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CN107119015A - 外泌体、其制备方法及其在制备治疗肺癌的药物中的应用 - Google Patents

外泌体、其制备方法及其在制备治疗肺癌的药物中的应用 Download PDF

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CN107119015A CN201710285865.0A CN201710285865A CN107119015A CN 107119015 A CN107119015 A CN 107119015A CN 201710285865 A CN201710285865 A CN 201710285865A CN 107119015 A CN107119015 A CN 107119015A
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Abstract

本发明涉及一种外泌体、其制备方法及其在制备治疗肺癌的药物中的应用。该制备方法通过采用KRN7000和ATP刺激细胞分泌外泌体。本发明所提供的制备方法能够高效地在体外制备外泌体。本发明还提供了上述方法制备的外泌体，其具有较强的细胞毒性作用以及抗肺部肿瘤活性。本发明还提供了上述外泌体在制备治疗肺癌的药物中的应用。

Description

外泌体、其制备方法及其在制备治疗肺癌的药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种外泌体、其制备方法及其在制备治疗肺癌的药物中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
随着恶性肿瘤对人类生存健康的威胁日益严重，肿瘤诊疗的新模式、新方法也在不断涌现。外泌体在肿瘤发生、发展机制中扮演着重要角色，其在肿瘤学中是一个新兴研究领域，近年来取得了很多突破，在肿瘤治疗上具有较好前景。
外泌体(exosome)是由多种活细胞分泌的囊泡小体，其中含有蛋白质和RNA等多种关键组分，外泌体在多种生理和病理过程中发挥着重要作用，包括恶性肿瘤。外泌体可以用于肿瘤的免疫治疗，Rao等人的研究表明(Rao et al，Hepatology，2016)，肿瘤细胞来源的外泌体可以通过DC介导的免疫反应起到抑制肝癌动物模型和人类肿瘤生长的作用。另有研究证明(Katakowski et al，Cell Molecular Neurobiology，2016)，由于外泌体直径较小，可透过血脑屏障进入脑部血循环，外泌体可以将抗肿瘤的RNA和蛋白质带入，对脑部原发性肿瘤发挥治疗作用。此外，自然杀伤T细胞(NK细胞)也可以通过释放含有穿孔素和颗粒酶的外泌体发挥直接抗肿瘤作用(Lugini et al，Journal of Immunology，2012)。
与肿瘤的免疫细胞治疗相比，外泌体治疗具有一定优势。Helmlinger等人的研究表明(Helmlinger et al，Nature Medicine，1997)，对实体肿瘤进行免疫细胞治疗的作用效果不显著很大程度上是由于肿瘤的酸性微环境所引起；Fischer等人的体外研究试验也表明(Fischer et al，Clinical Immunology，2000)，如果细胞外环境的pH为酸性，NK细胞和LAK细胞的穿孔素/颗粒酶释放，以及Fas/FasL作用都会被抑制，这意味着这些免疫细胞无法充分发挥其细胞毒作用。然而有研究证实(Parolini et al，Journal of BiologicalChemistry，2009)，对于外泌体而言，酸性环境更有助于外泌体被肿瘤细胞摄取吸收，以进一步发挥外泌体的抗肿瘤生物学活性。以上说明，利用外泌体制备抗肿瘤药物具有很大的应用前景。
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，CIK细胞)是由人外周血或脐带血等来源的单个核细胞在体外用多种细胞因子与CD3抗体共同培养后获得的一群异质细胞。CIK细胞同时具有T淋巴细胞的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀肿瘤活性的特点，被认为是肿瘤过继免疫治疗的新希望(朱子杰等人，医药卫生：全文版，2016)。基础和临床研究均表明，CIK细胞在多种肿瘤的治疗过程中均表现出一定疗效，但关于CIK细胞通过外泌体发挥治疗作用还未见报道。
KRN7000是从海绵组织中分离得到的一种α-半乳糖神经酰胺(α-galactosylceramide)，其具有广泛的生物活性。研究表明，KRN7000是一种选择性CDld蛋白的配体，通过活化NK细胞促进干扰素γ(IFN-γ)和白介素4(IL-4)的释放(冯俊娜等人，有机化学，2015)，在抗肿瘤、抗病毒、延缓或预防显性糖尿病的发病等方面均发挥作用。但KRN7000对于外泌体的作用未见报道。
三磷酸腺苷(ATP)在细胞内提供代谢需要的能量，从而支持细胞的功能，如蛋白质合成、细胞膜合成、细胞分化等。研究表明，ATP可以诱导人巨噬细胞和啮齿类动物胸腺细胞死亡(Takenouchi et al.，Immunology Letters，2015)。P2X7受体是ATP门控阳离子通道受体，其中P2X7受体信号通路与IL-1β、IL-6、COX-2等多种炎症因子的生成和释放相关，在多种疾病的发病过程中起到了至关重要的作用(Gu et al.，American Journal ofPhysiology-Cell Physiology，2000)。然而ATP对于外泌体的作用仍未见到有相关研究。
综上，CIK细胞来源外泌体的抗肿瘤活性仍未被充分证实。此外，将KRN7000和ATP协同作用于CIK细胞的培养及其对CIK细胞来源外泌体的活性作用未见报道。如何使用经济高效的方法在体外制备具有治疗肿瘤活性的外泌体，并提高其临床应用性，仍有待进一步研究。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种外泌体及其制备方法，该制备方法能够提高外泌体的抗肺部肿瘤活性。
本发明的目的还在于提供上述外泌体在制备治疗肺癌的药物中的应用。
为达到上述目的，本发明首先提供了一种外泌体的制备方法，其包括以下步骤：
(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ，于37℃、5％CO2条件下进行培养；
(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2，刺激细胞的生长和增殖；
(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(4)培养第7天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(5)培养第14天，在无血清培养基中加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM，孵育30分钟后，收获细胞培养液的上清液并提取得到所述外泌体；
该方法还包括：在步骤(2)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000，在步骤(4)中加入KRN7000和ATP储存液，KRN7000的添加量为70ng/ml，ATP的终浓度为4mM；或者，在步骤(1)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000，在步骤(4)中加入KRN7000和ATP储存液，KRN7000的添加量为35ng/ml，ATP的终浓度为4mM；或者，在步骤(2)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000，在步骤(4)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000；或者，在步骤(1)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000。
在上述制备方法，所采用的无血清培养基可以是本领域常用的无血清培养基；“据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液”中的半量换液可以根据常规方式进行，一般是在第3、5、7、9、11、13天进行；如果没有特殊说明，所有的浓度、添加量均以无血清培养基的体积为基准进行计算，半量换液之后补加人重组白介素2时也是以无血清培养基的总体积为基准进行计算。
在本发明提供的外泌体的制备方法中，细胞由脐血单个核细胞诱导获得，其中在细胞培养的过程中加入KRN7000、ATP储存液，可以有效增强外泌体的细胞毒性作用，大大增强其杀伤肿瘤细胞的作用效果。
根据本发明的第一种优选技术方案，上述制备方法可以包括以下具体步骤：
(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ，于37℃、5％CO2条件下进行培养；
(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，刺激细胞的生长和增殖；
(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(4)培养第7天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2、以70ng/ml的添加量加入KRN7000，并加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并补加300U/ml的人重组白介素2；
(5)培养第14天，在培养基中加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM，孵育30分钟后，收获细胞培养液的上清液并提取得到所述外泌体。
根据本发明的第二种优选技术方案，上述制备方法可以包括以下具体步骤：
(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，于37℃、5％CO2条件下进行培养；
(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2，刺激细胞的生长和增殖；
(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(4)培养第7天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，并加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(5)培养第14天，在培养基中加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM，孵育30分钟后，收获细胞培养液的上清液并提取得到所述外泌体。
根据本发明的第三种优选技术方案，上述制备方法可以包括以下具体步骤：
(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ，于37℃、5％CO2条件下进行培养；
(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，刺激细胞的生长和增殖；
(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(4)培养第7天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2、以35ng/ml的添加量加入KRN7000；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(5)培养第14天，在培养基中加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM，孵育30分钟后，收获细胞培养液的上清液并提取得到所述外泌体。
根据本发明的第四种优选技术方案，上述制备方法可以包括以下具体步骤：
(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，于37℃、5％CO2条件下进行培养；
(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2，刺激细胞的生长和增殖；
(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(4)培养第7天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(5)培养第14天，在培养基中加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM，孵育30分钟后，收获细胞培养液的上清液并提取得到所述外泌体。
在上述的制备方法中，优选地，外泌体的提取按照以下步骤进行：
收集20mL所述细胞培养液的上清液，于2000×g离心30min，取上清液，弃去细胞碎片等沉淀；
于4℃、10000×g离心60min，得到含外泌体的浓缩液；
将所述含外泌体的浓缩液于4℃、100000×g离心60min，收集底部沉淀；
将所得沉淀采用PBS缓冲液重悬，再次于100000×g离心60min，收集底部沉淀，即为外泌体；将所得外泌体用2ml的PBS缓冲液重悬，采用0.22μm滤膜过滤除菌，并于-80℃储存。
本发明还提供了一种外泌体，其是由上述制备方法制备的。该外泌体能够有效促进小细胞肺癌细胞的死亡。
本发明还提供了上述外泌体在制备治疗肺癌的药物中的应用，优选地，所述肺癌为小细胞肺癌。
本发明的有益效果在于：
本发明所提供的制备方法得到的外泌体具有抗肺部肿瘤活性，具有杀伤肺癌细胞的作用。本发明所提供的制备方法是高效地在体外制备外泌体的方法，可以有效增强外泌体的细胞毒性作用，进一步增强其抗肺部肿瘤活性。
附图说明
图1A-图1J为流式细胞术检测结果。
图2为细胞培养增殖曲线。
图3为外泌体特异性标志物CD63表达水平的柱状图。
图4为外泌体FasL表达水平的柱状图。
图5为外泌体穿孔素表达水平的柱状图。
图6为NCI-H446细胞死亡百分比的柱状图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更清楚的理解，对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1CIK细胞的培养
1.脐血单个核细胞提取：
取肝素抗凝新鲜脐血，采用Ficoll-Hypaque法分离脐血单个核细胞(CBMNC)。将脐血与磷酸盐缓冲液(PBS溶液)等体积混合，并按1∶1的体积比缓慢加入到Ficoll-Hypaque(购自GE公司)中，于20℃、400×g离心25min；小心吸取离心管中的CBMNC条带层，用PBS溶液重悬，并于200×g离心15min；去除上清液，将沉淀用PBS溶液重悬，并于200×g离心15min，即获得脐血单个核细胞。
2.细胞培养：
按照不同分组，将上述CBMNC进行重悬培养，分组情况及各种成分的添加量(ATP对应的是终浓度)、加入时机见表1。其中：
各组均采用无血清培养基(购自Lonza公司)，在其中加入人重组干扰素γ(rhIFN-γ，购自北京四环生物制药有限公司)、人重组白介素2(rhIL-2，购自北京四环生物制药有限公司)、抗CD3单克隆抗体(购自Peprotech公司)；并根据分组不同，在培养体系中加入KRN7000(购自abcam公司)和ATP(购自Sigma公司)；
培养第0天，将CBMNC按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，向培养体系中加入重组人IFN-γ；或加入重组人IFN-γ并同时加入KRN7000(添加量为35ng/ml或70ng/ml)，于37℃、5％(体积浓度)CO2条件下进行培养；
24h后，即培养第1天，加入CD3单克隆抗体和重组人IL-2；或在加入重组人IL-2的同时加入KRN7000(添加量为35ng/ml或70ng/ml)，刺激细胞的生长和增殖；
培养第3天，半量换液并加入重组人IL-2；或在加入重组人IL-2的同时加入ATP储存液，使ATP达到表1所示的终浓度；
根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并补加重组人IL-2；
培养第7天，半量换液并加入重组人IL-2；或在加入重组人IL-2的同时加入KRN7000(添加量为35ng/ml或70ng/ml)；或在加入重组人IL-2的同时加入KRN7000(添加量为35ng/ml或70ng/ml)和ATP储存液，使ATP达到表1所示的终浓度；
根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并补加重组人IL-2；
培养第14天，部分分组在培养基中加入ATP储存液使ATP达到4mM的终浓度，孵育30分钟后，即收获细胞培养的上清液并按实施例2中的操作提取外泌体，其为CIK细胞来源的外泌体，细胞部分进行流式细胞检测(如图1A-图1J所示，分别对应分组A-J)并绘制增殖曲线(图2)。
表1 细胞培养分组
将需要检测的细胞悬液分别取细胞数1×106的目的细胞至各个流式管。设置离心力为350g，离心时间为5min进行离心。离心结束后，平稳取出离心管，弃去上清液，加入100μl PBS溶液重悬细胞。分别将每组细胞悬液添加相应带荧光标签的抗体进行染色，添加抗体后避光孵育20min。孵育结束后每个流式管添加2ml PBS溶液，设置离心力为350g，离心时间为5min进行离心洗涤。离心结束后，弃去上清液，每管添加500μl PBS，于1h内上流式细胞仪检测。流式细胞仪上样时，使用对照组分别对各个电压进行调节，使添加CD3抗体组的细胞均调节位于CD56阴性部分，同理添加CD56抗体组的细胞均位于CD3阴性部分，未添加抗体组的细胞均位于CD3/CD56双阴性门中，调节完成后对检测组进行上样检测。流式检测分析时于FSC/SSC中圈取淋巴细胞设门，对淋巴细胞群进行CD3/CD56分析，其中CIK细胞为CD3+/CD56+双阳性部分。
细胞观察形态学及绘制增殖曲线：在培养过程中，每天观察细胞培养液的颜色和透明度的变化，在倒置显微镜下观察细胞的状态、体积、胞浆和胞核变化。于培养的第3、7、9、11、14天用台盼蓝染色计数不同培养条件下，不同培养时间的活细胞数(具体数据见表2)，绘制增殖曲线。
表2 CIK细胞培养在不同时间下的增殖个数
实施例2CIK细胞来源外泌体的提取和鉴定
1.外泌体的提取
对按照表1中的分组得到的细胞培养液分别提取外泌体，具体为：
收集上述细胞培养液上清液20mL，于2000×g离心30min，取上清液，弃去细胞碎片等沉淀；于4℃、10000×g离心60min，得到含外泌体的浓缩液；将上述浓缩液于4℃、100000×g离心60min，收集底部沉淀；将所得沉淀采用PBS缓冲液重悬，再次于100000×g离心60min，收集底部沉淀，即为CIK细胞外泌体；将所得外泌体用2ml的PBS缓冲液重悬，采用0.22μm滤膜过滤除菌，并于-80℃储存。
2.外泌体的鉴定
①外泌体的形态学观察：
将上述所得到的外泌体溶液充分混匀，经脱水、干燥、粘样、导电处理，在扫描电镜下观察微粒形态：各组CIK细胞外泌体直径约均为50-100nm，符合外泌体特征；各组外泌体的形态没有显著的差异，表明KRN7000和ATP应用于CIK细胞的培养时，对CIK细胞外泌体的形态没有显著的影响。
实验结果还表明，H组和G组的外泌体密度高于其他各组，而D组和E组的外泌体密度低于其他各组，表明在第0天或第1天加入小剂量的KRN7000(35ng/ml)，第7天加入KRN7000(35ng/ml或70ng/ml)并加入ATP激活，同时在第14天再次加入ATP激活，可以有效增加外泌体的密度；而当第0天或第1天加入大剂量的KRN7000(70ng/ml)，第7天与第14天重复与H组或G组相同的操作时，反而使外泌体密度降低；若不于第7天加入KRN7000并加入ATP激活，则各组外泌体密度与对照组A组相比没有明显的差异。
②外泌体标志物CD63检查：
采用蛋白免疫印迹法检测外泌体的特异表达蛋白CD63的表达情况。
采用RIPA裂解液(购自碧云天生物技术有限公司)对各组CIK细胞外泌体进行蛋白裂解30min，采用匀浆器(型号IKAT10)进行蛋白匀浆(15s×3次)；静置30min后，将上述匀浆液于4℃、12000g离心15分钟；采用BCA试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)进行蛋白定量，将总蛋白浓度调至同一水平；加入5×上样缓冲液(16％甘油、20％-巯基乙醇、2％十二烷基磺酸钠、0.05％溴酚蓝)，煮沸5min；将上述溶液上样，于80V电压经缩胶电泳约30min，于120V电压经分离胶电泳约60min；经电转移(250mA，2h)将蛋白质转移到PVDF膜(购自Millipore)，采用封闭液(含5％BSA的TBST溶液)于室温封闭1h。将上述PVDF膜分别与兔抗人CD63抗体(购自Abcam)于4℃孵育过夜后，采用TBST洗膜3次；之后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗于室温孵育1h后，采用TBST洗膜3次；加入ECL化学发光底物(购自Abcam)，采用化学发光凝胶成像系统(Bio-Rad)进行检测。
实验结果表3和图3所示。各实验组外泌体的CD63表达均显著高于CIK组(p＜0.01)，说明CIK细胞外泌体高表达外泌体特异性蛋白CD63，符合外泌体的特征。
与A组比较发现，G组和H组的CD63改变倍数显著增高(p＜0.05)；D组和E组虽然没有统计学差异，但有降低的趋势；B、C、F、I、J组与A组相比有一定量的增加，但均没有统计学差异。这些结果表明，在第0天或第1天加入小剂量的KRN7000(35ng/ml)，第7天加入KRN7000(35ng/ml或70ng/ml)并加入ATP激活，同时在第14天再次加入ATP激活，可以有效增加外泌体特异性蛋白的表达量；而当第0天或第1天加入大剂量的KRN7000(70ng/ml)，第7天与第14天重复与H组或G组相同的操作时，反而使外泌体特异性蛋白表达量降低；若不于第7天加入KRN7000并加入ATP激活，则各组外泌体特异性蛋白的改变不显著。
表3 外泌体特异性标志物的表达量
分组 CD63改变倍数值 标准差
CIK组 1.00 0.31
A组 12.30* 2.11
B组 12.67* 2.33
C组 13.53* 1.97
D组 11.81* 2.16
E组 12.18* 3.10
F组 14.76* 1.92
G组 16.97*# 1.44
H组 17.71*# 2.21
I组 14.51* 1.89
J组 13.28* 1.41
实施例3KRN7000和ATP对CIK细胞外泌体细胞毒性蛋白表达的影响
采用蛋白质免疫法检测外泌体中FasL和穿孔素(perforin)的水平：
采用RIPA裂解液对各组外泌体进行蛋白裂解30min，采用匀浆器进行蛋白匀浆(15s×3次)；静置30min后，将上述匀浆液于4℃、12,000g离心15分钟；采用BCA试剂盒进行蛋白定量，将总蛋白浓度调至同一水平；加入5×上样缓冲液，煮沸5min；将上述溶液上样，于80V电压经缩胶电泳约30min，于120V电压经分离胶电泳约60min；经电转移(250mA，2h)将蛋白质转移到PVDF膜，采用封闭液于室温封闭1h；将上述PVDF膜分别与兔抗FasL抗体、兔抗穿孔素抗体(购自Abcam)于4℃孵育过夜后，采用TBST洗膜(10min×3次)；之后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗于室温孵育1h后，采用TBST洗膜(10min×3次)；加入ECL化学发光底物，采用化学发光凝胶成像系统进行检测。
实验结果表4和图4、图5所示。
分析FasL实验结果发现，与A组相比，G组和H组的FasL水平显著增高(p＜0.01)，F组的FasL水平显著增高(p＜0.05)；D组(p＜0.05)和E组(p＜0.01)的FasL水平显著降低；B、C、I、J组与A组相比有一定量的增加，但均没有统计学差异。
分析perforin实验结果发现，与A组相比，G组和H组的perforin水平显著增高(p＜0.01)；D组perforin水平显著降低(p＜0.05)，E组perforin水平降低，但差异未达到显著水平(p＝0.06)；B、C、F、I、J组与A组相比有一定量的增加，但均没有统计学差异。
这些结果表明，在第0天或第1天加入小剂量的KRN7000(35ng/ml)，第7天加入KRN7000(35ng/ml或70ng/ml)并加入ATP激活，同时在第14天再次加入ATP激活，可以有效增加CIK细胞外泌体细胞毒性蛋白FasL和perforin水平；而当第0天或第1天加入大剂量的KRN7000(70ng/ml)，第7天与第14天重复与H组或G组相同的操作时，反而使细胞毒性蛋白FasL和perforin表达量降低；当于第1天加入小剂量的KRN7000(35ng/ml)，第7天再次加入小剂量的KRN7000(35ng/ml)，并于第14天加入ATP激活，可以在一定程度上增加FasL水平，但不能显著增加perforin水平，说明其细胞毒性物质分泌的促进作用有限。
表4 FasL和穿孔素的表达量
分组 FasL改变倍数值 标准差 穿孔素改变倍数值 标准差
A组 1.00 0.08 1.00 0.07
B组 1.03 0.21 0.96 0.16
C组 1.12 0.16 1.07 0.13
D组 0.82* 0.23 0.73* 0.28
E组 0.75** 0.32 0.89 0.22
F组 1.20* 0.19 1.16 0.12
G组 1.33** 0.22 1.41** 0.11
H组 1.32** 0.15 1.34** 0.19
I组 1.18 0.22 1.09 0.16
J组 1.08 0.13 1.01 0.11
实施例4KRN7000和ATP对CIK细胞外泌体抗肺部肿瘤生物学活性的作用
采用人小细胞肺癌细胞系NCI-H446与外泌体共培养，确定CIK细胞外泌体杀伤肿瘤细胞的生物学活性；采用碘化丙啶(PI)染色的流式细胞技术检测肺部肿瘤细胞的死亡情况：
取相同体积的各组CIK细胞培养上清液，按实施例2的方法提取外泌体，将外泌体与NCI-H446细胞混合(细胞数5×103)，并于完全培养基中培养，其中培养条件为温度37℃、5％(体积浓度)CO2；
培养后第12小时收集培养物，于PBS中洗涤，并于室温与PI(20mg/ml)孵育10min，之后于PBS中洗涤；将上述细胞与1％多聚甲醛混合，并采用流式细胞检测技术进行分析，其中，细胞毒性表示方法为：死亡细胞数/(死亡细胞数+存活细胞数)×100％。
实验结果如表5和图6所示。D组、E组的细胞死亡率显著高于A组(p＜0.05)，表明其杀伤肿瘤细胞的作用降低；G组(p＜0.05)和H组(p＜0.01)细胞死亡率显著高于A组，表明其杀伤肿瘤细胞的作用增强；其他各组细胞死亡率与A组相比没有显著性差异。
表5 NCI-H446细胞死亡百分比
分组 细胞死亡率 标准差
A组 40.2％ 3.2％
B组 42.2％ 5.1％
C组 40.6％ 6.2％
D组 32.2％* 5.9％
E组 29.8％* 7.3％
F组 47.9％ 4.0％
G组 51.5％* 7.1％
H组 52.7％** 8.3％
I组 41.4％ 5.3％
J组 43.9％ 4.9％
这些结果表明，在第0天或第1天加入小剂量的KRN7000(35ng/ml)，第7天加入KRN7000(35ng/ml或70ng/ml)并加入ATP激活，同时在第14天再次加入ATP激活，可以有效增强CIK细胞外泌体的杀伤肿瘤细胞的活性；而当第0天或第1天加入大剂量的KRN7000(70ng/ml)，第7天与第14天重复与H组或G组相同的操作时，反而使CIK细胞外泌体的杀伤肿瘤细胞的活性降低；若不于第7天加入KRN7000并加入ATP激活，则各组外泌体杀伤肿瘤细胞的作用没有显著差异。

Claims (9)

1.一种外泌体的制备方法，其包括以下步骤：
(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ，于37℃、5％CO2条件下进行培养；
(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2，刺激细胞的生长和增殖；
(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(4)培养第7天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(5)培养第14天，在无血清培养基中加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM，孵育30分钟后，收获细胞培养液的上清液并提取得到所述外泌体；
该方法还包括：在步骤(2)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000，在步骤(4)中加入KRN7000和ATP储存液，KRN7000的添加量为70ng/ml，ATP的终浓度为4mM；或者，在步骤(1)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000，在步骤(4)中加入KRN7000和ATP储存液，KRN7000的添加量为35ng/ml，ATP的终浓度为4mM；或者，在步骤(2)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000，在步骤(4)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000；或者，在步骤(1)中以35ng/ml的添加量加入KRN7000。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其包括以下步骤：
(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ，于37℃、5％CO2条件下进行培养；
(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，刺激细胞的生长和增殖；
(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(4)培养第7天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2、以70ng/ml的添加量加入KRN7000，并加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并补加300U/ml的人重组白介素2；
(5)培养第14天，在培养基中加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM，孵育30分钟后，收获细胞培养液的上清液并提取得到所述外泌体。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其包括以下步骤：
(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，于37℃、5％CO2条件下进行培养；
(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2，刺激细胞的生长和增殖；
(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(4)培养第7天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，并加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(5)培养第14天，在培养基中加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM，孵育30分钟后，收获细胞培养液的上清液并提取得到所述外泌体。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其包括以下步骤：
(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ，于37℃、5％CO2条件下进行培养；
(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，刺激细胞的生长和增殖；
(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(4)培养第7天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2、以35ng/ml的添加量加入KRN7000；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(5)培养第14天，在培养基中加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM，孵育30分钟后，收获细胞培养液的上清液并提取得到所述外泌体。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其包括以下步骤：
(1)培养第0天，将脐血单个核细胞按1×106/ml的浓度悬浮于无血清培养基中，以1000U/ml的添加量加入人重组干扰素γ、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，于37℃、5％CO2条件下进行培养；
(2)培养第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3单克隆抗体、以300U/ml的添加量加入人重组白介素2，刺激细胞的生长和增殖；
(3)培养第3天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(4)培养第7天，半量换液并以300U/ml的添加量加入人重组白介素2；根据细胞的生长状态，每隔一天进行半量换液，并以300U/ml的添加量补加人重组白介素2；
(5)培养第14天，在培养基中加入ATP储存液使ATP的终浓度达到4mM，孵育30分钟后，收获细胞培养液的上清液并提取得到所述外泌体。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其中，所述提取按照以下步骤进行：
收集20mL所述细胞培养液的上清液，于2000×g离心30min，取上清液，弃去沉淀，所述沉淀包括细胞碎片；
于4℃、10000×g离心60min，得到含外泌体的浓缩液；
将所述含外泌体的浓缩液于4℃、100000×g离心60min，收集底部沉淀；
将所得沉淀采用PBS缓冲液重悬，再次于100000×g离心60min，收集底部沉淀，即为外泌体；
将所得外泌体用2ml的PBS缓冲液重悬，采用0.22μm滤膜过滤除菌，并于-80℃储存。
7.一种外泌体，其是由权利要求1-6任一项所述的制备方法制备的。
8.权利要求7所述的外泌体在制备治疗肺癌的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述肺癌为小细胞肺癌。
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