

在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：

a)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的可变轻链结构域，或

b)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的可变轻链结构域，或

c)包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的可变轻链结构域，或

d)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的可变轻链结构域。

本文报道的一方面是特异性结合人PDGF-B的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的HVR-H3。

在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的HVR-L3。

本文报道的一方面是特异性结合人PDGF-B的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的HVR-H3。

在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HVR-L3。

本文报道的一方面是特异性结合人PDGF-B的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的HVR-H3。

在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的HVR-L3。

本文报道的一方面是特异性结合人PDGF-B的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的HVR-H3。

在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：90的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列的HVR-L3。

本文报道的一方面是特异性结合人PDGF-B的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3。

在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的HVR-L3。

本文报道的一方面是特异性结合人PDGF-B的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3。

在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列的HVR-L3。

本文报道的一方面是这样的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：10的序列的重链可变结构域氨基酸序列和选自SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：52的组的轻链可变结构域氨基酸序列。

本文报道的一方面是这样的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：15的序列的重链可变结构域氨基酸序列和选自SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：52的组的轻链可变结构域氨基酸序列。

本文报道的一方面是这样的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：20的序列的重链可变结构域氨基酸序列和选自SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：52的轻链可变结构域氨基酸序列。

本文报道的一方面是这样的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：25的序列的重链可变结构域氨基酸序列和选自SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：52组的轻链可变结构域氨基酸序列。

本文报道的一方面是这样的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：30的序列的重链可变结构域氨基酸序列和选自SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：52的组的轻链可变结构域氨基酸序列。

本文报道的一方面是这样的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：35的序列的重链可变结构域氨基酸序列和选自SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：52的轻链可变结构域氨基酸序列。

本文报道的一方面是特异性结合人PDGF-BB和人PDGF-AB但不结合人PDGF-AA的抗体。

在一个实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：90的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列的HVR-L3。

本文报道的一方面是特异性结合人PDGF-BB和PDGF-AB以及PDGF-AA的抗体。

在一个实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：02的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3.。

在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(a)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-L3。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述抗体是人IgG1亚类的或人IgG4亚类的。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述抗体是具有κ轻链的人IgG1亚类的。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。

在一个实施方案中，所述抗体是双特异性抗体。

在所有方面的一个实施方案中，所述抗体特异性结合人PDGF-B但不结合人PDGF-C。

在所有方面的一个实施方案中，所述抗体特异性结合人、大鼠、小鼠和食蟹猴PDGF-B。

在所有方面的一个实施方案中，所述抗体通过抑制PDGF-B与其受体的结合而抑制人PDGF-B的生物学活性。

在所有方面的一个实施方案中，所述抗体通过抑制细胞迁移而抑制人PDGF-B的生物学活性。

在所有方面的一个实施方案中，所述抗体通过抑制PDGF-B受体磷酸化而抑制人PDGF-B的生物学活性。

在所有方面的一个实施方案中，所述抗体通过抑制细胞增殖而抑制人PDGF-B的生物学活性。

本文报道的一方面是编码本文报道的抗体的(分离的)核酸。

本文报道的一方面是包含本文报道的核酸的宿主细胞。

本文报道的一方面是制备本文报道的抗体的方法，所述方法包括培养本文报道的宿主细胞，从而产生所述抗体，并且从所述宿主细胞或培养基中回收所述抗体。

本文报道的一方面是包含本文报道的抗体和药用载体的药物制剂。

在一个实施方案中，所述药物制剂进一步包含另外的治疗剂。在一个实施方案中，所述另外的治疗剂是抗-ANG2抗体或抗-VEGF抗体。

本文报道的一方面是本文报道的抗体，其用作药物。

本文报道的一方面是本文报道的抗体，其用于治疗眼血管疾病，优选用于治疗黄斑变性。

本文报道的抗体用于抑制PDGF-B与其受体之间的相互作用。

本文报道的抗体用于抑制细胞迁移。

本文报道的抗体用于抑制增殖。

本文报道的一方面是本文报道的抗体在制备药物中的应用。

在一个实施方案中，所述药物用于治疗眼血管疾病，优选用于治疗黄斑变性。

在一个实施方案中，所述药物用于抑制PDGF-B与其受体之间的相互作用。

本文报道的一方面是治疗具有眼血管疾病、优选具有黄斑变性的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文报道的抗体。

本文报道的一方面是抑制个体中PDGF-B与其受体之间的相互作用的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文报道的抗体，从而抑制PDGF-B与其受体之间的相互作用。

发明实施方案详述

I.定义

用于本文的目的的“接纳体人框架”是包含如下文定义的源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的接纳体人框架可以包含其相同氨基酸序列，或其可以含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数量为10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，或2个或更少。在一些实施方案中，VL接纳体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。

“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本文中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(K_d)表示。通过本领域已知的常见方法(包括本文描述的那些)，可以测量亲和力。在下面描述了用于测量结合亲和力的具体举例性和示例性的实施方案。

“亲和力成熟的”抗体表示，与不具有这种改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，这种改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。

术语“抗-PDGF-B抗体”和“结合PDGF-B的抗体”表示这样的抗体：其能够以足够的亲和力结合PDGF-B，使得所述抗体可用作靶向PDGF-B的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，如例如通过ELISA或表面等离子体共振所测得的，抗-PDGF-B抗体与无关的、非-PDGF-B蛋白结合的程度小于所述抗体与PDGF-B的结合的约10％。在某些实施方案中，结合PDGF-B的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM(例如，10^-8M或更低，例如，10^-8M至10^-10M，例如，10^-9M至10^-10M)的解离常数(KD)。在某些实施方案中，抗-PDGF-B抗体结合在来自不同物种的PDGF-B之间保守的PDGF-B的表位。

本文中的术语“抗体”以最宽泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括，但不限于，单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。

“抗体片段”表示除了完整抗体以外的分子，所述分子包含完整抗体的一部分，所述部分结合所述完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于：Fv、Fab、Fab’、Fab'-SH、F(ab')₂；双抗体；直链抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由多个抗体片段形成的多特异性抗体。

与参比抗体“结合相同表位的抗体”是指与所述参比抗体一样具有与至少一些相同的氨基酸残基相互作用的抗体。例如，这些相互作用是带电荷氨基酸残基之间的离子相互作用或疏水氨基酸残基之间的疏水相互作用。

术语“嵌合的”抗体表示这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，同时重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种。

抗体的“类型”表示其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要的抗体类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。

术语“免疫缀合物”表示抗体与非抗体结构部分之间的共价缀合物。所述非抗体结构部分可以是检测标记、效应分子或细胞毒性剂。

本文中使用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括、但不限于：放射性同位素(例如，At²¹¹，I¹³¹，I¹²⁵，Y⁹⁰，Re¹⁸⁶，Re¹⁸⁸，Sm¹⁵³，Bi²¹²，P³²，Pb²¹²和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段诸如溶核酶；抗生素；毒素诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下面公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。

“效应子功能”表示可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，其随抗体种类改变。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B-细胞活化。

试剂(例如，药物制剂)的“有效量”表示在必要的剂量和持续必要的时间段，有效地实现期望的治疗或预防结果的量。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-端区域，该区域含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。但是，Fc区的C-端赖氨酸(Lys447)或C端甘氨酰-赖氨酸二肽(Gly446Lys447)可以存在或不存在。除非在本文中另外指出，在Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如在Kabat，E.A.等人.，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication 91-3242中所述。

“框架”或“FR”表示除了高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下述顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完整的抗体”在本文中互换地用于表示这样的抗体：其具有与天然抗体结构基本上类似的结构或具有含有如本文中定义的Fc区的重链。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”互换使用，且表示其中已经引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和由其来源的后代(不考虑传代次数)。后代在核酸内容物方面可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。针对最初转化的细胞筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代包括在本文中。

“人抗体”是这样的抗体：其氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体或源自利用人抗体组库(repertoires)或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。该人抗体的定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的框架。通常，从可变结构域序列的亚组选择人免疫球蛋白VL或VH序列。通常，序列的亚组是如Kabat，E.A.等人.，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版，Bethesda MD(1991)，NIH Publication 91-3242，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，所述亚组是如在Kabat等人(出处同上)中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚组是如在Kabat等人(出处同上)中的亚组III。

“人源化的”抗体表示包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个和通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”表示已经经历人源化的抗体。

本文中使用的术语“高变区”或“HVR”表示抗体可变结构域的在序列上高变(“互补性决定区”或“CDR”)和/或形成在结构上确定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的每个区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL(L1、L2、L3)中。

本文的HVR包括：

(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处存在的高变环(Chothia，C.和Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；

(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处存在的CDR(Kabat，E.A.等人.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242.)；

(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处存在的抗原接触点(MacCallum等人.J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和

(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，其包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。

除非另有说明，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人(出处同上)编号。

“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子缀合的抗体。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，驯养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物诸如猴)，兔，和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述个体或受试者是人。

“分离的”抗体是已经与它的天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)来确定。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman，S.等人.，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。

“分离的”核酸表示已经与它的天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但是所述核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置。

“分离的编码抗-PDGF-B抗体的核酸”表示编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单个载体或分开的载体中的这样的核酸分子、以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置的这样的核酸分子。

本文中使用的术语“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括，但不限于，杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其他示例性的制备单克隆抗体的方法。

“裸抗体”表示没有与异源结构部分(例如，细胞毒性的结构部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。

“天然抗体”表示具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由二硫键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N-端至C-端，每个重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N-端至C-端，每个轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，接着是恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列归入两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。

术语“包装说明书”用于表示治疗性产品的商业包装中通常包括的使用说明，其含有关于这样的治疗性产品的使用的适应证、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌和/或告诫的信息。

相对于参比多肽序列而言的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为，比对所述序列，如果必要的话引入间隙以实现最大序列同一性百分比，且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分，候选序列中与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术中的多种方式实现，例如，使用公众可得到的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括实现在要对比的序列的全长上的最大比对所需的任何算法。但是，为了本文的目的，使用序列对比计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列对比计算机程序由Genentech，Inc.创造，并且源代码已经在美国版权局(U.S.Copyright Office，Washington D.C.，20559)与用户文档一起提交，其在美国版权登记号TXU510087下登记。ALIGN-2程序可以从Genentech，Inc.，South San Francisco，California公开获得，或可以从源代码编译。应该编译ALIGN-2程序以在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列对比参数由ALIGN-2程序设定并且不改变。

在采用ALIGN-2进行氨基酸序列对比的情况下，按下述计算给定氨基酸序列A相对、与、或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以可替换地叙述为相对、与、或针对给定氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)：

100×分数X/Y

其中X是通过序列比对程序ALIGN-2(在该程序的A和B的比对中)评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A相对B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别说明，本文使用的所有％氨基酸序列同一性值如在紧邻的上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得。

术语“药物制剂”表示这样的制品：其呈使得包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式，并且所述制剂不含有对所述制剂要施用的受试者有不可接受的毒性的额外组分。

“药学上可接受的载体”表示药物制剂中除了活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

术语“PDGF-B”用在本文中是指人PDGF-B。该术语包括“全长”、未加工的PDGF-B以及由于在细胞内加工导致的任何形式的PDGF-B。该术语还包括天然存在的PDGF-B变体，例如，剪接变体或等位基因变体。人PDGF-B的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：110中。

本文中使用的“治疗(treatment)”(和其语法变体诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)表示试图改变治疗的个体的天然进程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学进程中执行。期望的治疗效果包括，但不限于：防止疾病的发生或复发，缓解症状，减少疾病的任何直接或间接病理学后果，防止转移，降低疾病进展的速度，改善或减轻疾病状态，以及减轻或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。

术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与所述抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有类似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见，例如，Kindt，T.J.等人.Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(2007)，第91页)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原-结合特异性。此外，使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补VL或VH结构域的文库，可以分离结合特定抗原的抗体(参见，例如，Portolano，S.等人.，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson，T.等人.，Nature 352(1991)624-628)。

本文中使用的术语“载体”表示能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合进它已经引入其中的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文称为“表达载体”。

II.组合物和方法

本发明的单克隆抗体特异性结合PDGF-B分子上参与PDGF-B的受体结合和增殖活性的决定簇位点。单克隆人源化抗体不结合PDGF-C。本文报道的特异性抗体结合人PDGF-BB和PDGF-AB但不结合PDGF-AB。本文报道的其他特异性抗体结合人PDGF-BB和PDGF-AB以及PDGF-AA。

A.示例性的抗-PDGF-B抗体

本文提供不同的新型的抗-人PDGF-B抗体。

第一抗-PDGF-B抗体是具有SEQ ID NO：01的VH和SEQ ID NO：06的VL的新型鼠抗-人PDGF-B抗体。该抗体在下文中称为mumAb。该抗体结合人、食蟹猴、大鼠和鼠PDGF-B并且抑制PDGF-B与其受体之间的相互作用。

所述抗体具有下面表格中列出的下述特征。

	kd[1/s]	t1/2[min]
			mumAb	4.50E-04	26

下表显示了所述抗体的存储稳定性(具有参比表面的活性浓度)。

通过确定聚集起始温度(Tagg)和解链温度(Tm)(见下表)评价所述抗体的热稳定性。

	Tagg[℃]	Tm[℃]
			mumAb	57	62-63.5

基于鼠mumAb的氨基酸序列(SEQ ID NO：01和SEQ ID NO：06)，产生相应的人源化抗-PDGF-B抗体。VH的人源化变体是基于人种系IMGT_hVH_1_69、IMGT_hVH_4_59和IMGT_hVH_3_23结合人J-元件种系IGHJ5-01。

在IMGT_hVH_1_69变体中，在框架区1的位置27(G27Y)和/或框架区2的位置40(A40R)和/或位置43(Q43H)和/或框架区3的位置73(E73T)引入回复突变。

在IMGT_hVH_4_59中，在框架区3的位置78(F78A)引入一个回复突变。在IMGT_hVH_3_23中，在框架区2的位置43(K43H)和框架区3的位置71(R71A)和78(L78A)引入回复突变。

VL的人源化变体是基于人种系IMGT_hVK_3_20、IMGT_hVK_4_1和IMGT_hVK_1_27结合人J-元件种系IGKJ2-01。

对于一种变体，在IMGT_hVK_3_20中，在框架区2的位置43(A43P)和框架区3的位置68(G68R)引入回复突变。在IMGT_hVK_1_27中，在框架区3的位置43(V43P)引入一个回复突变。

该抗体表示为作为单特异性抗体的抗体0044和作为具有另外的ANG2结合特异性的双特异性CrossMab的抗体0146。

其余的抗体是从人Ig基因座转基因兔获得的人抗体。所述抗体具有下表中列出的结合特性。

在一个实施方案中，所述人源化抗-PDGF-B抗体结合人、大鼠、小鼠和食蟹猴PDGF-B。

在多样性活性测定中，所述抗体表现出可以从下面表格中所列的数据所看出的生物学活性。

使用表面等离体子共振技术确定不同抗体的动力学结合特性(见下面的表格)。

	kd[1/s]	t1/2[min]
			抗体-0058	2.91E-04	40
抗体-0060	2.64E-04	44
			抗体-0064	1.35E-04	85
抗体-0085	1.02E-04	114
			抗体-0086	7.93E-05	146

Fab	ka[1/Ms]	kd[1/s]	KD＊[nM]	t1/2[s]
					抗体-0106	2.02E+05	3.74E-04	2	1853
抗体-0107	1.95E+05	3.62E-04	2	1915
					抗体-0108	3.96E+05	7.73E-03	20	90
抗体-0109	3.14E+05	1.36E-02	43	51
					抗体-0110	1.30E+05	1.01E-03	8	686

下表显示不同抗体的存储稳定性(具有参比表面的活性浓度)。

	Tagg[℃]	Tm[℃]
			抗体-0086	64	64.5-68

抗体0144是一种双特异性抗-ANG2/PDGF-B抗体，其包含抗体0085的VH和VL结构域作为PDGF-B结合特异性。

抗体0117是一种双特异性抗-VEGF/PDGF-B抗体，其包含抗体0085的VH和VL结构域作为PDGF-B结合特异性。

为了确定动力学结合值，使用实施例32中报道的测定。

ANG2	ka[1/Ms]	kd[1/s]	KD＊[nM]	t1/2[s]
					抗体-0144	9.06E+04	1.55E-03	17	446

VEGF	ka[1/Ms]	kd[1/s]	KD＊[nM]	t1/2[s]
					抗体-0117	2.46E+04	＜1E-06	＜0.1	-

通过SPR分析已经证明所有的双特异性抗体具有同时与其两个抗原结合的特性。

所述双特异性抗体在基于细胞的测定中表现出结合和生物学活性。

在ANG2特异性pTie2-ELISA中，抗体0144的活性是WO 2014/09465中报道的抗-ANG2/VEGF抗体的6倍。

在VEGF特异性报道子测定中，抗体0117具有与WO 2014/09465中报道的抗-ANG2/VEGF抗体相似的活性。

记载抗体0085具有SEQ ID NO：92-100的序列(结合位点，HVR，VH，VL)。抗体0085的双特异性形式记载在序列SEQ ID NO：131-134，147-150，和163-166中。所有这些序列单独地或组合地组成本发明的各个方面。

记载抗体0086具有SEQ ID NO：101-109的序列(结合位点，HVR，VH，VL)。抗体0086的双特异性形式记载在序列SEQ ID NO：135-138，151-154，和167-167中。所有这些序列单独地或组合地组成本发明的各个方面。

记载抗体0144具有SEQ ID NO：147-150的序列(CrossMab形式，2条重链，2条轻链)。

记载抗体0117具有SEQ ID NO：171-174的序列(CrossMab形式，2条重链，2条轻链)。

将抗体0144和0145在不同pH值温育2周，然后分别确定它们与PDGF-BB和ANG2的结合。

本文报道的一方面是人源化抗-人PDGF-B抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO：02的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ IDNO：05的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ IDNO：07的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-L3。

本文报道的一方面是人源化抗-人PDGF-B抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO：02的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ IDNO：05的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ IDNO：07的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-L3。

本文报道的一方面是抗-人PDGF-B抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ IDNO：100的氨基酸序列的HVR-L3。

在一方面中，本发明提供一种抗-PDGF-B抗体，其包含选自下述的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO：95的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQID NO：98的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的HVR-L3。

在一个优选的实施方案中，本文报道的抗-PDGF-B抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ IDNO：96的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO：99的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的HVR-L3。还在一个优选的实施方案中，本文报道的抗-PDGF-B抗体包含具有SEQ ID NO：92的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：97的氨基酸序列的VL。还在一个优选的实施方案中，所述抗-PDGF-B抗体是双特异性抗体。

在一方面中，本发明提供包含选自下述的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列的抗体：(a)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQ ID NO：100的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3，包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的HVR-L3，和包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的HVR-H2。在另一个实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一方面中，本发明提供包含选自下述的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列的抗体：(a)包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一方面中，本发明的抗体包含：(a)包含选自下述的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列的VH结构域：(i)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含选自下述的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列的VL结构域：(i)包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一方面中，本发明提供包含下述的抗体：(a)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO：100的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一方面中，抗-PDGF-B抗体包含与SEQ ID NO：92的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-PDGF-B抗体保留结合PDGF-B的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO：92中总共1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-PDGF-B抗体包含SEQ ID NO：92中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个具体的实施方案中，VH包含选自下述的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQID NO：93的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一方面中，提供一种抗-PDGF-B抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO：97的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-PDGF-B抗体保留结合PDGF-B的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO：97中总共1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-PDGF-B抗体包含SEQ IDNO：97中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个具体的实施方案中，VL包含选自下述的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO：99的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一方面中，提供一种抗-PDGF-B抗体，其中所述抗体包含在上文提供的任一个实施方案中的VH和在上文提供的任一个实施方案中的VL。在一个实施方案中，所述抗体包含分别处在SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：97中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。

本文报道的一方面是包含下述的抗-人PDGF-B抗体：(a)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQID NO：109的氨基酸序列的HVR-L3。

在一方面中，本发明提供一种抗-PDGF-B抗体，其包含选自下述的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQID NO：104的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列的.HVR-L3。

在一个优选的实施方案中，所述抗-PDGF-B抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQID NO：108的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列的HVR-L3。还在一个优选的实施方案中，本文报道的抗-PDGF-B抗体包含具有SEQ ID NO：101的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：106的氨基酸序列的VL。还在一个优选的实施方案中，所述抗-PDGF-B抗体是双特异性抗体。

在一方面中，本发明提供一种包含选自下述的至少一个、至少两个或全部三个VHHVR序列的抗体：(a)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQ ID NO：109的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个实施方案中，所述抗体包含：含有SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3，含有SEQ ID NO：109的氨基酸序列的HVR-L3，和含有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的HVR-H2。在另一个实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一方面中，本发明提供包含选自下述的至少一个、至少两个或全部三个VLHVR序列的抗体：(a)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一方面中，本发明的抗体包含：(a)包含选自下述的至少一个、至少两个或全部三个VH HVR序列的VH结构域：(i)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含选自下述的至少一个、至少两个或全部三个VL HVR序列的VL结构域：(i)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一方面中，本发明提供包含下述的抗体：(a)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO：109的氨基酸序列的HVR-L3。

在另一方面中，抗-PDGF-B抗体包含与SEQ ID NO：101的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-PDGF-B抗体保留结合PDGF-B的能力。在某些实施方案中，SEQID NO：101中总共1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-PDGF-B抗体包含SEQ ID NO：101中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个具体的实施方案中，VH包含选自下述的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3。

在另一方面中，提供一种抗-PDGF-B抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO：106的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，相对于参比序列，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列包含置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗-PDGF-B抗体保留结合PDGF-B的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO：106中总共1-10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗-PDGF-B抗体包含SEQID NO：106中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个具体的实施方案中，VL包含选自下述的一个、两个或三个HVR：(a)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列的HVR-L3。

本文报道的一方面是包含两条重链和两条轻链的抗体，其中：a)第一重链具有SEQID NO：147的氨基酸序列，第二重链具有SEQ ID NO：148的氨基酸序列，第一轻链具有SEQID NO：149的氨基酸序列并且第二轻链具有SEQ ID NO：150的氨基酸序列，或b)所述抗体包含包括翻译后修饰(是Fc区域中的突变)的项目a)的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，本文报道的双特异性抗体具有突变P329G，L234A，L235A，I253A，H310A和H434A(按照Kabat索引编号)。

在另一方面中，提供抗-PDGF-B抗体，其中所述抗体包含如在上面提供的实施方案中的任一个中的VH，和如在上面提供的实施方案中的任一个中的VL。在一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：106中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。

在本发明的另一个方面，上述任一个实施方案中所述的抗-PDGF-B抗体是单克隆抗体。

在一个实施方案中，抗-PDGF-B抗体是抗体片段，例如，Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)₂片段。

在另一个实施方案中，所述抗体是全长抗体，例如，完整的IgG1抗体或如本文中定义的其他抗体类型或同种型。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述抗-PDGF-B抗体是效应子沉默的抗-PDGF-B抗体。在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述抗-PDGF-B抗体是效应子沉默的抗-PDGF-B抗体并且不结合人FcRn。在本文报道的所有方面的一个实施方案中是人IgG1亚类的抗-PDGF-B抗体并且在两条重链中具有突变L234A，L235A，P329G，I253A，H310A和H434A(按照Kabat索引编号)。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述抗-PDGF-B抗体是双特异性抗体。

本文报道的一方面是二价的双特异性抗体，其包含：

a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和

b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此替换，

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

a)中的抗体不包含b)中报道的修饰，并且a)中重链和轻链是分离的链。

在b)中的抗体中，

在所述轻链中

可变轻链结构域VL替换为所述抗体的可变重链结构域VH，

并且

在所述重链中

可变重链结构域VH替换为所述抗体的可变轻链结构域VL。

在一个实施方案中，

i)在a)中第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸(按照Kabat编号)被置换为带正电荷的氨基酸，并且，其中在a)中第一重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸(按照Kabat EU索引编号)被置换为带负电荷的氨基酸，

或

ii)在b)中第二轻链的恒定结构域CL，位置124的氨基酸(按照Kabat编号)被置换为带正电荷的氨基酸，并且，其中在b)中第二重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸(按照Kabat EU索引编号)被置换为带负电荷的氨基酸。

在一个优选的实施方案中，

i)在a)中第一轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸独立地被置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(按照Kabat编号)(在一个优选的实施方案中，独立地被置换为赖氨酸(K)或精氨酸(R))，并且，其中在a)中第一重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸独立地被置换为谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(按照Kabat EU索引编号)，

或

ii)在b)中第二轻链的恒定结构域CL中，位置124的氨基酸独立地被置换为赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)(按照Kabat编号)(在一个优选的实施方案中，独立地被置换为赖氨酸(K)或精氨酸(R))，并且，其中在b)中第二重链的恒定结构域CH1中，位置147的氨基酸或位置213的氨基酸独立地被置换为谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(按照Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸置换为K(按照Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中，在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸置换为E(按照Kabat的EU索引编号)。

在一个优选的实施方案中，在第一轻链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸置换为K，并且，在第一重链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸置换为E(按照Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中，在第二重链的恒定结构域CL中，位置124和123的氨基酸置换为K，并且，其中在第二轻链的恒定结构域CHl中，位置147和213的氨基酸置换为E，并且在第一轻链的结构域VL中，位置38的氨基酸置换为K，在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸置换为E，在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸置换为K，并且在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸置换为E(按照Kabat EU索引编号)。

本文报道的一方面是二价的、双特异性抗体，其包含

a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和

b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此替换，并且，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替换，

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

a)中的抗体不包含b)中报道的修饰，并且a)中的重链和轻链是分离的链。

在b)中的抗体中

在轻链中

可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替换，并且恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替换；并且

在重链中

可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替换，并且恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替换。

本文报道的一方面是二价的、双特异性抗体，其包含：

a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和

b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替换，

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

在b)中的抗体中

在轻链中

恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替换；并且在重链中

恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替换。

本文报道的一方面是多特异性抗体，其包含：

a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，和

b)一个、两个、三个或四个单链Fab片段，其特异性结合一至四种其他抗原(即，第二和/或第三和/或第四和/或第五抗原，优选地，特异性结合一种其他抗原，即第二抗原)，

其中b)中所述的单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C-或N-端的肽接头融合到a)中所述的全长抗体上，

其中第一抗原或所述其他抗原中的一种是人PDGF-B。

在一个实施方案中，与第二抗原结合的一个或两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C-端的肽接头融合到所述全长抗体上。

在一个实施方案中，与第二抗原结合的一个或两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链的C-端的肽接头融合到所述全长抗体上。

在一个实施方案中，与第二抗原结合的一个或两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的轻链的C-端的肽接头融合到所述全长抗体上。

在一个实施方案中，与第二抗原结合的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个重链或轻链的C-端的肽接头融合到所述全长抗体上。

在一个实施方案中，与第二抗原结合的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个重链的C-端的肽接头融合到所述全长抗体上。

在一个实施方案中，与第二抗原结合的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个轻链的C-端的肽接头融合到所述全长抗体上。

本文报道的一方面是三价的、双特异性抗体，其包含：

a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，

b)第一多肽，其由下述组成：

ba)抗体重链可变结构域(VH)，

或

bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，

其中所述第一多肽通过肽接头以其VH结构域的N-端融合到所述全长抗体的两条重链中的一条的C-端，

c)第二多肽，其由下述组成：

ca)抗体轻链可变结构域(VL)，

或

cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)，

其中所述第二多肽通过肽接头以VL结构域的N-端融合到所述全长抗体的两条重链中的另一条的C-端，

并且

其中第一多肽的抗体重链可变结构域(VH)和第二多肽的抗体轻链可变结构域(VL)一起形成特异性结合第二抗原的抗原-结合位点，

并且

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

在一个实施方案中，b)中多肽的抗体重链可变结构域(VH)与c)中多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过在下述位置之间引入二硫键而经由链间二硫键桥连接起来并稳定：

i)重链可变结构域位置44与轻链可变结构域位置100，或

ii)重链可变结构域位置105与轻链可变结构域位置43，或

iii)重链可变结构域位置101与轻链可变结构域位置100(总是按照Kabat EU索引编号)。

引入二硫键桥用于稳定的技术在例如WO 94/029350，Rajagopal，V.，等人.，Prot.Eng.(1997)1453-59；Kobayashi，H.，等人.，Nuclear Medicine&Biology，Vol.25，(1998)387-393；或Schmidt，M.，等人.，Oncogene(1999)181711-1721中描述。在一个实施方案中，在b)和c)的多肽的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置44与轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，在b)和c)的多肽的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置105与轻链可变结构域位置43之间(总是按照Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH与VL之间不具有所述任选的二硫化物稳定的三价双特异性抗体。

本文报道的一方面是三特异性或四特异性的抗体，其包含：

a)特异性结合第一抗原的全长抗体的第一轻链和第一重链，和

b)特异性结合第二抗原的全长抗体的第二(修饰的)轻链和第二(修饰的)重链，其中可变结构域VL和VH彼此替换，和/或其中恒定结构域CL和CH1彼此替换，和

c)其中特异性结合一种或两种其他抗原(即，第三和/或第四抗原)的一至四种抗原结合肽经由肽接头融合到a)和/或b)的轻链或重链的C-或N-端，

其中第一抗原或第二抗原或所述其他抗原中的一种是人PDGF-B。

在一个实施方案中，所述三特异性或四特异性的抗体在c)中包含特异性结合一种或两种其他抗原的一种或两种抗原结合肽。

在一个实施方案中，所述抗原结合肽选自scFv片段和scFab片段的组。

在一个实施方案中，所述抗原结合肽是scFv片段。

在一个实施方案中，所述抗原结合肽是scFab片段。

在一个实施方案中，所述抗原结合肽融合在a)和/或b)的重链的C-端。

在一个实施方案中，所述三特异性或四特异性的抗体在c)中包含一种或两种特异性结合一种其他抗原的抗原结合肽。

在一个实施方案中，所述三特异性或四特异性的抗体在c)中包含两个特异性结合第三抗原的相同的抗原结合肽。在一个优选的实施方案中，所述两个相同的抗原结合肽均经由相同的肽接头融合在a)和b)的重链的C-端。在一个优选的实施方案中，所述两个相同的抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。

在一个实施方案中，所述三特异性或四特异性的抗体在c)中包含特异性结合第三和第四抗原的两个抗原结合肽。在一个实施方案中，所述两个抗原结合肽均经由相同的肽连接体融合在a)和b)的重链的C-端。在一个优选的实施方案中，所述两个抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。

本文报道的一方面是双特异性的、四价抗体，其包含：

a)抗体的两条轻链和两条重链，其特异性结合第一抗原(并且包含两个Fab片段)，

b)抗体的两个另外的Fab片段，其特异性结合第二抗原，其中所述另外的Fab片段均经由肽接头分别融合到a)的重链的C-或N-端，

并且

其中在所述Fab片段中进行下述修饰：

i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，和/或恒定结构域CL和CH1彼此替换，

或

ii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，并且恒定结构域CL和CH1彼此替换，

并且

在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，或者恒定结构域CL和CH1彼此替换，

或

iii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，或恒定结构域CL和CH1彼此替换，

并且

在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，并且恒定结构域CL和CH1彼此替换，

或

iv)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，并且在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换，

或

v)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换，并且在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

在一个实施方案中，所述另外的Fab片段均经由肽接头融合在a)的重链的C-端或融合在a)的重链的N-端。

在一个实施方案中，所述另外的Fab片段均经由肽接头融合在a)的重链的C-端。

在一个实施方案中，所述另外的Fab片段均经由肽连接体融合在a)的重链的N-端。

在一个实施方案中，在所述Fab片段中进行下述修饰：

i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，

和/或

恒定结构域CL和CH1彼此替换。

在一个实施方案中，在所述Fab片段中进行下述修饰：

i)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，

和/或

恒定结构域CL和CH1彼此替换。

在一个实施方案中，在所述Fab片段中进行下述修饰：

i)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CHl彼此替换。

在一个实施方案中，在所述Fab片段中进行下述修饰：

i)在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，

和/或

恒定结构域CL和CH1彼此替换。

在一个实施方案中，在所述Fab片段中进行下述修饰：

i)在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换。

本文报道的一方面是双特异性的四价抗体，其包含：

a)第一抗体的(修饰的)重链，所述第一抗体特异性结合第一抗原并且包含第一VH-CH1结构域对，其中所述第一抗体的第二VH-CH1结构域对的N-端经由肽接头融合在所述重链的C-端，

b)a)所述的第一抗体的两条轻链，

c)第二抗体的(修饰的)重链，所述第二抗体特异性结合第二抗原并且包含第一VH-CL结构域对，其中所述第二抗体的第二VH-CL结构域对的N-端经由肽接头融合在所述重链的C-端，并且

d)c)所述的第二抗体的两条(修饰的)轻链，它们分别包含CL-CH1结构域对，

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

本文报道的一方面是包含下述的双特异性抗体：

a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链，和

b)特异性结合第二抗原的第二全长抗体的重链和轻链，其中所述重链的N-端经由肽接头连接在所述轻链的C-端，

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

a)中的抗体不包含b)中报道的修饰，并且所述重链和轻链是分离的链。

本文报道的一方面是包含下述的双特异性抗体：

b)Fv片段，其特异性结合第二抗原并包含VH2结构域和VL²结构域，其中两个结构域通过二硫键桥彼此连接，

其中仅有VH²结构域和VL²结构域中的一个经由肽接头融合到特异性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链，

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

在所述双特异性中，a)中的重链和轻链是分离的链。

在一个实施方案中，VH²结构域和VL²结构域中的另一个没有经由肽接头融合到特异性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链。

在本文报道的所有方面中，第一轻链包含VL结构域和CL结构域，第一重链包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。

在所有方面的一个实施方案中，本文报道的抗体是多特异性抗体，其需要至少两个重链多肽的异二聚化，并且其中所述抗体特异性结合人PDGF-B和第二非-人PDGF-B抗原。

已经记载了一些用于CH3-修饰的方法，以支持异二聚化，例如，记载在WO 96/27011，WO 98/050431，EP 1870459，WO 2007/110205，WO 2007/147901，WO 2009/089004，WO2010/129304，WO 2011/90754，WO 2011/143545，WO 2012/058768，WO 2013/157954，WO2013/096291中，它们通过引用包括在本文中。典型地，在本领域已知的方法中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域都是以互补方式改造的，使得包含一个改造的CH3结构域的重链不再与相同结构的另一条重链同型二聚化(例如，CH3-改造的第一重链可能不再与另一条CH3-改造的第一重链同型二聚化；并且CH3-改造的第二重链可能不再与另一条CH3-改造的第二重链同型二聚化)。由此，包含一个改造的CH3结构域的重链被迫使与另一条包含以互补方式改造的CH3结构域的重链异二聚化。对于本发明的这个实施方案，第一重链的CH3结构域与第二重链的CH3结构域通过氨基酸置换以互补方式改造，从而迫使第一重链和第二重链异二聚化，而第一重链和第二重链不再能够同二聚化(例如，由于空间原因)。

考虑将上文引用并包括的本领域已知的支持重链异二聚化的不同的方法作为用于本发明的多特异性抗体的不同的备选方案，所述多特异性抗体包含来源于特异性结合第一抗原的第一抗体的“非交叉的Fab区”和来源于特异性结合第二抗原的第二抗体的“交叉的Fab区”连同上文描述的用于本发明的特定的氨基酸置换。

本文报道的多特异性抗体的CH3结构域可以通过“凸起-进入-孔洞”技术改变，该技术以一些实例详细记载在，例如WO 96/027011，Ridgway，J.B.，等人.，Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant，A.M.，等人.，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中。在这种方法中，两个CH3结构域的相互作用表面被改变，以增加包含这两个CH3结构域的两个重链的异二聚化。(这两个重链的)这两个CH3结构域中的每一个都可以是“凸起”，而另一个是“孔洞”。引入二硫键桥进一步稳定该异二聚体(Merchant，A.M.，等人.，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell，S.，等人.，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并且增加产量。

在一个优选的实施方案中，本文报道的双特异性抗体在“凸起链”的CH3结构域中包含T366W突变并且在“孔洞链”的CH3结构域中包含T366S、L368A、Y407V突变(按照KabatEU索引编号)。也可以使用CH3结构域之间的另外的链间二硫键桥(Merchant，A.M.，等人.，Nature Biotech.16(1998)677-681)，例如，通过向“凸起链”的CH3结构域中引入Y349C突变，和向“孔洞链”的CH3结构域中引入E356C突变或S354C突变。由此，在另一个优选的实施方案中，本文报道的多特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C和T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含E356C、T366S、L368A和Y407V突变，或本文报道的多特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C和T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变(一个CH3结构域中的额外的Y349C突变和另一个CH3结构域中的额外的E356C或S354C突变形成链间二硫键桥)(根据Kabat EU索引编号)。

但是，还可以备选地或另外应用EP 1 870 459A1所述的其他凸起-入-孔洞技术。在一个实施方案中，本文报道的多特异性抗体包含在“凸起链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变，和在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(按照Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中，本文报道的多特异性抗体包含在“凸起链”的CH3结构域中的T366W突变，和在“孔洞链”的CH3结构域中的T366S、L368A和Y407V突变，和另外的在“凸起链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变以及在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(按照Kabat EU索引编号)。

在一个实施方案中，本文报道的多特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C和T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变，或本文报道的多特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C和T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变，以及另外包含在“凸起链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变和在“孔洞链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(按照Kabat EU索引编号)。

除了“凸起-进入-孔洞技术”之外，其他用于修饰多特异性抗体的重链的CH3结构域从而迫使异二聚化的技术在本领域中是已知的。在本文中考虑将这些技术，尤其是记载在WO 96/27011，WO 98/050431，EP 1870459，WO 2007/110205，WO 2007/147901，WO 2009/089004，WO 2010/129304，WO 2011/90754，WO 2011/143545，WO 2012/058768，WO 2013/157954和WO 2013/096291中的那些，作为“凸起-进入-孔洞技术”的备选方案与本文报道的多特异性抗体联用。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用EP 1870459中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。这一方法是基于在两条重链，即，第一和第二重链之间的CH3/CH3-结构域-界面中的特定氨基酸位置引入带相反电荷的带电荷氨基酸。

因此，该实施方案涉及本文报道的多特异性抗体，其中在所述抗体的三级结构中，第一重链的CH3结构域与第二重链的CH3结构域形成位于各自抗体CH3结构域之间的界面，其中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域各自的氨基酸序列分别包含位于抗体三级结构中的所述界面内的一组氨基酸，其中来自位于一条重链的CH3结构域中的界面内的该组氨基酸中的第一氨基酸被置换为带正电荷的氨基酸，并且来自位于另一条重链的CH3结构域中的界面内的该组氨基酸中的第二氨基酸被置换为带负电荷的氨基酸。该实施方案所述的多特异性抗体在本文中还称为“CH3(+/-)-改造的多特异性抗体”(其中缩写“+/-”表示被引入到各自的CH3结构域中的带相反电荷的氨基酸)。

在本文报道的所述CH3(+/-)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述带正电荷的氨基酸选自K、R和H，并且所述带负电荷的氨基酸选自E或D。

在本文报道的所述CH3(+/-)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述带正电荷的氨基酸选自K和R，并且所述带负电荷的氨基酸选自E或D。

在本文报道的所述CH3(+/-)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，所述带正电荷的氨基酸是K，并且所述带负电荷的氨基酸是E。

在本文报道的所述CH3(+/-)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置409的氨基酸R被置换为D，并且位置的氨基酸K被置换为E，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置399的氨基酸D被置换为K，并且位置357的氨基酸E被置换为K(按照Kabat EU索引编号)。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO2013/157953中记载的方法支持多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为K，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被置换为D(按照Kabat EU索引编号)。在本文报道的所述多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为K，位置351的氨基酸L被置换为K，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被置换为D(按照Kabat EU索引编号)。

在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为K，位置351的氨基酸L被置换为K，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被置换为D(按照Kabat EU索引编号)。另外，在另一条重链的CH3结构域中包含下述置换中的至少一个：位置349的氨基酸Y被置换为E，位置349的氨基酸Y被置换为D并且位置368的氨基酸L被置换为E(按照Kabat EU索引编号)。在一个实施方案中，位置368的氨基酸L被置换为E(按照Kabat EU索引编号)。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO2012/058768中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被置换为Y并且位置407的氨基酸Y被置换为A，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为A，并且位置409的氨基酸K被置换为F(按照Kabat EU索引编号)。在另一个实施方案中，除了前述置换之外，在另一条重链的CH3结构域中，在下述位置的氨基酸中的至少一个被置换：位置411(初始是T)，399(初始是D)，400(初始是S)，405(初始是F)，390(初始是N)和392(初始是K)(按照Kabat EU索引编号)。优选的置换为：

-位置411的氨基酸T被选自N，R，Q，K，D，E和W的氨基酸置换(按照Kabat EU索引编号)，

-位置399的氨基酸D被选自R，W，Y和K的氨基酸置换(按照Kabat EU索引编号)，

-位置400的氨基酸S被选自E，D，R和K的氨基酸置换(按照Kabat EU索引编号)，

-位置405的氨基酸F被选自I，M，T，S，V和W的氨基酸置换(按照Kabat EU索引编号)；

-位置390的氨基酸N被选自R，K和D的氨基酸置换(按照Kabat EU索引编号)；和

-位置392的氨基酸K被选自V，M，R，L，F和E的氨基酸置换(按照Kabat EU索引编号)。

在本文报道的所述多特异性抗体的另一个实施方案中(按照WO2012/058768所述改造)，在一条重链的CH3结构域中，位置351的氨基酸L被置换为Y并且位置407的氨基酸Y被置换为A，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为V并且位置409的氨基酸K被置换为F(按照Kabat EU索引编号)。在本文报道的所述多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y被置换为A，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为A并且位置409的氨基酸K被置换为F(按照KabatEU索引编号)。在所述最后一个前述的实施方案中，在所述另一条重链的CH3结构域，位置392的氨基酸K被置换为E，位置411的氨基酸T被置换为E，位置399的氨基酸D被置换为R并且位置400的氨基酸S被置换为R(按照Kabat EU索引编号)。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO 2011/143545中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在两条重链的CH3结构域中在位置368和/或409引入氨基酸修饰(按照Kabat EU索引编号)。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO 2011/090762中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。WO 2011/090762涉及按照“凸起-进入-孔洞”技术进行的氨基酸修饰。在本文报道的所述CH3(KiH)-改造的多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为W，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y被置换为A(按照Kabat EU索引编号)。在本文报道的所述CH3(KiH)-改造的多特异性抗体的另一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置366的氨基酸T被置换为Y，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置407的氨基酸Y被置换为T(按照Kabat EU索引编号)。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，其是IgG2同种型的，使用WO201I/090762中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO 2009/089004中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置392的氨基酸K或N被置换为带负电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被置换为E或D，在一个优选的实施方案中，被置换为D)，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置399的氨基酸D、位置356的氨基酸E或D或位置357的氨基酸E被置换为带正电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被置换为K或R，在一个优选的实施方案中，被置换为K，在一个优选的实施方案中，位置399或356的氨基酸被置换为K)(按照Kabat EU索引编号)。在另一个实施方案中，除了前述置换之外，在一条重链的CH3结构域，位置409的氨基酸K或R被置换为带负电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被置换为E或D，在一个优选的实施方案中，被置换为D)(按照Kabat EU索引编号)。在甚至另一个实施方案中，除了或备选地前述置换之外，在一条重链的CH3结构域，位置439的氨基酸K和/或位置370的氨基酸K彼此独立地被置换为带负电荷的氨基酸(在一个优选的实施方案中，被置换为E或D，在一个优选的实施方案中，置换为D)(按照Kabat EU索引编号)。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO 2007/147901中所述的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。在本文报道的所述多特异性抗体的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置253的氨基酸K被置换为E，位置282的氨基酸D被置换为K，并且位置322的氨基酸K被置换为D，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置239的氨基酸D被置换为K，位置240的氨基酸E被置换为K，并且位置292的氨基酸K被置换为D(按照Kabat EU索引编号)。

在本文报道的多特异性抗体的一个实施方案中，使用WO 2007/110205中记载的方法来支持所述多特异性抗体的第一重链与第二重链的异二聚化。

在本文报道的所有方面和实施方案的一个实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。在本发明的一个优选的实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述抗体是二价或三价抗体。在一个实施方案中，所述抗体是二价抗体。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述多特异性抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是人IgG1亚类的或是具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是人IgG2亚类的。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于所述多特异性抗体是人IgG3亚类的。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体示人IgG4亚类的，或是具有另外的突变S228P的人IgG4亚类的。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是人IgG1亚类的或人IgG4亚类的。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的(按照Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的(按照Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是具有突变S228P和L235E的人IgG4亚类的(按照KabatEU索引编号)。在本文报道的所有方面的另一个实施方案中，所述多特异性抗体特征在于，所述多特异性抗体是具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的(按照Kabat EU索引编号)。

在本文报道的所有方面的一个实施方案中，包含含有本文指定的CH3结构域的重链的抗体包含另外的C-端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，按照Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个实施方案中，包含含有本文指定的CH3结构域的重链的抗体包含另外的C-端甘氨酸残基(G446，按照Kabat EU索引编号)。

在另一方面中，按照上述实施方案中任一个所述的抗-PDGF-B抗体可以结合单独的或组合的如在下文1-5节中所述的任意特征。

1.抗体亲和性

在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM(例如10^-8M或更少，例如10^-8M-10^-10M，例如，10^-9M-10^-10M)的解离常数(KD)。

用于确定KD值的方法在下文的实施例中描述。

当使用表面等离体子共振测定时，备选地，KD值可以按下文所述进行测量：使用或(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)的测定在25℃以～10个响应单位(RU)的固定的抗原CM5芯片进行。在一个实施方案中，按照供应商的使用说明，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠(pH 4.8)稀释为5μg/mL(～0.2μM)，之后以5μL/分钟的流速注入，获得大约10个响应单位(RU)的偶联的蛋白。注入抗原之后，注入1M乙醇胺以阻断未反应的基团。为了动力学测量，在25℃，以大约25μL/min的流速注入在具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单的一对一朗缪尔(Langmuir)结合模型(评价软件版本3.2)，通过同时匹配结合和解离传感图，计算结合速率(k_a)和解离速率(k_d)。平衡解离常数(KD)计算为比例k_d/k_a(参见，例如，Chen，Y.等人.，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。通过上述表面等离子共振测定，如果结合速率(on-rate)超过10⁶M^-1s^-1，那么解离速率可以通过使用荧光淬灭技术确定，所述荧光淬灭技术在以光谱仪，如装有停流(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌的比色皿的8000-系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)测量的增加的抗原浓度的存在下，在25℃测量在PBS(pH 7.2)中20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括，但不限于：Fab，Fab’，Fab'-SH，F(ab')₂，Fv，和scFv片段，以及下面描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson，P.J.等人.，Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见，例如，Plueckthun，A.，在：The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)中，Vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York(1994)，第269-315页；也参见WO 93/16185；US 5,571,894和US 5,587,458。关于包含结合补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)₂片段的讨论，参见US 5,869,046。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson，P.J.等人.，Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger，P.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。三抗体和四抗体也描述在Hudson，P.J.等人.，Nat.Med.9(2003)129-134)中。

单结构域抗体是这样的抗体片段：其包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或者轻链可变结构域的全部或部分。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，US 6,248,516)。

可以通过多种技术制备抗体片段，所述技术包括，但不限于，如本文中所述的完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)的生产。

3.嵌合抗体和人源化抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述在，例如，US4,816,567；和Morrison，S.L.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855)中。在一个实施例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物诸如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实施例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中所述类或亚类已经从亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对于人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含这样的一个或多个可变结构域：其中HVR例如CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地也包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人抗体(例如，HVR残基所来源的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法综述在，例如，Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，且进一步描述在，例如，Riechmann，I.等人.，Nature332(1988)323-329；Queen，C.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US5，821,337，US 7,527,791，US 6,982,321，和US 7,087,409；Kashmiri，S.V.等人.，Methods36(2005)25-34(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan，E.A.，Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述了“表面再建”)；Dall'Acqua，W.F.等人.，Methods 36(2005)43-60(描述了“FR改组”)；和Osbourn，J.等人.，Methods 36(2005)61-68和Klimka，A.等人.，Br.J.Cancer83(2000)252-260(描述了用于FR改组的“指导选择”方案)。

可以用于人源化的人框架区包括，但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims，M.J.等人.，J.Immunol.151(1993)2296-2308)；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter，P.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta，L.G.等人.，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和从筛选FR文库来源的框架区(参见，例如，Baca，M.等人.，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok，M.J.等人.，J.Biol.Chem.271(19969 22611-22618)。

4.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述结合特异性之一是针对PDGF-B，且另一种是针对任意其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合PDGF-B的两个不同表位。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位至表达PDGF-B的细胞。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。

用于制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein，C.和Cuello，A.C.，Nature 305(1983)537-540，WO 93/08829，和Traunecker，A.等人.，EMBO J.10(1991)3655-3659)，和“凸起-进入-孔洞”工程改造(参见，例如，US 5,731,168)。也可以通过以下方式制备多特异性抗体：改造静电转向效应(engineering electrostatic steering effects)用于制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(参见，例如，US 4,676,980，和Brennan，M.等人.，Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体(参见，例如，Kostelny，S.A.等人.，J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双抗体”技术以制备双特异性抗体片段(参见，例如，Holliger，P.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如，Gruber，M等人.，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt，A.等人.，J.Immunol.147(1991)60-69)中所述。

本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的经工程改造的抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibodies)”(参见，例如，US 2006/0025576)。

本文中的抗体或片段也包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含结合PDGF-B以及另一种不同抗原的抗原结合位点(参见，例如US 2008/0069820)。

本文的抗体或片段还包括在WO 2009/080251，WO 2009/080252，WO 2009/080253，WO 2009/080254，WO 2010/112193，WO 2010/115589，WO 2010/136172，WO 2010/145792，和WO 2010/145793中所述的特异性抗体。

5.抗体变体

在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能合乎需要的是，改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成，可以制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列删除残基和/或插入残基和/或置换残基。可以制备缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，条件是，所述最终构建体具有期望的特征，例如，抗原结合。

a)置换、插入和缺失变体

在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目标位点包括HVR和FR。在下表中在“优选的置换”的标题下显示了保守置换。在表1中在“示例性置换”的标题下提供了更实质性的变化，并且参考氨基酸侧链类别在下面进一步描述。可以将氨基酸置换引入目标抗体中并且针对期望的活性(例如，保留的/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC)来筛选产物。

表

氨基酸可以根据共同的侧链特性分组：

(1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性的：Asp，Glu；

(4)碱性的：His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳族的：Trp，Tyr，Phe。

非保守置换需要将这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。

一类置换变体涉及置换亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体在某些生物学特性上具有改进(例如，改善)(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)，和/或具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。一种示例性的置换变体是亲和力成熟的抗体，所述抗体可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如本文描述的那些)方便地产生。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示和针对特定生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。

可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如，以改善抗体亲和力。这类改变可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程中以高频率经历突变的密码子所编码的残基(参见，例如，Chowdhury，P.S.，Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)，和/或接触抗原的残基中做出，并对得到的变体VH或VL试验结合亲和力。通过构建次级文库并从中重新选择而实现的亲和力成熟已经描述在，例如，Hoogenboom，H.R.等人.在Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178(2002)1-37中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易出错的PCR、链改组或寡核苷酸-定向的诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后建立次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR-定向的方案，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别地经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以出现在一个或多个HVR内部，只要这类改变不实质上降低抗体的结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出不实质上降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文中提供的保守置换)。这类改变可以例如在HVR的抗原接触残基的外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR未改变或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。

一种用于鉴定可以被靶向以便诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham，B.C.和Wells，J.A.，Science 244(1989)1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)，并且用中性的或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对初始置换显示出功能敏感性的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，可以使用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以靶向或消除这类接触残基和邻近残基作为置换的候选物。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。

氨基酸序列插入包括长度在从一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基端和/或羧基端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C-端与酶(例如针对ADEPT的酶)或增加所述抗体的血清半衰期的多肽的融合体。

b)糖基化变体

在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列从而建立或移除一个或多个糖基化位点，可以方便地实现对抗体添加或删除糖基化位点。

在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双天线寡糖，所述寡糖通常借助N-键连接至Fc区的CH2结构域的Asn297(参见，例如，Wright，A.和Morrison，S.L.，TIBTECH 15(1997)26-32)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线寡糖结构的“茎部”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明的抗体中的寡糖以便产生具有某些改善的特性的抗体变体。

在一个实施方案中，提供具有碳水化合物结构的抗体变体，所述碳水化合物结构缺少与Fc区(直接地或间接地)连接的岩藻糖。例如，这类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％、或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：相对于如通过MALDI-TOF质谱法(例如，如WO 2008/077546中所述)所测量的与Asn297连接的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算糖链内在Asn297处的岩藻糖的平均量。Asn297表示位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；但是，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可以位于位置297的上游或下游±3个氨基酸处，即，在位置294和300之间。这样的岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，US2003/0157108；US 2004/0093621。与“去岩藻糖基化的”或“岩藻糖-缺陷型”抗体变体相关的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki，A.等人.，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki，N.等人.，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够生产去岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括在蛋白岩藻糖基化方面有缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka，J.等人.，Arch，Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；和WO2004/056312，特别是实施例11)，和敲除的细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki，N.等人.，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda，Y等人.，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。

还可以为抗体变体提供双分的寡糖，例如，其中与抗体的Fc区连接的双天线寡糖由GlcNAc对分。这样的抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这样的抗体变体的例子例如描述在WO 2003/011878；US 6,602,684；和US 2005/0123546中。还提供了在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。这样的抗体变体例如描述在WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764中。

c)Fc-区变体

在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。该Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处含有氨基酸修饰(例如，置换)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。

在某些实施方案中，本发明预见到具有一些但并非全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为下述应用的合乎需要的候选物：其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定以证实CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞(即NK细胞)仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch，J.V.和Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子描述在US 5,500,362(参见，例如，Hellstrom，I.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom，I.等人.，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann，M.等人.，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。备选地，可以采用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性的细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA；和CytoTox 非放射性的细胞毒性测定(Promega，Madison，WI)。用于这样的测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，可以在体内评估目标分子的ADCC活性，例如，在动物模型中，诸如在Clynes，R.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656公开的动物模型中。也可以实施C1q结合测定以证实抗体不能结合C1q且因此缺少CDC活性(参见，例如，WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA)。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro，H.等人.，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg，M.S.等人.，Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期确定(参见，例如，Petkova，S.B.等人.，Int.Immunol.18(2006：1759-1769))。

具有减少的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的置换的那些(US 6,737,056)。这样的Fc突变体包括具有在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处的置换的Fc突变体，包括将残基265和297置换成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(US 7,332,581)。

描述了具有改善的或减少的与FcR的结合的某些抗体变体(参见，例如，US6,737,056；WO 2004/056312，和Shields，R.L.等人.，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处的置换)的Fc区。

在一些实施方案中，在Fc区中做出导致改变的(即，改善的或减少的)C1q结合和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)的改变，例如，如在US 6,194,551，WO 99/51642，和Idusogie，E.E.等人.，J.hnmunol.164(2000)4178-4184中所述。

在US 2005/0014934中描述了具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，所述新生儿Fc受体负责母体IgG向胎儿的转移(Guyer，R.L.等人.，J.Immunol.117(1976)587-593，和Kim，J.K.等人.，J.Immunol.24(1994)2429-2434)。那些抗体包含其中具有一个或多个改善Fc区与FcRn的结合的置换的Fc区。这样的Fc变体包括在下述Fc区残基中一个或多个处具有置换的那些：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如，Fc区残基434的置换(US 7,371,826)。

关于Fc区变体的其他例子，也参见Duncan，A.R.和Winter，G.，Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；和WO 94/29351。

d)半胱氨酸改造的抗体变体

在某些实施方案中，可能合乎需要的是，建立半胱氨酸改造的抗体，例如，“硫代MAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，置换的残基出现在抗体的可到达位点处。通过用半胱氨酸置换那些残基，由此使反应性巯基位于抗体的可到达位点处并且可以用于将抗体缀合至其他结构部分(诸如药物结构部分或接头-药物结构部分)以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以如例如US 7,521,541中所述产生半胱氨酸改造的抗体。

e)抗体衍生物

在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域已知的且容易得到的额外非蛋白性结构部分。适合用于抗体衍生的结构部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧杂环戊烷、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、亚乙基/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。由于它在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点。所述聚合物可以具有任何分子量，并可以是分支或不分支的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接超过一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定：包括、但不限于，待改善的抗体的特定特性或功能，抗体衍生物是否将用在确定条件下的疗法中等。

在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白性结构部分的缀合物，所述非蛋白性结构部分可以通过暴露于辐射而选择性地加热。在一个实施方案中，非蛋白性结构部分是碳纳米管(Kam，N.W.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以具有任何波长，并包括，但不限于这样的波长：其不伤害普通细胞，但是其将非蛋白性结构部分加热至杀伤在抗体-非蛋白性结构部分附近的细胞的温度。

B.重组方法和组合物

使用重组方法和组合物(例如，如在US 4,816,567中所述)可以生产抗体。在一个实施方案中，提供了分离的核酸，其编码本文描述的抗-PDGF-B抗体。所述核酸可以编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列和/或包含所述抗体的VH的氨基酸序列(例如，所述抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了一种或多种包含所述核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含所述核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含以下载体(例如，已经用以下载体转化)：(1)包含编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列和包含所述抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含所述抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗-PDGF-B抗体的方法，其中所述方法包括在适合表达所述抗体的条件下培养上述提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，和任选地，从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。

为了重组生产抗-PDGF-B抗体，将编码抗体的核酸(例如，如上所述)分离，并将其插入到一种或多种载体中用以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法容易地对这样的核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。

适用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文中所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中制备，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，US 5,648,237，US 5,789,199，和US 5,840,523。(也参见Charlton，K.A.，在：Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(编)，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，第245-254页中，其描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以分离自可溶级分中的细菌细胞糊，并且可以被进一步纯化。

除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经被“人源化”的真菌和酵母菌株，从而导致具有部分地或完全地人糖基化模式的抗体的生产。参见Gemgross，T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li，H.等人.，Nat.Biotech.24(2006)210-215。

适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞也来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴别出众多可以与昆虫细胞结合使用的杆状病毒毒株，特别用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

植物细胞培养物也可以用作宿主(参见，例如，US 5,959,177，US 6,040,498，US6,420,548，US 7,125,978，和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIES^TM技术))。

脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适合悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，其描述在例如Graham，F.L.等人.，J.Gen Virol.36(1977)59-74中)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(TM4细胞，其描述在例如Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，其描述在例如Mather，J.P.等人.，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(编)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，第255-268页。

C.测定

通过本领域已知的各种测定，可以针对它们的物理/化学性能和/或生物学活性鉴别、筛选或表征本文中提供的抗-PDGF-B抗体。示例性的测定在实施例中报道。

D.免疫缀合物

本发明还提供了免疫缀合物，其包含与一个或多个细胞毒性剂诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素缀合的本文报道的抗-PDGF-B抗体。

在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中将抗体与一个或多个药物缀合，所述药物包括，但不限于，美登素类(maytansinoid)(参见US 5,208,020，US5,416,064和EP 0 425 235 B1)；澳瑞他汀(auristatin)诸如单甲基澳瑞他汀药物结构部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见US 5,635,483，US 5,780,588，和US 7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见US 5,712,374，US 5,714,586，US 5,739,116，US 5,767,285，US 5,770,701，US 5,770,710，US 5,773,001，和US 5,877,296；Hinman，L.M.等人.，Cancer Res.53(1993)3336-3342；和Lode，H.N.等人.，CancerRes.58(1998)2925-2928)；蒽环类抗生素(anthracycline)诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz，F.等人.，Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey，S.C.，等人.，Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362；Torgov，M.Y.，等人.，Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy，A.，等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；Dubowchik，G.M.，等人.，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King，H.D.，等人.，J.Med.Chem.45(2002)4336-4343；和US 6,630,579)；甲氨蝶呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉罗他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯(trichothecene)；和CC1065。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括、但不限于，白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲毒蛋白(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合的如本文中所述的抗体，从而形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。例子包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。当将放射性缀合物用于检测时，它可以包括用于闪烁法研究的放射性原子，例如TC^99m或I¹²³，或用于核磁共振(NMR)成像(也被称作磁共振成像，MRI)的自旋标记，诸如碘-123(再次出现)、碘-131、钢-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以用多种双官能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚胺酯的双官能衍生物(诸如盐酸二亚胺代己二酸二甲酯(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(诸如如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、二-叠氮基化合物(诸如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮基衍生物(诸如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以按照Vitetta，E.S.等人.，Science 238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸酯(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸敏感接头、肽酶敏感接头、光敏感接头、二甲基接头或含有二硫化物的接头(Chari，R.V等人.，Cancer Res.52(1992)127-131；US 5,208,020)。

本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用包括、但不限于如下的市售交联剂(例如来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)制备的这类缀合物：BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，磺基-EMCS，磺基-GMBS，磺基-KMUS，磺基-MBS，磺基-SLAB，磺基-SMCC和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。

E.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文提供的任何抗-PDGF-B抗体可用于检测PDGF-B在生物样品中的存在。本文中使用的术语“检测”包括定量或定性检测。

在一个实施方案中，提供了用在诊断或检测方法中的抗-PDGF-B抗体。在另一个方面，提供了检测PDGF-B在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：在允许抗-PDGF-B抗体与PDGF-B结合的条件下使生物样品与如本文中所述的抗-PDGF-B抗体接触，并且检测在抗-PDGF-B抗体和PDGF-B之间是否形成复合物。这样的方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗-PDGF-B抗体来选择对于使用抗-PDGF-B抗体的疗法而言合格的受试者，例如在PDGF-B是用于患者选择的生物标志物的情况下。

在某些实施方案中，提供了标记的抗-PDGF-B抗体。标记包括，但不限于，直接检测的标记或结构部分(诸如荧光标记、生色标记、电子密度标记、化学发光标记和放射性标记)，以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的结构部分(诸如酶或配体)。示例性的标记包括，但不限于：放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I，荧光团，如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(US 4,737,456))，荧光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，其与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶(诸如HR，乳过氧化物酶，或微氧化酶)偶联，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基等。

F.药物制剂

通过将具有期望纯度的这类抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)(1980))混合，可以以冻干制剂或水溶液的形式制备如本文中所述的抗-PDGF-B抗体的药物制剂。药学上可接受的载体在采用的剂量和浓度对接受者而言通常是无毒的，且包括，但不限于：缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。示例性的药学上可接受的载体在本文中还包括间质(insterstitial)药物分散剂，诸如可溶性的中性活性的透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性的PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rhuPH20(Baxter International，Inc.)。包括rhuPH20在内的某些示例性sHASEGP和使用方法描述在US 2005/0260186和US 2006/0104968中。在一方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。

在US 6,267,958中描述了示例性的冻干的抗体制剂。水性抗体制剂包括在US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。

本文中的制剂还可以含有超过一种正在治疗的特定适应证所需的活性成分，优选地具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些。例如，可能合乎需要的是，进一步提供抗-ANG2抗体或抗-VEGF抗体。这样的活性成分适当地以对于预期目的而言有效的量联合存在。

活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别例如，羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或大乳剂中。这样的技术公开在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)(1980)中。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适的例子包括含有所述抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形制品(例如薄膜或微胶囊)的形式。

要用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以容易地实现无菌度，例如，通过穿过无菌过滤膜过滤。

G.治疗方法和组合物

本文提供的任何抗-PDGF-B抗体可以用在治疗方法中。

在一方面中，提供了用作药物的抗-PDGF-B抗体。在其他方面，提供了用于治疗眼血管疾病、优选是黄斑变性的抗-PDGF-B抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的抗-PDGF-B抗体。在某些实施方案中，本发明提供用在治疗患有眼血管疾病、优选黄斑变性的个体的方法中的抗-PDGF-B抗体，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗-PDGF-B抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。在其他实施方案中，本发明提供用于抑制血管发生的抗-PDGF-B抗体。在某些实施方案中，本发明提供用在抑制个体的血管发生的方法中的抗-PDGF-B抗体，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗-PDGF-B抗体，从而抑制血管发生。按照上述任意实施方案所述的“个体”优选是人。

在另一方面中，本发明提供抗-PDGF-B抗体在药物的生产或制备中的应用。在一个实施方案中，所述药物用于治疗眼血管疾病，优选是黄斑变性。在另一个实施方案中，药物用在治疗眼血管疾病、优选黄斑变性的方法中，所述方法包括向患有眼血管疾病、优选黄斑变性的个体施用有效量的所述药物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。在另一个实施方案中，所述药物用于抑制血管形成。在另一个实施方案中，所述药物用在抑制个体血管发生的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述药物，从而抑制血管发生。按照上述任意实施方案所述的“个体”可以是人。

在另一方面中，本发明提供用于治疗眼血管疾病、优选黄斑变性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有这样的眼血管疾病、优选黄斑变性的个体施用有效量的抗-PDGF-B抗体。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下文所述。按照上述任意实施方案所述的“个体”可以是人。

在另一方面中，本发明提供用于抑制个体中血管发生的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗-PDGF-B抗体，从而抑制血管发生。在一个实施方案中，“个体”是人。

在另一方面中，本发明提供包含本文提供的任一种抗-PDGF-B抗体的药物制剂，例如，用在上述任一种治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任一种抗-PDGF-B抗体和药学可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任一种抗-PDGF-B抗体和至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。

本发明的抗体可以单独地或与其他药剂联合地用在治疗中。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂一起共同施用。在某些实施方案中，另外的治疗剂是抗-VEGF抗体或抗-ANG2抗体。

上面指出的这样的联合治疗包括组合施用(其中将两种或更多种治疗剂包括在同一制剂或分开的制剂中)和分开施用，在后一种情况下，本发明的抗体的施用可以发生在一种或多种另外的治疗剂的施用之前、同时和/或之后。在一个实施方案中，抗-PDGF-B抗体的施用和另外的治疗剂的施用发生在彼此的约一个月内，或在约一、二或三周内，或在约一天、两天、三天、四天、五天或六天内。

本发明的抗体(和任何另外的治疗剂)可以通过任意合适的方式施用，包括胃肠外、肺内和鼻内施用，并且，如果需要局部治疗，病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。定量给药可以是通过任意适当的途径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行，部分地取决于施用是短暂的还是长期的。各种定量给药时间方案包括但不限于在不同时间点单次或多次施用，推注施用，并且在本文中考虑脉冲输注。

以与良好医学实践一致的方式，配制、定量给药和施用本发明的抗体。在该背景下考虑的因素包括正在治疗的特定病症、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、药剂的递送位点、施用方法、施用的时间方案和医学从业人员已知的其他因素。抗体不需要、但任选地与一种或多种当前用于预防或治疗讨论的病症的药剂一起使用。这样的其他药剂的有效量取决于存在于所述制剂中的抗体的量，病症或治疗的类型，和上文讨论的其他因素。这些通常以相同剂量并且以本文所述的施用途径使用，或以本文所述的剂量的约1至99％、或以经验上/临床上确定为合适的任意剂量和任意途径使用。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独地或与一种或多种其他另外的治疗剂联合使用时)的适当剂量将取决于要治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和进程、施用抗体是为了预防还是治疗目的、以前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的判断。适当地一次性地或在一系列治疗中将抗体施用给患者。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.5mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于施用给患者的最初候选剂量，例如，不论通过一次或多次分开施用，还是通过连续输注。一个典型的日剂量可能是在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内，取决于上面提及的因素。对于在几天或更长时间内的重复施用，取决于病症，所述治疗通常持续至发生期望的疾病症状抑制作用。抗体的一种示例性剂量是在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因而，可以将一剂或多剂约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任意组合)的剂量施用给患者。可以间歇地(例如，每周或每三周)施用这样的剂量(例如，使得患者接受约两剂至约二十剂、或例如约六剂抗体)。可以施用最初的较高负荷剂量(loading dose)，继之以一个或多个较低剂量。但是，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定容易地监测该治疗的进展。

应当理解，使用本发明的免疫缀合物替代抗-PDGF-B抗体或者在抗-PDGF-B抗体之外还使用本发明的免疫缀合物，可以实现以上制剂或治疗方法中的任一种。

III.制品

在发明的另一方面，提供了制品，其含有用于治疗、预防和/或诊断上文所述的病症的材料。所述制品包含容器和贴在容器上或与容器结合的标签或包装说明书。适当的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、静脉内(IV)溶液袋等。容器可以由多种材料制成，如玻璃或塑料。所述容器容纳单独的组合物或与另一种有效地治疗、预防和/或诊断病症的组合物组合的组合物，且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物内的至少一种活性剂是本发明的抗体。所述标签或包装说明书指示，所述组合物用于治疗选择的病症。此外，制品可以包含：(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性治疗剂或其他的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可以包含包装说明书，所述包装说明书指示所述组合物可以用于治疗特定病症。备选地，或另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，所述容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑制细菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其可以进一步包含从商业和使用者观点看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

应当理解，以上制品中的任一种可以包括本发明的免疫缀合物以替代抗-PDGF-B抗体或者与抗-PDGF-B抗体组合。

IV.具体的实施方案

1.特异性结合人PDGF-B的抗体，其中所述抗体是包含SEQ ID NO：01的重链可变结构域和SEQ ID NO：06的轻链可变结构域的鼠抗体的人源化变体。

2.特异性结合人PDGF-B的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含：(a)包含SEQ IDNO：02的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：03的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3。

3.特异性结合人PDGF-B的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含：(a)包含SEQ IDNO：02的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H3。

4.根据实施方案2-3中任一项所述的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：07的氨基酸序列的HVR-L1(b)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-L3。

5.特异性结合人PDGF-B的抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3。

6.特异性结合人PDGF-B的抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3。

7.根据实施方案5-6中任一项所述的抗体，其中所述抗体进一步包含：(d)包含SEQID NO：98的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的HVR-L3。

8.特异性结合人PDGF-B的抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3。

9.特异性结合人PDGF-B的抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3。

10.根据实施方案8-9中任一项所述的抗体，其中所述抗体进一步包含：(d)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列的HVR-L3。

11.特异性结合与实施方案1-4中任一项的抗体相同的表位的抗体，或特异性结合与实施方案5-7中任一项的抗体相同的表位的抗体，或特异性结合与实施方案8-10中任一项的抗体相同的表位的抗体。

12.根据实施方案1-11中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人IgG1亚类的或是人IgG4亚类的。

13.根据实施方案1-12中任一项所述的抗体，其中所述抗体是具有κ轻链的人IgG1亚类的。

14.根据实施方案1-13中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

15.包含SEQ ID NO：92的重链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO：97的轻链可变结构域氨基酸序列的抗体，或包含SEQ ID NO：101的重链可变结构域氨基酸序列和SEQ IDNO：106的轻链可变结构域氨基酸序列的抗体。

16.根据实施方案1-15中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体。

17.根据实施方案1-16中任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性结合人PDGF-B但是不结合人PDGF-C。

18.根据实施方案1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性结合人PDGF-BB、人PDGF-AB和人PDGF-AA.

19.根据实施方案1-17中任一项所述的抗体，其中所述抗体通过抑制人PDGF-B与其受体的结合而阻断人PDGF-B的生物学活性。

20.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的二价的双特异性抗体：

a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

21.根据实施方案20所述的抗体，其中所述抗体包含：

或

22.根据实施方案20-21中任一项所述的抗体，其中所述抗体在第二重链的恒定结构域CL中包含置换为K的位置124和123的氨基酸(按照Kabat EU索引编号)。

23.根据实施方案20-22中任一项所述的抗体，其中所述抗体在第二轻链的恒定结构域CH1中包含置换为E的位置147和213的氨基酸(按照Kabat的EU索引编号)。

24.根据实施方案20-23中任一项所述的抗体，其中所述抗体在第一轻链的恒定结构域CL中包含置换为K的位置124和123的氨基酸，并且在第一重链的恒定结构域CH1中包含置换为E的位置147和213的氨基酸(按照Kabat EU索引编号)。

25.根据实施方案20-24中任一项所述的抗体，其中所述抗体在第二重链的恒定结构域CL中包含置换为K的位置124和123的氨基酸，并且，其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，位置147和213的氨基酸被置换为E，并且，在第一轻链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸被置换为K，在第一重链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸被置换为E，在第二重链的可变结构域VL中，位置38的氨基酸被置换为K，并且在第二轻链的可变结构域VH中，位置39的氨基酸被置换为E(按照Kabat EU索引编号)。

26.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的二价的双特异性抗体：

a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和

b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此替换，并且，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CHl彼此替换，

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

27.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的二价双特异性抗体：

a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

28.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的多特异性抗体：

其中第一抗原或所述其他抗原中的一种是人PDGF-B。

29.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的三价双特异性抗体：

b)第一多肽，其由下述组成：

ba)抗体重链可变结构域(VH)，

或

bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)。

c)第二多肽，其由下述组成：

ca)抗体轻链可变结构域(VL)，

或

cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)，

并且

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

30.根据实施方案29所述的抗体，其中b)中多肽的抗体重链可变结构域(VH)与c)中多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过在下述位置之间引入二硫键而经由链间二硫键桥连接起来并稳定：

i)重链可变结构域位置44与轻链可变结构域位置100，或

ii)重链可变结构域位置105与轻链可变结构域位置43，或

31.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的三特异性或四特异性的抗体：

32.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的双特异性的四价抗体：

并且

其中在所述Fab片段中进行下述修饰：

或

并且

在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，

或恒定结构域CL和CH1彼此替换，

或

并且

或

v)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换，

并且在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

33.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的双特异性的四价抗体：

b)a)所述的第一抗体的两条轻链，

c)第二抗体的(修饰的)重链，所述第二抗体特异性结合第二抗原并且包含第一VH-CL结构域对，其中所述第二抗体的第二VH-CL结构域对的N-端经由肽接头融合在所述重链的C-端，和

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

34.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的双特异性抗体：

a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链，和

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

35.根据实施方案1-19中任一项所述的抗体，其中所述抗体是包含下述的双特异性抗体：

b)Fv片段，其特异性结合第二抗原并包含VH²结构域和VL²结构域，其中两个结构域通过二硫键桥彼此连接，

其中第一抗原或第二抗原是人PDGF-B。

36.根据实施方案1-35中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽，并且

其中

i)第一Fc-区多肽选自包括下述的组：

-人IgG1 Fc-区多肽，

-人IgG2 Fc-区多肽，

-人IgG3 Fc-区多肽，

-人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变L234A、L235A的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc-区多肽

-具有突变L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变L234A、L235A、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变P329G的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变S228P、L235E的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变S228P、L235E、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变P329G的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变K392D的人IgG1、IgG2或IgG4，和

-具有突变N392D的人IgG3，

并且

ii)第二Fc-区多肽选自包括下述的组：

-人IgG1 Fc-区多肽，

-人IgG2 Fc-区多肽，

-人IgG3 Fc-区多肽，

-人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变L234A、L235A的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变S354C、T366W的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变Y349C、T366W的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变L234A、L235A、S354C、T366W的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变L234A、L235A、Y349C、T366W的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变P329G的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变P329G、S354C、T366W的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变P329G、Y349C、T366W的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366W的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366W的人IgG1 Fc-区多肽，

-具有突变S228P、L235E的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变S354C、T366W的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变Y349C、T366W的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变S228P、L235E、S354C、T366W的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变S228P、L235E、Y349C、T366W的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变P329G的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变P329G、S354C、T366W的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变P329G、Y349C、T366W的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366W的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C，T366W的人IgG4 Fc-区多肽，

-具有突变D399K、D356K和/或E357K的人IgG1，和

-具有突变D399K、E356K和/或E357K的人IgG2、IgG3或IgG4。

37.根据实施方案1-35中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽，并且

其中

i)第一Fc-区多肽是人IgG1 Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是人IgG1 Fc-区多肽，或

ii)第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A的人IgG1 Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A的人IgG1 Fc-区多肽，或

iii)第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1 Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G的人IgG1 Fc-区多肽，或

iv)第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、S354C、T366W的人IgG1 Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc-区多肽，或

v)第一Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G、S354C、T366W的人IgG1 Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG1 Fc-区多肽，或

vi)第一Fc-区多肽是人IgG4 Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是人IgG4 Fc-区多肽，或

vii)第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E的人IgG4 Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E的人IgG4 Fc-区多肽，或

viii)第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4 Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G的人IgG4 Fc-区多肽，或

ix)第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、S354C、T366W的人IgG4 Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc-区多肽，或

x)第一Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G、S354C、T366W的人IgG4 Fc-区多肽，并且第二Fc-区多肽是具有突变S228P、L235E、P329G、Y349C、T366S、L368A、Y407V的人IgG4 Fc-区多肽。

38.根据实施方案1-37中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽，并且

其中所述抗体在第一Fc-区多肽中和在第二Fc-区多肽中包含下述突变组合：

i)I253A，H310A，和H435A，或

ii)H310A，H433A，和Y436A，或

iii)L251D，L314D，和L432D，或

iv)i)至iii)的组合。

39.根据实施方案1-37中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽，并且其中

a)第一和第二Fc-区多肽均为人IgG1或人IgG4亚类的(来源于人起源的)，并且在第一Fc-区多肽中包含选自下述突变中的一个或两个：i)I253A，H310A和H435A的组，或ii)H310A，H433A和Y436A的组，或iii)L251D，L314D和L432D的组(按照Kabat EU索引编号系统编号)以及在第二Fc-区多肽中包含选自包括突变L251D、I253A、H310A、L314D、L432D、H433A、H435A和Y436A的组(按照Kabat EU索引编号系统编号)中的一个或两个突变，从而使得第一和第二Fc-区多肽中的所有突变在一起发生时导致在变体(人)IgG种类Fc-区中包含下述突变：i)I253A，H310A和H435A，或ii)H310A，H433A和Y436A，或iii)L251D，L314D和L432D，

或

b)第一和第二Fc-区多肽均为人IgG1或人IgG4亚类的(即来源于人起源的)，并且都在所述Fc-区中包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D或它们的组合(按照Kabat EU索引编号系统编号)，由此在第一或第二Fc-区多肽存在所有突变，或在第一Fc-区多肽中存在一个或两个突变并且在第二Fc-区多肽中存在一个或两个突变，从而使得当第一和第二Fc-区多肽中的所有突变在同时发生时导致在所述Fc-区中包含下述突变：i)I253A，H310A和H435A，或ii)H310A，H433A和Y436A，或iii)L251D，L314D和L432D，

或

c)第一和第二Fc-区多肽均为人IgG1或人IgG4亚类的(即来源于人起源的)，并且在第一以及第二Fc-区多肽中包含突变I253A/H310A/H435A或H310A/H433A/Y436A或L251D/L314D/L432D(按照Kabat EU索引编号系统编号)，或在第一Fc-区多肽中包含突变组合I253A/H310A/H435A并且在第二Fc-区多肽中包含突变组合H310A/H433A/Y436A(按照KabatEU索引编号系统编号)。

40.根据实施方案1-37中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽，并且其中

a)第一变体Fc-区多肽衍生自第一亲本IgG种类Fc-区多肽，并且第二变体Fc-区多肽衍生自第二亲本IgG种类Fc-区多肽，其中第一亲本IgG种类Fc-区多肽与第二亲本IgG种类Fc-区多肽相同或不同，并且

b)除了第一亲本IgG种类Fc-区多肽与第二亲本IgG种类Fc-区多肽不同的那些氨基酸残基之外，第一变体Fc-区多肽与第二变体Fc-区多肽还在一个或多个氨基酸残基处不同，并且

c)包含第一变体Fc-区多肽和第二变体Fc-区多肽的IgG种类Fc-区具有的针对人Fc-受体的亲和力不同于包含a)中第一亲本IgG种类Fc-区多肽和a)中第二亲本IgG种类Fc-区多肽的IgG种类Fc-区的亲和力，

其中第一Fc-区多肽或第二Fc-区多肽或这两个Fc-区多肽彼此独立地包含下述突变或突变组合中的一个：

-T307H，或

-Q311H，或

-E430H，或

-N434H，或

-T307H和Q311H，或

-T307H和E430H，或

-T307H和N434A，或

-T307H和N434H，或

-T307Q和Q311H，或

-T307Q和E430H，或

-T307Q和N434H，或

-T307H和Q311H和E430H和N434A，或

-T307H和Q311H和E430H和N434H，或

-T307H和Q311H和E430H和N434Y，或

-T307Q和Q311H和E430H和N434A，或

-T307Q和Q311H和E430H和N434H，或

-T307Q和Q311H和E430H和N434Y，或

-T307Q和V308P和N434Y和Y436H，或

-T307H和M252Y和S254T和T256E，或

-T307Q和M252Y和S254T和T256E，或

-Q311H和M252Y和S254T和T256E，或

-E430H和M252Y和S254T和T256E，或

-N434H和M252Y和S254T和T256E，或

-T307H和Q311H和M252Y和S254T和T256E，或

-T307H和E430H和M252Y和S254T和T256E，或

-T307H和N434A和M252Y和S254T和T256E，或

-T307H和N434H和M252Y和S254T和T256E，或

-T307Q和Q311H和M252Y和S254T和T256E，或

-T307Q和E430H和M252Y和S254T和T256E，或

-T307Q和N434H和M252Y和S254T和T256E，或

-T307H和Q311H和E430H和N434A和M252Y和S254T和T256E，或

-T307H和Q311H和E430H和N434H和M252Y和S254T和T256E，或

-T307H和Q311H和E430H和N434Y和M252Y和S254T和T256E，或

-T307Q和Q311H和E430H和N434A和M252Y和S254T和T256E，或

-T307Q和Q311H和E430H和N434H和M252Y和S254T和T256E，或

-T307Q和Q311H和E430H和N434Y和M252Y和S254T和T256E，或

-T307Q和V308P和N434Y和Y436H和M252Y和S254T和T256E。

41.根据实施方案1-37中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一Fc-区多肽和第二Fc-区多肽，

并且其中第一Fc-区多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V(孔洞-链)，并且第二Fc-区多肽包含突变S354C和T366W(凸起-链)，并且其中第一Fc-区多肽(孔洞-链)包含下述突变：

i)I253A或I253G，和

ii)L314A或L314G或L314D，

并且其中第一Fc-区多肽与第二Fc-区多肽通过一个或多个二硫键桥连接，

并且其中第一多肽的CH3-结构域与第二多肽的CH3-结构域都结合蛋白质A或不都结合蛋白质A(按照Kabat EU索引编号)。

42.根据实施方案41所述的抗体，其中所述抗体包含下述突变：

i)I253A或I253G，和

ii)L314A或L314G或L314D，和

iii)T250Q，和/或

iv)T256E或T256A。

43.根据实施方案41-42中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含下述突变：

i)I253A或I253G，和

ii)L314A或L314G或L314D，和

iii)任选地，a)T250Q，和/或T256E或T256A，和

iv)a)L251A或L251G或L251D，和/或b)H310A或H310G。

44.根据实施方案41-43中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含下述突变：

i)I253A或I253G，和

ii) L314A或L314G或L314D，和

iii)a)T250Q，和/或T256E或T256A，和

iv)a)L251A或L251G或L251D，和/或b)H310A或H310G，

v)任选地，a)T307A或T307H或T307Q或T307P，和/或b)Q311H，和/或c)M252Y，和/或d)S254T。

45.根据实施方案41-44中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含下述突变：

i)T250Q，和/或

ii)M252Y，和/或

iii)S254T，和/或

iv)T256E或T256A，和/或

v)T307A或T307H或T307Q或T307P，和/或

vi)Q311H。

46.根据实施方案1-45中任一项所述的抗体，其用作药物。

47.根据实施方案1-45中任一项所述的抗体，其用于治疗眼血管疾病。

48.实施方案1-45中任一项所述的抗体用于治疗眼部疾病、尤其是眼血管疾病的应用。

49.实施方案1-45中任一项所述的抗体，其用于治疗眼部疾病。

50.根据实施方案1-45中任一项所述的抗体，其用于治疗眼部疾病、尤其是眼血管疾病。

51.一种治疗患有眼血管疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的实施方案1-45中任一项所述的抗体。

52.一种药物制剂，其包含实施方案1-45中任一项所述的抗体。

53.一种用于治疗眼血管疾病的药物制剂，其包含实施方案1-45中任一项所述的抗体。

54.实施方案1-45中任一项所述的抗体在制备用于治疗眼血管疾病的药物中的应用。

55.一种治疗患有眼血管疾病的患者的方法，所述方法通过向需要所述治疗的患者施用实施方案1-45中任一项所述的抗体进行。

56.根据实施方案52-53中任一项所述的药物制剂，其中所述抗体通过玻璃体内应用进行施用。

57.根据实施方案55-56中任一项所述的施用，其中所述施用是玻璃体内应用。

58.编码实施方案1-45中任一项所述的抗体的核酸。

59.包含一种或多种编码实施方案1-45中任一项所述的抗体的核酸的细胞。

60.用于制备实施方案1-45中任一项所述的抗体的方法，其中所述方法包括下述步骤：

a)任选地用一种或多种编码实施方案1-45中任一项所述的抗体的核酸转染哺乳动物细胞，

b)培养所述细胞，从而表达所述抗体，和

c)从所述细胞或培养基回收所述抗体，由此制备所述抗体。

V.实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，如果有上文提供的一般描述，可以实行各种其他实施方案。

实施例1

免疫

对于小鼠(NMRI小鼠)和兔(人Ig基因座转基因兔)的免疫，使用基于RIMMS(“快速免疫，多个位点”(“Rapid IMmunization，Multiple Sites”))的时间方案。抗原是人PDGF-BB(Cell Signaling Tech.)。

实施例2

确定抗-PDGF-B抗体的血清效价

将人重组PDGF-B以在PBS中2.5μg/ml(小鼠)或1.0μg/ml(兔)固定在96-孔NUNCMaxisorb平板上(100μl/孔)，然后：用200μl/孔在PBS中的2％CroteinC封闭所述平板；以100μl/孔一式两份应用在含0.5％CroteinC的PBS中的抗血清的系列稀释液；用在含0.5％CroteinC的PBS中1∶16,000稀释的HRP-缀合的山羊抗-小鼠IgG抗体(JacksonImmunoresearch)检测小鼠血清，或用在含0.5％CroteinC的PBS中1∶5,000稀释的生物素酰化的山羊抗-人κ抗体(Southern Biotech)和1∶8,000稀释的HRP--缀合的链霉抗生物素蛋白检测兔血清，100μl/孔。对于所有步骤，将平板在37℃温育1小时。在所有步骤之间，将平板用含0.05％吐温20的PBS清洗3次。通过加入100μl/孔可溶性BM Blue POD底物(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，德国)显现信号；并且通过加入100μl/孔1M HCl终止。以690nm作为参比，在450nm读取吸光度。效价定义为导致一半的最大信号的抗血清稀释液。

实施例3

来自兔的B细胞克隆

分离兔外周血单核细胞(PBMC)

从三只经免疫的兔采集血液样品。将包含EDTA的全血用1x PBS(PAA，Pasching，奥地利)稀释两倍，然后使用哺乳动物淋巴细胞(lympholyte mammal)(CedarlaneLaboratories，Burlington，Ontario，加拿大)按照制造商的使用说明进行密度离心。将PBMC用1x PBS洗涤两次。

EL-4B5培养基

使用补充了10％FCS(Hyclone，Logan，UT，USA)，2mM谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素溶液(PAA，Pasching，奥地利)，2mM丙酮酸钠，10mM HEPES(PAN Biotech，Aidenbach，德国)和0.05mM β-巯基乙醇(Gibco，Paisley，苏格兰)的RPMI 1640(Pan Biotech，Aidenbach，德国)。

平板包被

将无菌细胞培养6孔平板用在碳酸缓冲液(0.1M碳酸氢钠，34mM碳酸氢二钠(disodium hydrogen carbonate)，pH 9.55)中的PBGF-BB(2μg/ml)或PDGF-AA与PDGF-CC蛋白混合物(1μg/ml PDGF-AA和PDGF-CC)在4℃包被过夜。在使用之前，将平板用无菌PBS清洗三次。

消耗巨噬细胞/单核细胞

将一半血液样品的PBMC接种在无菌6孔平板(细胞培养级别)上，以通过非特异性粘附消耗巨噬细胞和单核细胞。

将剩余的50％的PBMC接种在预先用PDGF-AA与PDGF-CC蛋白的混合物包被的平板中，从而一步去除B细胞与这些蛋白的结合并去除巨噬细胞和单核细胞。

每个孔最多装满4ml培养基和多至6x10⁶个来自经免疫的兔的PBMC，并且允许在培养箱中在37℃结合1小时。

将上清中的细胞(外周血淋巴细胞(PBL))用于抗原淘选步骤。

在PDGF BB蛋白上富集B细胞

将用PDGF-BB蛋白包被的6孔组织培养平板接种多至6x 10⁶个PBL/4ml培养基，并且允许在培养箱中在37℃结合1小时。通过用1xPBS清洗孔1-2次小心地去除不贴壁的细胞。通过在培养箱中在37℃用胰蛋白酶处理10分钟，使其余的贴壁细胞脱落。用EL-4B5培养基终止胰蛋白酶解。在进行免疫荧光染色之前，将细胞保持在冰上。

免疫荧光染色和流式细胞术

使用抗-IgG FITC(AbD Serotec，Düsseldorf，德国)进行单细胞分选。对于表面染色，将来自消耗和富集步骤的细胞用在PBS中的与FITC缀合的抗-IgG抗体温育，并且在暗处在4℃温育45分钟。染色后，将PBMC用冰冷的PBS清洗两次。最后，将PBMC重悬在冰冷的PBS中，并立即进行FACS分析。在FACS分析之前，加入浓度为5μg/ml的碘化丙啶(BDPharmingen，San Diego，CA，USA)，从而区分死细胞和活细胞。

使用配有计算机和FACSDiva软件(BD Biosciences，USA)的Becton DickinsonFACSAria进行单细胞分选。

B-细胞培养

简言之，将单个分选的兔B-细胞在96孔平板中用200μl/孔包含Pansorbin细胞(1∶100,000)(Calbiochem(Merck)，Darmstadt，德国)、5％兔胸腺细胞上清(MicroCoat，Bernried，德国)和γ-辐射的鼠EL-4B5胸腺瘤细胞(2.5×10⁴个细胞/孔)的EL-4B5培养基在培养箱中在37℃培养7天。取出B-细胞培养物的上清用于筛选，并且立即收集剩余的细胞并在100μl RLT缓冲液(Qiagen，Hilden，德国)中在-80℃冷冻。

实施例4

杂交瘤产生

细胞培养

使用小鼠骨髓瘤细胞系P3x63-Ag8.653作为融合配偶体以产生小鼠-小鼠杂交瘤。在融合前约14天将细胞解冻，并且在8-氮鸟嘌呤的存在下培养。每3-4天，将细胞分传(split)并且调整至1-2x 10⁵个细胞/m的浓度。

细胞融合

材料：

小鼠杂交瘤培养基(RPMI 1640(PAN)，FBS超低-IgG，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，NEAA，具有muIL-6的Nutridoma-CS，HAZ(SIGMA，#A9666))，调整至室温(RT)

RPMI 1640培养基(37℃)

RPMI 1640培养基(4℃)

PEG(37℃)

在融合之前，大致将骨髓瘤细胞离心(250rpm，7min.)。将细胞团块重悬在培养基中。对于一个脾，需要大约1-5*10⁷个细胞。

对于细胞融合，应该使用约5∶1的淋巴细胞：骨髓瘤细胞比例。将P3x63-Ag8.653-细胞重悬在50ml RPMI 1640培养基中，并离心(250rpm，7min.)。去除上清。然后将细胞添加到脾细胞中。

在融合过程中，在水浴中将温度调节至37℃。

向所述细胞中逐滴加入PEG溶液(37℃)。

将融合混合物在培养箱中在37℃温育15-120分钟。然后，将融合混合物离心(250rpm，7min.)并且重悬在1200μl重悬培养基中。将100μl细胞混悬液添加到50ml半固体杂交瘤培养基中，匀化，并且在6孔平板的每个孔中分别加入4ml。培养9-13天后，挑取单个克隆。

实施例5

杂交瘤培养

将约5x10⁶个细胞悬浮在50ml Hyclone培养基中。将培养混合物温育96小时。然后，加入75ml Hyclone培养基。继续培养7天。如果生存力降至低于40％，将细胞混悬液通过0.22μ滤器过滤，并且使用滤过液进行纯化。

实施例6

B-细胞克隆

V-结构域的PCR扩增

使用NucleoSpin 8/96 RNA试剂盒(Macherey&Nagel；740709.4，740698)，按照制造商的流程从B-细胞裂解物(重悬在RLT缓冲液中-Qiagen-Cat.N°79216)制备总RNA。将RNA用60μl无RNA酶的水洗脱。按照制造商的使用说明，用Superscript III第一链合成超级混合物(Invitrogen 18080-400)和寡dT-引物，通过反转录酶反应，使用6μl RNA产生cDNA。所有的步骤在Hamilton ML Star系统上进行。使用4μl cDNA与AccuPrime超级混合物(Invitrogen 12344-040)以50μl的终体积来扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)，对于野生型兔B-细胞的重链使用引物rbHC.up和rbHC.do，对于轻链使用rbLC.up和rbLC.do，并且对于转基因兔B-细胞的轻链使用BcPCR_FHLC_leader.fw和BcPCR_huCkappa.rev。所有的正向引物都特异性针对(VH和VL各自的)信号肽，而反向引物特异性针对(VH和VL各自的)恒定区。用于RbVH+RbVL的PCR条件如下：94℃热启动5分钟；35个循环：94℃20s，70℃20s，68℃45s，并且在68℃最后延伸7分钟。用于HuVL的PCR条件如下：94℃热启动5分钟；40个循环：94℃20s，52℃20s，68℃45s，并且在68℃最后延伸7分钟。

将50μl PCR溶液中的8μl上样到48 E-凝胶2％(Invitrogen G8008-02)上。按照制造商的流程使用NucleoSpin Extract II试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)纯化阳性PCR反应物，并且以50μl洗脱缓冲液洗脱。所有的纯化步骤均在Hamilton ML Starlet系统上进行。

实施例7

兔单克隆二价抗体的重组表达

对于兔单克隆二价抗体的重组表达，通过突出物克隆法(overhang cloningmethod)将编码VH或VL的PCR产物以cDNA克隆到表达载体中(RS Haun等人.，BioTechniques13(1992)515-518；MZ Li等人.，Nature Methods 4(2007)251-256)。表达载体包含由下述组成的表达盒：包含内含子A的5′CMV启动子，和3′BGH多聚腺苷酸化序列。除了表达盒，质粒还包含用于在大肠杆菌中的质粒扩增的pUC-来源的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。使用基本质粒的三种变体：一种质粒包含设计为接纳VH区的兔IgG恒定区；两种质粒包含接纳VL区的兔或人κLC恒定区。

使用重叠的引物，通过PCR扩增编码κ或γ恒定区和VL/VH插入物的线性的表达质粒。

将纯化的PCR产物与T4 DNA-聚合酶一起温育，这产生单链突出物。反应通过加入dCTP而终止。

在下一步，将质粒和插入物组合并与recA一起温育，这诱导位点特异性的重组。将重组的质粒转化到大肠杆菌中。次日，挑取生长的菌落，并通过质粒制备、限制性分析和DNA-测序来检测正确的重组质粒。

对于抗体表达，将分离的HC和LC质粒瞬时共转染到HEK293细胞中，并且在1周后收集上清。

实施例8

兔单克隆单价抗体的重组表达

为了将所选的候选物重组表达为单克隆单价抗体，将所有VH链的兔恒定区转化为在CH3片段中包绕凸起-突变的人恒定区。对于来源于兔野生型B-细胞的VL链，将兔Cκ恒定区转化为人的。使用4μl所选候选物的cDNA与AccuPrime超级混合物(Invitrogen 12344-040)以50μl的终体积来扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区，其中正向引物特异性针对信号肽，反向引物特异性针对具有与(VH和VL各自的)人恒定区同源的重合序列(20bp)(在3’端)的CDR3-J区。用于VH和VL链扩增的PCR条件如下：94℃热启动5分钟；35个循环：94℃20s，68℃20s，68℃45s，在68℃最后延伸7分钟。

通过突出物克隆方法，将编码VH或VL的PCR-产物作为cDNA克隆到表达载体中(RSHaun等人.，BioTechniques 13(1992)515-518；MZ Li等人.，Nature Methods 4(2007)251-256)。表达载体包含由下述组成的表达盒：包含内含子A的5′CMV启动子和3′BGH多聚腺苷酸化序列。除了表达盒，质粒还包含用于在大肠杆菌中的质粒扩增的pUC-来源的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。使用基本质粒的两种变体：一种质粒包含设计为接纳新扩增的VH链的人IgG恒定区，第二种质粒包含接纳VL链的人κLC恒定区。

实施例9

人PDGF-BB结合ELISA

使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术进行结合分析。将抗原人PDGF-BB(Cell Signaling，Cat.No 8921BF)以125ng/mL的浓度(25μL，在PBS，0.5％BSA和0.05％吐温中)固定在384孔微量滴定平板(Thermo Scientific，Cat.No.464718)上。下述每个步骤之后是3次常规清洗(90μL PBS，以分散和抽吸进行)：1)封闭步骤：使未结合的表面饱和(1小时，2％BSA)；2)增加浓度的抗-PDGF-BB抗体，持续1小时；3)检测抗体，稀释度＝1∶3000(ECL抗-兔IgG-POD，NA9340V+ECL抗-人IgG-POD，NA933V或对于鼠抗体备选地是ECL抗-小鼠IgG-POD；NA 9310V)。加入底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB，Piercenet，Cat.No.34021)后20-30分钟，在370nm确定光学密度。使用GraphPad Prism 6.0软件利用四参数逻辑模型计算EC₅₀。

实施例10

食蟹猴PDGF-BB结合ELISA

使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术进行结合分析。将抗原人PDGF-BB以125ng/mL的浓度(25μL，在PBS，0.5％BSA和0.05％吐温中)固定在384孔微量滴定平板(Thermo Scientific，Cat.No.464718)上。下述每个步骤之后是3次常规清洗(90μL PBS，0.5％BSA，0.05％吐温，以分散和抽吸进行)：1)封闭步骤：使未结合的表面饱和(1小时，2％BSA)；2)增加浓度的抗-PDGF-BB抗体，持续1小时；3)检测抗体，稀释度＝1∶3000(ECL抗-兔IgG-POD，NA9340V+ECL抗-人IgG-POD，NA933V或对于鼠抗体备选地是ECL抗-小鼠IgG-POD；NA 9310V)。加入底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB，Piercenet，Cat.No.34021)后20-30分钟，在370nm确定光学密度。使用GraphPad Prism 6.0软件利用四参数逻辑模型计算EC₅₀。

实施例11

鼠PDGF-BB结合ELISA

使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术进行结合分析。将抗原鼠PDGF-BB(Peprotech 315-18)以125ng/mL的浓度(25μL，在PBS，0.5％BSA和0.05％吐温中)固定在384孔微量滴定平板(Thermo Scientific，Cat.No.464718)上。下述每个步骤之后是3次常规清洗(90μL PBS，0.5％BSA，0.05％吐温，以分散和抽吸进行)：1)封闭步骤：使未结合的表面饱和(1小时，2％BSA)；2)增加浓度的抗-PDGF-BB抗体，持续1小时；3)检测抗体，稀释度＝1∶3000(ECL抗-兔IgG-POD，NA9340V+ECL抗-人IgG-POD，NA933V或对于鼠抗体备选地是ECL抗-小鼠IgG-POD；NA 9310V)。加入底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB，Piercenet，Cat.No.34021)后20-30分钟，在370nm确定光学密度。使用GraphPad Prism 6.0软件利用四参数逻辑模型计算EC₅₀。

实施例12

大鼠PDGF-BB结合ELISA

使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术进行结合分析。将抗原大鼠PDGF-BB(R&D，520-BB)以125ng/mL的浓度(25μL，在PBS，0.5％BSA和0.05％吐温中)固定在384孔微量滴定平板(Thermo Scientific，Cat.No.464718)上。下述每个步骤之后是3次常规清洗(90μL PBS，0.5％BSA，0.05％吐温，以分散和抽吸进行)：1)封闭步骤：使未结合的表面饱和(1小时，2％BSA)；2)增加浓度的抗-PDGF-BB抗体，持续1小时；3)检测抗体，稀释度＝1∶3000(ECL抗-兔IgG-POD，NA9340V+ECL抗-人IgG-POD，NA933V或对于鼠抗体备选地是ECL抗-小鼠IgG-POD；NA9310V)。加入底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB，Piercenet，Cat.No.34021)后20-30分钟，在370nm确定光学密度。使用GraphPad Prism 6.0软件利用四参数逻辑模型计算EC₅₀。

实施例13

人PDGF-AA结合ELISA

使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术进行结合分析。将抗原人PDGF-AA(Peprotech，Cat.No.AF-100-13A)以125ng/mL的浓度(25μL，在PBS，0.5％BSA和0.05％吐温中)固定在384孔微量滴定平板(Thermo Scientific，Cat.No.464718)上。下述每个步骤之后是3次常规清洗(90μL PBS，0.5％BSA，0.05％吐温，以分散和抽吸进行)：1)封闭步骤：使未结合的表面饱和(1小时，2％BSA)；2)增加浓度的抗-PDGF-BB抗体，持续1小时；3)检测抗体，稀释度＝1∶3000(ECL抗-兔IgG-POD，NA9340V+ECL抗-人IgG-POD，NA933V或对于鼠抗体备选地是ECL抗-小鼠IgG-POD；NA9310V)。加入底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB，Piercenet，Cat.No.34021)后20-30分钟，在370nm确定光学密度。使用GraphPad Prism 6.0软件利用四参数逻辑模型计算EC₅₀。

实施例14

人PDGF-CC结合ELISA

使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术进行结合分析。将抗原人PDGF-CC(PeprotechAF-100-00C)以125ng/mL的浓度(25μL，在PBS，0.5％BSA和0.05％吐温中)固定在384孔微量滴定平板(Thermo Scientific，Cat.No.464718)上。下述每个步骤之后是3次常规清洗(90μL PBS，0.5％BSA，0.05％吐温，以分散和抽吸进行)：1)封闭步骤：使未结合的表面饱和(1小时，2％BSA)；2)增加浓度的抗-PDGF-BB抗体，持续1小时；3)检测抗体，稀释度＝1∶3000(ECL抗-兔IgG-POD，NA9340V+ECL抗-人IgG-POD，NA933V或对于鼠抗体备选地是ECL抗-小鼠IgG-POD；NA 9310V)。加入底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB，Piercenet，Cat.No.34021)后20-30分钟，在370nm确定光学密度。使用GraphPad Prism 6.0软件利用四参数逻辑模型计算EC₅₀。

实施例15

蛋白-蛋白相互作用抑制测定：人PDGF-B：人PDGF-BB受体

使用基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的技术进行人PDGF-BB与人PDGF-BB受体的蛋白-蛋白相互作用抑制分析。将人Fc-标记的PDGF-BB受体蛋白(RnD，Cat.No.385-PR-100)以750μg/mL的浓度(25μL，在PBS，0.5％BSA和0.05％吐温中)固定在384孔微量滴定平板(Thermo Scientific Cat.No.464718)上。下述每个步骤之后是3次常规清洗(90μL PBS，以分散和抽吸进行)：1)使未结合的表面饱和的封闭步骤(1小时，2％BSA)；2)将15μL增加浓度的抗-PDGF-BB抗体与15μL 75nM的生物素酰化的人PDGF-BB(Cell Signaling，Cat.No.8921BF)在30μL的体积中温育1小时；3)使用过氧化物酶-标记的链霉抗生物素蛋白(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国，Cat.No.11089153001)实现检测。加入底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB，Piercenet，Cat.No.34021)后20-30分钟，在370nm确定光学密度。使用GraphPad Prism 6.0软件利用四参数逻辑模型计算IC₅₀。

实施例16

从鼠杂交瘤进行抗体纯化

将包含抗体的杂交瘤上清过滤，并通过两个层析步骤纯化。使用用PBS(1mMKH₂PO₄，10mM Na₂HPO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl)(pH 7.4)平衡的HiTrap Protein G(GEHealthcare)，通过亲和层析捕获抗体。通过用平衡缓冲液清洗去除未结合的蛋白，并且用25mM柠檬酸缓冲液(pH 3.0)回收抗体，并在洗脱后立即用1M Tris-碱(pH 9.0)中和至pH6.0。使用在Superdex 200^TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。所述大小排阻层析在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行。将包含抗体的溶液用配备Biomax-SK膜(Millipore，Billerica，MA)的Ultrafree-CL离心过滤器部件浓缩并保存在-80℃。

将包含抗体的杂交瘤上清过滤，并通过两个层析步骤纯化。将上清与50％v/v 2M甘氨酸，pH 8.6，600mM NaCl混合，并且使用用1M甘氨酸，pH 8.6，300mM NaCl平衡的HiTrapMabSelectSuRe(GE Healthcare)通过亲和层析捕获。通过用平衡缓冲液清洗去除未结合的蛋白，并且用100mM柠檬酸缓冲液(pH 2.8)回收抗体，并在洗脱后立即用1M Tris-碱(pH8.5)中和至pH 6.0。使用在Superdex 200^TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。所述大小排阻层析在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行。将包含抗体的溶液用配备Biomax-SK膜(Millipore，Billerica，MA)的Ultrafree-CL离心过滤器部件浓缩并保存在-80℃。

实施例17

人PDGF-BB结合表面等离子体共振谱测定

使用BIAcore B4000系统(GE Healthcare)，用基于表面等离子体共振谱的技术进行结合分析。利用胺偶联化学，将抗原人PDGF-BB(Cell Signaling，Cat.No.8921BF)以1μg/mL的浓度(在PBS，0.1％BSA，0.05％吐温中)固定在C1传感器芯片(GE Healthcare，Cat.No.BR-1005-35)上。应用在10mM HEPES pH 7.2，150mM NaCl中的增加浓度的抗-PDGF-BB抗体。使用180秒缔合期和600秒解离期的读取时间，计算表观k_a和表观k_d。使用BIAcoreT200 v2.0拟合软件计算表观K_D(avidity，抗体亲抗原性)。

实施例18

食蟹猴PDGF-BB结合表面等离子体共振谱测定

使用BIAcore B4000系统(GE Healthcare)，用基于表面等离子体共振谱的技术进行结合分析。利用胺偶联化学，将抗原食蟹猴PDGF-BB以1μg/mL的浓度(在PBS，0.1％BSA，0.05％吐温中)固定在C1传感器芯片(GE Healthcare，Cat.No.BR-1005-35)上。应用在10mMHEPES pH 7.2，150mM NaCl中的增加浓度的抗-PDGF-BB抗体。使用180秒缔合期和600秒解离期的读取时间，计算表观k_a和表观k_d。使用BIAcore T200 v2.0拟合软件计算表观K_D(avidity，抗体亲抗原性)。

实施例19

在HEK细胞中，人源化抗体的转染和瞬时表达

使用转染剂293-free(Transfection Reagent 293-free，Novagen)，在混悬适应的HEK293F(FreeStyle 293-F细胞；Invitrogen)细胞中进行抗体的瞬时表达。

在125ml摇瓶(在37℃，7％CO₂，85％湿度，135rpm温育/摇动)中解冻后，细胞已经通过稀释传代至少四次(体积为30ml)。

将细胞在250ml体积中增殖至3x10⁵个细胞/ml。三天后，将细胞分传，并且以7*10⁵个细胞/ml的密度新接种到1升摇瓶中的250ml体积中。转染将在细胞密度约为1.4-2.0x10⁶个细胞/ml后24小时进行。

在转染之前，用预热的(水浴；37℃)Opti-MEM(Gibco)将250μg质粒-DNA(122μg轻链和128μg重链)稀释在10ml的终体积中。轻轻混合溶液并且在室温温育不超过5分钟。然后，向DNA-OptiMEM-溶液中加入333.3μl的293-free转染剂。轻轻混合并且在室温温育15-20分钟。将全部体积的混合物加入到具有250ml HEK-细胞-培养体积的1L摇瓶中。

在37℃，7％CO₂，85％湿度，135rpm温育/摇动6或7天。

通过以2,000rpm，4℃，10分钟的第一离心步骤收集上清。然后将上清转移到新的离心瓶中，以4,000rpm，4℃第二次离心20分钟。然后，将不含细胞的上清通过0.22μm瓶顶滤器(bottle-top-filter)过滤并保存在冰箱中(-20℃)。

实施例20

从HEK上清纯化抗体

将包含抗体的培养物上清过滤，并通过两个层析步骤纯化。使用用PBS(1mMKH₂PO₄，10mM Na₂HPO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl)(pH 7.4)平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GEHealthcare)，通过亲和层析捕获抗体。通过用平衡缓冲液清洗去除未结合的蛋白，并且用100mM柠檬酸缓冲液(pH 2.8)回收抗体，并在洗脱后立即用1M Tris-碱(pH 9.0)中和至pH6.0。使用在Superdex 200^TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。所述大小排阻层析在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行。将包含抗体的溶液用配备Biomax-SK膜(Millipore，Billerica，MA)的Ultrafree-CL离心过滤器部件浓缩并保存在-80℃。

实施例21

抗体制剂的分析

使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm的光学密度(OD)，而确定抗体制剂的蛋白浓度。

使用具有蛋白表达芯片(Protein Express Chip)和HT蛋白表达试剂盒(HTProtein Express Reagents Kit)的LabChip GX II (PerkinElmer)，通过CE-SDS分析抗体的纯度和完整性。

通过使用TSK-GEL QC-PAK GFC 300用2x PBS，pH 7.4作为运行缓冲液的高效SEC，或通过使用BioSuite高分辨率SEC，5μm分析级大小排阻柱(Waters GmbH)用200mMK₂HPO₄/KH₂PO₄，250mM KCl，pH 7.0作为运行缓冲液的高效SEC，来确定抗体制剂的聚集物含量。

实施例22

从抗体制备Fab片段并分析：

将5mg抗体(在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中约1mg/ml)与90μl L-半胱氨酸溶液(Merck Millipore；在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中250mM)和12μl木瓜蛋白酶(Roche Life Science；3.2U/mg抗体)在37℃温育120分钟。切割后，使用用PBS(1mM KH₂PO₄，10mM Na₂HPO₄，137mM NaCl，2.7mM KCl)(pH 7.4)平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GEHealthcare)的亲和层析去除完整的IgG和Fc片段。随后，使用在Superdex 200^TM(GEHealthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤，进一步纯化MabSelectSuRe层析的流过液。所述大小排阻层析在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行。将包含Fab片段的溶液用装配Biomax-SK膜(Millipore，Billerica，MA)的Ultrafree-CL离心过滤器部件浓缩并保存在-80℃。

使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm的光学密度(OD)，确定Fab-片段的蛋白浓度。

在存在和不存在还原剂(5mM 1.4-二硫苏糖醇)的条件下，通过SDS-PAGE(NuPAGE4-12％Bis-Tris凝胶，Invitrogen)并用Simply Blue Safe Stain(Invitrogen)染色分析Fab-片段的纯度和完整性。

使用Superdex 200 10/300 GL分析级大小排阻柱(GE Healthcare)，使用2x PBS，pH 7.4作为运行缓冲液，通过高效SEC确定Fab制剂的聚集物含量。

实施例23

3T3细胞增殖ELISA

为了确定增殖抑制作用，按照制造商的手册使用BrdU比色测定(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，德国，#11 647 229 001)。在该测定中，使用5ng/ml人PDGF-BB和抗体。

实施例24

磷酸-PDGF-R β(Tyr751)夹心ELISA

将10,000个3T3-细胞/孔在补充了10％新生牛血清的DMEM-培养基中培养24小时。然后，将细胞在Hunger培养基(具有0.5％新生牛血清的DMEM-培养基)中培养24小时。

在加入之前，将抗体(1μg/ml)在包含5ng/ml PDGF-BB的培养基中预先培养2小时。将3T3细胞在具有5ng/ml人PDGF-BB和抗体的Hunger培养基中培养10分钟。

在裂解之前，将细胞用PBS清洗4次。细胞裂解在100μl裂解缓冲液中进行。

将裂解溶液在用兔抗-PDGF-Rβ抗体包被的96孔平板的孔中在4℃温育过夜。然后，将孔用PBS清洗4次。在用小鼠抗-磷酸-PDGF受体β抗体温育1小时后，将孔用清洗缓冲液洗涤4次。对于检测，将孔用100μl TMB底物溶液温育30分钟。通过加入100μl终止溶液终止反应。在450nm确定吸光度。

实施例25

细胞迁移测定

使用CIM-平板16(ACEA Biosciences Inc.，n°05665817001，孔尺寸膜8μm)。

流程

在使用(50-70％汇合)前将原代人视网膜周细胞((ACBRI 183 CellSystems)，用hTERT无限增殖化)饥饿过夜(在不含生长因子(b°SF-4ZR-500-S)的CellSystems CSC无血清培养基中)。

平板准备

上部室：(50μl培养基+100μl细胞混悬液)

用在PBS中的20μg/ml的纤连蛋白(Sigma n°F0895-2mg)包被两侧：

在每个孔的传感器侧(底侧)上加入40μl纤连蛋白溶液，将上部室在通风橱中温育30分钟。从传感器侧小心吸走纤连蛋白溶液，避免触及电极。将UC翻转，使得孔侧向上而传感器侧向下。在孔中加入50μl纤连蛋白溶液，并且在通风橱中在室温(RT)温育30分钟。从孔内侧小心吸走溶液。在孔中加入50μl不含生长因子的CSC无血清培养基。

下部室：160μl/孔你的待检测的样品(1X浓缩的)

所有的稀释液都在不含生长因子(n°SF-4ZR-500-S)的CellSystems CSC无血清培养基中；将样品/抗体混合物在通风橱中温育2小时；添加160μl/孔的样品；使用CIM-平板16组装工具组装UC和LC；将CIM-平板16在培养箱中在37℃放置1小时以平衡；将CIM-平板16放置在RTCADP分析仪上；在RTCA软件中通过开始步骤1起始背景测量。

细胞制剂

将细胞用细胞解离缓冲液剥离，并以1.5x10⁵个细胞/ml重悬在不含生长因子(n°SF-4ZR-500-S)的CellSystems CSC无血清培养基中；将CIM-平板16从RTCA分析仪上取下，并在UC中加入在基础培养基(不含生长因子n°SF-4ZR-500-S的Cell Systems CSC无血清培养基)中的15,000个原代人视网膜周细胞((ACBRI 183 CellSystems)，用hTERT无限增殖化)/孔/100μl；将平板放回RTCA分析仪并且立即开始10-20小时的测量。

实施例26

细胞增殖测定

CellTiter 96 Aqueous One溶液细胞增殖测定(Promega，G3580)。

原代人视网膜周细胞((ACBRI 183 CellSystems)，用hTERT无限增殖化)，2500个细胞/孔/100μl

培养基

生长培养基＝CSC完全培养基，培养增强物(culture boost)(ACBRI n°4Z＝-500)

测定培养基＝不含生长因子的CSC物血清培养基(ACBRI n°SF-4ZR-500-S)

Balbc3T3，5000个细胞/孔/100μl

培养基

生长培养基＝DMEM(Gibco n°41966)，10％NBCS(新生牛血清)

测定培养基＝DMEM(Gibco n°41966)，0.4％NBCS

增殖测定

在测定前24-48小时将细胞接种在生长培养基中。当细胞至80-90％汇合时，用胰蛋白酶溶液收集细胞。将细胞以0.25×10⁵个细胞/ml(或0.5×10⁵个细胞/ml)重悬在生长培养基中。向96孔平板的每个孔中加入100μl细胞混悬液。在37℃温育24小时。去除生长培养基，向每个孔中加入100μl测定培养基。温育24小时。向每个孔中加入100μl标准物或样品(2X浓缩的，稀释在测定培养基中)。在37以5％CO₂温育72小时。向细胞加入40μl染料溶液并在37℃温育。在不同时间(1h至8h)在490nm读取。

实施例27

抗-PDGF-BB抗体动力学筛选

使用BIACORE T200仪器(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振研究抗-PDGF-BB抗体与人PDGF-BB的结合。使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒，在pH 4.0将大约20个共振单位(RU)的重组人PDGF-BB(5μg/ml；ordering code 220-BB；R&D Systems)偶联到Series S C1芯片(GE Healthcare BR-1005-35)上。用于固定的运行缓冲液是HBS-N pH7.4(10mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4，GE Healthcare)。对于下述动力学表征，运行和稀释缓冲液为HBS-P pH 7.4(10mM HEPES，150mM NaCl，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4，GEHealthcare)。流动池设置为25℃-并且样品区组设置为12℃-并用运行缓冲液致敏两次。

通过以100μl/min的流速注入在溶液中浓度为30nM和3nM的抗-PDGF-BB抗体30秒而测量缔合。监测解离期直至600秒，并且通过由样品溶液转换为运行缓冲液而引发。通过以5μl/min的流速连续两次注入0.85％H₃PO₄(磷酸)溶液60秒进行清洗，而使表面再生。通过减去由空白表面得到的反应而校正容积折射率(bulk refractive index)差异。还减去空白注射液(＝双重参比)。为了计算K_D和其他动力学参数，使用朗缪尔1∶1模型进行。

实施例28

抗-PDGF-BB Fab动力学表征

使用BIACORE T200仪器(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振研究抗-PDGF-BB Fab样品与人PDGF-BB的结合。使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒，在pH 4.0将大约50个共振单位(RU)的重组人PDGF-BB(0.5μg/ml；ordering code 220-BB；R&D Systems)偶联到Series S CM3芯片(GE Healthcare BR-1005-36)上。用于固定的运行缓冲液是HBS-N pH 7.4(10mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4，GE Healthcare)。对于下述动力学表征，运行和稀释缓冲液为HBS-P pH 7.4(10mM HEPES，150mM NaCl，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4，GE Healthcare)。流动池设置为25℃-并且样品区组设置为12℃-并用运行缓冲液致敏两次。

通过以30μl/min的流速注入在溶液中的不同浓度(以300nM起始，连续1∶3稀释)的抗-PDGF-BB Fab 180秒而测量缔合。监测解离期直至900秒，并且通过由样品溶液转换为运行缓冲液而引发。通过以5μl/min的流速用0.85％H₃PO₄(磷酸)溶液清洗60秒，而使表面再生。通过减去由空白表面得到的反应而校正容积折射率差异。还减去空白注射液(＝双重参比)。为了计算KD和其他动力学参数，使用朗缪尔1∶1模型进行。

实施例29

化学降解试验

将样品分成三份等分试验，并且分别重新缓冲在20mM His/His*HCl，140mM NaCl，pH 6.0中或在PBS中，保存在40℃(His/NaCl)或37℃(PBS)。对照样品保存在-80℃。

在温育结束后，分析样品的相对活性浓度(BIAcore)，聚集(SEC)和破裂(毛细管电泳或SDS-PAGE)并与未处理的对照进行比较。

实施例30

热稳定性

在20mM组氨酸/盐酸组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中制备浓度为1mg/mL的样品，经由0.4μm滤板离心转移到光学384孔平板中，并且用石蜡油覆盖。在DynaPro平板读取仪(Wyatt)上通过动态光散射重复测量水力半径，同时以0.05℃/min的速率将样品从25℃加热至80℃。

备选地，将样品转移到10μL微量比色皿阵列中，并且用Optim1000仪器(AvactaInc.)记录静态光散射数据以及用266nm激光激发时的荧光数据，同时以0.1℃/min的速率将它们从25℃加热至90℃。

聚集开始温度定义为水力半径(DLS)或散射的光强度(Optim1000)开始增加时的温度。

解链温度定义为荧光强度相对于波长的图中的拐点。

尽管出于清楚理解的目的，通过举例说明和实施例详细地描述了前述的发明，但是所述说明和实施例不应该解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的功能内容通过引用明确地整体结合在本文中。

实施例31

双特异性抗体的制备和纯化

在用转染试剂293-free(Novagen)转染DNA后，在混悬适应的HEK293F(FreeStyle293-F细胞；Invitrogen)细胞中进行双特异性抗体的瞬时表达。

在125ml摇瓶中解冻(在37℃，7％CO2，85％湿度，135rpm温育/摇动)后，每逢第三天或第四天通过稀释将细胞传代，至少传代四次(体积为30ml)。通过将细胞以3x10⁵个细胞/ml的细胞密度接种在250ml培养基中而扩增细胞。三天后，将细胞分传，并且以2*10⁵个细胞/ml的密度新接种在500ml培养基中。四天后，将细胞分传，并且以7*10⁵个细胞/ml的密度新接种在1升培养基中(在37℃，7％CO2，85％湿度，110rpm温育/摇动)。在24小时后，在大约1.4-2.0x10⁶个细胞/ml的细胞密度进行转染。

在转染之前，将1000μg质粒-DNA(2x 250μg轻链编码质粒DNA和2x 250μg重链编码质粒DNA)稀释在终体积为40ml的预热的(水浴；37℃)Opti-MEM(Gibco)中。将溶液轻轻混合，并且在室温温育不超过5分钟。然后，向DNA-Opti-MEM-溶液中加入1333μl 293-free转染剂。将混合物轻轻混合，并且在室温温育15-20分钟。小心地将全部体积的混合物添加到1升HEK-细胞培养物中。将细胞在37℃，7％CO2，85％湿度下以110rpm摇动进一步培养7天。

7天后，通过以2000rpm，4℃离心10分钟的第一离心步骤收集上清。然后，将上清转移到新的离心瓶中用于以4000rpm，4℃离心20分钟的第二离心步骤。将不含细胞的上清通过0.22μm滤器(Millipore)过滤并且在开始纯化步骤之前保存在冰箱中(-20℃)。

将含有抗体的培养上清过滤并通过至少两个层析步骤纯化。使用用PBS(1mMKH2PO4，10mM Na2HPO4，137mM NaCl，2.7mM KCl)(pH 7.4)平衡的CaptureSelect预装柱IgG-CH1(life technologies，#494320005)，通过亲和层析捕获抗体。通过用平衡缓冲液清洗去除未结合的蛋白，并且用25mM柠檬酸缓冲液(pH 3.0)回收抗体，并在洗脱后立即用1MTris-碱(pH 9.0)中和至pH 6.0。

使用在Superdex 200^TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。所述大小排阻层析在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH 6.0中进行。将含有抗体的溶液用装配Biomax-SK膜(Millipore，Billerica，MA)的Ultrafree-CL离心过滤器部件浓缩并保存在-80℃。

使用疏水相互作用层析(HIC)进一步纯化抗-PDGF-B/ANG2抗体(clone 0144-0004)。向含有抗体的溶液中加入硫酸铵至终浓度为1M。将溶液应用到用1M硫酸铵，35mM乙酸盐，pH 5.6平衡的Butyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare)柱上。将抗体用35mM乙酸盐(pH 5.6)以线性梯度(0-100％)洗脱。将含有抗体的级分汇集并且应用到大小排阻层析上。

使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm的光学密度(OD)确定抗体制剂的蛋白浓度。

使用具有蛋白表达芯片和HT蛋白表达试剂盒的LabChip GX II(PerkinElmer)，通过CE-SDS分析抗体的纯度和完整性。

使用BioSuite高分辨率SEC，5μm分析级大小排阻柱(Waters GmbH)，使用200mM K2HPO4/KH2PO4，250mM KCl，pH 7.0作为运行缓冲液，通过高效SEC确定抗体制剂的聚集物含量。

抗体0144是包含SEQ ID NO：117(VH)与SEQ ID NO：118(VL)的ANG2结合位点和SEQID NO：92(VH)与SEQ ID NO：97(VL)的PDGF-B结合位点的CrossMab抗体。

抗体0117是包含SEQ ID NO：119(VH)与SEQ ID NO：120(VL)的VEGF结合位点和SEQID NO：92(VH)与SEQ ID NO：97(VL)的PDGF-B结合位点的CrossMab抗体。

抗体0145是包含SEQ ID NO：119(VH)与SEQ ID NO：120(VL)的ANG2结合位点和SEQID NO：101(VH)与SEQ ID NO：106(VL)的PDGF-B结合位点的CrossMab抗体。

抗体0146是包含SEQ ID NO：117(VH)与SEQ ID NO：118(VL)的ANG2结合位点和SEQID NO：121(VH)与SEQ ID NO：122(VL)的PDGF-B结合位点的CrossMab抗体。

实施例32

双特异性抗体动力学表征

PDGF-BB

使用BIACORE T200仪器(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振研究双特异性抗-PDGF-BB/ANG2抗体与人PDGF-BB的结合。使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒，在pH4.0将大约50个共振单位(RU)的重组人PDGF-BB(0.5μg/ml；ordering code 220-BB；R&DSystems)偶联到Series S CM3芯片(GE Healthcare BR-1005-36)上。用于固定的运行缓冲液是HBS-N pH 7.4(10mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4，GE Healthcare)。对于下述动力学表征，运行和稀释缓冲液为HBS-P pH 7.4(10mM HEPES，150mM NaCl，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4，GE Healthcare)。流动池设置为25℃-并且样品区组设置为12℃-并用运行缓冲液致敏两次。

通过以30μl/min的流速注入在溶液中的不同浓度(以300nM起始，连续1∶3稀释)的双特异性抗体180秒而测量缔合。监测解离期直至900秒，并且通过由样品溶液转换为运行缓冲液而引发。通过以5μl/min的流速用0.85％H₃PO₄(磷酸)溶液清洗60秒，而使表面再生。通过减去由空白表面得到的反应而校正容积折射率差异。还减去空白注射液(＝双重参比)。为了计算KD和其他动力学参数，使用朗缪尔1∶1模型进行。

ANG2

使用BIACORE T200仪器(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振研究双特异性抗体与人ANG2-RBD-小鼠Fc-区融合体的结合。使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒，在pH 5.0将大约4000RU的抗-小鼠Fc-区抗体(10μg/ml抗-小鼠(Fc)抗体)偶联到Series SCM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上。在固定步骤过程中使用HBS-N(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，GE Healthcare)作为运行缓冲液。对于下述动力学表征，样品和运行缓冲液为HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，0.05％表面活性剂P20；GEHealthcare)。流动池设置为25℃-并且样品区组设置为12℃-并在动力学表征之前用运行缓冲液致敏两次。

通过以5μl/min的流动注入1μg/ml溶液30秒而捕获人ANG2-RBD-鼠Fc-区融合体。通过以90μl/min的流速注入在溶液中的不同浓度(以300nM起始，连续1∶3稀释)的双特异性抗体90秒而测量缔合。监测解离期直至600秒，并且通过由样品溶液转换为运行缓冲液而引发。通过以5μl/min的流速用3M MgCl2溶液清洗60秒而使所有表面再生。通过减去由抗-小鼠IgG抗体(Fc)表面得到的反应而校正容积折射率差异。还减去空白注射液(＝双重参比)。为了计算KD和其他动力学参数，使用朗缪尔1∶1模型进行。

VEGF

使用BIACORE T200仪器(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振研究双特异性抗体与人VEGF同种型121的结合。使用GE Healthcare供应的胺偶联试剂盒，按照制造商的使用说明，将抗-六-组氨酸抗体偶联到CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上。在固定步骤过程中使用HBS-N(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，GE Healthcare)作为运行缓冲液。对于下述动力学表征，样品和运行缓冲液为HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，0.05％表面活性剂P20；GE Healthcare)。流动池设置为25℃-并且样品区组设置为12℃-并在动力学表征之前用运行缓冲液致敏两次。

通过以5μl/min的流速注入溶液30秒捕获包含组氨酸标记的人VEGF同种型121。通过以90μl/min的流速注入在溶液中的不同浓度(以300nM起始，连续1∶3稀释)的双特异性抗体90秒而测量缔合。监测解离期直至600秒，并且通过由样品溶液转换为运行缓冲液而引发。通过以5μl/min的流速用3M MgCl2溶液清洗60秒而使所有表面再生。通过减去由抗-六-组氨酸抗体表面得到的反应而校正容积折射率差异。还减去空白注射液(＝双重参比)。为了计算KD和其他动力学参数，使用朗缪尔1∶1模型进行。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司

<120> 抗-PDGF-B抗体和使用方法

<130> P32415

<150> EP14192519.8

<151> 2014-11-10

<160> 174

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Val Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gln Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 2

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 3

Gly Ser Gly

1

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 4

Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Val

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 5

Thr Gln Asp Phe Asp

1 5

<210> 6

<211> 111

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 6

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr

20 25 30

Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 7

Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr Gly Tyr Ser Phe

1 5 10

<210> 8

<211> 3

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 8

Arg Ala Ser

1

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 9

Ser Asn Glu Asp Pro Arg

1 5

<210> 10

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 VH-001

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gln Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H1-001

<400> 11

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 12

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H2s-001

<400> 12

Gly Ser Gly

1

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H2-001

<400> 13

Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Val

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H3-001

<400> 14

Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser

1 5

<210> 15

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 VH-002

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gln Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H1-002

<400> 16

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 17

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H2s-002

<400> 17

Gly Ser Gly

1

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H2-002

<400> 18

Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Val

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H3-002

<400> 19

Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser

1 5

<210> 20

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 VH-003

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gln Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H1-003

<400> 21

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 22

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H2s-003

<400> 22

Gly Ser Gly

1

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H2-003

<400> 23

Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H3-003

<400> 24

Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser

1 5

<210> 25

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 VH-004

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gln Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H1-004

<400> 26

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 27

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H2s-004

<400> 27

Gly Ser Gly

1

<210> 28

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H2-004

<400> 28

Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H3-004

<400> 29

Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser

1 5

<210> 30

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 VH-005

<400> 30

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ala Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gln Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H1-005

<400> 31

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 32

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H2s-005

<400> 32

Gly Ser Gly

1

<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H2-005

<400> 33

Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H3-005

<400> 34

Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser

1 5

<210> 35

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 VH-006

<400> 35

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gln Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H1-006

<400> 36

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 37

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H2s-006

<400> 37

Gly Ser Gly

1

<210> 38

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H2-006

<400> 38

Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-H3-006

<400> 39

Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser

1 5

<210> 40

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 VL-001

<400> 40

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr

20 25 30

Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 41

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-L1-001

<400> 41

Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr Gly Tyr Ser Phe

1 5 10

<210> 42

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-L2-001

<400> 42

Arg Ala Ser

1

<210> 43

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-L3-001

<400> 43

Ser Asn Glu Asp Pro Arg

1 5

<210> 44

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 VL-002

<400> 44

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr

20 25 30

Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-L1-002

<400> 45

Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr Gly Tyr Ser Phe

1 5 10

<210> 46

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-L2-002

<400> 46

Arg Ala Ser

1

<210> 47

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-L3-002

<400> 47

Ser Asn Glu Asp Pro Arg

1 5

<210> 48

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 VL-003

<400> 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr

20 25 30

Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-L1-003

<400> 49

Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr Gly Tyr Ser Phe

1 5 10

<210> 50

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-L2-003

<400> 50

Arg Ala Ser

1

<210> 51

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-L3-003

<400> 51

Ser Asn Glu Asp Pro Arg

1 5

<210> 52

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 VL-004

<400> 52

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr

20 25 30

Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 53

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-L1-004

<400> 53

Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr Gly Tyr Ser Phe

1 5 10

<210> 54

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-L2-004

<400> 54

Arg Ala Ser

1

<210> 55

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0044 HVR-L3-004

<400> 55

Ser Asn Glu Asp Pro Arg

1 5

<210> 56

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ala Gly Gly Gly Ile Thr His Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Glu Ser Gly Gly Asp Ile Tyr Ser Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 57

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 57

Ser Phe Trp Met Thr

1 5

<210> 58

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 58

Ser Ala Gly Gly Gly Ile

1 5

<210> 59

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 59

Ser Ile Ser Ala Gly Gly Gly Ile Thr His Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 60

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 60

Ser Gly Gly Asp Ile Tyr Ser Asp Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 61

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 61

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 62

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 63

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 64

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 65

<211> 120

<212> PRT

<213> 智人

<400> 65

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ala Gly Gly Gly Ile Thr His Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Glu Ser Gly Gly Asp Ile Tyr Ser Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 66

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 66

Ser Phe Trp Met Thr

1 5

<210> 67

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 67

Ser Ala Gly Gly Gly Ile

1 5

<210> 68

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 68

Ser Ile Ser Ala Gly Gly Gly Ile Thr His Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 69

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 69

Ser Gly Gly Asp Ile Tyr Ser Asp Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 70

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 70

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 71

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 71

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 72

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 72

Thr Thr Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 73

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 73

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 74

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0060 VH

<400> 74

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Ala Gly Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ser Ser Arg Asp Asn Tyr Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Tyr Pro Gly Tyr Asn Ser Asp Thr Tyr Tyr Tyr Asp Gly

100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 75

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0060 HVR-H1

<400> 75

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 76

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0060 HVR-H2s

<400> 76

Ser Ala Gly Gly Gly Tyr

1 5

<210> 77

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0060 HVR-H2

<400> 77

Gly Ile Ser Ala Gly Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 78

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0060 HVR-H3

<400> 78

Phe Tyr Pro Gly Tyr Asn Ser Asp Thr Tyr Tyr Tyr Asp Gly Met Asp

1 5 10 15

Val

<210> 79

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0060 VL kappa

<400> 79

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 80

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0060 HVR-L1

<400> 80

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 81

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0060 HVR-L2

<400> 81

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 82

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0060 HVR-L3

<400> 82

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 83

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0064 VH

<400> 83

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys

85 90 95

Ala Glu Ser Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 84

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0064 HVR-H1

<400> 84

Ser Tyr Trp Met Ser

1 5

<210> 85

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0064 HVR-H2s

<400> 85

Ser Asp Gly Gly Gly Thr

1 5

<210> 86

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0064 HVR-H2

<400> 86

Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 87

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0064 HVR-H3

<400> 87

Ser Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 88

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0064 VL kappa

<400> 88

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ile Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 89

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0064 HVR-L1

<400> 89

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 90

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0064 HVR-L2

<400> 90

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0064 HVR-L3

<400> 91

Gln Gln Ser Tyr Ile Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 92

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0085 VH

<400> 92

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Glu Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Trp Leu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 93

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0085 HVR-H1

<400> 93

Ser Tyr Trp Met Ser

1 5

<210> 94

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0085 HVR-H2s

<400> 94

Ser Asp Gly Gly Gly Leu

1 5

<210> 95

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0085 HVR-H2

<400> 95

Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 96

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0085 HVR-H3

<400> 96

Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Trp Leu Phe Gly Tyr

1 5 10

<210> 97

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0085 VL kappa

<400> 97

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 98

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0085 HVR-L1

<400> 98

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 99

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0085 HVR-L2

<400> 99

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 100

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0085 HVR-L3

<400> 100

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 101

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0086 VH

<400> 101

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Glu Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Trp Leu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 102

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0086

<400> 102

Ser Tyr Trp Met Ser

1 5

<210> 103

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0086 HVR-H2s

<400> 103

Ser Asp Gly Gly Gly Leu

1 5

<210> 104

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0086 HVR-H2

<400> 104

Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 105

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0086 HVR-H3

<400> 105

Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Trp Leu Phe Gly Tyr

1 5 10

<210> 106

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0086 VL kappa

<400> 106

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 107

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0086 HVR-L1

<400> 107

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 108

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0086 HVR-L2

<400> 108

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 109

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFB-0086 HVR-L3

<400> 109

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 110

<211> 231

<212> PRT

<213> 智人

<400> 110

Met Asn Arg Cys Trp Ala Leu Phe Leu Ser Leu Cys Cys Tyr Leu Arg

1 5 10 15

Leu Val Ser Ala Glu Gly Asp Pro Ile Pro Glu Glu Leu Tyr Glu Met

20 25 30

Leu Ser Asp His Ser Ile Arg Ser Asp Pro Gly Glu Glu Asp Gly Ala

35 40 45

Glu Leu Asp Leu Asn Met Thr Arg Ser His Ser Gly Gly Glu Leu Glu

50 55 60

Ser Leu Ala Arg Gly Arg Arg Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu

65 70 75 80

Pro Ala Met Ile Ala Glu Cys Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile

85 90 95

Ser Arg Arg Leu Ile Asp Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro

100 105 110

Pro Cys Val Glu Val Gln Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn

115 120 125

Val Gln Cys Arg Pro Thr Gln Val Gln Leu Arg Pro Val Gln Val Arg

130 135 140

Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val

145 150 155 160

Thr Leu Glu Asp His Leu Ala Cys Lys Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala

165 170 175

Arg Pro Val Thr Arg Ser Pro Gly Gly Ser Gln Glu Gln Arg Ala Lys

180 185 190

Thr Pro Gln Thr Arg Val Thr Ile Arg Thr Val Arg Val Arg Arg Pro

195 200 205

Pro Lys Gly Lys His Arg Lys Phe Lys His Thr His Asp Lys Thr Ala

210 215 220

Leu Lys Glu Thr Leu Gly Ala

225 230

<210> 111

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rbHC.up

<400> 111

aagcttgcca ccatggagac tgggctgcgc tggcttc 37

<210> 112

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rbHCf.do

<400> 112

ccattggtga gggtgcccga g 21

<210> 113

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rbLC.up

<400> 113

aagcttgcca ccatggacay gagggccccc actc 34

<210> 114

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rbLC.do

<400> 114

cagagtrctg ctgaggttgt aggtac 26

<210> 115

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BcPCR_FHLC_leader.fw

<400> 115

atggacatga gggtccccgc 20

<210> 116

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BcPCR_huCkappa.rev

<400> 116

gatttcaact gctcatcaga tggc 24

<210> 117

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Ang2 LC10 wt + G114A, S360P, T28N, T30A (HC) + D50T (LC) VH

<400> 117

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Pro Gly Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Pro Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 118

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Ang2 LC10 wt + G114A, S360P, T28N, T30A (HC) + D50T (LC) VL

<400> 118

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser

100 105 110

<210> 119

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEGF_LC VHVL cross LC kappa

<400> 119

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 120

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEGF_LC10 VHVL cross IgG HC LALAPGAAA knob

<400> 120

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 121

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFang2-0044 VH

<400> 121

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Val Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gln Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 122

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDGFang2-0044 VL

<400> 122

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ile Tyr

20 25 30

Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 123

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CrossMab Ang2 wt-PDGF-0044 HC1

<400> 123

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser

100 105 110

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

115 120 125

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

130 135 140

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

145 150 155 160

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

180 185 190

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

195 200 205

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

210 215 220

Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

305 310 315 320

Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

385 390 395 400

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 124

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CrossMab Ang2 wt-PDGF-0044 HC2

<400> 124

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Val Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gln Thr Thr Gln Asp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

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<210> 157

<211> 236

<212> PRT

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145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 169

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CrossMab Ang2 mut5-PDGF-0086 LC1

<400> 169

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Ser Ser Pro Gly Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Pro Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

130 135 140

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 170

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CrossMab Ang2 mut5-PDGF-0086 LC2

<400> 170

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

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195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 171

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体0117 HC1

<400> 171

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

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20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

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100 105 110

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

115 120 125

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

130 135 140

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

145 150 155 160

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

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245 250 255

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

275 280 285

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435

<210> 172

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体0117 HC2

<400> 172

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

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Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 173

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体0117 LC1

<400> 173

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

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Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala

115 120 125

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

130 135 140

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

145 150 155 160

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

195 200 205

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210 215 220

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 174

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体0117 LC2

<400> 174

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims

1.特异性结合人PDGF-B的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列的HVR-L3。

2.特异性结合人PDGF-B的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列的HVR-L3。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人IgG1亚类的或是人IgG4亚类的。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中所述抗体通过抑制人PDGF-B与人PDGF受体的结合而阻断人PDGF-B的生物学活性。

5.一种药物制剂，其包含权利要求1-4中任一项所述的抗体和任选地药学可接受的载体。

6.根据权利要求5所述的药物制剂，其还包含选自抗-ANG2抗体和抗-VEGF抗体的另外的治疗剂。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其用作药物。

8.权利要求1-4中任一项的抗体在制备药物中的应用。

9.根据权利要求7和8中任一项的应用，其中所述药物用于治疗眼血管疾病，优选用于治疗黄斑变性。

10.根据权利要求7-9中任一项的应用，其中所述药物用于抑制PDGF-B与PDGF-B受体之间的相互作用。