CN106983134A - 北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法，包括如下步骤：将北冬虫夏草菌种进行增殖培养，得到增殖培养液，将所述增殖培养液进行浓缩处理，得到菌丝体浓缩液，向所述菌丝体浓缩液中加入冻干保护剂，混匀，预冻，冻干，包装，即得。本发明通过采用北冬虫夏草菌种和含有特定含量的葡萄糖，海藻糖，脱脂乳粉和β‑CD等复配的冻干保护剂，结合真空冷冻干燥技术，有效提高菌种存活率，根本上解决了菌种的继代培养退化问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法,有利于北冬虫夏草菌种的有效保藏。
背景技术
北冬虫夏草菌Cordyceps militaris , ( L . ex Fr. )Link.也称蛹草 、蛹虫草、北虫草。北冬虫夏草，是一种具有较高滋补和药用价值的珍贵中药材。蛹虫草在我国的人工栽培已有十多年历史，其药用价值与驰名中外的冬虫夏草( Cordyceps sinensis) 相似 。
蛹虫草人工栽培技术的成熟和产业化发展一方面说明市场的大量需求，另一方面也反映出冬虫夏草野生资源稀缺的现状。野生冬虫夏草价格的连年暴涨，使越来越多的人关注蛹虫草的人工栽培。人工栽培的蛹虫草原始菌株均来自与野外采集的冬虫夏虫菌，通常是每年野外采集，再经过复杂的分离纯化获得性状稳定的菌种用于生产。但蛹虫草菌较之其他真菌更易变异、退化，实际证明虫草菌中通过有性繁殖后，转管传代超过三次以上，菌种的出草性能会有明显的下降。无性传代在5次以上，虫草菌种会丧失出草性能。一般而言 从制备原始母种到栽培种植 , 一般需要6-9个月保藏期，生产单位不得不每1-2个月即进行传代保藏，从而造成菌种性能严重退化。为保证菌种质量，往往需要每年都要重新采集，重复分离纯化工作，不但增加了工作量，而且每年的生产菌种的差异也会引起产品质量的不稳定。菌种退化会引起大面积减产失收，给批量生产带来极大的风险。如何能够有效地保藏优良的蛹虫草菌，解决蛹虫草的菌种退化问题已成为国内外学者研究的焦点。目前广泛应用的保藏蛹虫草菌的方法是低温试管保藏法，但方华舟等人的研究结果表明用这种方法保藏，时间在30 d内虫草菌种的后代性状较为稳定，不表现为退化，保藏60 d后的菌种遗传性状表现出明显的差异，随着保藏时间的延迟其菌丝生长速度变慢和菌落形态发 生改变，菌落的角变率明显提高。现有的保藏方法显然不能解决实际生产问题，仍需探索更有效的保藏方法。
优良的蛹虫草菌种能够保证虫草产品的质量和品质。传统对蛹虫草菌种的利用需要对菌种进行扩大培养，操作繁琐，周期长，菌种易污染、退化、变异等诸多弊端。为解决这一生产实际问题，本研究在分析菌种退化原因的基础上，将已分离获得的北冬虫夏草菌种经过优化培养、离心、加入保护剂、再经真空冷冻干燥工艺，将其制成冻干粉，于-20℃下保存，以期达到长期保藏菌种的目的。本制作方法通过真空、冷冻、干燥等工艺在保存其活力的情况下给蛹虫草菌创造了缺氧、低温、干燥条件，有效控制了虫草菌的繁殖代数，而且能够直接用于生产，从根本上解决了菌种的继代培养退化问题。不但有效地解决了菌种长期保存的问题，而且省去了每年繁重的菌种选育工作，降低了成本，保证了产品质量，为蛹虫草产业化发展更进一步提供技术支持，具有深远的现实意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的目的是提供一种能够有效保持菌种活力，方便生产应用的北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法,制备得到的北冬虫夏草菌冻干粉保存在-20℃下，无需传代，存放数月后菌种仍保持较高出草率、且出草茁壮，转色正常，无畸形。
本发明上述目的通过如下技术方案予以实现将野外采集生产性状优良的冬虫夏草菌经过分离纯化得到试管斜面纯菌种，接种于增殖培养基中进行震荡增殖培养，获得液体菌种。将增殖培养液在适当条件下离心收集下层菌丝体，加入复合冻干保护剂，混匀，装瓶，冻干，即得北冬虫夏草菌冻干粉。
步骤1：增殖培养基的制备
增殖培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氰钾3.0g，硫酸镁1.5g，Vb10mg，蛋白胨（提供N源）5g，定容至1000ml，pH自然备用。
步骤2：冬虫夏草菌增殖培养
温度24℃，震荡频率130-150rpm，培养时间72h，至能见到均匀的菌丝球。
步骤3：培养液离心收集菌丝体
离心时间10min，离心速度，6000rpm。
步骤4：冻干保护剂制备
冻干保护剂,按质量百分比,包括如下组分：
脱脂乳粉10%，海藻糖5%，甘油10%，葡萄糖5%，β-CD 5%，甘露醇15%。
所述冻干保护剂的制备方法,包括如下步骤：
将上述组分按照配比溶解并平衡30min后备用。
步骤5：按一定的体积比加入冻干保护剂，与菌丝体浓缩液混匀。
步骤6：预冻至冻干所需温度。预冻温度为-80℃，时间为60min。
步骤7：真空冷冻干燥的条件为：绝度真空度为20Pa,温度为-40℃,冻干时间为24h。
步骤8：蜡封，密闭。
本发明与现有技术相比,具有如下有益效果
目前采用的低温试管保藏法，需对蛹虫草菌种进行扩大培养，操作繁琐，周期长，菌种易污染、退化、变异等诸多弊端。本制作方法通过真空、冷冻、干燥等工艺在保存其活力的情况下给蛹虫草菌创造了缺氧、低温、干燥条件，有效地解决了菌种长期保存的问题，从根本上解决了菌种的继代培养退化问题。
实施例1
(1)增殖培养基的制备及其培养
A:其组分包括：马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氰钾3.0g，硫酸镁1.5g，Vb10mg，蛋白胨（提供N源）5g。
B将上述组分按照配比溶解并平衡30min,在温度121.3℃条件，30min高压灭菌。即得培养基。
C:将菌块接种于增殖培养基中，于20℃，震荡频率130rpm培养72h，至能见到均匀的菌丝球。
(2)将上述培养液倒入离心管，于6000rpm，15min的离心机中，进行离心，取浓缩液备用。
(3)按质量百分比,冻干保护剂包括如下组分：脱脂乳粉5%，海藻糖7%，甘油10%，葡萄糖5%，β-CD 7%，甘露醇10%。将上述组分按照配比溶解并平衡30min后，按浓缩液和保护剂比为1：5与菌丝体浓缩液混匀。
(4)将(3)混合液进行预冻至冻干所需温度，其预冻温度为-80℃，时间为60min。最后，进行真空冷冻干燥，其条件为绝度真空度为20Pa,温度为-40℃,冻干时间为24h。
实施例2
(1)增殖培养基的制备及其培养
A:其组分包括：马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氰钾3.0g，硫酸镁1.5g，Vb10mg，蛋白胨（提供N源）5g。
B将上述组分按照配比溶解并平衡30min,在温度121.3℃条件，30min高压灭菌。即得培养基。
C:将菌块接种于增殖培养基中，于24℃，震荡频率140rpm培养72h，至能见到均匀的菌丝球。
(2)将上述培养液倒入离心管，于7000rpm，10min的离心机中，进行离心，倒出上清液备用。
(3)按质量百分比,冻干保护剂包括如下组分：脱脂乳粉10%，海藻糖3%，甘油10%，葡萄糖10%，β-CD 3%，甘露醇12%。将上述组分按照配比溶解并平衡30min后，按浓缩液和保护剂比为1：8与菌丝体浓缩液混匀。
(4)将(3)混合液进行预冻至冻干所需温度其预冻温度为-80℃，时间为60min。最后，进行真空冷冻干燥，其条件为绝度真空度为20Pa,温度为-40℃,冻干时间为24h。
实施例3
(1)增殖培养基的制备及其培养
A:其组分包括：马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氰钾3.0g，硫酸镁1.5g，Vb10mg，蛋白胨（提供N源）5g。
B将上述组分按照配比溶解并平衡30min,在温度121.3℃条件，30min高压灭菌。即得培养基。
C:将菌块接种于增殖培养基中，于22℃，震荡频率150rpm培养72h，至能见到均匀的菌丝球。
(2)将上述培养液倒入离心管，于8000rpm，5min的离心机中，进行离心，倒出上清液备用。
(3)按质量百分比,冻干保护剂包括如下组分：脱脂乳粉15%，海藻糖5%，甘油10%，葡萄糖8%，β-CD 5%，甘露醇15%。将上述组分按照配比溶解并平衡30min后，按浓缩液和保护剂比为1：10与菌丝体浓缩液混匀。
将(3)混合液进行预冻至冻干所需温度其预冻温度为-80℃，时间为60min。最后，进行真空冷冻干燥，其条件为绝度真空度为20Pa,温度为-40℃,冻干时间为24h。
Claims (8)
1.北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 将北冬虫夏草菌种菌液进行增殖培养，得到培养液，将所述培养液进行离心处理，得到菌丝体浓缩液，向所述菌丝体浓缩液中加入冻干保护剂，混匀，预冻及冻干，包装，即得适于常温存放的北冬虫夏草冻干粉。
2.根据权利要求1所述的北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法，其特征在于，培养基增殖温度20~24℃，震荡频率为130~150，时间为72h；其中培养基的组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氰钾3.0g，硫酸镁1.5g，Vb10mg，蛋白胨（提供N源）5g。
3.根据权利要求1所述的北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述离心处理的条件为：6000rmp,15min;7000rmp,10min;800rmp，5min。
4.根据权利要求1所述的适于长期存放的北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法，其特征在于,所述冻干保护剂，按体积百分比，包括如下组分：
脱脂乳粉5~15%
海藻糖3~7%
甘油 10%
葡萄糖5~10%
β-CD 3~7%
甘露醇10~15%
所述冻干保护剂的制备方法，包括，将上述组分按照配比溶解，升温至115℃灭菌15分钟，即得冻干保护剂。
5.根据权利要求1所述的北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法，其特征在于,所述菌丝体浓缩液与加入保护剂的体积比为1:5~10。
6.根据权利要求1所述的北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法，其特征在于,所述预冻是指置于深冷冰箱进行预冻，其预冻时间为60min，预冻温度为-80℃。
7.根据权利要求1所述的北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述冻干是指置于冷冻干燥机中进行冻干处理，冻干的绝度真空度为20Pa,温度为-40℃,冻干时间为24h。
8.根据权利要求1所述的北冬虫夏草菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述包装是将所得冻干粉在相对湿度低于35%的环境下，蜡封。
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