CN107001457A - 用于治疗血管性眼病的方法和制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗、预防眼病或减轻其严重性的方法。本发明的方法包含对有此需要的个体施用治疗组合物，其包含血管生成素‑2(Ang‑2)抑制剂例如抗Ang‑2抗体与血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂(例如阿帕西普)。

Description

用于治疗血管性眼病的方法和制剂

发明领域

本发明涉及治疗或改善血管性眼病的至少一种症状或适应症的方法，包括对有此需要的个体施用包含血管生成素-2(Ang-2)抑制剂和血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂的药物制剂。

背景

血管性眼病是当今老龄化人群视力丧失的主要原因。这些疾病的特征在于生长入视网膜的异常“漏血”血管。对该患者群体的最大贡献者的两个是糖尿病视网膜病变和渗出性年龄相关性黄斑变性。

糖尿病视网膜病变(DR)在美国是视力缺损的主要原因(Klein等人1984，Ophthalmology 91：1464-1474；Moss等人1998，Ophthalmology 105：998-1003)。糖尿病视网膜病变由从基膜增厚开始的微血管代偿失调导致(Ruggiero等人1997，DiabetesMetab.23：30-42)，且最终导致血管闭塞和新生血管形成(Porta等人2002，Diabetologia.45：1617-1634)。据估计约28％的40岁和以上的糖尿病患者具有DR，且4.4％具有威胁视力的DR(Zhang等人2010，JAMA.304：649-656)。糖尿病黄斑水肿(DME)是DR的一种表现并且是年轻和中年成人中最常见的失明原因(Klein等人1984，Ophthalmology 91：1464-1474；Moss等人1998，Ophthalmology 105：998-1003)。

年龄相关性黄斑变性(AMD)是发达国家中50岁或以上人群中严重视力丧失的主要原因。近年来，在治疗AMD方面取得了重大进展，引入了抗血管生成药物，为具有新生血管性AMD的患者提供了显着视觉恢复的希望(Keane等人2012，Surv Ophthalmol.57：389-414)。

抗血管内皮生长因子(VEGF)疗法(例如阿帕西普)是新生血管性AMD和DME的护理治疗标准。阿帕西普在这些患者群体中的疗效和安全性得到充分表征(Dixon等人2009；Expert Opin.Investig.Drugs 18：1573-80)。然而，在AMD中，虽然～95％的患者维持了其视力，但只有约30％的患者在1年时获得了15个或更多的最佳矫正视力(BCVA)字母的改善。在DME中，也存在改善治疗结果的可能性，如使用阿帕西普和雷珠单抗所观察到的，不到50％的具有视力丧失的患者由于DME而在1年和2年内达到15个或更多的字母改善。此外，在使用雷珠单抗的研究中，增殖性视网膜病的临床证据在高达7.2％的患者中发现，他们接受了3年的每月雷珠单抗治疗，其中高达3.2％的患者需要广泛视网膜光凝术，即潜在的视觉障碍的治疗方式(Brown等人2013 Ophthalmology 10：2013-22)。

抗VEGF疗法的玻璃体内(IVT)递送例如雷珠单抗和阿帕西普已经显示了对于脉络膜视网膜疾病的功效和安全性。然而，还存在许多其它促成血管通透性、新生血管形成和其它血管功能障碍的因素。促成血管通透性的一个最值得研究的因素是血管生成素-2(Ang-2)。Ang-2在正常血管发育期间且还在成人的生理或病理血管生成过程中由血管内皮细胞表达(Maisonpierre等人1997，Science 277：55-60；Holash等人1999，Science 284：1994-98)。Ang-2与其受体Tie-2的结合在正常血管发育过程中和在以病理性新生血管形成为特征的病症中促进血管生成。小鼠中Ang-2的遗传缺失显著地抑制正常的视网膜血管发育和病理性新血管形成(Hackett等人2000，J.Cell Physiol.184：275-83；Hackett等人2002，J.Cell Physiol.192：182-7；Gale等人2002，Dev.Cell 3：411-423)。靶向血管生成素-2(Ang2)将单独地或以组合方式支持任何这些因子的任意种的抑制，并且在单独的抗VEGF疗法成功时具有改善的潜能。

发明概述

根据本发明的一个方面，提供了用于治疗、预防或改善个体中血管性眼病或眼障碍的至少一种症状或适应症的方法。根据本发明该方面的方法包含对有此需要的个体施用治疗有效量的包含血管生成素-2(Ang-2)抑制剂的药物组合物。在一些实施方案中，将Ang-2抑制剂与血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂联合施用。

根据本发明的另一个方面，提供用于抑制个体的视网膜血管发生的方法。该方法包括对有此需要的个体施用治疗有效量的包含Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂的药物组合物。在一些实施方案中，联合施用导致与施用单独的Ang-2抑制剂或VEGF拮抗剂相比视网膜血管区减少至少65％。在一些实施方案中，所述视网膜血管发生与血管性眼病或眼障碍相关。

在另一个方面，本发明提供了用于抑制具有与血管发生相关的眼病或眼障碍的个体的视网膜新生血管化的方法，所述方法包括对有此需要的个体施用治疗有效量的包含Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂的药物组合物。

根据本发明的另一个方面，提供了用于抑制具有眼病或眼障碍的个体的血管渗漏的方法。所述方法包括对有此需要的个体施用治疗有效量的包含Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂的药物组合物。

在一个相关的方面，本发明提供了用于抑制具有与血管发生相关的眼病或眼障碍的个体的血管渗漏的方法，其中所述方法包括对有此需要的个体施用单剂量的VEGF拮抗剂，然后施用包含Ang-2抑制剂的药物组合物的一个或多个剂量。

在几个实施方案中，与已经施用单独的VEGF拮抗剂的个体相比，将所述血管渗漏抑制至少3周、3周以上、4周以上、8周以上或10周以上。

在另一个方面，本发明提供了用于抑制脉络膜新生血管化的方法，包括对有此需要的个体施用治疗有效量的包含Ang-2抑制剂的药物组合物。

根据本发明的另一个方面，提供了用于减少具有血管性眼病或眼障碍的个体对频繁玻璃体内注射的依赖性和治疗负担的方法。所述方法包含对有此需要的个体依次施用初始剂量、然后施用一个或多个二次剂量的治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂；其中所述药物组合物的施用与已经单独施用VEGF拮抗剂的个体相比每9周被减少了1次。

在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗血管性眼病的方法，所述方法包括对有此需要的个体施用一个或多个剂量的药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的抗Ang-2抑制剂和治疗有效量的VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，所述方法包括施用初始剂量的药物组合物，然后施用一个或多个二次剂量。在一些实施方案中，在即刻在先剂量后1-4周施用各二次剂量。在一些实施方案中，所述方法还包含对所述个体施用一个或多个第三次剂量。在一些实施方案中，在即刻在先剂量后5-12周施用各第三次剂量。在一个实施方案中，在即刻在先剂量后4周施用各二次剂量。在一些实施方案中，在即刻在先剂量后8周或12周施用各第三次剂量。在一些实施方案中，所述药物组合物包含约10mg/mL-约120mg/mL的抗Ang-2抑制剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含约40mg/mL的VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含约10mg/mL-约120mg/mL的抗Ang-2抑制剂和约40mg/mL的VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，对所述个体通过玻璃体内施用所述药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物的各剂量包含约0.5mg-约6mg的抗Ang-2抑制剂和约2mg的VEGF拮抗剂。在一个实施方案中，药物组合物的各剂量包含约3mg的抗Ang-2抑制剂和约2mg的VEGF拮抗剂。在一个实施方案中，药物组合物的各剂量包含约6mg的抗Ang-2抑制剂和约2mg的VEGF拮抗剂。

在一些实施方案中，所述眼病或眼障碍选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管化、视网膜中央静脉闭塞、视网膜分支静脉闭塞、多息肉状脉络膜血管病和脉络膜新生血管化。

在一些实施方案中，将Ang-2抑制剂作为与VEGF拮抗剂的共同制剂施用。在一些实施方案中，对有此需要的个体通过玻璃体内施用单独的Ang-2抑制剂或其与VEGF拮抗剂组合。在可选实施方案中，通过静脉内或皮下施用Ang-2抑制剂。在一些实施方案中，通过静脉内或皮下施用Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂，其中通过玻璃体内施用VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，通过局部或眼内(例如通过玻璃体内)共同施用Ang-2抑制剂和VEGF拮抗剂。

在一些实施方案中，以0.05mg-10mg的剂量对有此需要的个体施用Ang-2抑制剂。在一些实施方案中，以0.01mg-5mg的剂量对有此需要的个体施用VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，以约1-50mg/kg个体体重的剂量施用Ang-2抑制剂。

在一些实施方案中，将包含Ang-2抑制剂的药物组合物的一个或多个二次剂量对有此需要的个体施用。在一些实施方案中，所述一个或多个剂量包含至少2个药物组合物的二次剂量。在一些实施方案中，在即刻在先剂量后1-4周施用各二次剂量。

可以用于本发明上下文中的方法的示例性的Ang-2抑制剂包括，例如Ang-2的小分子化学抑制剂或靶向Ang-2的生物活性剂。根据一些实施方案，Ang-2抑制剂是结合Ang-2配体并且阻断Tie2信号传导的抗体或抗原结合蛋白。在一些实施方案中，所述抗Ang-2抗体或抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的重链互补决定区(HCDRs)和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的轻链CDRs。

可以与本发明组合物和方法中的Ang-2抑制剂联用的VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体(例如雷珠单抗)、小分子VEGF抑制剂(例如舒尼替尼(sunetinib))和抑制VEGF的融合蛋白(“VEGF Traps”)。可以与本发明治疗方法中的抗Ang-2抗体联用的VEGF拮抗剂的实例是阿帕西普，即一种抑制VEGF的融合蛋白(参见US 7,087,411)。

在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含治疗有效量的Ang-2抑制剂和药学上可接受的载体或稀释剂。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含VEGF拮抗剂。

在一些实施方案中，本发明提供了抗Ang-2抗体或其抗原结合片段在制备治疗或预防或改善个体包括人的眼病或眼障碍的至少一种症状或适应症的药物中的用途。

在一些实施方案中，本发明提供了本发明的Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂在制备治疗个体包括人的眼病或眼障碍的药物中的用途。

根据本发明的另一个方面，提供稳定的液体药物制剂，其包含：(i)VEGF拮抗剂；(ii)特异性地结合Ang-2的抗体或其抗原结合片段；(iii)缓冲剂；(iv)非离子洗涤剂；(v)张度剂；和(vi)稳定剂。在一个实施方案中，提供稳定的眼用制剂，其包含：(i)VEGF拮抗剂；(ii)特异性地结合Ang-2的抗体或其抗原结合片段；(iii)缓冲剂；(iv)非离子洗涤剂；(v)张度剂；和(vi)稳定剂。

在一个实施方案中，以5mg/mL±0.75mg/mL-约100mg/mL±15mg/mL的浓度提供VEGF拮抗剂，并且以10±1.5mg/mL-120±18.0mg/mL的浓度提供抗Ang-2抗体。在一些实施方案中，提供浓度为10mg/mL±1.5mg/mL-80mg/mL±12mg/ml或20mg/mL±3.0mg/mL-60mg/mL±9.0mg/mL的VEGF拮抗剂。在一个实施方案中，提供浓度为40mg/mL±6.0mg/ml或约40mg/mL的VEGF拮抗剂。在一个实施方案中，提供浓度为10mg/ml±1.5mg/ml或约10mg/mL的抗体。在另一个实施方案中，提供浓度为20mg/mL±3.0mg/ml或约20mg/mL的抗体。在另一个实施方案中，提供浓度为60mg/mL±9.0mg/ml或约60mg/mL的抗体。在另一个实施方案中，提供浓度为120mg/mL±18.0mg/ml或约120mg/mL的抗体。

在一些实施方案中，液体制剂的pH约为pH 5.5-约pH 6.5。在一些实施方案中，液体制剂的pH为pH 6.2±0.3、pH 6.2±0.25、pH 6.2±0.2、pH 6.2±0.15、pH 6.2±0.1、pH6.2±0.05、pH 6.2±0.01或pH 6.2。在一个实施方案中，液体制剂的pH为pH 6.2±0.3或约pH 6.2。

在一个实施方案中，所述缓冲剂为磷酸钠。在一些实施方案中，磷酸钠的浓度为5mM±0.75mM-50mM±7.5mM、5mM±0.75mM-40mM±6.0mM或5mM±0.75mM-25mM±3.75mM。在一个实施方案中，磷酸钠的浓度为10mM±1.5mM或约10mM。

在一些实施方案中，所述非离子洗涤剂是包含聚氧乙烯部分的非离子聚合物。在一些实施方案中，所述非离子洗涤剂是聚山梨醇酯20、伯洛沙姆188和聚乙二醇3350的任意一种或多种。在一个实施方案中，所述洗涤剂为聚山梨醇酯20。在一个实施方案中，所述洗涤剂为聚山梨醇酯80。

在一些实施方案中，所述非离子洗涤剂是0.005％±0.00075％-1％±0.15％“重量/体积”或“w/v”的浓度，其中，例如0.1g/ml＝10％，且0.01g/ml＝1％。在一个实施方案中，所述非离子洗涤剂是聚山梨醇酯20，其浓度约为0.01％±0.0045％-约0.05％±0.0045％w/v。在一个实施方案中，所述非离子洗涤剂为聚山梨醇酯20，其浓度为0.03％±0.0045％w/v或约0.03％w/v。

在一些实施方案中，所述张度剂为氯化钠或氯化钾。在一个实施方案中，所述张度剂为氯化钠。在一些实施方案中，所述张度剂为10mM±1.5mM-75mM±11.25mM、20mM±3.0mM-60mM±9.0mM或30mM±4.5mM-50mM±7.5mM浓度的氯化钠。在一个实施方案中，氯化钠的浓度为40mM±6.0mM或约40mM。

在一个实施方案中，所述稳定剂为糖。在一个实施方案中，所述糖选自蔗糖、甘露糖醇和海藻糖。在一个实施方案中，所述稳定剂为蔗糖。

在一些实施方案中，所述稳定剂浓度为1％±0.15％w/v-20％±3％w/v。在一些实施方案中，所述稳定剂为浓度1％±0.15％w/v-15％±2.25％w/v或1％±0.15％w/v-10％±1.5％w/v的蔗糖。在一个实施方案中，所述稳定剂为浓度5％±0.15％w/v或约5％w/v的蔗糖。在另一个实施方案中，所述稳定剂为浓度7.5％±1.125％w/v或约7.5％w/v的蔗糖。在另一个实施方案中，所述稳定剂为浓度10％±1.5％w/v或约10％w/v的蔗糖。在另一个实施方案中，所述稳定剂为浓度12.5％±1.875％w/v或约12.5％w/v的蔗糖。在另一个实施方案中，所述稳定剂为浓度15％±2.25％w/v或约15％w/v的蔗糖。在另一个实施方案中，所述稳定剂为浓度20％±3％w/v或约20％w/v的蔗糖。

在一个方面，提供稳定的液体药物制剂，其包含：(i)5±0.75mg/mL-100±15.0mg/mL的VEGF拮抗剂；(ii)5±0.75mg/mL-150±22.5mg/mL的特异性地结合人Ang-2的人抗体；(iii)5mM±0.75mM-50mM±7.5mM磷酸钠；(iv)0.01％±0.0015％-0.1％±0.015％(w/v)聚山梨醇酯20；(v)10mM±1.5mM-100mM±15mM氯化钠；和(vi)1％±0.15％-20％±3％(w/v)蔗糖，该制剂的pH约为5.5-约6.5。

在一个实施方案中，所述药物制剂包含：(i)40mg/mL±6.0mg/mL的阿帕西普；(ii)10±1.5mg/mL的抗Ang-2抗体；(iii)10±1.5mM磷酸钠；(iv)0.03％±0.0045％(w/v)聚山梨醇酯20；(v)40mM±6.0mM氯化钠；和(vi)5％±0.75％(w/v)蔗糖，该制剂的pH为6.2±0.3。

在一个实施方案中，所述药物制剂包含：(i)40mg/mL±6.0mg/mL的阿帕西普；(ii)20±3.0mg/mL的抗Ang-2抗体；(iii)10±1.5mM磷酸钠；(iv)0.03％±0.0045％(w/v)聚山梨醇酯20；(v)40mM±6.0mM氯化钠；和(vi)5％±0.75％(w/v)蔗糖，该制剂的pH为6.2±0.3。

在一个实施方案中，所述药物制剂包含：(i)40mg/mL±6.0mg/mL的阿帕西普；(ii)60±9.0mg/mL的抗Ang-2抗体；(iii)10±1.5mM磷酸钠；(iv)0.03％±0.0045％(w/v)聚山梨醇酯20；(v)40mM±6.0mM氯化钠；和(vi)5％±0.75％(w/v)蔗糖，该制剂的pH为6.2±0.3。

在一个实施方案中，所述药物制剂包含：(i)40mg/mL±6.0mg/mL的阿帕西普；(ii)120±18.0mg/mL的抗Ang-2抗体；(iii)10±1.5mM磷酸钠；(iv)0.03％±0.0045％(w/v)聚山梨醇酯20；(v)40mM±6.0mM氯化钠；和(vi)5％±0.75％(w/v)蔗糖，该制剂的pH为6.2±0.3。

在一个方面，在容器中提供本发明的液体药物制剂。在一个实施方案中，容器为聚碳酸酯小瓶。在另一个实施方案中，容器为玻璃小瓶。在一个实施方案中，玻璃小瓶为第1型硼硅酸玻璃小瓶，具有涂覆氟碳化物的丁基橡胶瓶塞。在另一个实施方案中，容器为微输注器。在另一个实施方案中，容器为注射器。在一个特定实施方案中，注射器含有一个涂覆氟碳化物的塞盖。在一个特定实施方案中，注射器为2mL长玻璃注射器，其含有少于约500份/十亿的钨，其配有30-G针头、涂覆氟碳化物的丁基橡胶瓶塞，以及无乳胶、非细胞毒性橡胶顶盖。在一个实施方案中，注射器为NUOVA OMPI 2mL长玻璃注射器，其配有30-G薄壁针头、涂覆FLUROTEC的4023/50GRY B2-40瓶塞，以及FM 27橡胶顶盖。在一些实施方案中，注射器为1mL、2mL或3mL塑料注射器，其装有27-G针头。在一个实施方案中，容器为聚氯乙烯IV袋。在另一个实施方案中，容器为聚烯烃IV袋。

在一个方面，本发明包含预装注射器，其包含前述方面的任一项的药物制剂。

在一个方面，提供了药盒，其包含前述方面中任一项的药物组合物、容器以及使用说明书。在一个实施方案中，容器为预装注射器。在一个实施方案中，容器为硼硅酸小瓶，其配有涂覆FLUROTEC的4023/50的橡胶瓶塞。

本发明的其它实施方案从如下详细描述的综述中显而易见。

附图简述

图1显示已经如本文实施例2中所述用抗Ang-2抗体、VEGF拮抗剂或抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂治疗的DL-α-氨基己二酸(DL-α-AAA)-诱导的视网膜新生血管化的家兔中的渗漏面积改变百分比。

图2显示具有DL-α-AAA-诱导的视网膜新生血管化的家兔中的渗漏面积改变百分比，所述具有DL-α-AAA-诱导的视网膜新生血管化的家兔已经如本文实施例3中所述、按照如下治疗方案通过玻璃体内(IVT)用VEGF拮抗剂(VGT)(或对照品)治疗和通过静脉内(IV)用抗Ang-2抗体(或对照品)治疗：(a)对照IVT和对照IV；(b)VGT IVT和对照IV；(c)对照IVT和抗Ang-2IV；和(d)VGT IVT和抗Ang-2抗体IV。

图3显示如本文实施例5中所述的基线、对照组(hFc)和抗Ang-2抗体(mAb1)治疗组的总视网膜下损害大小(A)、新血管体积(B)和血管密度(C)的定量。与hFc-治疗的对照组相比，mAb1-治疗组显示总损害体积的具有统计学显著性的减小(斯氏t-检验，p＝0.0034)和向新血管体积减小(斯氏t-检验，p＝0.1658)的趋势(26.9％)。误差条表示标准偏差。

发明详述

在描述本发明前，应理解，本发明不受限于所述的特定方法及实验条件，因为这类方法以及条件是可以改变的。亦应理解，本文所用术语仅是供描述特定实施方案之用，而不意欲为限制性的，因为本发明的范围将仅被随附的权利要求所限制。

除非另有定义，否则本文所用全部技术与科学术语和本发明所属领域中普通技术人员一般所理解的意思相同。如本文所用，术语“约”，当提及特定引用的数值时，表示该数值可相对于引用的数值改变不超过1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99与101，以及其间的所有数值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。

尽管任何与本文所述方法和材料类似或等效者可用于实施本发明，现将描述优选方法与材料。本文提及的全部公开文献以其全文并入本文做为参考文件来描述。

用于治疗或改善血管性眼病或眼障碍的方法

本发明包括用于治疗、预防或改善个体的血管性眼病或眼障碍的至少一种症状或适应症的方法。本发明该方面的方法包括对有此需要的个体施用治疗有效量的包含Ang-2抑制剂的药物组合物。在一些实施方案中，通过皮下或静脉内施用Ang-2抑制剂。在一些实施方案中，将Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂联合施用。在一些实施方案中，通过玻璃体内将Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂联合施用。在一些实施方案中，将Ang-2抑制剂作为与VEGF拮抗剂的单一联用剂量制剂施用。在一些实施方案中，将Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂联合施用，其中通过静脉内施用Ang-2抑制剂，且通过玻璃体内施用VEGF拮抗剂。在Ang-2抑制剂之前、之后或与其同时施用VEGF拮抗剂。

本文所用的术语“治疗”等是指以短暂或持久为基础缓解、消除症状原因或预防或减慢新生血管眼病症状的表现。在一些实施方案中，本方法用于治疗或改善至少一种症状或适应症，包括、但不限于视网膜血管发生、新生血管形成、血管渗漏、中央凹中心的500μm内的视网膜增厚、具有相邻视网膜增厚的中央凹的中心和视网膜增厚的至少1个视盘区的500μm内的硬黄色渗出液(其中的任意部分处于中央凹的1个视盘直径内)、视力模糊、悬浮物、对比度丧失、复视和最终目盲。在用于治疗血管性眼病例如AMD或DME的方法的背景下，该术语是指从治疗开始，患者展示出在早期治疗糖尿病视网膜病变研究(EDTRS)视力表上一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上)字母的增加。在一些实施方案中，该术语是指从治疗开始，大于或等于15个字母的视力缺失在患者中得以预防。

本文所用的术语“预防”等是指预防血管性眼病的症状的发展、适应症或并发症。在用于治疗血管性眼病例如AMD或DME的方法的背景下，该术语是指从治疗开始，中度或严重性视力丧失在患者中得以预防。

本文所用的“血管性眼病或眼障碍”是指侵害眼中的血管的眼病或眼障碍。所述疾病可以因异常血管发生(新血管形成)或血管阻塞或封闭导致。本文所用的该术语包括与血管发生相关的眼病或眼障碍。该术语包括、但不限于选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管化、视网膜中央静脉闭塞、视网膜分支静脉闭塞、多息肉状脉络膜血管病和脉络膜新生血管化的眼病或眼障碍。在一些实施方案中，术语“新生血管眼病或眼障碍”可以与术语“与血管发生相关的眼病或眼障碍”互换使用。

在一些实施方案中，本发明包括用于治疗、预防或改善与个体的血管发生相关的眼病或眼障碍的至少一种症状或适应症的方法，其中所述疾病或障碍选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管化、多息肉状脉络膜血管病和脉络膜新生血管化。

本文所用的“糖尿病黄斑水肿”(DME)是指侵害具有糖尿病(1型或2型)的人的严重性眼病症。黄斑水肿发生在视网膜中的血管渗入黄斑，且流体和蛋白质沉积物聚集在眼睛的黄斑上或其下方(视网膜的黄色中心区域)，并导致其变厚和肿胀(水肿)。肿胀可能会扭曲人的中心视力，因为黄斑在靠近眼球背面上的视网膜中心附近。DME的主要症状包括、但不限于视力模糊、悬浮物、对比度丧失、复视和最终目盲。DME的病理学特征在于通常防止视网膜中的水分移动的血液视网膜屏障破坏，从而允许流体积聚在视网膜组织中并存在视网膜增厚。DME目前在由以下组成的眼科检查期间被诊断：视觉敏感度试验，其确定人们可以在标准化图表上读取的最小字母；扩大的眼科检查以检查疾病的迹象；成像测试，例如光协调性体层摄影术(OCT)或荧光素血管造影术(FA)和眼压测量法，即用于测量眼内压的仪器。还进行以下研究以确定治疗：光协调性体层摄影术(OCT)、荧光素血管造影术(FA)和彩色立体眼底照相术。DME可以广泛地被表征为两个主要类别-局部性和弥漫性。局部性DME的特征在于具有足够黄斑血流的黄斑中分离和不同渗漏的特定区域。弥漫性DME因自围绕黄斑的整个毛细血管床的渗漏导致，这是因眼的内部血液-视网膜屏障的破裂引起。除了局部和弥漫之外，DME还基于临床检查结果被分为临床上显著的黄斑水肿(CSME)、非CSME和牵涉中枢的CSME(CSME-CI)，其涉及中央凹。本发明包括治疗上述举出的DME类别的方法。

如本文所用，年龄相关性黄斑变性(AMD)是指当视网膜的小中心部分(称作黄斑)恶化时的严重眼病症。AMD的湿形式的特征在于来自黄斑下方的脉络膜异常血管的生长。这被称为脉络膜新血管化。这些血管将血液和流体渗入视网膜，导致视力扭曲，使直线看起来如波浪，以及盲点和中心视觉丧失。这些异常血管最终会形成疤痕，导致中心视觉永久丧失。AMD的症状包括视力中心的黑暗、模糊区域；以及颜色感知的减少或变化。AMD可以在常规眼科检查中被检测到。黄斑变性的最常见的早期症状之一是玻璃疣的存在--视网膜下的微黄色沉积物--或颜色聚集。

如本文所用，表述“有此需要的个体”是指表现出一种或多种眼病或眼障碍相关性血管发生的症状或适应症和/或已被诊断患有眼病或眼障碍相关性血管发生的人或非人哺乳动物。术语“有此需要的个体”还可以包括，例如治疗前展现(或已展示)一种或多种新生血管性眼病的适应症的个体，所述适应症例如视网膜血管发生、新生血管形成、血管渗漏、视网膜增厚500μm以内的中心凹、具有相邻视网膜增厚的中央凹和至少1个视网膜增厚的视盘区域500μm的以内的硬黄色渗出物(其中任何部分均在中央凹中心的1个视盘直径内)、视力模糊、悬浮物、对比度缺失、复视和最终目盲。

在本发明的上下文中，“有此需要的个体”还包括具有血管性眼病或眼障碍的人或非人的哺乳动物，所述血管性眼病或眼障碍选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管化、视网膜中央静脉闭塞、视网膜分支静脉闭塞、多息肉状脉络膜血管病和脉络膜新生血管化。

在本发明的上下文中，“有此需要的个体”可以包括对DME或AMD更敏感的人群的子群体，或者可以显示升高的DME相关或AMD相关生物标记的水平。例如，“有此需要的个体”可以包括患有糖尿病超过10年、具有频繁的高血糖水平或高空腹血糖水平的患者。在一些实施方案中，术语“有此需要的个体”包括在施用Ang-2抑制剂和/或VEGF拮抗剂之前或之时具有或被诊断患有糖尿病的个体。在一些实施方案中，术语“有此需要的个体”包括在施用Ang-2抑制剂和/或VEGF拮抗剂之前或之时超过50岁的个体。在一些实施方案中，术语“有此需要的个体”包括吸烟者或具有高血压或高胆固醇的个体。

本发明包括治疗、预防或降低血管性眼病的严重性的方法，包括对有此需要的个体施用治疗有效量的包含Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂的药物组合物，其中将该药物组合物以多个剂量施用于个体，例如作为特定治疗剂量施用方案的组成部分。例如，治疗剂量施用方案可以包含以每天约1次、每2天1次、每3天1次、每4天1次、每5天1次、每6天1次、每周1次、每2周1次、每3周1次、每4周1次、每个月1次、每2个月1次，每3个月1次、每4个月1次或更低频率的频率向个体施用多剂量的药物组合物。在一些实施方案中，治疗剂量施用方案可以包含以每天1次或每天2次或多次的频率对个体施用多剂量的药物组合物。

根据一些实施方案，本发明的方法包含向个体施用治疗有效量的包含Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂的药物组合物。在一些实施方案中，可以将本发明的Ang-2抑制剂与疗法联合施用，所述疗法包括激光治疗以阻止渗入黄斑。如本文所用，短语“与之组合”是指将包含Ang-2抑制剂的药物组合物与施用VEGF拮抗剂的同时、之前、或之后施用于个体。

本发明还包括用于抑制或减少或阻止个体血管渗漏的方法。在一些实施方案中，根据本发明该方面的方法包括向个体施用一个或多个剂量的包含Ang-2抑制剂的药物组合物，以减少或抑制个体眼中的血管渗漏。在一些另外的实施方案中，所述方法包含向个体施用一个或多个剂量的药物组合物，其包含与VEGF拮抗剂组合的Ang-2抑制剂，以减少或抑制个体眼中的血管渗漏。在一些实施方案中，与单独施用VEGF拮抗剂的个体相比，血管渗漏被抑制超过3周、超过4周、超过8周或超过10周。

根据一些实施方案，本发明的方法包含向个体施用治疗有效量的包含与VEGF拮抗剂组合的Ang-2抑制剂的药物组合物。如本文所用，短语“与之组合”是指将包含Ang-2抑制剂的药物组合物在施用VEGF拮抗剂同时、之前或之后施用于个体。在一些实施方案中，将VEGF拮抗剂与Ang-2抑制剂作为共同制剂施用。在一个相关的实施方案中，本发明包括包含施用治疗有效量的包含Ang-2抑制剂的药物组合物的方法，其与单独施用的VEGF拮抗剂相比提供更大的治疗效果或协同效应。所述个体可以是针对玻璃体内施用的VEGF拮抗剂的治疗方案。在一些实施方案中，Ang-2抑制剂被添加到该治疗方案中，其中一次或多次玻璃体内注射VEGF拮抗剂可以被减少或者连续的玻璃体内注射之间的持续时间可以增加。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗血管性眼病的方法，所述方法包括对此有需要的个体施用一个或多个剂量的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的抗Ang-2抑制剂和治疗有效量的VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，将所述药物组合物通过玻璃体内施用于个体。在一些实施方案中，所述药物组合物包含约10mg/mL-约120mg/mL的抗Ang-2抑制剂和约40mg/mL的VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，所述方法包含施用初始剂量的药物组合物，然后是一个或多个二次剂量，其中每个二次剂量在紧接在前的剂量之后1至4周施用。在一些实施方案中，施用一个或多个第三次剂量的药物组合物，其中每个第三次剂量在紧接之前的剂量后5至12周施用。在一些实施方案中，药物组合物的剂量各自包含约0.5-约6mg的抗Ang-2抑制剂和约2mg的VEGF拮抗剂。

在一些实施方案中，本发明提供减少患有血管性眼病的个体玻璃体内注射次数的方法，所述方法包括施用包含抗Ang-2抑制剂和VEGF拮抗剂的药物组合物，其中与使用抗Ang-2抑制剂或VEGF拮抗剂单独施用的个体相比，玻璃体内施用在8周内减少至1次。

本发明的方法用于治疗或预防已被诊断患有血管性眼病或处于其风险中的患者的血管性眼病。通常，本发明的方法在治疗方案开始的36周内(初始剂量在“第0周”时施用)显示出效能，例如到第6周结束时，到第12周结束时，到第18周结束时，到第24周结束时等。在治疗血管生成性眼睛疾病的方法的背景下，例如AMD和DME，“效能”意味着，从治疗开始，患者在早期治疗糖尿病视网膜病变研究(ETDRS)视力表上表现出10个或更少的字母丢失。在一些实施方案中，“效能”是指从治疗开始时的ETDRS图表上获得一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多)个字母。

血管生成素-2(Ang-2)抑制剂

如本文所用，术语“Ang-2”或“ANG2”是指通常称作Tie2激活的自分泌拮抗剂的人血管生成素-2。Ang-2在本领域中通常已知“触发”血管内皮以接受细胞因子的作用。Ang-2在肿瘤血管系统中被强烈表达并且通常认为其与另外的细胞因子(即血管内皮生长因子)发生协同作用以促进血管发生和肿瘤发展。

如本文所用，“Ang-2抑制剂”(本文中也称作“Ang-2拮抗剂”、“Ang-2阻断剂”等)是结合Ang-2或与Ang-2发生相互作用并且抑制或减弱Ang-2的正常生物信号传导功能/活性的任意活性剂。

Ang-2抑制剂类别的非限制性实例包括小分子Ang-2抑制剂、抗Ang-2适体、基于肽的Ang-2抑制剂(例如“肽体”分子)、“受体-主体”(例如包含Ang-2成分的受体结合结构域的改造的分子)和抗体或与人Ang-2特异性结合的抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，Ang-2抑制剂是例如美国专利申请公开号US20110027286中公开的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗Ang-2抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)。

本发明的方法包含对有需要的个体施用包含Ang-2抑制剂的治疗组合物。

抗Ang-2抗体及其抗原结合片段

根据本发明的一些示例性实施方案，Ang-2抑制剂是抗Ang-2抗体或其抗原结合片段。如本文所用的术语“抗体”包括包含四条多肽链、通过二硫键相互连接的两条重链(H)链和两条轻链(L)链及其多聚体(例如IgM)的免疫球蛋白分子。在典型的抗体中，每个重链包含重链可变区(本文缩写为HCVR或V_H)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域C_H1、C_H2和C_H3。每个轻链包括轻链可变区(本文中缩写为LCVR或V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(C_L1)。V_H和V_L区可进一步再分为高变区，称作互补决定区(CDRs)，其散布于更保守的区，称作框架区(FR)。每个V_H和V_L由以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDRs和四个FRs组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同的实施方案中，抗Ang-2抗体(或其抗原结合部分)的FRs可以与人种系序列相同，或者可以是天然的或人工修饰的。可以基于两个或更多个CDRs的并排分析来定义氨基酸共有序列。

本文所用的术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。本文所用的抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合部分”等包括与抗原特异性结合形成复合物的任何天然存在的、酶促获得的、合成的或遗传改造的多肽或糖蛋白。例如可以使用任何适合的标准技术从完整抗体分子衍生抗体的抗原结合片段，所述适合的标准技术例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变和任选恒定结构域的DNA的操纵和表达的重组遗传工程技术。这类DNA是已知的或者易于得自例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体抗体文库)或可以合成。例如，可以通过化学方式或通过使用分子生物学技术对DNA进行测序和操作，以便将一个或多个可变和/或恒定结构域排列成适合的构型，或导入密码子、生成半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。

抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab′)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如CDR3肽的分离的互补决定区(CDR))或约束FR3-CDR3-FR4肽。其它改造的分子例如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、双体、三链抗体、四链抗体、微小抗体(minibodies)、纳米抗体(nanobodies)(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIPs)和鲨鱼可变IgNAR结构域也被本文所用的表述“抗原结合片段”涵盖。

抗体的抗原结合片段典型地包含至少一个可变结构域。该可变结构域可以具有任意大小或氨基酸组成，并且通常将包含至少一个CDR，其与一个或多个构架序列相邻或处于框内。在具有V_H结构域与V_L结构域结合的抗原结合片段中，V_H和V_L结构域可以相对于彼此以任意适合的排列方式定位。例如，可变区可以是二聚的并且包含V_H-V_H、V_H-V_L或V_L-V_L二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可以包含单体V_H或V_L结构域。

在一些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以包含共价连接至少一个恒定结构域的至少一个可变结构域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)V_H-C_H1；(ii)V_H-C_H2；(iii)V_H-C_H3；(iv)V_H-C_H1-C_H2；(v)V_H-C_H1-C_H2-C_H3；(vi)V_H-C_H2-C_H3；(vii)V_H-C_L；(viii)V_L-C_H1；(ix)V_L-C_H2；(x)V_L-C_H3；(xi)V_L-C_H1-C_H2；(xii)V_L-C_H1-C_H2-C_H3；(xiii)V_L-C_H2-C_H3；和(xiv)V_L-C_L。在包括上面列出的任意示例性构型的可变和恒定结构域的任意构型中，可变和恒定结构域可以彼此直接连接，或者可以通过完全或部分铰链或连接区连接。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或以上个)氨基酸组成，其在单个多肽分子中相邻的可变和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性连接键。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包含以上列出的任意可变和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)，它们彼此之间和/或与一个或多个单体V_H或V_L结构域(例如通过二硫键)非共价结合。

本文所用的术语“抗体”还包括多特异性(例如双特异性)抗体。抗体的多特异性抗体或抗原结合片段典型地包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合单独的抗原或同一抗原上的不同表位。任意的多特异性抗体形式可以应用本领域可得到的常规技术来适用于本发明的抗体或本发明的抗原结合片段的上下文中。例如，本发明包括使用双特异性抗体的方法，其中免疫球蛋白的一个臂对于IL-4Rα或其片段是特异性的，而免疫球蛋白的另一个臂对于第二治疗靶标是特异性的，或者与治疗部分缀合。可用于本发明上下文中的示例性双特异性形式包括、但不限于，例如基于scFv的或双抗体的双特异性形式、IgG-scFv融合体、双重可变结构域(DVD)-Ig、细菌杂交瘤、旋钮孔、共同轻链(例如通用轻链，带孔孔等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、双体、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG和Mab²双特异性形式(参见，例如Klein等人2012，mAbs 4：6，1-11和其中引用的参考文献有关上述形式的综述)。也可以使用肽/核酸缀合来构建双特异性抗体，例如，其中具有正交化学反应性的非天然氨基酸用于产生位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，其然后自组装成具有确定的组成、价态和几何形状的多聚化复合物。(参见，例如Kazane等人，J.Am.Chem.Soc.[电子版：2012年12月4日])。

用于本发明方法的抗体可以是人抗体。本文所用的术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。尽管如此，但是本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变导入或通过体内体细胞突变导入的突变)，例如在CDR且特别是CDR3中。然而，本文所用的术语“人抗体”并不意图包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人构架序列上的抗体。

用于本发明方法的抗体可以是重组人抗体。本文所用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)、从重组组合人抗体文库(下文进一步描述)分离的抗体、从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参见，例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res，20：6287-6295)或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在一些实施方案中，将这类重组人抗体进行体外诱变(或者当使用针对人Ig序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，且由此重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列是这样的序列，尽管其源自人类种系V_H和V_L序列和与之相关的序列，但在体内的人抗体种系组成成分中可能并不天然存在。

根据一些实施方案，本发明药物制剂和方法中使用的抗体特异性地结合Ang-2。术语“特异性结合”等意指抗体或其抗原结合片段在生理条件下相对稳定地与抗原形成复合物。用于测定抗体是否特异性结合抗原的方法是本领域众所周知的，并且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。例如，如本发明上下文中所使用的“特异性结合”Ang-2的抗体包括以小于约500nM、小于约300nM，小于约200nM、小于约100nM、小于约90nM、小于约80nM、小于约70nM、小于约60nM、小于约50nM、小于约40nM、小于约30nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM、小于约1nM或小于约0.5nM的KD结合Ang-2或其部分的抗体，正如在表面等离子体共振测定法中测定的。然而，特异性结合人Ang-2的分离的抗体可能与其它抗原具有交叉反应性，例如来自其它(非人)物种的Ang-2分子。

根据本发明的一些示例性实施方案，Ang-2抑制剂是抗Ang-2抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)、轻链可变区(LCVR)和/或包含抗Ang-2抗体的任意氨基酸序列的互补决定区(CDRs)，正如美国专利申请公开号US20110027286中所举出的。

在一些示例性实施方案中，可用于本发明上下文方法中的抗Ang-2抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的重链互补决定区(HCDR)和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的轻链互补决定区(LCDR)。根据一些实施方案，抗Ang-2抗体或其抗原结合片段包含三个HCDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和三个LCDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO：NO：3；HCDR2包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；并且LCDR3包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在其它实施方案中，抗Ang-2抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：1的HCVR和含有SEQ ID NO：2的LCVR。在一些实施方案中，本发明的方法包括使用抗Ang-2抗体，其中抗体包含含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，抗Ang-2抗体包含含有SEQID NO：10的氨基酸序列的轻链。包含含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链和含有SEQ IDNO：10的氨基酸序列的轻链的示例性抗体是称作nesvacumab的完整人-抗Ang-2抗体。根据一些示例性实施方案，本发明的方法包含使用nesvacumab或其生物等效物。如本文所用，术语“生物等效物”是指作为药物等效物或药物替代选择的抗Ang-2抗体或Ang-2结合蛋白或其片段，其吸收速率和/或程度与在类似实验条件下以单剂量或多剂量施用相同摩尔剂量时，未显示出与nesvacumab的显著性差异。在本发明的上下文中，该术语是指结合Ang-2的抗原结合蛋白，其在安全性、纯度和/或效力方面与nesvacumab不具有临床意义上的差异。

本文实施例中使用的非限制性示例性抗体称作“H1H685P”，如US 2011/0027286所述。该抗体包含具有SEQ ID NO：1/2的HCVR/LCVR氨基酸序列对和由SEQ ID NOs：3-4-5/SEQID NOs：6-7-8表示的HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域。

针对人Ang-2的其它抗体描述于专利申请公开号US 2010/0166768、US 2011/0065902和WO 2010/077854中，其通过引用并入本文作为参考。

包含在本发明药物制剂内的抗体或其抗原结合片段的量可以根据期望的制剂的具体特性以及预期使用制剂的具体情况和目的不同而变化。在一些实施方案中，所述药物制剂是液体制剂，其可以包含：5±0.75mg/mL-150±22.5mg/mL的抗体；7.5±1.125mg/mL-140±21mg/mL的抗体。例如，本发明的制剂可以包含：约10mg/mL；约20mg/mL；约30mg/mL；约50mg/mL；约60mg/mL；约80mg/mL；约100mg/mL；约120mg/mL；或约150mg/mL的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人Ang-2。

VEGF拮抗剂

如本文所用，“VEGF拮抗剂”是与VEGF结合或与VEGF发生相互作用、抑制VEGF与其受体(VEGFR1和VEGFR2)结合和/或抑制VEGF的生物信号传导和活性的任意活性剂。VEGF拮抗剂包括干扰VEGF与天然VEGF受体之间的相互作用的分子，例如结合VEGF或VEGF受体并且预防或以其它方式阻碍VEGF与VEGF受体之间的相互作用的分子。具体示例性的VEGF拮抗剂包括抗-VEGF抗体(例如雷珠单抗)、抗-VEGF受体抗体(例如抗-VEGFR1抗体、抗-VEGFR2抗体等)、VEGF的小分子抑制剂(例如舒尼替尼)和基于VEGF受体的嵌合分子或抑制VEGF的融合蛋白(本文也称作″VEGF-Traps″)。

基于VEGF受体的嵌合分子包括包含VEGF受体的两个或多个免疫球蛋白(Ig)样结构域的嵌合多肽，例如VEGFR1(也称作Flt1)和/或VEGFR2(也称作Flk1或KDR)并且还可以包含多聚化结构域(例如促进两个或多个嵌合多肽的多聚化[例如二聚化]的Fc结构域)。示例性的基于VEGF受体的嵌合分子是称作VEGFR1R2-FcAC1(a)的分子(也称作阿帕西普，以产品名销售)。在一些实施方案中，阿帕西普由SEQ ID NO：11的氨基酸序列编码。

包含在本发明药物制剂中VEGF拮抗剂的量可以根据期望的制剂的具体特性以及制剂旨在被使用的具体情况和目的不同而变化。在一些实施方案中，所述药物制剂是液体制剂，其可以包含5±0.75mg/mL-150±22.5mg/mL的VEGF拮抗剂；10±1.5mg/mL-100±15.0mg/mL的VEGF拮抗剂；20±3mg/mL-80±12mg/mL的VEGF拮抗剂；30±4.5mg/mL-70±10.5mg/mL的VEGF拮抗剂或40±6.0mg/mL的VEGF拮抗剂。例如，本发明的制剂可以包含：约20mg/mL；约30mg/mL；约40mg/mL；约50mg/mL；或约60mg/mL的VEGF拮抗剂。

联合疗法

根据一些实施方案，本发明的方法包括向个体施用VEGF拮抗剂与抗Ang-2抗体。如本文所用，表述“与之组合”是指VEGF拮抗剂在包含抗Ang-2抗体的药物组合物之前、之后或与之同时施用。术语“与之组合”还包括依次或同时施用抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂。例如，当在包含抗Ang-2抗体的药物组合物“之前”施用时，VEGF拮抗剂可以在施用包含抗原-Ang-2抗体的药物组合物之前大于72小时、约72小时、约60小时、约48小时、约36小时、约24小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟或约10分钟施用。当在包含抗Ang-2抗体的药物组合物“之后”施用时，VEGF拮抗剂可以在包含抗Ang-2抗体的药物组合物施用后约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约24小时，约36小时、约48小时、约60小时、约72小时或72小时以上施用。与包含抗Ang-2抗体的药物组合物″同时″施用是指将VEGF拮抗剂在施用包含抗Ang-2抗体的药物组合物5分钟以内(之前、之后或同时)在单独的剂型中施用于个体，或将其作为包含VEGF拮抗剂和抗Ang-2抗体的单一组合剂量制剂施用于个体。

联合疗法可以包括本发明的抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂(例如阿帕西普、VEGF-Trap，参见、例如US 7,087,411(本文也称作“抑制VEGF的融合蛋白“)、抗-VEGF抗体(例如雷珠单抗)、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼)等。

本发明的方法包含施用具有累加或协同活性的抗Ang-2抗体与VEGF拮抗剂，以便治疗或改善眼病或眼障碍的至少一种症状或适应症，所述眼病或眼障碍选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管化、视网膜中央静脉闭塞、视网膜分支静脉闭塞、多息肉状脉络膜血管病和脉络膜新生血管化。

药物组合物和制剂

本发明包括包含对个体施用Ang-2抑制剂的方法，其中Ang-2抑制剂包含在药物组合物中。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含VEGF拮抗剂。在可选实施方案中，Ang-2抑制剂和VEGF拮抗剂可以在自身单独的药物剂型中。可以用提供适合的转移、递送、耐受等的载体、赋形剂和另外的试剂配制本发明的药物组合物。众多适合的制剂可以在所有药物化学家公知的处方集中找到：Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，PA。这些制剂包括，例如，粉末、糊剂、软膏剂、胶冻剂、蜡、油、脂质、包含囊泡的脂质(阳离子型或阴离子型)(例如LIPOFECTIN^TM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油型和油包水型乳剂、乳剂碳蜡(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和包含碳蜡是半固体混合物。另外参见Powell等人″Compendium of excipients for parenteral formulations″PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。

如本文所用，表述“药物制剂”意指至少一种活性成分(例如，小分子、大分子、化合物等，其能够在人类或非人类动物体内展现生物效应)以及至少一种非活性成分(其与活性成分或一种或多种其它非活性成分组合时，适于治疗性施用于人类或非人类动物)的组合。除非另有指明，否则如本文所用的术语“制剂”表示“药物制剂”。本发明提供包含至少一种治疗性多肽的药物制剂。根据本发明的一些实施方案，该治疗性多肽为抗体或其抗原结合片段，其特异结合至人血管生成素-2(Ang-2)蛋白质。根据一些另外的实施方案，本发明提供包含一种以上治疗性多肽的药物制剂。更具体地，本发明包括包含下列成分的药物制剂：(i)特异结合至人Ang-2的人抗体；(ii)VEGF拮抗剂；(iii)磷酸钠缓冲剂；(iv)为非离子型表面活性剂的有机共溶剂；(v)张度剂，例如氯化钠；以及(iv)为碳水化合物的热稳定剂。本发明中包括的特定示例性成分和制剂详述于下文。

包含在本发明药物制剂中的抗体或其抗原结合片段的量可以根据期望的制剂的具体特性以及制剂旨在被使用的具体情况和目的不同而变化。在一些实施方案中，所述药物制剂是液体制剂，其可以包含：5±0.75mg/mL-150±22.5mg/mL的抗体；7.5±1.125mg/mL-140±21mg/mL的抗体；10±1.5mg/mL-130±19.5mg/mL的抗体；10±1.5mg/mL的抗体；20±3mg/mL的抗体；60±9mg/mL的抗体；或120±18mg/mL的抗体。例如，本发明的制剂可以包含：约10mg/mL；约20mg/mL；约40mg/mL；约60mg/mL；约80mg/mL；约100mg/mL；约120mg/mL；或约140mg/mL的抗体或其抗原结合片段，它们特异性结合人Ang-2。

在一些实施方案中，所述药物制剂是液体制剂，其可以包含5±0.75mg/mL-100±15mg/mL的VEGF拮抗剂。例如，本发明的制剂可以包含：约5mg/mL；约10mg/mL；约15mg/mL；约20mg/mL；约25mg/mL；约30mg/mL；约35mg/mL；约40mg/mL；约50mg/mL；约60mg/mL；约70mg/mL；约80mg/mL；约90mg/mL；或约100mg/mL的VEGF拮抗剂，例如阿帕西普。

在一些实施方案中，所述药物制剂是稳定的液体联用制剂，其包含约5mg/mL-约150mg/mL的抗Ang-2抗体和约5-100mg/mL的VEGF拮抗剂。

本发明的药物制剂包含一种或多种赋形剂。如本文所用，术语″赋形剂”是指添加到所述制剂中以提供期望的稠度、粘度或稳定作用的任意非治疗剂。

在一些实施方案中，本发明的药物制剂包含至少一种有机共溶剂，其类型和用量在剧烈加工或搅拌例如涡旋条件下稳定人Ang-2抗体。在一些实施方案中，所谓的“稳定”是在剧烈加工过程中防止抗体总量的4％以上(以摩尔为基准)聚集的抗体形成。在一些实施方案中，剧烈加工是将包含抗体和有机共溶剂的溶液涡旋约60分钟或约120分钟。

在一些实施方案中，所述有机共溶剂是非离子表面活性剂，例如烷基聚(环氧乙烷)，本发明的制剂中可以包括的特定非离子表面活性剂包括，例如聚山梨醇酯类，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81和聚山梨醇酯85；伯洛沙姆，例如伯洛沙姆181、伯洛沙姆188、伯洛沙姆407；或聚乙二醇(PEG)。聚山梨醇酯20也称作吐温20、月桂山梨坦和聚氧乙烯月桂山梨坦。伯洛沙姆188也称作PLURONIC F68。

本发明药物制剂中包含的非离子表面活性剂的量可以根据制剂期望的特定性质以及预期使用该制剂的具体环境和目的的不同而改变。在一些实施方案中，所述制剂可以包含0.01％±0.0015％-1％±0.15％的表面活性剂。例如，本发明的制剂可以包含：约0.0085％；约0.01％；约0.02％；约0.03％；约0.04％；约0.05％；约0.06％；约0.07％；约0.08％；约0.09％；约0.1％；约0.11％；约0.12％；约0.13％；约0.14％；约0.15％；约0.16％；约0.17％；约0.18％；约0.19％；约0.20％；约0.21％；约0.22％；约0.23％；约0.24％；约0.25％；约0.3％；约0.4％；约0.5％；约0.6％；约0.7％；约0.8％；约0.9％；约1％；约1.1％；约1.15％；或约1.2％的聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或伯洛沙姆188。

本发明的药物制剂还可以包含一种或多种稳定剂，其类型和用量在热压力条件下可以稳定人Ang-2抗体。在一些实施方案中，所谓“稳定”是在将包含所述抗体和热稳定剂的溶液保持在约45℃下至多约28天时维持大于约93％的天然构象形式的抗体。在一些实施方案中，所谓“稳定”在于，其中在将包含所述抗体和热稳定剂的溶液保持在约45℃下至多约28天时，小于约4％的抗体聚集。在一些实施方案中，所谓“稳定”是在将包含所述抗体和热稳定剂的溶液保持在约37℃下至多约28天时维持大于约96％的天然构象形式的抗体。在一些实施方案中，所谓“稳定”在于，其中在将包含所述抗体和热稳定剂的溶液保持在约37℃下至多约28天时，小于约2％的抗体聚集。本文所用的“天然”是指通过大小排除的抗体主要形式，其通常为该抗体的完整单体。

在一些实施方案中，所述热稳定剂是糖或糖醇，其选自蔗糖、山梨醇、甘油、海藻糖和甘露糖醇或其任意的组合，其包含在所述制剂中的用量可以根据使用该制剂的具体情况和预期的目的不同而改变。在一些实施方案中，所述制剂可以包含约1％-约20％的糖或糖醇；约2％-约18％的糖或糖醇；约3％-约15％的糖或糖醇；约4％-约10％的糖或糖醇；或约5％的糖或糖醇。例如，本发明的药物制剂可以包含：4％±0.6％；5％±0.75％；6％±0.9％；7％±1.05％；8％±1.2％；9％±1.35％；10％±1.5％；11％±1.65％；12％±1.8％；13％±1.95％；或约14％±2.1％的糖或糖醇(例如蔗糖、海藻糖或甘露糖醇)。

在一些实施方案中，本发明的药物制剂包含张度剂，例如氯化钠或氯化钾。在一些实施方案中，所述张度剂是氯化钠。在一些实施方案中，氯化钠的存在浓度为：5mM±0.75mM-100mM±15.0mM；10mM±1.5mM-50mM±7.5mM；40mM±6.0mM；或约40mM。

本发明的药物制剂还可以包含缓冲剂或缓冲系统，其用于维持稳定的pH和有助于稳定人Ang-2抗体。在一些实施方案中，所谓“稳定”是指，其中在将包含所述抗体和所述缓冲剂的溶液保持在约45℃下至多约28天时，小于5％±0.5％或不超过约4.3％的抗体聚集。在一些实施方案中，所谓“稳定”是指，其中在将包含所述抗体和所述缓冲剂的溶液保持在约45℃下至多约28天时，如通过大小排阻色谱法测定的至少92％±0.5％的抗体为其天然构象形式。所谓“天然”或“天然构象”是指未聚集或降解的抗体部分。这通常通过一种测定法来测定，该测定法测定抗体实体的相对大小，例如大小排阻色谱测定法。未聚集和未降解的抗体以等于天然抗体的部分洗脱并且通常是主要洗脱的部分。聚集抗体以显示大于天然抗体的大小的部分洗脱。降解的抗体以显示小于天然抗体的大小的部分洗脱。

在一些实施方案中，所谓“稳定”是指，其中在将包含所述抗体和所述缓冲剂的溶液保持在约45℃下至多约28天时，至少52％±0.5％的抗体为其主要载荷形式，正如通过阳离子交换色谱法测定的。所谓“主要载荷”或“主要载荷形式”是指从主峰的离子交换树脂上洗脱的抗体部分，其通常位于一侧更具“碱性的”峰上和另一侧更具“酸性的”峰上。

本发明的药物制剂可以具有约5.5-约6.5的pH。例如，本发明的制剂可以具有约5.5；约5.6；约5.7；约5.8；约5.9；约6.0；约6.1；约6.2；约6.3；约6.4；或约6.5的pH。在一些实施方案中，pH为6.2±0.3；6.2±0.2；6.2±0.1；约6.2；或6.2。

在一些实施方案中，所述缓冲剂或缓冲系统包含至少一种缓冲剂，其具有完全或部分涵盖pH 5.5-7.4范围的缓冲范围。在一个实施方案中，所述缓冲剂具有约6.2±0.5的pKa。在一些实施方案中，所述缓冲剂包含磷酸钠缓冲剂。在一些实施方案中，磷酸钠的存在浓度为5mM±0.75mM-15mM±2.25mM；6mM±0.9mM-14mM±2.1mM；7mM±1.05mM-13mM±1.95mM；8mM±1.2mM-12mM±1.8mM；9mM±1.35mM-11mM±1.65mM；10mM±1.5mM；或约10mM。在一些实施方案中，所述缓冲系统包含10mM±1.5mM的磷酸钠，该制剂的pH为6.2±0.3或6.1±0.3。

包含可以在本发明上下文中使用的VEGF拮抗剂的示例性制剂公开在例如美国专利US 7,531,173和US 7,608,261中。包含可以在本发明上下文中使用的抗Ang-2抗体的示例性药物制剂公开在例如美国专利申请公开号US 20130186797中。

药物制剂的稳定性

本发明药物制剂典型地表现出高水平的稳定性。如本文所用，术语“稳定”在涉及药物制剂时，表示药物制剂中的抗体在储存于特定条件下之后保有可接受程度的化学结构或生物功能。制剂可以是稳定的，尽管其中所含抗体在储存特定时间期限之后并未维持其化学结构或生物功能的100％。在某些情况下，在储存特定时间期限之后维持约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的抗体结构或功能被视为“稳定”。

稳定性尤其可于特定温度下储存特定时间期限之后通过测定制剂中维持的天然抗体百分比来确定。天然抗体的百分比尤其可以通过大小排阻色谱法(例如大小排阻高效超高液相色谱法[SE-HPLC或SE-UPLC])来测定，使得天然是指非聚集和未降解的。作为本文所用的措词“可接受程度的稳定性”表示抗体的至少90％的天然形式可于特定温度下储存特定时间期限之后在制剂中检测到。在一些实施方案中，抗体的至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的天然形式可于特定温度下储存特定时间期限之后在制剂中检测到。在其后测量稳定性的特定时间期限可为至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更久。当评价稳定性时，药物制剂储存的特定温度可为下列的任一温度：约-80℃至约45℃，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃或约45℃。例如，若在储存于5℃9个月之后，通过SE-HPLC或SE-UPLC检测到超过约96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％天然抗体，则药物制剂可被视为是稳定的。若在储存于25℃6个月之后，通过SE-HPLC或SE-UPLC检测到超过约96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％的天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于37℃28天之后，通过SE-HPLC或SE-UPLC检测到超过约96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％的天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于45℃28天之后，通过SE-HPLC或SE-UPLC检测到超过约93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于-20℃6个月之后，通过SE-HPLC或SE-UPLC检测到超过约96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％的天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于-30℃6个月之后，通过SE-HPLC或SE-UPLC检测到超过约96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％的天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。在储存于-80℃6个月之后，通过SE-HPLC或SE-UPLC检测到超过约96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％的天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。

稳定性尤其可通过测定在特定温度下储存特定时间期限之后，制剂中抗体形成聚集物的百分比来测量，其中稳定性与形成聚集物的百分比呈反比。聚集抗体百分比尤其可通过大小排阻色谱法(例如，大小排阻高效液相色谱法[SE-HPLC])来测定。当“可接受程度的稳定性”这个词组用于本文中时，表示至多6％的抗体于特定温度下储存特定时间量之后在制剂中检测到为聚集物形式。在某些实施方案中，可接受程度的稳定性表示至多约6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体于特定温度下储存特定时间量之后在制剂中检测到为聚集物形式。在其后测得稳定性的特定时间量可为至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更久。当评价稳定性时，药物制剂储存的特定温度可为约-80℃至约45℃的任一温度，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃或约45℃。例如，若在储存于5℃9个月之后，检测到少于约2％、1.75％、1.5％、1.25％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或0.1％抗体呈聚集形式，则药物制剂可被视为是稳定的。若在储存于25℃6个月之后，检测到少于约2％、1.75％、1.5％、1.25％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或0.1％抗体呈聚集形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于45℃28天之后，检测到少于约4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％、0.5％或0.1％抗体呈聚集形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于-20℃、-30℃或-80℃3个月之后，检测到少于约2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1％、0.5％或0.1％抗体呈聚集形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。

稳定性尤其可通过测定抗体在离子交换(“酸性形式”)期间移至比抗体主要级分(“主要电荷形式”)更为酸性的级分的百分比来测量，其中稳定性与呈酸性形式的抗体级分呈反比。尽管不希望受到理论所限制，抗体的去酰胺化可使得抗体变为更加带负电并因而相对于非去酰胺化抗体更为酸性(参见，例如Robinson，N.，Protein Deamidation，PNAS，2002年4月16日，99(8)：5283-5288)。“酸化”抗体百分比尤其可通过离子交换色谱(例如，阳离子交换高效液相色谱法[CEX-HPLC])测定。当“可接受程度的稳定性”这个词组用于本文中时，表示于特定温度下储存特定时间量之后在制剂中至多52％抗体呈更为酸性的形式。在某些实施方案中，可接受程度的稳定性表示于特定温度下储存特定时间量之后在制剂中至多约52％、50％、45％、40％、35％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体被检测呈酸性形式。其后测量稳定性的特定时间量可为至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更久。当评价稳定性时，储存药物制剂的温度可为约-80℃至约45℃的任一温度，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃或约45℃。例如，若在储存于-80℃、-30℃或-20℃3个月之后，少于约29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体呈更为酸性的形式，则药物制剂可被视为是稳定的。若在储存于5℃9个月之后，少于约28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体呈更为酸性的形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于25℃28天后，少于约30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体呈更为酸性的形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于37℃28天之后，检测到少于约37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体呈更为酸性的形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于45℃28天之后，检测到少于约52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体呈更为酸性的形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。

测量抗体对其靶标的结合亲和力亦可用于评价稳定性。例如，若在储存于例如-80℃、-30℃、-20℃、5℃、25℃、37℃、45℃等温度下特定时间期限(例如14天至6个月)之后，制剂中所含抗Ang-2抗体以储存前该抗体结合亲和力的至少84％、90％、95％或更高结合至Ang-2，则本发明制剂可被视为是稳定的。结合亲和力可通过任意方法、例如ELISA或等离子体共振来测定。生物活性可通过Ang-2活性测定(诸如，例如使表达Ang-2的细胞与包含抗Ang-2抗体的制剂接触)来测定。抗体结合至这类细胞可直接通过诸如，例如经由FACS分析来测定。或者，可在抗体存在下测定Ang-2系统的下游活性，并且与抗体不存在时Ang-2系统的活性相比较。在一些实施方案中，Ang-2对细胞来说是内源性的。在其它实施方案中，Ang-2在细胞中异位地表达(即，异源表达)。

在下文提供的实施例中显示了用于评价抗体在制剂中的稳定性的另外的方法。

容器和施用方法

各种递送系统是已知的，并且可以用于施用本发明的药物组合物，例如在脂质体中的包封、微粒、微囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见，例如Wu等人，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)。施用方法包括、但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述组合物可以通过任意便利的途径施用，例如，通过输注或快速浓注，通过经上皮或粘膜皮肤衬里吸收(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)并且可以与其它生物活性剂一起施用。

为了治疗眼睛障碍，本发明的药物制剂可以例如通过滴眼剂、结膜下注射、结膜下植入物、玻璃体内注射、玻璃体内注植入物、特农囊下(sub-Tenon)注射或特农囊下植入物来施用。

本发明的药物组合物可以用标准针和注射器经皮下或静脉内递送。此外，关于皮下递送，笔递送装置便利地用于递送本发明的药物组合物。这类笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置通常使用包含药物组合物的可替换的药筒。一旦药筒中的所有药物组合物已被施用并且药筒是空的，则空的药筒可以容易地被丢弃，并且被包含药物组合物的新药筒替代。然后可以重复使用笔递送装置。在一次性笔递送装置中，没有可更换的药筒。相反，一次性笔递送装置预先填充保存在该装置内的储库中的药物组合物。一旦储库清空了药物组合物，则整个装置被丢弃。

在某些情况下，所述药物组合物可以在受控释放系统中被递送。在一个实施方案中，可以使用泵。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料；参见Medical Applications ofControlled Release，Langer和Wise(eds.)，1974，CRC Pres.，Boca Raton，Florida。在另一个实施方案中，可以将控释系统放置在组合物的靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如Goodson，1984，在Medical Applications of Controlled Release中，同上，第2卷，第115-138页)。其它控释系统在Langer，1990，Science 249：1527-1533的综述中进行了讨论。

注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些注射制剂可以通过已知方法制备。例如，可以制备注射剂制剂，例如通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射剂的无菌水性介质或油性介质中来进行。作为注射用水性介质，例如可以使用生理盐水、包含葡萄糖等辅助剂等的等渗溶液等，它们可以与适合的增溶剂组合使用，例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如聚山梨酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。作为油性介质，例如使用芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂组合使用，例如苯甲酸苄酯、苯甲醇等。优选将由此制备的注射剂填充在适当的安瓿中。

有利地，可以将上述用于口服或肠胃外使用的药物组合物制备成以适合于符合活性成分的剂量的单位剂量的剂型。单位剂量的这类剂型包括，例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)，栓剂等。

本发明药物制剂可包含在任一种适于储存或施用药物及其它治疗性组合物的容器中。例如，药物制剂可包含在密封与灭菌的具有预定体积的塑料或玻璃容器中，例如小瓶、安瓿、注射器、药筒、瓶子或IV袋中。不同类型的小瓶可用于包含本发明的制剂，包括，例如透明与不透明(例如琥珀色)玻璃或塑料小瓶。同样地，任何类型的注射器可用于包含或施用本发明的药物制剂。

本发明的药物制剂可包含在“标准钨”注射器或“低钨”注射器中。如本领域技术人员可以理解的，制造玻璃注射器的工艺通常涉及使用热钨杆(其作用为刺穿玻璃)，从而由其产生一个液体可被抽出并排出注射器的孔洞。此工艺使微量钨沉积在注射器的内表面。之后的洗涤与其它加工步骤可用于降低钨在注射器中的量。如本文所用，术语“标准钨”表示注射器包含超过或等于每十亿份中有500份(ppb)的钨。术语“低钨”表示注射器包含少于500ppb的钨。例如，根据本发明，低钨注射器可包含少于约490、480、470、460、450、440、430、420、410、390、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或更低ppb的钨。

注射器中所使用的橡胶塞盖，以及用于密封小瓶开口的橡胶瓶盖可被涂敷以防止注射器或小瓶的药物内容物污染，或维持其稳定性。因此，根据一些实施方案，本发明药物制剂可包含在具有经涂敷塞盖的注射器内，或在以经涂敷橡胶瓶盖密封的小瓶内。例如，塞盖或瓶盖可涂敷有氟碳化合物膜。适用于与包含本发明药物制剂的小瓶及注射器一起使用的经涂敷的塞盖或瓶盖的实例在如下文献中举出：例如，美国专利第4,997,423号；第5,908,686号；第6,286,699号；第6,645,635号及第7,226,554号，其内容以其整体并入本文做为参考。可用于本发明上下文内的特定示例性经涂敷的橡胶瓶盖与塞盖可在商业上以商标名由West Pharmaceutical Services，Inc.(Lionville，PA)取得。是一种用于使药品尽可能不附着于橡胶表面或防止药品附着于橡胶表面的氟碳化合物涂层。

根据本发明的一些实施方案，药物制剂可包含于含有经氟碳化合物涂敷的塞盖的低钨注射器内。

药物制剂可以通过非经胃肠外途径施用于患者，例如注射(例如皮下、静脉内、肌内、腹膜内等)，或经皮、粘膜、鼻、肺或口服施用。许多可重复使用笔型或自动注射递送装置可用于皮下递送本发明的药物制剂。实例包括、但不限于AUTOPEN^TM(Owen Mumford，Inc.，Woodstock，UK)、DISETRONIC^TM笔(Disetronic Medical Systems，Bergdorf，Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25^TM笔、HUMALOG^TM笔、HUMALIN 70/30^TM笔(Eli Lilly和Co.，Indianapolis，IN)、NOVOPEN^TM I、II与III(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、NOVOPENJUNIOR^TM(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、BD^TM笔(Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ)、OPTIPEN^TM、OPTIPEN PRO^TM、OPTIPEN STARLET^TM、以及OPTICLIK^TM(sanofi-aventis，Frankfurt，Germany)。具有在皮下递送本发明药物制剂应用的一次性笔型或自动注射递送装置的实例包括、但不限于SOLOSTAR^TM笔(sanofi-aventis)、FLEXPEN^TM(NovoNordisk)以及KWIKPEN^TM(Eli Lilly)、SURECLICK^TM自动注射器(Amgen，Thousand Oaks，CA)、PENLET^TM(Haselmeier，Stuttgart，Germany)、EPIPEN(Dey，L.P.)、以及HUMIRA^TM Pen(Abbott Labs，Abbott Park，IL)。

在本文中亦预期使用微输注器递送本发明的药物制剂。如本文所用，术语“微输注器”表示被设计成在一段长时间内(例如约10、15、20、25、30或更多分钟)缓慢地施用大体积(例如多达约2.5mL或更多)治疗制剂的皮下递送装置。参见，例如U.S.6,629,949；US 6,659,982以及Meehan等人，J.Controlled Release 46：107-116(1996)。微输注器尤其可用于递送大剂量的治疗性蛋白(以高浓度(例如约100、125、150、175、200或更多mg/mL)范围内包含)或粘性溶液。

在一个实施方案中，通过IV滴注施用所述药物制剂，使得将该制剂稀释在包含生理学可接受的溶液的IV袋中。在一个实施方案中，药物组合物是在静脉注射袋中的混合的无菌制剂，使得将药物产品的单剂量稀释入100mL、250mL(或另外类似的用量，其适合于静脉滴注递送)的生理缓冲液(例如0.9％盐水)。在一些实施方案中，输注袋由聚氯乙烯制成(例如VIAFLEX，Baxter，Deerfield，Illinois)。在一些实施方案中，输注袋由聚烯烃制成(EXCEL IV Bags，Braun Medical Inc.，Bethlehem，Pennsylvania)。

在一些实施方案中，包含10mg/mL-120mg/mL的抗Ang-2抗体的液体制剂被包含在预装注射器中并且通过玻璃体内以至多约100μL的体积施用。在一些实施方案中，包含10mg/mL-120mg/mL的抗Ang-2抗体和10mg/mL-100mg/mL的阿帕西普的液体制剂被包含在预装注射器中并且通过玻璃体内以至多约100μL的体积施用。在一些实施方案中，包含10mg/mL-120mg/mL的抗Ang-2抗体和10mg/mL-100mg/mL的阿帕西普组成的液体制剂被包含在预装注射器中并且通过玻璃体内以至多约500μL的体积施用。在一些实施方案中，包含60mg/mL-120mg/mL的抗Ang-2抗体和40mg/mL的阿帕西普的液体制剂在预装注射器中并且通过玻璃体内以至多约500μL的体积施用。在一个实施方案中，注射器为2mL长的玻璃注射器，其配备30-号薄壁针头、碳氟化合物涂敷的橡胶塞和橡胶针罩。在一个实施方案中，注射器为1mL长的玻璃注射器，其配备30-号薄壁针头、碳氟化合物涂敷的橡胶塞和橡胶针罩。

施用方案

本发明包括方法，其包含给个体施用包含抗Ang-2抗体的药物组合物，其施药频率约为每周4次、每周2次、每周1次、每2周1次、每3周1次、每4周1次、每5周1次、每6周1次、每8周1次、每12周1次、或更低频率，只要治疗响应得以实现。在一些实施方案中，所述方法涉及施用包含抗Ang抗体-2与VEGF拮抗剂的药物组合物，其施药频率约为每周4次、每周2次、每周1次、每2周1次、每3周1次、每4周1次、每5周1次、每6周1次、每8周1次、每9周1次、每12周1次、或更低频率，只要治疗响应得以实现。

根据本的发明一些实施方案，可以将多剂量的抗Ang-2抗体在定义的时间过程内施用于个体。本发明该方面的方法包含对个体依次施用多剂量的抗Ang-2抗体。如本文所用，“依次施用”是指在不同时间点对个体施用每种剂量的抗Ang抗体，例如在不同天以预定间隔(例如小时、天、周或月)分开施用。本发明包括方法，其包含对患者依次施用单一初始剂量的抗Ang抗体-2，随后施用一个或多个二次剂量的抗Ang-2抗体，且任选地随后施用一个或多个第三次剂量的抗Ang-2抗体。

根据本发明的一些实施方案，可以将多剂量的包含抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂的联用制剂在定义的时间过程内施用于个体。本发明该方面的方法包含对个体依次施用多剂量的包含抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂的联用制剂。如本文所用，“依次施用”是指在不同时间点对个体施用每种剂量的抗Ang抗体与VEGF拮抗剂，例如在不同天以预定间隔(例如小时、天、周或月)分开施用。本发明包括方法，其包含对患者依次施用单一初始剂量的包含抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂的联用制剂，随后施用一个或多个二次剂量的共同配制的抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂，且任选地随后施用一个或多个第三次剂量的共同配制的抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂。

术语“初始剂量”、“二次剂量”和“第三次剂量”指的是施用的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也被称为“基线剂量”)；“二次剂量”是在初始剂量后施用的剂量，且“第三次剂量“是在二次剂量后施用的剂量。初始、二次和第三次剂量均可以包含相同量的抗Ang-2抗体(或包含抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂的联用制剂)，但通常在施用频率方面彼此不同。然而，在一些实施方案中，初始、二次和/或第三次剂量中包含的量在治疗期间彼此可变(例如如果适合上调或下调)。在一些实施方案中，在治疗方案开始时将一个或多个(例如1、2、3、4或5个)剂量作为″负荷剂量″施用，随后基于较低频率施用后续剂量(例如″维持剂量″)。例如，可以对具有眼病或眼障碍的患者施用抗Ang-2抗体(或包含抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂的联用制剂)，所施用的负荷剂量约为6mg，随后施用一个或多个约0.5mg-约10mg的维持剂量。

在本发明的一个示例性的实施方案中，在紧接在前的剂量后1-14(例如1、1¹/₂、2、2¹/₂、3、3¹/₂、4、4¹/₂、5、5¹/₂、6、6¹/₂、7、7¹/₂、8、8¹/₂、9、9¹/₂、10、10¹/₂、11、11¹/₂、12、12¹/₂、13、13¹/₂、14、14¹/₂或更多)周施用每个二次和/或第三次剂量。如本文所用，措词″紧接在前的剂量″是指在多次施用的顺序中，在每个下一次剂量施用前施用于患者的抗Ang-2抗体(或包含抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂的联用制剂)的剂量。

根据本发明该方面的方法可以包含对患者施用任意次数的二次和/或第三次剂量的抗Ang-2抗体(或包含抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂的联用制剂)。例如，在一些实施方案中，仅对患者施用单一二次剂量。在另外的实施方案中，对患者施用两个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)二次剂量。同样，在一些实施方案中，仅对患者施用单一第三次剂量。在另外的实施方案中，对患者施用两个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第三次剂量。

在涉及多个二次级剂量的实施方案中，将每个二次剂量可以以与另一个二次剂量相同的频率施用。例如，可以在紧接在前的剂量之后1至2周向患者施用每个二次剂量。类似地，在涉及多个第三次剂量的实施方案中，可以将每个第三次剂量以与另外的第三次剂量相同的频率施用。例如，可以在紧接在前的剂量之后2至4周向患者施用每个第三次剂量。或者，向患者施用二次和/或第三次剂量的频率可以在治疗方案过程中改变。施用频率也可以在治疗过程中根据临床检查后个体患者的需要由临床医师调整。

本发明包括方法，其包含对患者依次施用抗Ang-2抗体与VEGF拮抗剂，以便治疗DME或AMD。在一些实施方案中，本发明包含施用一个或多个剂量的抗Ang-2抗体，随后施用一个或多个剂量的VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，本方法包含施用单剂量的VEGF拮抗剂，随后施用一个或多个剂量的抗Ang-2抗体。在一些实施方案中，可以施用一个或多个剂量的约0.05mg-约2mg的VEGF拮抗剂，随后施用一个或多个剂量的约0.05mg-约10mg的Ang-2抑制剂。在一个实施方案中，可以施用一个或多个剂量的约1mg/kg-约15mg/kg个体体重的抗Ang-2抗体，此后，可以施用一个或多个剂量的VEGF拮抗剂以治疗、缓解、降低或改善与DME或AMD相关的一种或多种病症(例如血管发生抑制)。在一些实施方案中，以一个或多个剂量施用抗Ang-2抗体，导致一个或多个参数改善(例如视网膜增厚、视敏度)，随后施用VEGF拮抗剂(例如阿帕西普)以预防复发或具有累加活性。本发明的可选实施方案涉及伴随施用抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂，将其以相对于抗Ang-2抗体类似或不同的频率以单独剂量施用。在一些实施方案中，在抗Ang-2抗体之前、之后或与之同时施用VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，将VEGF拮抗剂作为与抗Ang-2抗体的单剂量制剂施用。

剂量

根据本发明方法施用于个体的Ang-2抑制剂(例如抗-Ang-2抗体)的量通常为治疗有效量。如本文所用，措词“治疗有效量”是指导致以下一种或多种情形的Ang-2抑制剂的量：(a)视网膜血管渗漏的严重性降低；(b)视网膜或脉络膜新血管形成的面积降低；(c)中央视网膜厚度变化；(d)眼中血管渗漏的抑制持续时间增加；和(e)具有与血管发生相关的眼病或眼障碍的个体中玻璃体内注射的次数减少。

就抗-Ang-2抗体而言，治疗有效量可以在约0.05mg-约100mg，例如约0.05mg、约0.1mg、约1.0mg、约1.5mg、约2.0mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg或约100mg的抗-Ang-2抗体。在一些实施方案中，施用0.5mg、1.0mg、3.0mg或6.0mg的抗Ang-2抗体。

各剂量中包含的Ang-2抑制剂的量用毫克抗体/千克患者体重(即mg/kg)来表示。例如，可以以约0.0001-约100mg/kg患者体重的剂量向患者施用Ang-2抑制剂。

在一些实施方案中，将0.5mg、1.0mg、3.0mg或6.0mg的抗Ang-2抗体与0.05mg-约10mg的VEGF拮抗剂(例如阿帕西普)联合施用。

实施例

提出下列实施例以将如何制造与使用本发明方法和组合物的完整揭示内容以及发明说明提供给本领域普通技术人员，且不欲限制发明人就其发明所视为的范畴。已尽力确保所用数字的正确性(例如数量、温度等)，但应当解释为某些实验误差与偏差。除非另有指明，否则份为以重量计，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，而压力为大气压或近乎大气压。

实施例1：VEGF和Ang2使用阿帕西普(VEGF Trap)和抗Ang2抗体对小鼠中的进行性视网膜血管发生的联合抑制作用

引言：VEGF是正常和病理性血管中的血管发生调节剂。然而，另外的生长因子也牵涉血管发生并且能够介导对抗-VEGF疗法的血管抗性。经证实血管生成素-2(Ang2)在不同情况中以背景依赖性方式牵涉血管生长和退化。在本研究中，我们测试了使用单独的阿帕西普和使用Ang2抑制剂与抗Ang2抗体对正常视网膜血管发育(RVD)模型中的血管生长和退化的VEGF阻滞作用。

如美国专利申请公开号US20110027286中所述生成人抗Ang-2抗体。用于本实施例和如下实施例的示例性抗Ang-2抗体是人抗Ang-2抗体，命名为H1H685，其具有SEQ ID NOs：1/2的HCVR/LCVR(本文也称作“mAb1”)。

在一个实验中，通过玻璃体内施用单独的抗Ang-2抗体或其与阿帕西普的组合。

方法：用单独或组合形式的阿帕西普和抗Ang2抗体从出生后第4天(P4)到P6治疗正常C57B1/6小鼠幼崽。在P4给幼崽IVT注射5μg对照蛋白(hFc)、5μg mAb1(抗Ang2抗体)或1.25μg阿帕西普，作为单一活性剂或阿帕西普和mAb1两者的混合物注射。在P6对幼崽实施人道地安乐死，取出眼并且用4％低聚甲醛固定。然后剖离视网膜并且用FITC标记的GS外源凝集素I染色(用于血管内皮细胞)。

结果：将P4选作使用mAb1治疗的起点，以便评价Ang2和/或VEGF对RVD的抑制作用。施用mAb1或阿帕西普与hFc治疗的对照组相比减少了表浅视网膜血管系统的过度生长。特别地，相对于对照组，mAb1和阿帕西普将视网膜的平均血管化面积分别减少了17％和36％，而使用mAb1和阿帕西普两者联合治疗将血管面积减少了72％，这表明在治疗期内完全阻止了视网膜血管的发展(与P4时的视网膜血管面积相比)。与hFc对照组相比，mAb1和阿帕西普还将平均血管长度分别减少了23％和22％。使用mAb1和阿帕西普联合治疗具有显著的协同作用，导致总血管生长显著地减少了77％。与P4视网膜相比，在联合治疗的样品中，总血管长度甚至减小25％。

在第二个实验中，当将每种药物作为单一活性剂使用时，所用的mAb1(25mg/kg，皮下[SC])和阿帕西普(25mg/kg，SC)的剂量超过了得到视网膜血管发生最大抑制作用所需的最低剂量。相对于hFc对照组，在P3时施用mAb1或阿帕西普将在P6时测定的视网膜的平均血管化面积分别减少了36％和42％。此外，与使用单独的活性剂相比，使用mAb1和阿帕西普两者治疗的动物中视网膜的平均血管化面积显著较小，为减少了68％，这表明在治疗期内接近完全阻止了视网膜血管发育。

结论：Ang2和VEGF-A的联合药理学抑制作用对发育的视网膜血管发生具有的作用大于单独施用Ang2或VEGF-A阻滞剂的作用，使得与在P4时的初始治疗情况相比，Ang2和VEGF-A两者的抑制作用导致在治疗期间视网膜血管发育和部分血管退化的接近完全的阻止。

实施例2：IVT注射共同配制的mAb1和阿帕西普对家兔眼中DL-α-氨基己二酸(DL-α-AAA)-诱导的视网膜新生血管化(RNV)的作用

神经胶质毒素DL-α-AAA靶向视网膜米勒细胞和星形细胞并且导致新生血管形成和慢性血管渗漏，持续至少12个月(Kato等人1993；Neuroscience 57：473)。本研究的目的在于评价IVT注射共同配制的抗Ang2和阿帕西普对于DL-α-AAA诱导的RNV的作用。

方法：采用单一玻璃体内注射DL-α-AAA处理雄性新西兰白色家兔(＞2kg体重)以诱导RNV。使用荧光素血管造影术(FA)以非侵害性方式监测和定量渗漏。在注射后13周内建立病理性血管系统和相对不变的渗漏区。在疾病建立时，将个体分成用于治疗的3个组，如下所示：

I组：125μg/50μl的阿帕西普IVT

II组：500μg/50μl的mAb1 IVT

III组：共同配制的125μg阿帕西普和500μg mAb1/50μl，IVT

在第一次治疗之前进行基线检查以平衡治疗组。在IVT治疗后第1、2、3、4、5、6、7和8周进行随访检查。在荧光素血管造影(FA)分析后，使用Adobe Photoshop量化渗漏面积。静脉施用荧光剂以监测血管渗漏，并使用眼协调性体层摄影术来监测视网膜结构。

结果：如图1所示，在阿帕西普治疗的个体中，在第3周显示出渗漏，而在用mAb1和阿帕西普组合治疗的个体中，渗漏区域直到第8周才改变。阿帕西普和mAb1的联合治疗可以显著地增加抗-渗漏作用期限，与单独的单一IVT注射阿帕西普相比高达3倍。

实施例3：对DL-AAA诱导的家兔眼视网膜新血管渗漏的单独的mAb1全身施用或与VEGF Trap-Eye IVT共同治疗

本研究的目的在于评价抗Ang2抗体和阿帕西普共同治疗对DL-α-AAA诱导的RNV的影响，其中阿帕西普的玻璃体内施用之后是全身施用mAb1。本研究的原理在于尝试和维持在较长时间内抑制渗漏，首先注射阿帕西普，且随后在两周(q2w)的抗Ang 2抗体中进行1次全身注射。

如实施例2中所公开的，在单次玻璃体内注射DL-α-AAA的雄性新西兰雄性家兔中诱导视网膜新生血管化。稳定的视网膜新生血管化和血管渗漏建立在诱导后10周。疾病建立10周后，将个体分为具有平均渗漏严重程度的4组，且如下所示施用治疗：

1组：对照品42μg/50μl、IVT和对照品5mg/kg，IV，q2w

2组：对照品42μg/50μl、IVT和mAb1(抗Ang2ab)15mg/kg，IV，q2w

3组：阿帕西普125μg/50μl、IVT和对照品5mg/kg，IV，q2w

4组：阿帕西普125μg/50μl、IVT和mAb1(a-Ang2)15mg/kg，IV，q2w

在第一次治疗之前、随访FA和IV治疗后第1、2、3、4、6、8、10、12和14周OCT，通过荧光素血管造影术(FA)、基线荧光素血管造影术(FA)和光学相干体层摄影术(OCT)分析渗漏面积。

如图2所示，在第2周阿帕西普治疗的眼中没有渗漏。仅在阿帕西普治疗的第4周显示出恢复渗漏。然而，用阿帕西普和mAb1组合治疗的个体在第10周之前没有发生渗漏。联合治疗的个体在第12周显示初次恢复的渗漏。

实施例4：针对DL-α-AAA诱导的RNV和兔眼中的血管渗漏的阿帕西普IVT注射

本研究是对IVT阿帕西普单一疗法对家兔眼中DL-α-AAA诱导的视网膜新生血管化(RNV)和血管渗漏的影响的剂量范围研究。如实施例2中所公开的，使用DL-α-AAA诱导家兔眼中的RNV。在建立RNV和血管渗漏时，用4种剂量的阿帕西普治疗个体：50mcg、125mcg、250mcg和500mcg。视网膜血管泄漏通过FA(如本文其它地方所公开)在IVT后第1、2、3、4、5、6、8、10和12周在随访时间点进行监测和量化。

不进行治疗，FA显示视网膜NV和血管渗漏在第10周至第22周保持一致。表1显示治疗后的渗漏复发的平均时间，其中“第一次渗漏复发”＝任何渗漏复发、而非完全复发的时间。

表1：首次渗漏复发的平均时间

IVT VTE剂量	平均值(周)	STD(周)	范围(周)
				500mcg(n＝4)	9	2	8-12
250mcg(n＝3)	6.3	1.5	5-8
				125mcg(n＝2)	4.5	0.7	4-5
50mcg(n＝2)	2.5	0.7	2-3

阿帕西普500mcg在1周内阻断视网膜NV泄漏，并且在治疗后第12周内没有恢复渗漏。因此，阿帕西普治疗导致血管渗漏的抑制和新生血管形成的部分消退。血管渗漏重新发生，但抑制期限是剂量依赖性的。

实施例5：抗Ang-2抗体的全身施用抑制大鼠中的基质胶-诱导的脉络膜新生血管化(CNV)

引言：Ang2是酪氨酸激酶受体Tie-2的配体，并且在发育中的血管的血管内皮中以及在不同生理和病理生理条件下经历主动生长或重塑的血管中被广泛表达。mAb1是针对Ang-2的人单克隆中和抗体。本研究使用脉络膜新生血管化(CNV)的大鼠模型来评价mAb1介导的Ang-2对CNV的药理学抑制的抑制效应。

方法：在第0天通过视网膜下注射基质胶在Sprague Dawley(SD)大鼠中诱导CNV。使用一组动物(动物：N＝4-6；眼：N＝8-12)建立基线，并且在CNV诱导后10天，用染料[1，1′-二十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐(DiI))灌注动物以便染色血管。将其它动物分成2组(动物：N＝5-6和眼睛：N＝10-12，在每组中)，并在第10、13和16天以相对于mAb1等摩尔量分别通过皮下注射25mg/kg mAb1或6.5mg/kg hFc用掩蔽溶液处理，随后在第20天用DiI灌注以便染色血管。使用如下公式在整个损害中定量50μm切片的视网膜损伤和CNV血管体积：

其中V：总损伤体积；

T：切片厚度；

A：每个切片上的损害或血管面积

将来自两个相同实验的结果合并用于3组之间的损伤体积、血管体积和血管密度比较。使用双尾斯氏t检验来比较用mAb1治疗的组与对照组之间的损害体积、血管容积和血管密度的差异。使用直接酶联免疫吸附测定(ELISA)测量大鼠血清中功能性mAb1的浓度和抗-mAb1抗体水平。

结果：与hFc处理的对照组相比，向SD大鼠全身施用mAb1(25mg/kg)对总损伤体积和血管容积产生抑制作用(图3)。在对照治疗组中，相对于第10天时的基线，到第20天时，视网膜下损伤体积、新血管体积和新生血管密度分别提高了28.2％、62.5％和28.6％。与hFc治疗组相比，mAb1治疗组显示总损伤体积减少了26.5％且血管容积减少了26.9％，不过，血管密度与hFc治疗组相比未改变(图3)。与hFc治疗对照组相比，mAb1治疗组显示总损伤体积具有统计学显著性的降低(斯氏t检验，p＝0.0034)和倾向于新血管体积减小的趋势(26.9％)，但这一趋势未达到统计学显著性(斯氏t检验，p＝0.1658，可能归因于该组内的变异值)。大鼠血清样品中功能性mAb1和抗-mAb1抗体的生物分析显示在最终日期(第20天)mAb1处理的动物中功能性mAb1的可测量浓度水平为504±107μg/mL(表2)。单个抗-mAb1响应为阴性。

表2：mAb1和抗-mAb1抗体在大鼠血清样品中的浓度

BLQ：低于定量限(＜0.078μg/mL)

(-)：抗体阴性

结论：在SD大鼠中，在基质胶诱导的CNV中评价mAb1即一种中和人单克隆抗体对Ang2的作用。结果表明，用mAb1进行全身(皮下)治疗可显著地抑制大鼠中基质胶诱导的CNV损害。因此，本实施例为使用Ang-2抑制剂(例如mAb1)作为系统性单一疗法治疗血管性眼病提供了额外的支持。

实施例6：包含抗Ang-2抗体的制剂

制剂开发活动包括在抗Ang-2抗体的液体制剂中筛选缓冲液、有机共溶剂和热稳定剂，以鉴定增强蛋白质稳定性的赋形剂。还检查缓冲液条件以确定用于最大蛋白质稳定性的最佳pH。使用这些研究产生的结果用于开发适合于临床使用的稳定的液体制剂。抗Ang-2抗体是在美国专利申请公开US20110027286中具有SEQ ID NO：1/2的HCVR/LCVR的人抗Ang-2抗体，并称为H1H685(本文也称为“mAb1”)。

抗Ang-2抗体以四种浓度配制：

(i)10mg/mL±1.5mg/mL，

(ii)20mg/mL±3.0mg/ml，

(iii)60mg/mL±9.0mg/mL，和

(iv)120mg/mL±18.0mg/mL。

在不同的实施方案中，用10±1.5mM磷酸钠(pH 6.2±0.3)、0.03％±0.0045％聚山梨醇酯20、40mM±6.0mM氯化钠和5％±0.75％蔗糖在水中配制抗Ang-2抗体。

使用以下测定评价配制的药物物质和药物产品的稳定性：

通过如下方式检查颜色和外观：视觉检查；pH；通过在405nm处的光密度的增加测量的浊度；通过微流成像(MFI)的可见以下(subvisible)的颗粒分析；通过RP-HPLC的蛋白质浓度；通过大小排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)的纯度；还原和非还原性SDS-PAGE；通过阳离子交换UPLC的带电荷的变体分析；通过生物测定的效能。附加细节在实施例8中有描述。

开始稳定性研究以确定10mg/mL mAb1和120mg/mL mAb1 FDS的研究批次的储存、加速(高于储存条件的温度)和压力(搅拌和冷冻和融化)稳定性。选择这些条件以包括用于制造临床DP的FDS的蛋白质浓度。在加速和应激条件下对FDS的研究批次的评价通过对FDS进行各种测试来进行，所述测试是为超过FDS在制造DP期间可能遇到的压力并阐明mAb1FDS的降解途径设计。将FDS填充在5mL聚碳酸酯小瓶中。

药物物质的研究稳定性如表3和4所示：

表3：mAb1配制的药物物质的研究稳定性研究

表4：用于mAb1配制的药物物质的研究稳定性研究的分析计划

将稳定性研究的结果概括在下表5-14中：

表5：储存在-80℃的10mg/mL mAb1配制的药物物质的研究稳定性

表6：储存在-30℃的10mg/mL mAb1配制的药物物质的研究稳定性

表7：储存在-20℃的10mg/mL mAb1配制的药物物质的研究稳定性

表8：储存在-80℃的120mg/mL mAb1配制的药物物质的研究稳定性

表9：储存在-30℃的120mg/mL mAb1配制的药物物质的研究稳定性

表10：储存在-20℃的120mg/mL mAb1配制的药物物质的研究稳定性

表11：10mg/mL mAb1配制的药物物质的研究稳定性-加速条件的作用

表12：120mg/mL mAb1配制的药物物质的研究稳定性-加速条件的作用

表13：10mg/mL mAb1配制的药物物质的研究稳定性-压力条件的作用

表14：120mg/mL mAb1配制的药物物质的研究稳定性-压力条件的作用

如表15和16中所示对mAb1药物产品进行研究稳定性研究：

表15：mAb1药物产品的研究稳定性研究

表16：用于mAb1药物产品的研究稳定性研究分析计划

将药物产品的稳定性研究结果概括在表17-22中：

表17：储存在5℃的10mg/mL mAb1药物产品的研究稳定性

表18：储存在5℃的120mg/mL mAb1药物产品的研究稳定性

表19：10mg/mL mAb1药物产品的研究稳定性-加速条件的作用

表20：120mg/mL mAb1药物产品的研究稳定性-加速条件的作用

表21：mAb1(10mg/mL)药物产品的研究稳定性-压力条件的作用

表22：mAb1(120mg/mL)药物产品的研究稳定性-压力条件的作用

稳定性研究结果表明：

当储存在≤-20℃至少12个月时，配制的药物物质(FDS)10mg/mL mAb1是稳定的。

当储存在≤-20℃至少12个月时，FDS 120mg/mL mAb1是稳定的。

在5℃温育56天后，FDS 10mg/mL mAb1在物理和化学方面都是稳定的，且在5℃温育56天或在25℃/60％相对湿度(RH)和在40℃/75％RH温育28天时，维持效能。

在5℃温育56天后，FDS 120mg/mL mAb1在物理和化学方面都是稳定的，且在5℃温育56天或在25℃/60％相对湿度(RH)和在40℃/75％RH温育28天时，维持效能。

当搅拌(在环境温度下涡旋)120分钟或当经历8个冷冻/融化循环(在-30℃冷冻并且在室温融化)时，10mg/mL mAb1 FDS在物理和化学方面都保持稳定。在任意监测的属性中均未检测到可感觉到的物理或化学稳定性改变。当搅拌(在环境温度下涡旋)120分钟或当经历8个冷冻/融化循环(在-30℃冷冻并且在室温融化)时，mAb1维持效能。

当搅拌(在环境温度下涡旋)120分钟或当经历8个冷冻/融化循环(在-30℃冷冻并且在室温融化)时，120mg/mL mAb1 FDS在物理和化学方面都保持稳定。在任意监测的属性中均未检测到可感觉到的物理或化学稳定性改变。当搅拌(在环境温度下涡旋)120mg/mLmAb1 FDS 120分钟或当经历8个冷冻/融化循环(在-30℃冷冻并且在室温融化)时，mAb1维持效能。

当储存在2-8℃至少9个月时，药物产品(DP)10mg/mL mAb1是稳定的。

当储存在2-8℃至少9个月时，DP 120mg/mL mAb1是稳定的。

实施例7：包含抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂的联用制剂

联用制剂开发活动包括筛选在VEGF拮抗剂和抗Ang-2抗体的液体制剂中的缓冲液、有机共溶剂和热稳定剂，以鉴定增强蛋白质稳定的赋形剂。还检查缓冲条件以确定用于最大蛋白质稳定性的最佳pH。使用这些研究产生的结果用于开发适合于临床应用的稳定的液体制剂。VEGF拮抗剂由SEQ ID NO：11的氨基酸27-457组成的两种多肽的二聚体组成(本文也称作阿帕西普)。抗Ang-2抗体是在美国专利申请公开号US20110027286中具有SEQ IDNO：1/2的HCVR/LCVR的人抗Ang-2抗体并且命名为H1H685(本文也称为“mAb1”)。按照4种浓度将VEGF拮抗剂与抗Ang-2抗体共同配制：

(i)40mg/mL±6.0mg/mL阿帕西普与10mg/mL±1.5mg/mL mAb1；

(ii)40mg/mL±6.0mg/mL阿帕西普与20mg/mL±3.0mg/mL mAb1；

(iii)40mg/mL±6.0mg/mL阿帕西普与60mg/mL±9.0mg/mL mAb1；和

(iv)40mg/mL±6.0mg/mL阿帕西普与120mg/mL±18.0mg/mL mAb1。

在不同的实施方案中，用10±1.5mM磷酸钠(pH 6.2±0.3)、0.03％±0.0045％聚山梨醇酯20、40mM±6.0mM氯化钠和5％±0.75％蔗糖在水中共同配制抗Ang-2抗体和VEGF拮抗剂。

使用如本文实施例8中所述的测定法评价配制的药物物质和药物产品的稳定性。使用成像的毛细管等电聚焦(iCIEF)对配制的药物物质和药物产品进行电荷变异分析。

启动稳定性研究以便确定10mg/mL∶40mg/mL和120mg/mL∶40mg/mL(mAb1∶阿帕西普)FDS的研究批号的储存、加速(高于储存条件的温度)和压力(搅拌以及冷冻和融化)稳定性。选择这些条件以包括用于制备临床DP的FDS的蛋白质浓度。在加速和压力条件下对FDS的研究批号的评价通过使FDS经历各种测试来进行，所述测试是为超过FDS可能在DP制备过程中遇到的压力和为阐明mAb1∶阿帕西普FDS降解途经所设计的。将FDS填充在5mL聚碳酸酯小瓶中。

如表23和24中所示研究共同配制的药物物质的研究稳定性：

表23：mAb1：阿帕西普配制的药物物质的研究稳定性

表24：用于mAb1：阿帕西普配制的药物物质研究稳定性研究的分析计划

将共同配制的药物物质的稳定性结果概括在下表25-34中：

表25：储存在-80℃的mAb1∶阿帕西普(10mg/mL∶40mg/mL)配制的药物物质的研究稳定性

表26：储存在-30℃的mAb1∶阿帕西普(10mg/mL∶40mg/mL)配制的药物物质的研究稳定性

表27：储存在-20℃的mAb1∶阿帕西普(10mg/mL∶40mg/mL)配制的药物物质的研究稳定性

表28：在-80℃的mAb1∶阿帕西普(120mg/mL∶40mg/mL)配制的药物物质的研究稳定性

表29：储存在-30℃的mAb1∶阿帕西普(120mg/mL∶40mg/mL)配制的药物物质的研究稳定性

表30：储存在-20℃的mAb1∶阿帕西普(120mg/mL∶40mg/mL)配制的药物物质的研究稳定性

表31：mAb1∶阿帕西普(10mg/mL∶40mg/mL)配制的药物物质的研究稳定性-加速条件的作用

表32：mAb1∶阿帕西普(120mg/mL∶40mg/mL)配制的药物物质的研究稳定性-加速条件的作用

表33：mAb1∶阿帕西普(10mg/mL∶40mg/mL)配制的药物物质的研究稳定性-压力条件的作用

表34：mAb1∶阿帕西普(120mg/mL∶40mg/mL)配制的药物物质的研究稳定性-压力条件的作用

如表35和36中所示研究共同配制的药物产品的稳定性：

表35：mAb1∶阿帕西普药物产品的研究稳定性研究

表36：用于mAb1∶阿帕西普药物产品的研究稳定性研究分析计划

将共同配制的药物产品的稳定性结果概括在下表37-42中：

表37：储存在5℃的mAb1∶阿帕西普(10mg/mL∶40mg/mL)药物产品的研究稳定性

表38：储存在5℃的mAb1∶阿帕西普(120mg/mL∶40mg/mL)药物产品的研究稳定性

表39：mAb1∶阿帕西普(10mg/mL∶40mg/mL)药物产品的研究稳定性-加速条件的作用

表40：mAb1∶阿帕西普(120mg/mL∶40mg/mL)药物产品的研究稳定性-加速条件的作用

表41：mAb1∶阿帕西普(10mg/mL∶40mg/mL)药物产品的研究稳定性-压力条件的作用

表42：mAb1∶阿帕西普(120mg/mL∶40mg/mL)药物产品的研究稳定性-压力条件的作用

稳定性研究的结果表明：

当储存在≤-20℃至少12个月时，配制的药物物质(FDS)10∶40mg/mL mAb1∶阿帕西普是稳定的。

当储存在≤-20℃至少12个月时，FDS 120∶40mg/mL mAb1∶阿帕西普是稳定的。

在5℃温育56天或在25℃/60％RH温育28天后，10mg/mL∶40mg/mL mAb1∶阿帕西普FDS在物理和化学方面均是稳定的。在任何监测的属性方面均未检测到的可感觉到的物理或化学稳定性改变。当将10mg/mL∶40mg/mL FDS在5℃温育56天或在25℃/60％RH温育28天时，mAb1和阿帕西普均维持效能。

在5℃温育56天后，120mg/mL∶40mg/mL mAb1∶阿帕西普FDS在物理和化学方面均是稳定的。在任何监测的属性方面均未检测到的可感觉到的物理或化学稳定性改变。在25℃/60％RH温育28天后，120mg/mL∶40mg/mL FDS在物理方面是稳定的。在任何监测的属性方面均未检测到的可感觉到的物理或化学稳定性改变。当将120mg/mL∶40mg/mL FDS在5℃温育56天或在25℃/60％RH温育28天时，mAb1和阿帕西普均维持效能。

当搅拌(在环境温度下涡旋)120分钟或当经历8个冷冻/融化循环(在-30℃冷冻和在室温下融化)时，10mg/mL∶40mg/mL mAb1∶阿帕西普FDS在物理和化学方面是稳定的。在任何监测的属性方面均未检测到的可感觉到的物理或化学稳定性改变。当搅拌(在环境温度下涡旋)10mg/mL∶40mg/mL FDS 120分钟或当其经历8个冷冻/融化循环(在-30℃冷冻和在室温下融化)时，mAb1和阿帕西普维持效能。

当搅拌(在环境温度下涡旋)60分钟或当经历8个冷冻/融化循环(在-30℃冷冻和在室温下融化)时，10mg/mL∶40mg/mL mAb1∶阿帕西普FDS在物理和化学方面是稳定的。在任何监测的属性方面均未检测到的可感觉到的物理或化学稳定性改变。尽管当搅拌(在环境温度下涡旋)FDS 120分钟时观察到0.9％的高分子量种类增加(SE-UPLC)，但是在任意监测的另外的属性方面均未检测到可感觉到的改变。120分钟涡旋搅拌是极端的压力，且搅拌在制备过程中对于120mg/mL∶40mg/mL mAb1∶阿帕西普FDS是最少的。当搅拌(在环境温度下涡旋)10mg/mL∶40mg/mL mAb1∶阿帕西普FDS 120分钟或当其经历8个冷冻/融化循环(在-30℃冷冻和在室温下融化)时，mAb1和阿帕西普维持效能。

当储存在2-8℃至少9个月时，药物产品(DP)10∶40mg/mL mAb1∶阿帕西普是稳定的。

当储存在2-8℃至少9个月时，DP 120∶40mg/mL mAb1∶阿帕西普是稳定的。

实施例8：用于评价制剂稳定性的方法

采用如下测定法评价mAb1和mAb1∶阿帕西普FDS和DP的研究稳定性：通过视觉检查的颜色和外观；pH；根据在405nm处光密度(OD)增加确定的浊度；通过微流成像(MFI)确定的对DP进行的可见以下的颗粒分析；通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定的蛋白质浓度。

通过如下测定法评价纯度：大小排阻超效能液相色谱法(SE-UPLC)；还原性和非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。

通过如下测定法评价电荷变异分析：对mAb1 FDS和DP进行的阳离子交换UPLC(CEX-UPLC)；对mAb1和mAb1∶阿帕西普FDS和DP进行的成像毛细管等电聚焦(iCIEF)。

通过对mAb1制剂中的mAb1和对mAb1∶阿帕西普制剂中mAb1和阿帕西普进行的生物测定评价效能。使用生物测定法测定每种样品的相对效能并且定义为：(IC₅₀参比样品/IC₅₀样品)＊100％。储存稳定性样品的测定效能必须在参比标准品测定的效能的50-150％范围内。

制剂的物理稳定性是例如颜色、外观、pH、浊度和蛋白质浓度这样的特性。可以通过视觉检查检测溶液中可见的颗粒的存在。如果为澄清至适度乳光、尤其是不含可见颗粒且无色至淡黄色，则溶液通过视觉检查。通过在405nm处OD的增加测定的浊度也可以用于检测溶液中的颗粒。在405nm处OD的增加可以表示存在颗粒、乳光增加或测试制品的颜色改变。MFI用于测定大小≥2μm的可见以下的颗粒。通过RP-HPLC测定法测定蛋白质浓度并且报道为相对于原料的蛋白质中回收百分比。在RP-HPLC测定中，在从反相柱上洗脱后，从单一阿帕西普峰中拆分单一mAb1峰。通过比较mAb1峰面积采用mAb1标准品生成的校准曲线确定mAb1浓度，而通过比较阿帕西普峰面积与采用阿帕西普标准品生成的校准曲线确定阿帕西普浓度。分别基于测定的mAb1或阿帕西普浓度计算相对于起始mAb1或阿帕西普浓度回收百分比。

化学稳定性是指蛋白质的共价修饰的形式(例如共价聚集物、裂解产物或电荷变异形式)和非共价修饰形式(例如非共价聚集物)形成。可以采用SE-UPLC和SDS-PAGE从天然分子量产物中分离较高和较低分子量的降解产物。根据全部非天然峰的面积相对于全部mAb1峰的总面积之比计算SE-UPLC方法中降解的mAb1的百分比。通过非还原性和还原性SDS-PAGE测定的mAb1纯度根据主峰带强度与全部带的总强度之比计算。采用iCIEF和CEX-UPLC拆分mAb1的电荷变异形式。在这些方法中，将聚焦于低于主峰的pI的峰标记为“酸性”峰，而将聚焦于高于主峰的pI的峰标记为“碱性”峰。

通过SE-UPLC采用总分子量纯度表征mAb1∶阿帕西普制剂(天然mAb1+天然阿帕西普)(即mAb1和阿帕西普的分子量纯度并非单独测定)，因为mAb1和阿帕西普天然种类不能完全彼此拆分。类似地，采用总HMW种类(mAb1 HMW+阿帕西普HMW)和总LMW种类(mAb1 LMW+阿帕西普LMW)表征mAb1∶阿帕西普制剂，因为mAb1 HMW种类不能从阿帕西普HMW种类中拆分并且mAb1 LMW种类不能从阿帕西普LMW种类中拆分。

采用SE-UPLC方法测定的mAb1∶阿帕西普中总HMW种类或总LMW种类的百分比根据总HMW种类或总LMW种类的面积分别与全部mAb1∶阿帕西普峰的总面积之比来计算。通过非还原性和还原性SDS-PAGE测定的纯度根据(阿帕西普主峰带+mAb1主峰带)强度与全部带的总强度之比来计算。阿帕西普是包含高水平唾液酸的高度糖基化的蛋白质。作为阿帕西普上复杂电荷分布的结果，CEX-UPLC方法不具有足够的分离全部电荷变异形式的分辨率且由此用于测定mAb1∶阿帕西普样品的电荷变异分布改变。仅采用iCIEF拆分mAb1∶阿帕西普内共同配制的mAb1和阿帕西普的电荷变异形式。

对于Ab1，将聚焦于低于主峰的pI的峰标记为“酸性”峰，而将聚焦于高于主峰的pI的那些标记为“碱性”峰。对于阿帕西普，峰3-8是主峰，且标记为“主”峰。将聚焦于低于峰3的pI的阿帕西普峰标记为“酸性”峰，而将聚焦于高于峰8的pI的那些标记为“碱性”峰。

实施例9：mAb1、mAb1∶阿帕西普和阿帕西普制剂的储存稳定性比较

将得自评价10mg/mL mAb1、120mg/mL mAb1和40mg/mL阿帕西普的研究制剂的储存稳定性的SE-UPLC结果与来自mAb1∶阿帕西普(10mg/mL∶40mg/mL)和(120mg/mL∶40mg/ml)联用制剂的结果比较。进行该评价以确定当与单独配制的mAb1和阿帕西普的溶液(单一制剂)相比时，共同配制的mAb1和阿帕西普是否导致形成的高分子量种类的相对量的差异。使用得自在与联用制剂同等条件下温育的单一制剂的SE-UPLC结果来计算包含相同浓度的每种蛋白质的联用制剂的％HMW种类的理论增加值。将HMW的理论增加值与实际共同配制的药物产品在5℃下温育时测定的HMW的增加值进行比较。用于这些研究的DS批次是针对临床应用制造的有代表性的DS。

储存在5℃下包含单独的10mg/mL mAb1、单独的40mg/mL阿帕西普的制剂和mAb1∶阿帕西普(10mg/mL∶40mg/mL)联用制剂的SE-UPLC结果概述如下：在5℃储存9个月后，10mg/mL mAb1制剂中的HMW含量未增加。在相同评价期间内，40mg/mL阿帕西普制剂中的％HMW增加0.4％。基于得自10mg/mL mAb1和40mg/mL阿帕西普制剂的结果，预期在9个月评价期间内在mAb1∶阿帕西普(10mg/mL∶40mg/mL)联用制剂中发生0.4％HMW种类的增加。在9个月评价期间，对mAb1∶阿帕西普(10mg/mL∶40mg/mL)DP测定有0.4％的总HMW种类的增加。

％HMW的计算增加值与测定增加值之间的一致性启示，相对于对各自配制的药物产品测定的增加，作为mAb1∶阿帕西普(10mg/mL∶40mg/mL)DP在5℃储存9个月的mAb1和阿帕西普储存不会导致HMW形式生成增加。

储存在5℃下包含单独的120mg/mL mAb1、单独的40mg/mL阿帕西普的制剂和mAb1∶阿帕西普(120mg/mL∶40mg/mL)联用制剂的SE-UPLC结果概述如下：在5℃储存9个月后，120mg/mL mAb1制剂和40mg/mL阿帕西普制剂中的HMW含量分别增加0.5％和0.4％。基于得自120mg/mL mAb1制剂和40mg/mL阿帕西普制剂的结果，预期在9个月评价期间内在mAb1∶阿帕西普(120mg/mL∶40mg/mL)联用制剂中发生0.9％HMW种类的增加。该理论值结果与在5℃9个月储存期间mAb1∶阿帕西普(120mg/mL∶40mg/mL)DP测定的总HMW种类的1.0％的增加值相当。％HMW的计算增加值与实测增加值之间的紧密一致性启示，相对于对各自配制的药物产品测定的增加值，作为mAb1∶阿帕西普(120mg/mL∶40mg/mL)DP在5℃储存9个月的mAb1和阿帕西普储存不会导致HMW形式生成增加。

实施例10：与阿帕西普联合施用的玻璃体内(IVT)mAb1在具有新生血管性AMD或DME的患者中的临床试验

本研究是I期、开放标签、剂量递增临床研究，旨在评价单独mAb1的IVT施用或其与阿帕西普联合施用用于具有新生血管性AMD或DME的患者的安全性、耐受性和效能。

本研究的主要目的在于研究IVT mAb1和阿帕西普和IVT mAb1分别在具有新生血管性AMD的患者和具有DME的患者中的安全性和耐受性。

本研究的第二个目标是：(i)表征mAb1和阿帕西普在IVT注射mAb1和阿帕西普后的全身药代动力学(PK)；和(ii)表征IVT注射后抗-mAb1和抗-阿帕西普抗体的存在。

主要终点是单独使用单独的IVT mAb1或共同配制的mAb1和阿帕西普的IVT治疗的患者中24周时眼部和全身治疗突发性不良事件(TEAE)的发生率和严重程度。

次要终点是：(i)药代动力学；和(ii)在IVT注射的联用制剂之后开发抗-药物抗体(ADA)。

探索性终点是：(1)BCVA从基线的变化；(2)在第12周和第24周，中央视网膜中央厚度从基线的变化(通过OCT测定)；和(3)从第12周到第20周PRN阿帕西普的注射次数。

仅对于AMD患者：(i)在第12周和第24周时，CNV面积从基线的改变(通过FA测定)；(ii)在第12周和第24周，总损伤面积从基线的变化(通过FA测定)；(iii)在第12周和第24周，渗漏面积从基线的改变(通过FA测定)。

仅对于DME患者：在第12周和第24周，DRSS从基线的改变(通过FP测定)。

研究设计原理

抗VEGF疗法(例如阿帕西普)是新生血管性AMD和DME的护理治疗标准。靶向新生血管性眼病中的VEGF和血管生成素-2(Ang-2)途径可能会导致超过单独使用抗-VEGF疗法治疗的额外功效，并且也可能提供更长的作用持续时间，从而导致更长的治疗间隔。在DL-AAA在家兔中诱导的视网膜新生血管化和慢性血管渗漏的临床前期模型中，用静脉内(IV)mAb1(15mg/kg)与IVT阿帕西普(125μg/50μl)治疗导致抑制血管渗透到第8周，而与之相比，单独的阿帕西普只有到第3周(见实施例2中的细节)。

在另一项研究中，将mAb1对视网膜血管发育的影响与阿帕西普相比，或与用mAb1和阿帕西普治疗相比。在本实验中使用的mAb1(25mg/kg，皮下[SC])和阿帕西普(25mg/kg，SC)的剂量超过当使用每种药物作为单一活性剂时获得对视网膜血管生成最大抑制所需的最小剂量。在P3时，mAb1或阿帕西普的施用相对于hFc对照组显著地降低了P6时测定的视网膜平均血管化面积，分别为36％和42％。此外，与单独使用任一活性剂治疗的动物相比，用mAb1和阿帕西普治疗的动物的平均视网膜血管化面积显著更小，减少了68％，这表明在治疗期内接近视网膜血管发育的完全阻止(见实施例3的细节)。

剂量选择原理

起始剂量由在研究眼中通过IVT注射施用的0.5mg mAb1∶2mg阿帕西普的联用制剂组成。阿帕西普的2mg剂量相当于目前批准和销售的用于治疗湿性AMD和视网膜中央静脉闭塞的剂量。

在“良好实验室操作”毒理学研究期间，0.5mg∶2mg剂量的联用制剂是向短尾猴双侧施用IVT的最低剂量的一半。高达6mg mAb1与2mg阿帕西普和单独的6mg mAb1的剂量在猴中是良好耐受的。

来自生物学观点的这种起始剂量的原理基于家兔眼中新生血管形成的DL-AAA模型。在该模型中，与阿帕西普单一疗法相比，IVT阿帕西普(0.125mg)和mAb1(0.5mg)的联用制剂显著增加了从第3周至第8周的抗-漏效应持续时间。外推到人眼(其比家兔眼大约4倍)，剂量范围为0.5mg至0.6mg将预期显示生物活性。因此，从药理学观点来看，0.5mg的初始剂量是合理的(参见实施例2)。

提出的初始剂量的安全性得到在猴子中进行的为期13周的IVT毒理学研究的支持，其使用1、3和6mg的mAb1与2mg阿帕西普的双侧的剂量，并且包括单独的6mg mAb1剂量。鉴于人玻璃体腔的体积大约是猴玻璃体腔的4倍，因此初始起始剂量比猴子研究中的最低剂量低8倍，并且比最高计划剂量低约48倍。因此，猴IVT研究中使用的最低剂量为拟议的临床起始剂量提供了足够的安全范围。

研究设计

本研究由筛选期(-21至-1天)、基线访视(第1天)、治疗期(第1天至第57天)、随访(第85天至第141天)和研究访问结束[第169天(第24周)]组成。在第1天/基线时，符合条件的患者在接受第一种剂量的研究药物之前进行安全性评价。

在第1天、第29天和第57天，患者总共接受3次剂量的联用制剂(mAb1和阿帕西普)或单独的mAb1注射。初始组接受0.5mg∶2mg的联用制剂。表43中概述了联用制剂和单独的mAb1计划施用。如果确定了最大耐受剂量(MTD)，则单独给予的mAb1剂量将相当于在mAb1和阿帕西普联用制剂内施用的mAb1的最高剂量。

表43：计划的剂量水平

组(n＝4-8)	IVT mAb1∶阿帕西普	IVT mAb1
			1	0.5mg∶2mg
2	1mg∶2mg
			3	3mg∶2mg
4	6mg∶2mg
			5		6mg

研究药物的最后剂量在第8周时施用。从第12周开始，直到第20周，对于研究眼，所有患者都可以使用玻璃体内阿帕西普注射(2mg)。在12周时接受阿帕西普的患者将继续接受阿帕西普治疗，可能最高达到每月注射1次。

在眼和全身安全性(包括眼科检查、实验室评价等)和效能(光学相干体层摄影[OCT]、荧光素血管造影术[FA]/眼底摄影术[FP]、眼底自发荧光[FAF]和使用4-米早期治疗糖尿病视网膜病变研究[ETDRS]方案的BCVA)研究访视时评价患者，并继续至第24周(研究结束)。

研究眼/对侧眼选择：在本研究中每位患者仅登记1只眼。登记眼将被指定为研究眼。另一只眼被视为是对侧眼。

对于符合双眼资格标准的患者，选择BCVA评分较差的眼作为研究眼。如果患者在双眼中具有类似的BCVA评分，则选择具有最清晰的介质的眼作为研究眼。如果双眼的眼介质在清晰度上相似，则选择患者的非优势眼(如果可以识别)作为研究眼。如果双眼都不占优势，则右眼就被指定为研究眼。

研究小组

在剂量递增研究中录入约20至40名患者。4个依次递增剂量小组计划用于共同配制的mAb1和阿帕西普(0.5mg∶2mg，1mg∶2mg，3mg∶2mg和6mg∶2mg)，并且1组计划用于单独的mAb1(6mg)。每个剂量组最初由4名患者(2名DME和2名AMD)组成。如果发生1次剂量限制性毒性(DLT)，则可将该组扩大至包括2名额外的DME患者和/或2名额外的AMD患者。如果第4组到达，则第4组和第5组可以平行进行实验。

剂量递增和研究停止规则

递增到下一个更高剂量水平的共同配制的mAb1和阿帕西普的决定基于来自在进行的组中评价和评审的AMD和DME患者的安全性和耐受性信息。递增决定可以在接受第一个剂量研究药物后观察至少1周的组(AMD和DME)中的最后一名患者后进行。如果未确定MTD，则单独的mAb1组将以MTD或最高剂量(6mg)进行录入。如果没有确定MTD，则该组中的录入将与6mg∶2mg mAb1∶阿帕西普联用制剂组同时进行。

如果观察到DLT，则可以考虑扩充组。组的扩充可能涉及另外2名AMD患者和/或2名额外的DME患者。在DLT事件之后增加每个组超过4个的患者数量的理由是增强区分已知使用IVT注射偶发的某些AE(例如超敏反应或中度至严重眼内炎症)与涉及研究药物接触的真实DLT的能力。组扩充不是自动进行的。相反，将讨论调查结果以判定任何潜在的DLT的临床意义，以确定是否进行组扩充或剂量递增至下一个更高剂量水平的联用制剂。

所有患者在接受共同配制的mAb1和阿帕西普之后观察至少7天，然后开始下一个剂量组录入(尽管下一个剂量组的筛选可以在确认当前剂量安全之前开始)。一旦组中所有录入的初始4名患者在第8天完成(访问7)安全性评价，并且数据已经被评审，则递增至下一个剂量组。有关剂量递增和停止规则，请参阅表44。

表44：剂量递增和停止规则

如果观察到2个或更多个DLT，则暂停给药，直到进行安全性评审为止。安全性评审结果将决定：按计划继续本研究，扩大当前剂量组，或停止以当前剂量给药。在这种情况下，观察到的毒性将被认为是剂量限制性的，并且低于施用的最高剂量的剂量将被认为是MTD。如果在任何组(原始给药组或扩充组)中观察到1级4AE或4级严重不良事件(SAE)，则将暂停给药，并在考量进一步给药之前进行全面的安全性评审。

剂量限制性毒性

将DLT定义如下：由食品和药品监督管理局(Food and Drug Administration)(FDA)2007年9月的“用于在预防性疫苗临床试验中录入的健康成年人和青少年志愿者的工业化、毒性分级量表的指导原则(Guidance for Industry，Toxicity Grading Scale forHealthy Adult and Adolescent Volunteers Enrolled in Preventive VaccineClinical Trials)”中眼毒性分级量表(Ocular Toxicity Grading Scale)或3或4级毒性。

最大耐受剂量

将MTD定义为立即低于由于发生2个或更多个DLT而停止给药时的水平的剂量水平。如果研究由于DLT的发生而没有停止，则认为MTD尚未确定。

研究人群

目标人群是男性和女性50岁以上，具有新生血管性AMD，或男性和女性18岁及以上，具有牵涉中枢的临床显著性DME。

入选标准：患者必须符合以下标准才有资格纳入研究：(1)对于具有AMD的患者：a.活动性中心凹脉络膜新生血管化(CNV)继发于AMD，包括影响中央凹的并发性凹陷病变，如研究眼中FA或OCT所证明的；和b.男性或女性≥50岁及以上。对于具有DME的患者：c.具有牵涉中枢的临床显著性DME的患者(光谱域OCT中央子区≥300μm)；和d.男性或女性≥18岁及以上。(2)愿意和能够遵守门诊医疗和研究相关程序；和(3)提供签署的知情同意书。

排除标准：满足任何以下标准的患者不包括在研究中：(1)(a)对于具有新生血管性AMD的患者：由于任一眼中AMD以外的任何原因引起的CNV的证据；DR或DME在任一眼中；(b)对于具有DME的患者：由于任一眼中的任何原因引起的新生血管性AMD或CNV的证据；(2)以前的阿帕西普在任一眼中；(3)IVT贝伐珠单抗、雷珠单抗或哌加他尼钠在8周内第1天的研究眼中或在本研究中排除施用药物的使用任何以前的这些治疗中的AE；(4)任何先前用血管生成素抑制剂的治疗；(5)任何先前的全身(IV)抗-VEGF施用；(6)研究眼中玻璃体视网膜手术史；(7)在3个月筛查访视中的研究眼内的完全视网膜激光凝固术或黄斑激光凝固术；(8)在4个月筛查内研究眼中的在先使用眼内或眼周皮质类固醇；(9)筛查/基线时研究眼中眼内压(IOP)≥25mm Hg；(10)筛查/基线时任一眼中的感染性睑炎、角膜炎、巩膜炎或结膜炎的证据；(11)3个月筛查访视内任一眼内的任何眼内炎症/感染；(12)目前虹膜新生血管形成、玻璃体出血或视网膜脱离在筛查访视中的研究眼中可见；(13)无法获得照片、FA或OCT记录CNV，例如由于介质不透明度、对荧光素染料过敏或筛查/基线时静脉通路缺乏；(14)从研究人员的意见来看，不受控制的糖尿病；(15)不受控制的血压(定义为收缩压＞160mm Hg或舒张压＞95mm Hg，而患者正在就坐)；(16)180天内的第1天内脑血管意外或心肌梗死史；(17)肾衰竭、透析或肾移植史；(18)对多西环素或类似化合物(即四环素)的已知敏感性；(19)对研究制剂的任意化合物的已知敏感性；(20)妊娠或母乳喂养的妇女；和(210)在本研究期间不愿实行适当避孕措施的有性活力的男性或生育潜力的妇女(适当的避孕措施包括在筛查前2次或更多次月经循环使用口服避孕药具或其它处方药避孕药；宫内避孕器；双侧输卵管结扎术；输精管切除术；避孕套加避孕海绵、泡沫或胶冻剂或隔膜加避孕海绵、泡沫或胶冻剂)。

研究治疗

研究和参比治疗

共配制的mAb1和阿帕西普是由mAb1(抗Ang2抗体)和阿帕西普组成的药物产品。将作为无菌的一次性使用的2mL玻璃小瓶用于IVT施用的水溶液，以下列浓度(逐渐更高的浓度用于剂量递增的逐渐更高的剂量)供应于本研究：10∶40mg/mL，20∶40mg/mL，60∶40mg/mL和120∶40mg/mL(mAb1∶阿帕西普)。

单独的mAb1药物产品还以120mg/mL的浓度作为IVT施用的无菌、一次性使用的2mL玻璃小瓶中的水溶液供应用于本研究。

将联用制剂和mAb1通过IVT注射递送，且注射体积为50μl(0.05cc)。将会有0.050ml的最小抽出量。每个小瓶包含0.3mL的mAb1的抽出体积。

患者将被给予3个剂量的研究药物。研究药物由研究者或其他合格的研究人员在第1天、第29天和第57天进行施用。录入患者以接受以下联用制剂或mAb1治疗方案之一：

1组：0.5mg∶2mg(mAb1∶阿帕西普)

2组：1mg∶2mg(mAb1∶阿帕西普)

3组：3mg∶2mg(mAb1∶阿帕西普)

4组：6mg∶2mg(mAb1∶阿帕西普)

5组：6mg(仅mAb1)

背景治疗

研究眼治疗：玻璃体内阿帕西普注射液在无菌密封的小瓶中供应，其体积足以制备浓度为40mg/mL的50μL的注射器。从第12周开始(并持续到第20周)，患者将有资格在研究眼中每月接受阿帕西普治疗(2mg)，条件是下列任何重新治疗标准得以满足：(1)与以前的最低测量值相比，OCT上中央视网膜厚度增加＞50μm。(2)OCT上有新的或持续的囊性视网膜变化或视网膜下液，或OCT上中央子区持续性弥漫性水肿。(3)因最佳在先测量值与OCT上中心子区的视网膜厚度随视网膜厚度的任意增加结合而减少5个或以上的字母。(4)当前与最近访问之间≥5个字母的BCVA改善。

对侧眼治疗：在第4周，在具有AMD或DME的患者中处于筛查时或在试验期间被诊断患有AMD或DME的患者的对侧眼中可利用阿帕西普(2mg)。在本试验期间评价对侧眼的安全性，但不会考量研究眼。患者的对侧眼可以在研究人员的慎重考量下在同一天接受与研究眼相同的治疗。所有的对侧眼治疗必须记录在电子病例报告表(CRF)上，作为针对该对侧眼的操作程序。

接受对侧眼治疗的患者不需要从研究中撤出。采集对于对侧眼的研究评价和全部AEs。

禁用药物

研究眼：患者在研究眼中可以不接受并非用IVT联用制剂或IVT mAb1进行指定的研究治疗的任何用于AMD或DME治疗的标准或研究药物，且如果需要，可以使用如在本方案中指定的阿帕西普。这包括局部施用的药物(例如，IVT、局部、近巩膜或眶周路径)，以及全身施用的药物，其目的是在研究眼中治疗新生血管性AMD或DME。

对侧眼：从第4周开始，如果对侧眼具有涉及或威胁黄斑中心或新血管性AMD的DME，则可以施用阿帕西普(2mg)。对侧眼中的其它病症可以用经过批准的疗法治疗，但它们必须进行局部施用。

非眼系统：对于研究眼或对侧眼的新血管性AMD和DME，不允许使用非眼(全身)标准或研究治疗。本研究期间不允许使用全身抗血管生成药物。

研究方法

通过监测/评价治疗突发性不良事件(TEAEs)、身体检查、生命体征、心电图(ECG)和临床评价(血液学、血液化学和尿分析)来评价安全性和耐受性。通过眼科检查(裂隙灯、检眼镜间接检查法、眼内压[IOP]、光谱域OCT、BCVA、FAF和来自FP和FA的信息)评价眼部安全性。采集血清样品用于评价mAb1和阿帕西普的血浆PK样品。采集用于评价ADA响应的血清样品。

最佳矫正视力(BCVA)：研究眼和对侧眼的视力功能使用4M ETDRS方案(早期治疗糖尿病视网膜病变研究组1985)在筛选的每次研究访视时4米处、基线和治疗后第1周、第4周、第6周、第8周、第12周、第16周、第20周和第24周进行评价。

荧光素血管造影术/眼底照相术(FA/FP)：研究眼和对侧眼的视网膜脉管系统的解剖状态通过眼底镜检查、FA和FP在筛查、基线和治疗后第1、2、4、6、8、12、16、20和24周的每个研究访视的时间点进行评价。至少将采集有关以下变量的信息：

仅对于AMD：总损害面积、CNV面积、典型CNV面积和荧光素渗漏面积。

仅对于DME：糖尿病视网膜病变严重性评分(DRSS)。

认证的摄影师将在上面列出的时间点在双眼中进行FA和FP。将眼底和血管造影图像发送到独立阅读中心。研究眼将是输送眼。所有FA和FP将作为源文件的部分存档在站点。

光谱域光学相干层析体层摄影术：在筛选、基线和治疗后第1、2、4、6、8、12、16、20和24周的每个研究访视的时间点，使用光谱域OCT来评价视网膜和损伤特征。

图像被OCT技术人员在研究现场使用用于研究眼和对侧眼的光谱域OCT捕获并传播。光学相干性体层摄影图像被发送到独立阅读中心，其中将读取研究眼睛的图像。所有OCT将作为源文件的部分以电子方式存档在研究站点。光学相干性体层摄影技术人员将由阅读中心认证，以确保图像采集的一致性和质量，并将被掩蔽至联用制剂的患者剂量水平。

眼底自发荧光：使用自发荧光来评价视网膜的解剖特征。认证的摄影师将在筛选、基线和治疗后第1、2、4、6、8、12、16、20和24周的每个研究访视的时间点进行FAF。将图像将发送到独立阅读中心。所有图像将作为源文件的部分存档在站点。

眼内压：使用戈德曼压平眼压计测量法或Tono-pen^TM在每次研究访视时测量研究眼的眼内压。在整个研究中，在每个患者中必须使用相同的IOP测量方法。在给予阿帕西普治疗的访视中，IOP必须在治疗前(双侧)和治疗后大约30分钟(仅研究眼)进行测量。

裂隙灯检查：在筛查、基线和治疗后的第1、2、4、6、8、12、16、20和24周的每次研究访视的时间点，使用裂隙灯检查前段和前部玻璃体。检查双眼。眼底的检查也通过检眼镜间接检查法进行。

前房潮红和细胞分级。根据在45°至60°角的全强度下在1×3mm高功率光束中观察到的炎症细胞的数量来分级前房中的细胞反应强度。此外，对玻璃体炎症应答进行分级。

检眼镜间接检查法：检眼镜间接检查法在筛查、基线和治疗后的第1、4、6、8、12、16、20和24周的每次研究访视的时间点进行。在施用研究药物时的当天施用研究药物之后立即以双侧前剂量和在研究眼中进行。使用适当的透镜和光学镜头，即用于外围的头戴式或手持式检眼镜，以及用于中央眼底的裂隙灯。扩大瞳孔，且眼底检查对双眼进行。

非眼安全性：收集生命体征，包括体温、坐位血压、脉搏和呼吸，完整和彻底的身体检查、标准的12导联心电图以及血液学、化学、尿分析和妊娠试验的标准实验室测试将在筛查、基线和治疗后第1、4、6、8、12、16、20和24周的每个研究访问的时间点进行。

安全性

通过监测/评价治疗突发不良事件(TEAE)、身体检查、生命体征、心电图(ECG)和临床评价(血液学、血液化学和尿分析)来评价安全性和耐受性。

不良事件(AE)是在施用研究药物的患者中的任何不利的医学事件，其可能与或可能不与研究药物具有因果关系。因此，无论是否考虑与研究药物相关，AE是与使用研究药物暂时相关的任何不利的和非预期的征兆(包括异常的实验室检查)、症状或疾病。

严重不良事件(SAE)是在任何剂量下任何不适当的医疗事件：导致死亡，危及生命，需要患者住院治疗或延长现有住院时间，导致持续或显著性的残疾/丧失工作能力，是先天性异常/出生缺陷，和/或是重大的医疗事件。严重威胁视力的眼AE的标准包括：(1)AE导致BCVA减少＞30个字母(与BCVA最近的评价相比)。(2)AE导致VA降低到光感觉的水平或更差。(3)AE需要外科手术(例如玻璃体轻拍或使用IVT注射抗感染药物的活检、激光或使用气体的视网膜低温固定)，以防止永久性视力丧失。(4)AE与严重的眼内炎症(即4+前房细胞/潮红或4+玻璃体炎)有关。(5)在调查人员的意见中，AE可能需要医疗干预以防止永久性的视力丧失。

结果

对安全性结果的初步分析表明，在具有良好安全性的AMD和DME患者中，联用制剂得到充分耐受。

表45和46分别显示了具有AMD和DME的患者的基线人口统计数据。

表45：AMD患者的基线人口统计数据

表46：DME患者的基线人口统计数据

将AMD和DME患者的基线特征分别概括在表47和48中。

表47：AMD患者的基线特征

N(全部小组)	10
		BCVA	61.7(12.41)
最小值∶最大值	35∶76
		IOP	17.0(3.40)
最小值∶最大值	10∶22
		CRT(μm)	415.6(105.69)
最小值∶最大值	263∶621

表48：DME患者的基线特征

N(全部小组)	10
		BCVA	59.7(11.92)
最小值∶最大值	31∶75
		IOP	14.9(3.14)
最小值∶最大值	9∶20
		CRT(μm)	453.6(129.87)
最小值∶最大值	310∶689

迄今为止(12周)的结果显示了在所有剂量水平下视力(多达20个字母的视敏度增加)和视网膜形态(中心子区厚度的减小)的改善。在较高剂量(3mg∶2mg和6mg∶2mg剂量)下效果持续时间得以延长。

在治疗后24周，预期视敏度增加将在具有AMD或DME的患者中得到维持或改善。

本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文所描述的那些之外的本发明的各种变型对于本领域技术人员而言，从上述描述和附图将变得显而易见。预期这类变型落入所附权利要求的范围内。

Claims (122)

1.用于治疗血管性眼病或眼障碍的方法，包含对有此需要的个体通过玻璃体内施用治疗有效量的包含血管生成素-2(Ang-2)抑制剂的药物组合物。

2.权利要求1的方法，其中所述药物组合物还包含血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。

3.权利要求1-2任一项的方法，其中所述药物组合物包含约10-120mg/mL的Ang-2抑制剂。

4.权利要求3的方法，其中所述药物组合物包含10mg/ml、20mg/ml、60mg/mL或120mg/mL的Ang-2抑制剂。

5.权利要求2-4任一项的方法，其中所述药物组合物包含约40mg/mL的VEGF拮抗剂。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中对有此需要的个体施用0.5mg-10mg剂量的Ang-2抑制剂。

7.权利要求2-6任一项的方法，其中对有此需要的个体施用50μg-5mg剂量的VEGF拮抗剂。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述眼病或眼障碍选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管化、视网膜中央静脉闭塞、视网膜分支静脉闭塞、多息肉状脉络膜血管病和脉络膜新生血管化。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述眼病或眼障碍是年龄相关性黄斑变性。

10.权利要求1-8任一项的方法，其中所述眼病或眼障碍是糖尿病黄斑水肿。

11.用于抑制视网膜血管发生的方法，包含对有此需要的个体施用治疗有效量的药物组合物，其包含Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂。

12.权利要求11的方法，其中将Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂通过玻璃体内联合施用。

13.权利要求11-12任一项的方法，其中以约1-10μg的剂量施用Ang-2抑制剂。

14.权利要求11-13任一项的方法，其中以约1-10μg的剂量施用VEGF拮抗剂。

15.权利要求11的方法，其中将Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂通过皮下联合施用。

16.权利要求15的方法，其中以5-30mg/kg个体体重的剂量施用Ang-2抑制剂。

17.权利要求15或16的方法，其中以5-30mg/kg个体体重的剂量施用VEGF拮抗剂。

18.权利要求11-17任一项的方法，其中联合治疗与单独施用Ang-2抑制剂或VEGF拮抗剂相比将血管面积减少了至少65％。

19.权利要求11-18任一项的方法，其中所述视网膜血管发生与眼病或眼障碍相关，所述眼病或眼障碍选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管化、视网膜中央静脉闭塞、视网膜分支静脉闭塞、多息肉状脉络膜血管病和脉络膜新生血管化。

20.抑制视网膜新生血管化的方法，包含对有此需要的个体施用治疗有效量的包含Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂的药物组合物。

21.权利要求20的方法，其中将Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂通过玻璃体内联合施用。

22.权利要求21的方法，其中以0.1-10.0mg的剂量施用Ang-2抑制剂，并且以约0.1mg-5mg的剂量施用VEGF拮抗剂。

23.权利要求20的方法，其中将Ang-2抑制剂以15mg/kg个体体重的剂量通过静脉内施用，每2周1次。

24.权利要求23的方法，其中将VEGF拮抗剂以0.1-5mg的剂量通过玻璃体内施用。

25.权利要求20-24任一项的方法，其中所述视网膜新生血管化与眼病或眼障碍相关，所述眼病或眼障碍选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜中央静脉闭塞和视网膜分支静脉闭塞。

26.用于抑制血管渗漏的方法，包含对有此需要的个体施用治疗有效量的包含Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂的药物组合物。

27.权利要求26的方法，其中与已经单独施用VEGF拮抗剂的个体相比，将所述血管渗漏抑制至少3周。

28.权利要求27的方法，其中与已经单独施用VEGF拮抗剂的个体相比，将所述血管渗漏抑制3周以上。

29.权利要求26或28的方法，其中与已经单独施用VEGF拮抗剂的个体相比，将所述血管渗漏抑制至少8周。

30.权利要求26-29任一项的方法，其中与已经单独施用VEGF拮抗剂的个体相比，将所述血管渗漏抑制至少10周。

31.权利要求26-30任一项的方法，其中以约5-50mg/kg个体体重与0.05-2mg的VEGF拮抗剂的组合的剂量施用Ang-2抑制剂。

32.权利要求31的方法，其中以约15mg/kg个体体重与125μg的VEGF拮抗剂的组合的剂量施用Ang-2抑制剂。

33.权利要求26-30任一项的方法，其中通过静脉内或皮下施用Ang-2抑制剂。

34.权利要求26-33任一项的方法，其中通过玻璃体内使VEGF拮抗剂。

35.权利要求26-30任一项的方法，其中将Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂通过玻璃体内联合施用。

36.权利要求35的方法，其中将Ang-2抑制剂以约500μg的剂量与约125μg的VEGF拮抗剂联合施用。

37.权利要求26-36任一项的方法，其中所述血管渗漏与眼病或眼障碍相关，所述眼病或眼障碍选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管化、视网膜中央静脉闭塞、视网膜分支静脉闭塞、多息肉状脉络膜血管病和脉络膜新生血管化。

38.权利要求26-37任一项的方法，其中所述血管渗漏与视网膜新生血管化相关。

39.用于抑制具有眼病的个体的血管渗漏的方法，该方法包含对有此需要的个体施用单剂量的VEGF拮抗剂，然后施用一个或多个剂量的包含Ang-2抑制剂的药物组合物。

40.权利要求39的方法，其中以100-500μg的剂量施用VEGF拮抗剂。

41.权利要求39或40任一项的方法，其中通过玻璃体内施用VEGF拮抗剂。

42.权利要求39-41任一项的方法，其中通过静脉内或皮下施用Ang-2抑制剂。

43.权利要求39-42任一项的方法，其中每2周1次施用一个或多个剂量的Ang-2抑制剂。

44.权利要求39-43任一项的方法，其中Ang-2抑制剂的一个或多个剂量各自包含15mg/kg个体体重。

45.权利要求39-44任一项的方法，其中与已经单独施用VEGF拮抗剂的个体相比，将血管渗漏抑制至少4周。

46.权利要求45的方法，其中与已经单独施用VEGF拮抗剂的个体相比，将血管渗漏抑制4周以上。

47.权利要求45的方法，其中与已经单独施用VEGF拮抗剂的个体相比，将血管渗漏抑制至少8周。

48.权利要求47的方法，其中与已经单独施用VEGF拮抗剂的个体相比，将血管渗漏抑制至少10周。

49.权利要求39-48任一项的方法，其中所述血管渗漏与眼病或眼障碍相关，所述眼病或眼障碍选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管化、视网膜中央静脉闭塞、视网膜分支静脉闭塞、多息肉状脉络膜血管病和脉络膜新生血管化。

50.权利要求39-49任一项的方法，其中所述血管渗漏与视网膜新生血管化相关。

51.减少对具有眼病的个体施用的玻璃体内注射的次数的方法，该方法包含对有此需要的个体依次施用第一种初始剂量的药物组合物、然后施用一个或多个该药物组合物的二次剂量，所述药物组合物包含治疗有效量的Ang-2抑制剂与VEGF拮抗剂，其中VEGF拮抗剂的玻璃体内施用与已经单独施用VEGF拮抗剂的个体相比被减少至每9周1次。

52.权利要求51的方法，其中一个或多个二次剂量包含2-10个剂量的药物组合物。

53.权利要求52的方法，其中将药物组合物的至少2个二次剂量施用于个体，且其中在紧接在前剂量之后1-4周施用每个二次剂量。

54.权利要求51-53任一项的方法，其中药物组合物的初始剂量和一个或多个二次剂量各自包含约0.5-10mg的Ang-2抑制剂。

55.权利要求51-54任一项的方法，其中通过静脉内或皮下施用Ang-2抑制剂。

56.权利要求51-55任一项的方法，其中以约1-5mg的剂量施用VEGF拮抗剂。

57.权利要求51-56任一项的方法，其中所述眼病选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管化和脉络膜新生血管化。

58.用于抑制脉络膜新生血管化的方法，包含对有此需要的个体施用治疗有效量的包含Ang-2抑制剂的药物组合物。

59.权利要求58的方法，其中以约10-50mg/kg个体体重的剂量通过皮下施用Ang-2抑制剂。

60.权利要求59的方法，其中以25mg/kg个体体重的剂量施用Ang-2抑制剂。

61.权利要求58-60任一项的方法，其中脉络膜新生血管化与眼病或眼障碍相关，所述眼病或眼障碍选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜中央静脉闭塞、视网膜分支静脉闭塞和多息肉状脉络膜血管病。

62.权利要求1-61任一项的方法，其中Ang-2抑制剂是抗Ang-2抗体或其抗原结合片段。

63.权利要求62的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDRs)和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的CDRs。

64.权利要求63的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)、具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HCDR3、具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链CDR1(LCDR1)、具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的LCDR3。

65.权利要求64的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的LCVR。

66.权利要求2-57任一项的方法，其中VEGF拮抗剂包含基于VEGF受体的嵌合分子(VEGFTrap)。

67.权利要求66的方法，其中VEGF Trap包含一种或多种VEGFR1的免疫球蛋白(Ig)-样结构域、一种或多种VEGFR2的Ig-样结构域和多聚化结构域。

68.权利要求67的方法，其中VEGF Trap包含VEGFR1的Ig-样结构域2、VEGFR2的Ig-样结构域3和多聚化结构域。

69.权利要求66的方法，其中VEGF Trap是阿帕西普。

70.权利要求2-57任一项的方法，其中VEGF拮抗剂由两种多肽的二聚体组成，所述多肽由SEQ ID NO：11的氨基酸27-457组成。

71.稳定的液体制剂，包含：(i)血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂；(ii)特异性地结合人血管生成素-2(hAng-2)的抗体；(iii)pH为6.2±0.3的缓冲剂；(iv)非离子洗涤剂；(v)张度剂；和(vi)稳定剂；其中VEGF拮抗剂由两种多肽的二聚体组成，所述多肽由SEQ ID NO：11的氨基酸27-457组成。

72.权利要求71的制剂，其中所述抗体包含：三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，其中HCDR1具有SEQ ID NO：3，HCDR2具有SEQ ID NO：4，HCDR3具有SEQ ID NO：5；和三个轻链CDRs(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中LCDR1具有SEQ ID NO：6，LCDR2具有SEQ ID NO：7，且LCDR3具有SEQ ID NO：8。

73.权利要求71和72任一项的制剂，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链可变区(HCVR)和SEQ ID NO：2的轻链可变区(LCVR)。

74.权利要求73的制剂，其中VEGF拮抗剂浓度约为40mg/mL±1.5mg/mL。

75.权利要求74的制剂，包含约10-120mg/mL的抗体。

76.权利要求75的制剂，包含浓度选自10mg/ml、20mg/ml、60mg/mL和120mg/mL的抗体。

77.权利要求71的制剂，包含约5-100mg/mL的VEGF拮抗剂；约10-120mg/mL的抗Ang-2抗体；约5-50mM磷酸钠，pH约6.2；约0.01-0.1％(w/v)聚山梨醇酯；约10-50mM氯化钠；和约1-20％(w/v)蔗糖。

78.权利要求77的制剂，包含浓度选自10mg/ml、20mg/ml、60mg/ml和120mg/ml的抗体。

79.权利要求76的制剂，其中所述缓冲剂是磷酸钠。

80.权利要求79的制剂，其中磷酸钠浓度为10mM±1.5mM。

81.权利要求76的制剂，其中所述非离子洗涤剂为聚山梨醇酯20。

82.权利要求81的制剂，其中聚山梨醇酯20浓度约为0.03％w/v±0.0045％。

83.权利要求76的制剂，其中所述张度剂为氯化钠。

84.权利要求83的制剂，其中氯化钠浓度约为40mM±6.0mM。

85.权利要求76的制剂，其中所述稳定剂为蔗糖。

86.权利要求85的制剂，其中蔗糖浓度约为5％±0.75％(w/v)。

87.权利要求71的制剂，其中VEGF拮抗剂浓度为40mg/mL±6.0mg/ml；抗体浓度为10mg/mL±1.5mg/ml；缓冲剂为10mM±1.5mM磷酸钠，pH 6.2±0.3；非离子洗涤剂为0.03％w/v±0.0045％聚山梨醇酯20；张度剂为40mM氯化钠，且稳定剂为5％w/v±1.5％蔗糖。

88.权利要求71的制剂，其中VEGF拮抗剂浓度为40mg/mL±6.0mg/ml；抗体浓度为20mg/mL±3.0mg/ml；缓冲剂为10mM±1.5mM磷酸钠，pH 6.2±0.3；非离子洗涤剂为0.03％w/v±0.0045％聚山梨醇酯20；张度剂为40mM氯化钠，且稳定剂为5％w/v±1.5％蔗糖。

89.权利要求71的制剂，其中VEGF拮抗剂浓度为40mg/mL±6.0mg/ml；抗体浓度为60mg/mL±9.0mg/ml；缓冲剂为10mM±1.5mM磷酸钠，pH 6.2±0.3；非离子洗涤剂为0.03％w/v±0.0045％聚山梨醇酯20；张度剂为40mM氯化钠，且稳定剂为5％w/v±1.5％蔗糖。

90.权利要求71的制剂，其中VEGF拮抗剂浓度为40mg/mL±6.0mg/ml；抗体浓度为120mg/mL±18.0mg/ml；缓冲剂为10mM±1.5mM磷酸钠，pH 6.2±0.3；非离子洗涤剂为0.03％w/v±0.0045％聚山梨醇酯20；张度剂为40mM氯化钠，且稳定剂为5％w/v±1.5％蔗糖。

91.用于治疗或改善血管性眼病或眼障碍的方法，该方法包含对有此需要的个体施用权利要求71-90任一项的制剂。

92.权利要求91的方法，其中所述眼病或眼障碍选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管化、视网膜中央静脉闭塞、视网膜分支静脉闭塞、多息肉状脉络膜血管病和脉络膜新生血管化。

93.用于治疗血管性眼病的方法，该方法包含对有此需要的个体依次施用一个或多个剂量的药物组合物，其包含治疗有效量的抗Ang-2抑制剂和VEGF拮抗剂。

94.权利要求93的方法，其中所述药物组合物包含约10mg/mL-约120mg/mL的抗Ang-2抑制剂。

95.权利要求93-94任一项的方法，其中所述药物组合物包含约40mg/mL的VEGF拮抗剂。

96.权利要求93的方法，其中所述药物组合物包含约10mg/mL-约120mg/mL的抗Ang-2抑制剂和约40mg/mL的VEGF拮抗剂。

97.权利要求93-96任一项的方法，其中所述药物组合物包含10mg/mL的抗Ang-2抑制剂和40mg/mL的VEGF拮抗剂。

98.权利要求93-96任一项的方法，其中所述药物组合物包含20mg/mL的抗Ang-2抑制剂和40mg/mL的VEGF拮抗剂。

99.权利要求93-96任一项的方法，其中所述药物组合物包含60mg/mL的抗Ang-2抑制剂和40mg/mL的VEGF拮抗剂。

100.权利要求93-96任一项的方法，其中所述药物组合物包含120mg/mL的抗Ang-2抑制剂和40mg/mL的VEGF拮抗剂。

101.权利要求93-100任一项的方法，包含对所述个体施用药物组合物的初始剂量；然后对所述个体施用药物组合物的一个或多个二次剂量，其中在紧接在前的剂量后1-4周施用每个二次剂量。

102.权利要求101的方法，其中对所述个体施用至少2个二次剂量并且在紧接在前的剂量后4周施用每个二次剂量。

103.权利要求102的方法，还包含对所述个体施用一个或多个药物组合物的第三次剂量，其中在紧接在前的剂量后5-12周施用每个第三次剂量。

104.权利要求103的方法，其中在紧接在前剂量后8周施用每个第三次剂量。

105.权利要求101-104任一项的方法，其中药物组合物的每个剂量包含约0.5mg-约10mg的抗Ang-2抑制剂和约2mg的VEGF拮抗剂。

106.权利要求105的方法，其中药物组合物的每个剂量包含10mg/mL的抗Ang-2抑制剂和40mg/mL的VEGF拮抗剂。

107.权利要求105的方法，其中药物组合物的每个剂量包含20mg/mL的抗Ang-2抑制剂和40mg/mL的VEGF拮抗剂。

108.权利要求105的方法，其中药物组合物的每个剂量包含60mg/mL的抗Ang-2抑制剂和40mg/mL的VEGF拮抗剂。

109.权利要求105的方法，其中药物组合物的每个剂量包含120mg/mL的抗Ang-2抑制剂和40mg/mL的VEGF拮抗剂。

110.权利要求93-109任一项的方法，其中对所述个体通过玻璃体内施用药物组合物的每个剂量。

111.权利要求93-110任一项的方法，其中所述血管性眼病选自糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜中央静脉闭塞、视网膜分支静脉闭塞和多息肉状脉络膜血管病。

112.权利要求111的方法，其中所述血管性眼病是年龄相关性黄斑变性。

113.权利要求111的方法，其中所述血管性眼病是糖尿病黄斑水肿。

114.权利要求93-113任一项的方法，其中Ang-2抑制剂是抗Ang-2抗体或其抗原结合片段。

115.权利要求114的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDRs)和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的CDRs。

116.权利要求114或115的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)、具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的HCDR2、具有SEQ IDNO：5的氨基酸序列的HCDR3、具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链CDR1(LCDR1)、具有SEQID NO：7的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的LCDR3。

117.权利要求116的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的LCVR。

118.权利要求93-117任一项的方法，其中VEGF拮抗剂包含基于VEGF受体的嵌合分子(VEGF Trap)。

119.权利要求118的方法，其中VEGF Trap包含一种或多种VEGFR1的免疫球蛋白(Ig)-样结构域、一种或多种VEGFR2的Ig-样结构域和多聚化结构域。

120.权利要求119的方法，其中VEGF Trap包含VEGFR1的Ig-样结构域2、VEGFR2的Ig-样结构域3和多聚化结构域。

121.权利要求120的方法，其中VEGF Trap是阿帕西普。

122.权利要求93-121任一项的方法，其中VEGF拮抗剂由两种多肽组成，所述多肽由SEQID NO：11的氨基酸27-457组成。