CN107058317B - 一种花粉特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从玉米中分离得到的花粉特异性启动子序列及其应用,该启动子序列是通过对玉米基因组文库筛选，从玉米基因组中克隆得到的。本发明所述的花粉特异性启动子包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其特异性片段。本发明包括利用该启动子序列来创造雄性不育的植物基因工程方法，更具体的说，将所述启动子下游衔接异源或同源基因，并构建植物表达载体，转化宿主植物，该启动子序列能够驱动其下游基因在其花粉中特异表达目的蛋白，实现创造植物雄性不育，或者改造转基因植物的安全性。

Description

一种花粉特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种从玉米中分离到的花粉特异性启动子序列及其应用。从玉米基因组DNA中克隆得到的上述花粉特异性启动子，并与不同的同源、异源基因连接构建植物表达载体，转化宿主植物，使转基因植株花粉特异表达其下游基因的方法和应用。

背景技术

转基因植物研究与开发的过程中发现，外源基因表达的时间，空间和表达量，往往是造成无法得到理想的转基因植物和有效的研究基因作用机理的重要因素。转录水平的调控是植物基因表达调控的最重要的调控方式。启动子的驱动活性和特性直接决定了基因表达的时空特性以及表达量的多少。因此，对植物启动子的克隆和功能分析非常重要。

杂种优势作为一种提高作物产量，改善作物品质，提高作物抗虫、抗病、抗逆的手段已被广泛的应用，并取得令人瞩目的成就，以植物雄性不育为基础的杂种优势利用已成为许多作物的育种目标，在农业生产上发挥巨大的作用。但自然出现的雄性不育类型很少存在着周期长，不育基因来源单一等问题，而且恢复系的培育和后代的筛选上也存在着一定的不足。而利用基因工程创造雄性不育的策略为杂种优势的利用克服了上述缺陷。主要利用花粉或花药特异表达启动子，驱动目标基因在花粉中特异表达，获得雄性不育植株。例如：Mariani等利用烟草花药绒毡层特异启动子TA29将核糖核酸基因导入烟草，结果核糖核酸酶特异表达能够选择性地破坏与花粉发育相关的一些器官或组织，阻断花粉发育进程，导致植物雄性不育[Mariani C,Beuckeleer MD,Truettner J,Leemans J and RobertBG..Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonucleasegene.Nature 1990.347:737-741]。Paul等利用拟南芥花药绒毡层特异性启动子A9特异表达核糖核酸酶基因同样获得了雄性不育烟草植株[Paul W,Hodge R,Smartt S,Draper,Jand Scoott R.The isolation and characterization of the tapetum-specificArabidopsis thaliana A9gene.Plant Mol.Biol.1992.19:611-622]。Hird等将与抗病性相关的β-1,3葡聚糖酶基因分别与拟南芥花粉发育早期启动子A9,A3融合，转化矮牵牛后获得不同程度的雄性不育植株[Hird,D.L.,Worrall,W.,Hodge,R.,Smartt,S.,Paul, W.,Scott,R..The anther-specific protein encoded by the Brassica napus andArabidopsis thaliana A6gene displays similarity to beta 1,3-glucanases.PlantJ.1993.4:1023-1033]。

目前对花粉特异基因的转录调控还知之甚少，花粉特异启动子的获得有助于深入理解花粉发育。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种花粉特异表达启动子序列，其来自于玉米基因组DNA，在植物花粉中特异表达。

本发明的另一目的是提供一种驱动同、异源基因在花粉中高效特异表达的新方法。

本发明通过利用花粉特异的cDNA片段，筛选玉米基因组文库，得到的核苷酸序列，称之为pZm908，长度为2126bp，为双链核酸类型，其序列如SEQ ID No.1所示。生物信息学分析pZm908序列，发现其具备花粉特异表达的相关顺式元件。本发明提供了一种花粉特异性启动子，所述启动子的核苷酸序列包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或其特异性片段。

本发明同时提供了含有上述启动子的生物材料。

优选地，所述生物材料包含表达载体、细胞、细胞系、表达盒或工程菌。

本发明构建了含有pZm908启动子片段驱动外源基因的植物表达载体。在一个优选的实施方式中，表达盒是由pZm908启动子和GUS(β- 葡糖醛酸酶基因)报告基因及来自胭脂碱合成酶(nos)基因的转录终止区域构成，选择标记基因为新霉素磷酸转移酶II(NPTII)，所述的表达载体优选的是重组质粒pZm908::GUS。

在一个优选的实施方式中，将含有所述pZm908启动子序列驱动的表达载体转化烟草，获得了GUS基因在花粉中特异表达的转基因植物。

在一个优选的实施方式中，本发明所述的植物宿主细胞为植物花粉细胞。

本发明所述的花粉特异性启动子启动基因在植物花粉中表达的方法，包括下述步骤：

(1)将含有上述核苷酸序列的植物表达载体导入植物细胞，

(2)使所述的植物细胞生长成能够结种子的成熟植物。

本发明同时提供了上述启动子或上述生物材料在制备转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述启动子或上述生物材料在制备雄性不育的植物中的应用。

在一个优选的实施方式中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

在一个优选的实施方式中，所述植物为烟草。

本发明还提供了上述启动子或上述生物材料在驱动同、异源基因在植物花粉中高效特异表达的应用。

本发明还提供了上述启动子或上述生物材料在植物种质资源改良中的应用。

本发明中所述的其他外源基因是指任何一段核酸序列，并具有编码某种蛋白质功能，该序列与花粉特异性启动子正常情况不相结合。此核酸序列包括不同于启动子植物种类的异源核酸序列，以及从相同于启动子植物种类得到的同源核酸序列，但这些序列与野生型(非转基因)植物的启动子无关。

本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何一种载体，如pBI121等。

本发明中所述的转化技术是指已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法等。

本发明中所述的宿主细胞或宿主组织及后代细胞是指所有植物细胞或植物组织或由这些细胞或组织发育成熟的整株植株(包括种子)。

术语“花粉特异性启动子”是指在启动子控制下表达的基因在有或没有基本表达的植物花粉中优先表达。

本发明找到了玉米花粉特异表达启动子序列，并对这一启动子的花粉特异活性进行了功能验证。将所述的启动子序列连接异源或同源基因后，转化到植物中可使异源或同源基因在植物花粉中特异表达，避免了目的基因在其他部位持续表达所带的不利影响。本发明提供了一种利用所述核苷酸序列驱动目的基因在植物花粉中特异表达的新方法，在植物的遗传改良，雄性不育的创造和转基因生物安全性研究方面具有重大的应用前景。

附图说明

图1：由pZm908驱动的植物表达载体构建过程。

图2：烟草的再生过程；

其中，A:抗性筛选及分化；B:抗性芽诱导生根；C:移栽在盆中的抗性植株；D:开花期的转基因烟草

图3：转基因烟草分子检测；

其中，1：pZm908::GUS质粒；5：Marker(GenStar)；6：WT；2-4 和7-18：转基因烟草。

图4：pZm908及其不同截短片段::GUS转基因烟草不同组织的GUS 染色；

其中，A，pZm908各截短片段::GUS转基因烟草成熟花粉的GUS染色结果；

B，pZm908各截短片段::GUS转基因6叶期烟草幼苗的GUS染色结果；

C，pZm908各截短片段::GUS转基因烟草(6叶期幼苗)根的GUS染色结果；

D，pZm908各截短片段::GUS转基因烟草未成熟种子的GUS染色结果；

E，pZm908各截短片段::GUS转基因烟草花药的GUS染色结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册 (Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1玉米花粉特异性启动子序列pZm908的克隆

以从玉米成熟花粉cDNA文库中分离得到了花粉特异性表达的 cDNA克隆(682bp片段)，Zm401(Li et al.,2001)，为探针筛选玉米基因组文库(Cat.#FL1032D,Lot#5443,Clontech,Palo Alto,CA,USA)得到了Zm908基因的基因组克隆pGZM908。

实施例2花粉特异性启动子序列pZm908的分离

设计并合成如下两条引物，为以后分离和构建的需要，在两个引物的5’端分别加入了限制性内切酶SphI位点和限制性内切酶BamHI位点：

引物1 5'CgcGCATGCGGTGTGCGTAATGACTCGA 3'SphI

引物2 5'Cgcggatccgaaacatatgaatagtac3'BamHI

以质粒DNA pGZM908为模板，进行PCR反应，反应体系如下：

扩增条件：95℃10min；95℃1min、58℃1min、72℃2min，共30个循环；72℃10min，扩增得到2126bp的DNA片段(SEQ ID No.1)。用DNA胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收，把回收片段亚克隆到测序载体pM19-T中，连接产物转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的LB 固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook,et al.,1989,Molecular Cloning,a LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory,New York,p19-21]提取质粒，经限制性内切酶SphI和BamHI双酶切和PCR扩增鉴定阳性克隆，测序分析正确后，将阳性克隆命名为p19T-pZm908。

实施例3植物表达载体pZm908::GUS的构建

用碱裂解法提取质粒p19T-pZm908，经过SphI酶切，Klenow补平，再用BamHI酶切，得到pZm908启动子片段，与经过HindⅢ酶切， Klenow补平，再用BamHI酶切的植物表达载体pBI121的大片段相连 (图1)，然后将连接产物转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素(终浓度100μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含卡那霉素(终浓度 100μg/ml)的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒，测序结果显示载体pZm908::GUS构建正确。

实施例4植物表达载体pZm908不同截短片段::GUS的构建

设计并合成下表引物作为PCR反应中的上游引物，5’端分别加入了限制性内切酶SphI位点，为以后分离和构建的需要，PCR下游引物选用实施例2中的引物2：

构建pZm908不同截短片段::GUS植物表达载体的上游引物

以质粒p19T-pZm908为模板进行PCR反应扩增到各截短片段，用 DNA胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收，把回收片段亚克隆到测序载体pM19-T中，连接产物转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌 DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒，经限制性内切酶SphI和BamHI双酶切和PCR扩增鉴定阳性克隆，测序分析正确后，将阳性克隆分别命名为p19T-p1670、 p19T-p1126、p19T-p789、p19T-p586、p19T-p244、p19T-p184和 p19T-p126。

用碱裂解法提取各质粒，经过SphI酶切，Klenow补平，再用Bam HI酶切，得到各截短启动子片段，与经过HindⅢ酶切，Klenow补平，再用BamHI酶切的植物表达载体pBI121的大片段相连(图1)，然后将连接产物转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素(终浓度100μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含卡那霉素(终浓度100μg/ml)的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒，测序结果显示各载体p1670::GUS、p1126::GUS、p789::GUS、p586::GUS、p244::GUS、 p184::GUS和p126::GUS构建正确。

实施例5 pZm908::GUS表达载体转化烟草

利用冻融法将重组的植物表达载体pZm908::GUS转入根癌农杆菌 LBA4404，转化方法参照Hofen等[Hofen R，Willmitzer L，Storage of competent cells forAgrobacterium transformation.Nucleic Acids Research, 1988.16,9877]。

烟草的转化参照Horsch等[Horsch RB,Fry JE,Hoffman N.A simple andgeneral method for transferring genes into plants.Science,1985.227: 1229-1231]。转化受体为烟草(Nicotiana tabacum cv Samsun)。将过夜培养的农杆菌LBA4404(含有pZm908::GUS)菌液，按照1:100比例转接至YEB液体培养基中，振荡培养至OD₆₀₀值约0.6-0.8左右；收集菌体后，用渗入缓冲液悬浮菌体，稀释到OD₆₀₀值约为0.6左右，先将无菌的烟草叶盘与转入pZm908::GUS质粒的农杆菌共同孵育。十分钟后，将叶盘转移到MS基本培养基黑暗条件下共培养3d。然后将叶片转移至 MS分化培养基(3mg·l^-1 6-BA，0.2mg·l^{- 1}NAA，100mg·l^-1Kan，500 mg·l^-1Cb)培养(光周期16h/8h)，约四周后将抗性再生苗从外植体上切下，转到MS生根培养基(100mg·l^-1Kan,500mg·l^-1Cb)诱导生根(光周期16h/8h)，约两周后即可生出细嫩的抗性根。将生根良好的再生植株转移到温室中，经练苗后移栽到小花盆中(营养土:跖石＝1:1)(图 2)。

实施例6转基因烟草的分子检测

PCR检测：使用植物基因组DNA少量提取方法提取再生烟草植株叶片DNA，利用gus内部引物(GUS-F:5’ CTGCGACGCTCACACCGATACC 3’)和nos引物(NOS-R:5'TCGCAAGACCGGCAACAGGA 3')进行PCR扩增。结果表明，携带有外源基因的转基因烟草可以扩增出与转化质粒扩增产物大小一致的目的条带，而未转化植株则没有相应大小的产物(图3)。

实施例7转基因烟草的GUS活性的组织化学检测

GUS基因活性的组织化学染色分析方法依据Bradford等人 [Bradford H M.Arapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem.,1976,72:248-254.]。将收集转基因烟草的不同组织材料与含底物X-Gluc(X-Gluc染液组成:1.0mg/μl X-Gluc； 50mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.0；10mmol/L EDTA，pH 8.0；0.05 mmol/L铁氰化钾；0.05mmol/L亚铁氰化钾；甲醇,终浓度20％；0.1％ Triton X-100)的染色反应液于37℃保温6-8h，进行组织化学染色观察, 叶片等绿色组织用95％乙醇脱色后观察。结果发现pZm908::GUS转基因烟草的幼根、幼苗、种子和花药均未有蓝色出现(图4： B-E)，仅有转基因烟草的成熟花粉有蓝色出现(图4： A)结果表明pZm908启动子可以驱动报告基因特异地在花粉中表达。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种花粉特异性启动子及其应用

<130> KHP161119401.3

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2126

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 1

ggtgtgcgta atgactcgat aagttcagtt atctgtatct ccattatatc gcccaagagc 60

gctagaccca tcacgcagac attacacata atcggagtag agaatgagtg gaaaggatta 120

caataatata atttacattc atataaaaat atagaaagag tagttattac ataaccgggt 180

gtttgagtgc ggaacttatt attacattac cgggaggcaa aacaccctcc ccaaataagt 240

tttagtgttc ttcctcctgc ttgggaacca ccttggaaca gaaacaacat aactccgccg 300

tttcatcacc tacaacaaca tgggatcgaa aaccctgagt acggagtata cttttgcaag 360

tcttacccgt caaaggaaaa agacactcaa ggatatgctg ccttttggga ttcaaggtaa 420

agcttatcaa gattcaaaga ctctatttgc cgaaaagctt actaagattg gatcattaaa 480

aatccctttt tattatcagg ttaaatagtt acctgtatct agatttcttt ctatcctaga 540

tcaagcactt ggcctatact agccgtcttt tatcaatcct tcagttaact tgattggtac 600

gtgtaagtca gtgaccaagt cttcatgtcc gagaagtaat ggcgatccga atcgattaat 660

acccagctgg ggatctcgaa ccacgcgaca tatgtagcac ttaacccttg catatgtcaa 720

tcgccaccgg gtttctcaag accagaatgg gttcacgcca accgagagcg cagatgcacc 780

gccgtctagc ctcttgccac gaagggtaca cgctactctc gccatctctc cactcccatt 840

gcgtggtggg ctttctggta ttggtccgac tgaggcaaag cttacccatg acgaggcatg 900

tggccagtta aaaggtcctc gatcatcaag cctacatcgg ttcggtcctt aagcgactca 960

gacggagaca ctacaccgag actcctttct cgtgcaagtc aaccgcccga tctcgtcttt 1020

attacttaaa accccaaagc ttggtacctg gcagaggtac tctttccaga tgttgaaccc 1080

atcatggccc tgatgaattc accatcacaa gtcttttctt tgtaaaaatt cccatcccat 1140

atgaagcatc accttttgtt taaaaacaaa acattctatg ttctaaagca aggctaagca 1200

tcagaaaact ttaagtaaat caggtaacaa ggaatggtaa tcagttttcc aaggaaggga 1260

atgcaccaat tgtttaacac gcaactccta tcacctaatg catcaaacaa ggtgataaag 1320

tttctaaaac aacaaggaaa aggggtaacg caccggagct tgccttgtgt tgcaggaggt 1380

tcagggtcca ctccgtagat gttgaagtag aagtcgttct cggttggagg atttttagct 1440

tgagtgacta cctccccttc tgcctcagtt tcttcctcgt gttctataca agacaatata 1500

tgtacatgaa tgcttatgtg aagtaatgaa tatgcagtta cacaatagaa acatactagg 1560

ttgtatctta aatacaactt tccttcacgg tacaaactaa tcactagggt ttcctaagtt 1620

ggtattctat tagtgttaag taacttaacc cttggaggct agttattggg tttgtgacca 1680

aacagagacc aaatcatttc aaacctcacc caggatcttc aatcatcata ctaagttcac 1740

ccaaaaagtt ttaccatttt tggagctact aaattatttc taaaattcta aaaggcttgg 1800

tttgagcacc tttaaaggct acataattct aggtttggga tcaaaatctt tgaactattt 1860

ttattaaata ctatgtgatt ttagaagtct agcaaaattg gtcccatgat tttaccaatt 1920

ttctactatt ttctataaat ttcctgagct gacagtaaaa agaaaaagaa aaaatgatga 1980

atagtgttgg gccaattctg gcccaagtcg gcccgcaggc aggataacac gcacgcgtgc 2040

ttgcgctcgc gctggagaac ttgcacagag gcccctagcc ttttaaataa ctggtaaaga 2100

atccctaagt actattcata tgtttc 2126

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcgcatgcg gtgtgcgtaa tgactcga 28

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcggatccg aaacatatga atagtac 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcgcatgcg cttactaaga ttggatc 27

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcgcatgca accgcccgat ctcgtc 26

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgcgcatgca aaaggggtaa cgcac 25

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcgcatgcc acaatagaaa catact 26

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgcgcatgca gaagtctagc aaaattg 27

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgcgcatgcc ctgagctgac agtaa 25

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgcgcatgcg cccaagtcgg cccgca 26

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctgcgacgct cacaccgata cc 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcgcaagacc ggcaacagga 20

Claims (9)

1.一种花粉特异性启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述的启动子的生物材料；

所述生物材料为表达载体、细胞、细胞系、表达盒或工程菌。

3.根据权利要求2中所述的生物材料，所述细胞为植物宿主细胞，且所述植物宿主细胞不包括植物繁殖材料。

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于所述植物宿主细胞为植物花粉细胞。

5.权利要求1所述的启动子或权利要求2-4任一所述的生物材料在制备转基因植物中的应用。

6.权利要求1所述的启动子或权利要求2-4任一所述的生物材料在制备雄性不育的植物中的应用。

7.根据权利要求5或权利要求6所述的应用，其特征在于所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

8.权利要求1所述的启动子或权利要求2-4任一所述的生物材料在驱动同、异源基因在植物花粉中高效特异表达的应用。

9.权利要求1所述的启动子或权利要求2-4任一所述的生物材料在植物种质资源改良中的应用。

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