CN107090451A - 一种长链非编码RNAuc.77及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的之一是提供一种人鼠同源性肺纤维化相关的长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA），命名为lncRNA-uc.77，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所提供的lncRNA-uc.77，通过q-RTPCR方法获得证实，显著高表达于纤维化组织，且过表达lncRNA-uc.77可以通过调控其目的基因ZEB2，从而达到影响肺纤维化标记物的目的。这一新型的lncRNA-uc.77将进一步丰富肺纤维化发病及发展机制的研究，也为肺纤维化的早期诊断及预后检测提供了新的检测靶点。

Description

一种长链非编码RNAuc.77及其应用

技术领域

本发明属于生物医学专业领域，涉及一种新型人鼠同源性非编码RNA uc.77以及在制备诊断肺纤维化疾病试剂药物中的应用。

背景技术

肺纤维化（Pulmonary fibrosis，PF）是一种渐进性疾病，由急、慢性肺间质疾病演化而来，是多种间质性肺病终末期的共同状态及病理表现。随着我国各类原因导致的肺纤维化患病率不断上升，肺纤维化已成为我国呼吸系统主要疾病之一，其晚期及急性加重状态在急危重症中的比例不断升高，且与不良预后密切相关。

目前临床诊断肺纤维化疾病主要包括以下几种手段：一、影像学检查：胸部高分辨CT（HRCT）检查，能细致的显示肺部病变的位置、程度及性质，对某些类型的肺纤维化如特发性肺纤维化等的诊断具有指导意义。二、肺功能检查：肺功能检查亦是诊断肺纤维化不可缺少的检查项目，有助于了解肺通气与弥散功能等情况，尤其是动态肺功能演变更能反映疾病的发展和预后。三、外科手术活检：可根据肺活检病理做出明确的疾病诊断。但目前的诊断手段和策略都很难做到早期诊断，往往在疾病进展到一定程度以后，患者才因为症状逐渐明显而得到确诊和治疗。呼吸困难是肺纤维化最常见症状。轻度肺纤维化时，呼吸困难常在剧烈活动时出现，因此常常被忽视或误诊为其他疾病。当肺纤维化进展时，在静息时也发生呼吸困难，严重的肺纤维化患者可出现进行性呼吸困难。肺组织纤维化的严重后果，导致正常肺组织结构改变，功能丧失。当大量没有气体交换功能的纤维化组织代替肺泡，导致氧不能进入血液。患者呼吸不畅，缺氧、酸中毒、丧失劳动力，严重者最后可致死亡。由于肺纤维化后期所带来的严重后果，因此，及早的对其进行诊断具有重要意义，早期诊断，从而做到早期预防和早期治疗以期待获得更好的治疗效果。但在早期阶段，由于现有技术的限制，常被漏诊甚至误诊为其他疾病，容易延误最佳的治疗时期，成为目前临床上呼吸系统疾病的难点之一。

近年来表观遗传学成为多种疾病研究的热点与重点，且逐渐成为肺纤维化研究的一个重要方向。表观遗传学是指在基因组DNA序列不变的情况下，通过改变DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体结构参与基因表达调控的一种可逆、可遗传的遗传信息。目前已知，人体基因组中的98%不编码蛋白质的基因组DNA大多可转录产生非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。而这些ncRNA即介导和参与了表观遗传学的机制。根据成熟转录本大小的不同，ncRNA可分为小分子ncRNA( 如siRNA、miRNA、piRNA等)，中等长度ncRNA(70-200nt) 和长ncRNA(long ncRNA，lncRNA，≥ 200nt)。目前，ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA，而对lncRNA的研究还处于起步阶段。长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200nt、自身不编码蛋白、且物种间相对保守的RNA，已知其可参与X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰等多种重要生物过程。

发明内容

本发明通过构建小鼠肺纤维化模型，应用lncRNAmicroassay技术（Mouse lncRNAMicroarray V2.0, Arraystar.Inc，探针覆盖31,423 条lncRNA、25,376 条编码基因），开展小鼠正常肺组织、纤维化肺组织之间差异lncRNA的筛选，通过序列分析，共得到纤维化肺组织相对正常肺组织高表达5倍以上的lncRNA有513条、低表达5倍以上的lncRNA有204条。对芯片检测到的具有人鼠同源性的，差异表达基因、同时又被预测为差异lncRNA可能调控靶标的编码基因，进行Go和Pathway生物信息学分析，发现一条lncRNA-uc.77，其核酸序列如SEQ ID No.1所示。经定量PCR检测结果表明此lncRNA在肺纤维化组织中高表达，而在正常组织中低表达。构建lncRNA-uc.77的质粒过表达载体，并转染人肺泡上皮细胞A549，结果表明其明显促进其目的基因ZEB2的表达，因此相应的影响了肺泡上皮细胞转化为肌纤维母细胞的上皮间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）过程，表现为：细胞形态发生改变，诱导人肺泡上皮细胞中成纤维母细胞标记物：Vimentin、α-SMA、N-cadherin表达增加；上皮细胞标记物：E-cadherin、EpCAM、KRT-5表达下降；细胞外基质标记物：MMP-2、MMP-9表达增加。使用lncRNA-uc.77的质粒过表达载体转染人支气管上皮细胞（HBEc）所获得的结果与A549细胞系的结果一致。

本发明的目的之一是提供一种人鼠同源性肺纤维化相关的长链非编码RNA（Longnon-coding RNA，lncRNA），命名为lncRNA-uc.77，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所提供的lncRNA-uc.77，通过q-RTPCR方法获得证实，显著高表达于纤维化组织；通过功能学验证，获得其与目的基因之间的关系以及通过目的基因参与调控肺纤维化发展过程。这一新型的lncRNA-uc.77将进一步丰富肺纤维化发病机制的研究，也为肺纤维化的早期诊断及预后检测提供了新的检测靶点。

本发明所提供的人源lncRNA-uc.77的编码DNA序列定位于HOXA3基因的第2个内含子内，转录方向与HOXA3相反。HOXA3基因位于人类染色体7p15-p14，属于I型同源盒基因（Hox基因）A簇基因的一部分，编码DNA结合转录因子，是参与组织纤维化过程的重要因子。可以通过其特异的“时空”表达模式决定细胞的定向分化与增殖；HOXA3可诱导上皮细胞的迁移，促进血管lncRNA-uc.77序列在多个物种之间高度保守，存在人鼠同源序列,在人肺泡上皮细胞株A549或者人支气管上皮细胞HBEc中过表达lncRNA-uc.77不仅可以促进其靶基因ZEB2的表达，还能够诱导纤维化标志性蛋白的表达改变，lncRNA-uc.77通过参与调节ZEB2，在肺纤维化形成中发挥的重要作用，为早期肺纤维化的治疗提供新分子标记与药物靶点。

本发明提供的lncRNA-uc.77序列，既可以通过生物学方法获得，又可通过化学合成方法获得，若通过化学合成方法制备，只要将其核苷酸序列提供给相关专业公司，委托其合成即可。为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征，可对其进行硫代修饰或甲氧基修饰等。

本发明提供的人肺纤维化相关的lncRNA-uc.77，包括与其90％以上同源的核苷酸序列，或经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列，可用于制备诊断肺纤维化疾病的试剂。

本发明的目的之二是提供所述lncRNA-uc.77用于制备诊断或辅助诊断肺纤维化的药物或试剂盒的用途。

优选的，所述lncRNA-uc.77用于肺纤维化的辅助诊断。

本发明目的之三在于提供了一种用于诊断肺纤维化的芯片试剂盒，其中包括：负载有所述lncRNA-uc.77序列的检测芯片。

所述芯片试剂盒还包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等，以及标记RNA 样品的标记物、以及与所述标记物相对应的底物。

所述的芯片试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

本发明还提供了一种用于诊断肺纤维化的试剂盒，其中包括：

1）用于扩增lncRNA-uc.77的特异性引物对；

2）标准DNA模板或负载有权利要求1所述长链非编码RNA的检测芯片；

3）PCR反应体系。

优选地，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ IDNo.2，下游引物序列为SEQ ID No.3。

进一步优选地，所述PCR反应体系包括dNTP、PCR缓冲液和DNA聚合酶。

进一步优选地，所述PCR反应体系为荧光定量PCR反应液，包含荧光染料。

进一步地，所述试剂盒的使用方法：上游引物(10μmol/L)1.0μL，下游引物(10μmol/L)1.0μL，肺组织/血液样本cDNA 0.3μL，DNA 聚合酶(5U/μL)0.2μL，ddH2O 19μL；反应参数均为：94℃ 3min( 预变性) ；94℃ 30sec( 变性)，64℃ 30sec( 复性)，72℃ 60sec(延伸)，所述变性- 复性- 延伸30 次循环。

本发明目的之四在于提供一种检测所述lncRNA-uc.77的方法，包括如下步骤：

1）提取样品总RNA；

2）制备样品cDNA；

3）扩增lncRNA-uc.77。

本发明目的之五在于提供一种检测肺纤维化的方法，包括如下步骤：

1）提取样品总RNA；

2）制备样品cDNA；

3）定量扩增lncRNA-uc.77，并根据定量结果进行判断。

检测所用样品为全血或肺组织，由于肺组织非常难以获得，故本发明所述方法还可通过全血进行诊断，且诊断准确率与采用肺组织相当，大大增加了诊断的便捷性、考操作性和可靠性。

本发明目的之六在于提供所述lncRNA-uc.77作为肺纤维化药物新靶点的用途。

附图说明

图1是定量PCR检测本发明所述lncRNA-uc.77在肺纤维化组织以及正常对照组织中的表达结果图。

图2是对转染lncRNA-uc.77过表达载体的人肺泡上皮细胞株A549，转入空载pEX-3的细胞株和不转染的对照细胞株进行定量PCR检测lncRNA-uc.77表达结果图。

图3是对转染lncRNA-uc.77过表达载体的人肺泡上皮细胞株A549，转入空载pEX-3的细胞株和不转染的对照细胞株进行定量PCR检测目的调控基因ZEB2表达结果图。

图4是对转染lncRNA-uc.77过表达载体的人肺泡上皮细胞株A549和转入空载pEX-3的细胞株进行定量PCR检测成纤维母细胞标记物：Vimentin、α-SMA；上皮细胞标记物：E-cadherin、EpCAM、KRT-5；细胞外基质标记物：MMP-2 and MMP-9表达的结果图。

图5是对转染lncRNA-uc.77过表达载体的人肺泡上皮细胞株A549和转入空载pEX-3的细胞株进行Western Blot检测预测靶基因ZEB2以及成纤维母细胞标记物：Vimentin、α-SMA、N-cadherin；上皮细胞标记物：E-cadherin、connexin43表达的结果图。

图6是对转染lncRNA-uc.77过表达载体的人肺泡上皮细胞株A549和转入空载pEX-3的细胞株进行免疫荧光检测成纤维母细胞标记物：Vimentin、上皮细胞标记物：E-cadherin表达的结果图。

图7是对转染lncRNA-uc.77过表达载体；转入空载pEX-3的对照组,转入siZEB2的目的基因抑制组；以及同时转入lncRNA-uc.77过表达载体和siZEB2的人肺泡上皮细胞株A549；以上四组同时进行免疫荧光检测成纤维母细胞标记物：Vimentin、上皮细胞标记物：E-cadherin表达的结果图。

图8是对转染lncRNA-uc.77过表达载体的人肺泡上皮细胞株A549和转入空载pEX-3的细胞株在72小时之后的细胞形态学图像。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但并不限定于本发明。本领域的技术人员从本发明公开的内容直接或间接导出的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。下属实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等著的分子克隆：实验室手册(New York ：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，Freshney著的动物细胞培养：基本技术指南第五版(John Wiley&Sons，Inc，2005) 中所述的条件及实验步骤，或按照制造厂商所建议的条件及实验步骤。若无特别说明，下述实施例中所用实验材料，均为常规材料和化学试剂。

实施例1：lncRNA-uc.77序列的克隆与分析

1、试剂

Trizol试剂购自美国Invitrogen 公司；MMLV 逆转录酶DNA 聚合酶、DNA 连接酶、pfu酶、EcoRI酶、BamHI酶均购自立陶宛Fermentas公司；随机引物购自美国Promega公司；RNeasy抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、中量抽提试剂盒、QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒均购自德国Qiagen公司；Mouse lncRNA Microarray V2.0 芯片购自上海康成生物公司；PCR引物由Invitrogen 公司合成。

2、试剂、菌株、细胞株和载体

PCR-blunt-TOPO 载体购自美国Invitrogen 公司；BALB/c鼠，SPF(SpecificPathogen-free，无特定病原体) 级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

3、实验方法

3.1 肺纤维化组织总cDNA 文库的构建

3.1.1 小鼠纤维化肺组织及正常肺组织总RNA 的提取

使用Trizol试剂以及根据RNeasy抽提试剂盒实验步骤。将收获的肺组织加入1mlTrizol试剂裂解，裂解时用枪吸打几次；每50-100mg 组织样品，加入1ml 的TRIZOL 试剂，用电动匀浆器进行匀浆；所加样品体积不能超过匀浆此样品所使用的Trizol试剂体积的10％；在上述的Trizol中加入0.2ml 氯仿，漩涡振荡10 秒，室温下静置5 分钟，4℃下，12000rpm 离心15 分钟，吸取上层水相移入新的无RNA 酶离心管中；加入与上述上层水相等体积的异丙醇，混匀后，4℃条件下静置20 分钟，然后4℃下12000rpm 离心10 分钟，弃上清得沉淀；在上述沉淀中加入质量分数为75％的乙醇1ml，颠倒数次，4℃下12000rpm 离心5分钟，弃上清；再次4℃下12000rpm 离心2 分钟；弃上清，室温下干燥1 ～ 2 分钟，加20μl无RNA 酶水溶解，得到RNA 提取液，-80℃保存备用；

3.1.2 逆转录(RT)

在500μL EP 管中加入以下组分：

肺组织提取RNA 10μL；

随机引物(10μmol/L)1μL；

H₂O 18μL。

混匀后70℃温育5min，迅速置冰浴中，静置3min 后加样如下：

RNase 抑制剂1μL；

dNTP(10mmol/L)1μL；

5× 逆转录酶缓冲液8μL；

MMLV 逆转录酶1μL；

混匀后42℃温育1h，70℃ 10min 灭活逆转录酶，-20℃保存样品。

3.1.3 肺纤维化组织总cDNA 文库的构建

将本实施例3.1.2 所得单链cDNA 经DNA 聚合酶及pfu酶处理得到平末端双链cDNA(操作步骤见DNA 聚合酶、pfu酶操作手册)。所得平末端双链cDNA 连接到PCR-blunt-TOPO载体上，构建肺纤维化组织总cDNA 文库。

3.2 lncRNA microarray技术与分析

使用3.1.1中提取的两类组织的总的RNA，用Agilent 公司的快速Amp 标记试剂盒标记RNA，与芯片上的探针杂交；收集芯片的数据，用Agilent GeneSpring GX v12.0软件分析数据筛选出绝对信号值大、组间差异倍数大、组内样本间表达异质性小的lncRNA。采用GO 分析和Pathway 分析挑选出与肺纤维化过程有着密切关系的lncRNA，即lncRNA-uc.77，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2q-RTPCR鉴定lncRNA-uc.77在纤维化肺组织和正常组织中的差异表达

1、以鼠纤维化肺组织及正常肺组织为材料，用Trizol试剂分别提取纤维化肺组织及正常肺组织的总RNA(方法同实施例1 中的3.1.1)。将纤维化肺组织总RNA 和正常肺组织总RNA 各取1μg，用随机引物进行逆转录反应(方法同实施例1 中的3.1.2) 获纤维化肺组织及正常肺组织的总cDNA，合成的纤维化肺组织及正常肺组织的总cDNA 即为定量PCR 反应的模板。

2、lncRNA-uc.77的特异性引物引物序列如下：

F:5’ –CTGTCACACTGCTCCCAAGA- 3’；R: 5’ –TCAGCCAAAGATGCTTGAAA- 3’。

3、PCR的反应体系为：

PCR 缓冲液(10×)2.5μL；

dNTP(2.5mmol/L)1.0μL；

上游引物(10μmol/L)1.0μL；

下游引物(10μmol/L)1.0μL；

肺组织cDNA 0.3μL；

DNA 聚合酶(5U/μL)0.2μL；

ddH2O 19μL。

反应参数均为：94℃ 3min( 预变性) ；94℃ 30sec( 变性)，64℃ 30sec( 复性)，72℃ 60sec( 延伸)，所述变性- 复性- 延伸30 次循环。

RT-PCR 扩增获得的序列如序列表中SEQ ID NO：1 所示。

4、实验结果

纤维化肺组织及正常肺组织lncRNA-uc.77的表达情况见图1，可以看出，lncRNA-uc.77在几种模型的纤维化肺组织中高表达而在正常肺组织中低表达。实验结果表明，lncRNA-uc.77在纤维化肺组织和正常肺组织表达水平存在明显差异，通过多次试验统计表明，阳性检出率可达100%，因而lncRNA-uc.77在肺纤维化的发生发展过程中具有重要的生物学功能，可以作为纤维化肺组织诊断的标志物，用作纤维化肺组织的筛查。

实施例3： lncRNA-uc.77的过量表达促进人肺泡上皮细胞的转间充质细胞生长特性

1、试剂

采用常规的试剂，与实施例1 相同。

2、菌株、细胞株和载体

lipofectamine 2000 转染试剂购自美国Invitrogen 公司；DMEM 培养基、胎牛血清均购自美国Gibico公司；硝基蓝四唑(nitro blue tetrazolium，NBT) 购自美国Sigma 公司。

人肺泡上皮细胞株A549购自美国标准菌种收藏所(ATCC)；E.coli BL2 菌株购自上海吉玛制药技术有限公司；真核表达载体pEX-3购自上海吉玛制药技术有限公司。

3、实验方法

3.1 用PCR方法得到lncRNA-uc.77序列片段

3.1.1 oligo设计，目的基因上下游引物分别加上EcoRI和BamHI及保护碱基，用于载体的亚克隆， oligo序列如下

3.1.2 引物由上海吉玛制药技术有限公司合成

3.1.3将oligo溶解成50µM，将oligo分别取相同体积至一1.5ml离心管，混合均匀，配成oligo mix

3.1.4 用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应，

PCR体系如下：

oligo mix 6µl；

10×Pfu Buffer (＋Mg2＋) 5µl；

dNTP 1µl；

B1294-1 1µl；

B1294-26 1µl；

ddH₂O 36µl；

Pfu DNA polymerase 0.3µl。

循环条件：

95℃ 3min( 预变性) ；94℃ 30sec( 变性)，55℃ 30sec( 复性)，72℃ 30sec( 延伸)，所述变性- 复性- 延伸30 次循环。

3.1.5用B1294-1和B1294-26进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应的产物。

PCR体系如下：

第一轮PCR产物 1µl；

10×Pfu Buffer (＋Mg2＋) 5µl；

dNTP 1µl；

B1294-1 1µl；

B1294-26 1µl；

ddH₂O 41µl；

Pfu DNA polymerase 0.3µl。

反应条件与第一轮相同。第一轮PCR可得到混有目的基因条带的非单一条带PCR产物混合物，再用第一轮的PCR产物为模板，通过第二轮PCR则可获得单一的目的基因条带。

3.1.6 PCR反应完成后，利用Agarose 电泳并切胶回收lncRNA-uc.77基因片段。

3.2 目的基因lncRNA-uc.77克隆到载体pEX-3中

3.2.1 用EcoRI和BamHI对uc.77基因片段进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下：

10×Buffer 5µl；

DNA 15µl；

EcoRI 1µl；

BamHI 1µl；

ddH₂O 28µl。

3.2.2 用EcoRI和BamHI对载体pEX-3 进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下：

10×Buffer 5µl；

pEX-3 5µl；

EcoRI 1µl；

BamHI 1µl；

ddH₂O 38µl。

3.2.3 电泳，用DNA 凝胶回收试剂盒回收uc.77基因片段和载体pEX-3。

3.2.4 用T4 DNA ligase连接双酶切得到的uc.77基因片段和线性化的载体，22℃连接2小时，连接体系如下：

T4 DNA ligase buffer 2µl；

pEX-3 2µl；

uc.77 5µl；

T4 DNA ligase 1µl；

ddH₂O 10µl。

3.2.5 感受态细胞的制备：（氯化钙法）

3.2.5.1从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100 ml LB培养基的1 L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转／分)。

3.2.5.2 在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的 50ml 聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至 0℃。

3.2.5.3 于 4 ℃，以4000转／分离心10分钟，回收细胞。

3.2.5.4 倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

3.2.5.5以10 ml用冰预冷的 0.1 mol／L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。

3.2.5.6 于 4℃，以4000 转／分离心10分钟，回收细胞。

3.2.5.7 倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。

3.2.5.8 每50ml 初始培养物用 2 ml 用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(含20%甘油)重悬每份细胞沉淀。

3.2.5.9 将细胞分装成小份(100µl/支)，放于-70℃冻存。

（感受态细胞制备参考：分子克隆实验指南第二版55页）

3.2.6 将连接产物转化感受态细胞

3.2.6.1 从-70℃中取出感受态细胞，将装有感受态细胞的离心管冰上放置4分钟，待感受态细胞解冻后，加入10µl 连接产物，轻柔混匀内容物，在冰中放置 30 分钟。

3.2.6.2将离心管放到预加温到 42℃的水浴锅中放好的试管架上，放置 90 秒，不要摇动离心管。

3.2.6.3 快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3分钟。

3.2.6.4 向每支离心管加入800 µl LB培养基(不含抗生素)，然后将离心管转移到37℃摇床，250转/分钟，培育45分钟使细菌复苏。

3.2.6.5 取200µl培育后的细胞均匀涂布于含50µg/ml Kanamycin LB平板上。

3.2.6.6 等平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时。

3.2.7 从平板上挑取克隆菌落，小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆。

3.2.7.1 从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5ml (含50µg/mlKanamycin) LB 培养基的试管中，

3.2.7.2 将上述试管置于细菌摇床中培养，37℃，250转/分钟，培养16小时。

3.2.7.3 将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒(天根生化，DP104-02)抽提质粒，（质粒抽提步骤详见质粒小提试剂盒说明书）。

3.2.7.4 将抽提好的质粒进行双酶切鉴定，每管反应体系如下：

10×Buffer 1µl；

质粒 1µl；

EcoRI 0.5µl；

BamHI 0.5µl；

ddH₂O 7µl。

3.2.7.5 酶切37℃，1小时后电泳，在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆。

3.3 重组质粒测序验证并大量抽提

3.3.1 取200µl 阳性克隆对应的菌液送测序，并将剩余的菌液用甘油保存。

3.3.2 将测序结果与目的基因序列进行比对，正解无误后，用保存的甘油菌液接菌LB培养基，进行大量质粒抽提，得到足够量的重组质粒。

3.4 构建单克隆人肺泡上皮细胞株A549- lncRNA-uc.77

用含5％胎牛血清的DMEM 培养基将人肺泡上皮细胞株A549 培养于5％ CO2 的37℃培养箱中。转染前一天于6 孔板中接入1×10⁶个细胞/ 孔，用lipofectamine2000 进行转染，每孔转染重组质粒 pEX3- lncRNA-uc.77 4μg。细胞转染48 小时后收集细胞。同时以空载体pEX-3 转染A549细胞( 见lipofectamine 2000 说明书)，得到对照细胞株A549-pEX-3。

3.5 单克隆人肺泡上皮细胞株中lncRNA-uc.77的表达量检测

以常规半定量RT-PCR 检测各单克隆人肺泡上皮细胞株中lncRNA-uc.77的表达量，并以转入空表达载体pEX-3 的肺泡上皮细胞株A549-pEX-3 作为对照。

50μL 半定量PCR 反应体系，其组分为：

PCR 缓冲液(10×)5μL

MgCl₂(25mM)5μL

dNTP(2.5mmol/L)1.0μL

上游引物(10μmol/L)0.5μL

下游引物(10μmol/L)0.5μL

模板(A549- lncRNA-uc.77或A549-pEX-3 的cDNA)2μL

DNA 聚合酶(5U/μL)0.4μL

ddH₂O 35.6μL

所有PCR 的反应参数为：94℃ 3min( 预变性) ；94℃ 30ec( 变性)，64℃ 30s ec( 复性)，72℃ 60sec( 延伸)，所述变性- 复性- 延伸×n cycles。循环次数根据PCR 反应的起跳点确定，一般情况下，每次具体的PCR 反应较起跳点多1-2个循环。

图2是对转染lncRNA-uc.77过表达载体的人肺泡上皮细胞株A549，转入空载pEX-3的细胞株和不转染的对照细胞株进行定量PCR检测lncRNA-uc.77表达结果图。图2表明，与转染空表达载体相比，转染lncRNA-uc.77过表达载体的uc.77表达量达300倍以上。

3.6 lncRNA-uc.77过量表达的人肺泡上皮细胞株A549细胞形态学检测

将本实施例3.4 构建的单克隆人肺泡上皮细胞株A549- lncRNA-uc.77和转入空表达载体pEX-3的细胞株A549分别以1×10⁶个细胞/ 孔的数量接入在6 孔板中用1mL 含5％胎牛血清的DMEM 培养，培养于5％ CO₂的37℃培养箱中培养。3天后，相差显微镜下检查细胞形态学改变，见图8。

图8表明，与转染空表达载体pEX-3的A549细胞相比，转染重组质粒pEX-3-lncRNA-uc.77的A549细胞过量表达lncRNA-uc.77可以显著促进人肺泡上皮细胞向间充质细胞转分化的形态学变化，从多角形、鹅卵石样上皮细胞形态特征转化为细长、纺锤形等为特征的间充质细胞形态学特征，提示增强了A549细胞向间充质细胞转分化的生长特性。

3.7 lncRNA-uc.77过量表达促进人肺泡上皮细胞的转间充质细胞生长特性

细胞制备过程同实施例2中的3.6所述方法，使用q-RTPCR方法检测过量表达lncRNA-uc.77之后，上皮细胞转化为肌纤维母细胞的上皮间充质转化（Epithelial-MesenchymalTransition, EMT）标记物的表达：包括成纤维母细胞标记物：Vimentin、α-SMA；上皮细胞标记物：E-cadherin、EpCAM、KRT-5；细胞外基质标记物：MMP-2、MMP-9。如图4。

图4表明：过量表达lncRNA-uc.77后，明显促进了肺泡上皮细胞转化为肌纤维母细胞的上皮间充质转化过程，表现为：诱导人肺泡上皮细胞中成纤维母细胞标记物：Vimentin、α-SMA表达增加；上皮细胞标记物：E-cadherin、EpCAM、KRT-5表达下降；细胞外基质标记物：MMP-2、MMP-9表达增加。这表明lncRNA-uc.77对肺纤维化的发生发展具有调控作用。

细胞制备过程同实施例2中的3.6所述方法，使用Western Blot方法检测过量表达lncRNA-uc.77之后，上皮细胞转化为肌纤维母细胞的上皮间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）标记物的蛋白表达量的影响：成纤维母细胞标记物：Vimentin、α-SMA、N-cadherin；上皮细胞标记物：E-cadherin；细胞外基质标记物：MMP-2以及MMP-9表达的结果图。如图5。

图5表明：过量表达lncRNA-uc.77后，明显促进了肺泡上皮细胞转化为肌纤维母细胞的上皮间充质转化过程，表现为：诱导人肺泡上皮细胞中成纤维母细胞标记物：Vimentin、α-SMA、N-cadherin表达增加；上皮细胞标记物：E-cadherin、connexin43表达下降；这从蛋白层面进一步表明lncRNA-uc.77对肺纤维化的发生发展具有促进作用，具有治疗肺纤维化相关疾病的用途。

细胞制备过程同实施例2中的3.6所述方法，使用免疫荧光方法检测过量表达lncRNA-uc.77之后，上皮细胞转化为肌纤维母细胞的上皮间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）标记物的影响：成纤维母细胞标记物：Vimentin、上皮细胞标记物：E-cadherin表达的结果图。如图6。

图6表明：过量表达lncRNA-uc.77后，细胞标记物发生明显改变，表现为：诱导人肺泡上皮细胞中成纤维母细胞标记物：Vimentin表达增加；上皮细胞标记物：E-cadherin表达下降。

3.8 lncRNA-uc.77通过调节ZEB2目的基因的作用从而促进人肺泡上皮细胞的转间充质细胞生长特性

细胞制备过程同实施例2中的3.6所述方法，lncRNA-uc.77过表达载体构建过程同实施例2种的3.1所述方法，

siZEB2的构建方法：ZEB2 siRNA购自美国Santa Cruz生物科技公司，货号：sc-38641。使用Lipofectamine 2000转染A549细胞( 见lipofectamine 2000 说明书)。

转染lncRNA-uc.77过表达载体的人肺泡上皮细胞株A549，转入空载pEX-3的细胞株和不转染的对照细胞株，分别进行定量PCR检测目的调控基因ZEB2表达，其结果见图3。

图3表明：lncRNA-uc.77调节了其目的基因ZEB2的表达量。当lncRNA-uc.77过量表达之后，目的调控基因ZEB2表达量也明显增高。

使用免疫荧光方法检测四组细胞：转染lncRNA-uc.77过表达载体；转入空载pEX-3的对照组,转入siZEB2的目的基因抑制组；以及同时转入lncRNA-uc.77过表达载体和siZEB2之后，上皮细胞转化为肌纤维母细胞的上皮间充质转化（Epithelial-MesenchymalTransition, EMT）标记物的影响：成纤维母细胞标记物：Vimentin、上皮细胞标记物：E-cadherin表达的结果图。如图7。

图7表明：lncRNA-uc.77通过促进目的基因ZEB2的过量表达，从而促进人肺泡上皮细胞的转间充质细胞分化特性。当ZEB2基因被抑制后，lncRNA-uc.77的促纤维化效果被纠正。

实施例4：lncRNA-uc.77的差异表达对肺纤维化进行筛查的实施例

4.1 试剂、样本和载体

以人全血标本为材料，用Trizol 试剂提取全血标本的总RNA(方法同实施例1 中的3.1.1)。将全血样本总RNA 取1μg，用随机引物进行逆转录反应(方法同实施例1 中的3.1.2) 获样本总cDNA，合成的总cDNA 即为定量PCR 反应的模板。

4.2 lncRNA-uc.77的特异性引物序列如下：

F:5’ –CTGTCACACTGCTCCCAAGA- 3’；R: 5’ –TCAGCCAAAGATGCTTGAAA- 3’。

4.3 PCR的反应体系为：

PCR 缓冲液(10×)2.5μL；

dNTP(2.5mmol/L)1.0μL；

上游引物(10μmol/L)1.0μL；

下游引物(10μmol/L)1.0μL；

肺组织cDNA 0.3μL；

DNA 聚合酶(5U/μL)0.2μL；

ddH2O 19μL。

反应参数均为：94℃ 3min( 预变性) ；94℃ 30sec( 变性)，64℃ 30sec( 复性)，72℃ 60sec( 延伸)，所述变性- 复性- 延伸30 次循环。

RT-PCR 扩增获得的序列如序列表中SEQ ID NO：1 所示。根据定量结果进行判断即可，判断准确率高达100%。

实施例5：lncRNA-uc.77的差异表达对肺纤维化进行筛查的实施例

另一方面，本发明还提供了一种通过lncRNA-uc.77芯片检测人全血中lncRNA-uc.77的方法，包括步骤：

5.1 提供分离自人全血样本的RNA 样品，在所述的RNA 上设置标记物；

5.1.1其中从人组织中提取RNA 的方法是本领域技术人员熟知的方法，包括Trizol法，更优选的，在步骤4.1.1中，在从人全血样本中分离出RNA 样品后，对RNA 样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一股在150-250 之间。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA 进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获lncRNA 的准确性。

5.1..2 本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。对RNA 进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA 特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC 等)、其它荧光分子( 如Cy3、Cy5 等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP) 等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术。

5.2 将5.1的RNA 与所述的芯片接触，使所述的RNA 与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；

5.2.1 将上述的RNA 与lncRNA-uc.77芯片进行杂交时，可以先将lncRNA-uc.77芯片与预杂交缓冲液进行预杂交；

5.2.2本发明所述的RNA 与lncRNA-uc.77芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一股人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。

5.3检测5.2形成的二元复合物的标记物，可根据标记信号在lncRNA 芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray 3000 等)获取待测信息。从而确定人组织中相应的lncRNA-uc.77的含量。最后根据定量结果进行判断即可，判断准确率高达100%。

序列表

<110>张劲松

<120>一种长链非编码RNAENSMUST00000139055及其应用

<160>3

<210>1

<211>

<212>RNA

<213>homo sapiens

<400> 1

ctgcatatct agttcattaa caaatatgaa tagctaacac cagctcattt aaatagtatg 60

tcttacatga gttctcgcca cactctgttt ctgtcacact gctcccaaga atcattggct 120

cttattatac atgtaaatgg ctatcataaa aataaaaatt tcatttaaga ttgttaatga 180

cttctgcagc agtcagactt cctttaatga tcatcctctg cccctaatta aacgtattta 240

tctttcaagc atctttggct gagttctccc tcatagttga aaatctaaaa ccttaag 297

<210>2

<211>20

<212>RNA

<213>人工合成

<400> 2

ctgtcacact gctcccaaga 20

<210>3

<211>20

<212>RNA

<213>人工合成

<400> 3

tcagccaaag atgcttgaaa 20

Claims (10)

1.一种人鼠同源性肺纤维化相关的长链非编码RNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.1所示，或与该序列90%以上同源的核苷酸序列，或该序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的新的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的长链非编码RNA用于制备诊断肺纤维化的诊断剂或试剂盒的用途。

3.一种权利要求1所述的长链非编码RNA制备的用于诊断肺纤维化的试剂盒，其特征在于，包括：

1）用于扩增权利要求1所述长链非编码RNA的特异性引物对；

2）标准DNA模板或负载有权利要求1所述长链非编码RNA的检测芯片；

3）PCR反应体系。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID No.2，下游引物序列为SEQ ID No.3。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系包括dNTP、PCR缓冲液和DNA聚合酶。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系为荧光定量PCR反应液，包含荧光染料。

7.权利要求3-6任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，10μmol/L上游引物1.0μL，10μmol/L下游引物1.0μL，肺组织/血液样本cDNA 0.3μL，5U/μL DNA 聚合酶0.2μL，ddH2O19μL；反应参数均为：预变性94℃ 3min；变性94℃ 30sec，复性64℃ 30sec，延伸72℃60sec，所述变性- 复性- 延伸30 次循环。

8.一种检测权利要求1所述长链非编码RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）提取样品总RNA；

2）制备样品cDNA；

3）扩增权利要求1所述的lncRNA-uc.77。

9.一种权利要求1所述的长链非编码RNA检测肺纤维化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）提取样品总RNA；

2）制备样品cDNA；

3）定量扩增权利要求1所述的lncRNA-uc.77，并根据定量结果进行判断。

10.权利要求1所述的lncRNA-uc.77作为肺纤维化药物新靶点的用途。